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Ccayac - Validacion Micro PDF
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Protocolo para la evaluacin del desempeo: Documento que describe los pasos a seguir
durante la evaluacin del desempeo de un mtodo analtico microbiolgico, cuyo fundamento se
encuentra descrito en el presente documento.
Resultado Aberrante: Corresponde a cualquier valor extremo que ocurra durante la ejecucin de
la prueba. En menos de 1% de las pruebas esos resultados pueden ocurrir aleatoriamente en
situaciones normales.
Evaluacin del desempeo: Es el proceso que realiza un laboratorio para demostrar que un
mtodo normalizado produce consistentemente resultados confiables en las condiciones
particulares del laboratorio. Confirmacin mediante la aportacin de evidencia objetiva de que un
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4 DOCUMENTOS APLICABLES
4.3 USP 32, <1227> Validation of Microbiological Recovery from Pharmacopeical Articles
4.6 G.A. Leotta, I. Chinen. Validacin de una tcnica de PCR mltiple para la deteccin de
Escherichia coli productor de toxina shiga. Revista Argentina de Microbiologa. Vol.37, No. 1
2005.
4.8 ISO/IEC. 2003. International Standard ISO 16140:2003 (E). Microbiology of food and animal
feeding stuffs Protocol for the validation of alternative methods. First Edition.
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4.10 ISO 17994:2004 Water QualityCriteria for Establishing Equivalence between Microbiological
methods. First Edition.
4.11 The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and
Related Topics. Eurachem Guide. 1998. Disponible en http://www.eurachem.org/guides/pdf/valid.pdf
(febrero 2011)
4.12 Philip Feldsine, Carlos Abeyta, Wallace H. Andrews. AOAC International Methods Committee
Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Methods
of Analysis. 2002. Disponible en http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/Microbiology-Guidelines-
Appendix-X.pdf (febrero 2011)
5 DESCRIPCIN DE LA ACTIVIDAD.
Para cada mtodo de prueba a evaluar se deber contar con protocolo para la evaluacin del
desempeo particular que describa el mtodo a evaluar, la estrategia particular de evaluacin,
los materiales y reactivos y las especificaciones.
Durante la ejecucin del protocolo de evaluacin se debern documentar las actividades y los
resultados.
Verificar que todos los materiales, medios y reactivos cumplen con los criterios de calidad
conforme se establece en el sistema de gestin de calidad y conforme a la NMX-EC-17025-
IMNC-2006. Antes de cada validacin deber comprobarse que el equipo utilizado, cumple con
el calendario de mantenimiento y/o calibracin de cada laboratorio.
Con base en el protocolo de evaluacin se deber verificar que se cuenta con todos los
materiales y reactivos, es conveniente contar con un cronograma de las actividades y los
analistas que participaran en la evaluacin del desempeo.
La preparacin del inculo debe ser realizada por un solo analista durante el desarrollo de la
evaluacin del desempeo del mtodo.
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Inocular una colonia tomada a partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba en 9ml de
caldo BHI o cualquier otro caldo de enriquecimiento, incubar a 35C +/- 2C, por 22h a 24h,
(este tiempo puede ser diferente dependiendo de la experiencia en el laboratorio y el tipo de
microorganismo del que se trate) del cultivo transferir un mililitro a 90ml de BHI e incubar a
35C +/- 2C, por 22h a 24h, a partir del cultivo hacer diluciones decimales, de cada una de
ellas transferir por duplicado un mililitro a cajas de Petri y adicionar agar cuenta estndar,
incubar a 35C +/- 2C, por 18h a 24h, realizar el conteo en cada dilucin para conocer la
concentracin de microorganismos.
Antes de cada prueba deber repetirse la preparacin del inculo de forma idntica que en la
determinacin de concentracin de la cuenta bacteriana en la fase estacionaria y cada inculo
deber ser verificado por vaciado en placa utilizado al menos dos cajas.
Nota 1: Con la prueba previa de fase estacionaria se fija el tiempo de incubacin, volumen necesario que lleve la concentracin
microbiana, para fortificar cada una de las alcuotas de acuerdo al protocolo de evaluacin de desempeo del mtodo en
particular. Durante su manipulacin se recomienda sumergir el recipiente que contiene la FE en agua fra.
Nota 2: Cuando la matriz sea slida, fortificar las alcuotas. Si es lquida se puede fortificar la matriz completa o las alcuotas.
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Repeticiones: 30 repeticiones.
Clculos:
No. de positivos
Lectura = 100
No. de repeticiones
Ejemplo:
Se desea validar el mtodo para aislamiento de un patgeno; para la determinacin del lmite
de deteccin deber prepararse un inculo de menos de 5 UFC del patgeno.
Para la verificacin del inculo, incubar en condiciones adecuadas y hacer los clculos para
determinar la cantidad de microorganismos inoculados a la muestra. La prueba es vlida si se
inoculan menos de 5 UFC.
Para las muestras inoculadas proceder como se indica en el mtodo de prueba. Registrar los
resultados de ausencia y presencia.
Ausencia. 5
Presencia 25
Entonces:
25
Lectura = 100 Lectura = 83.33%
30
Conclusin:
Se cumple con el criterio de aceptacin
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5.5.3 Repetibilidad
Ejemplo:
Supongamos que:
Ausencia 5
Presencia 25
Entonces:
5
Lectura = 100 Lectura = 16.66%
30
Conclusin:
Se cumple con el criterio de aceptacin
5.5.4 Reproducibilidad
Inoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen resultados negativos menores o iguales al 20
% cuando realizan al menos 10 repeticiones cada uno.
Analista Uno
Cumple el
Ausencia: 1 1
Lectura = 100 Lectura = 10% criterio de
Presencia: 9 10 Se cumple el
repetibilidad
criterio de
Analista Dos Cumple el reproducibilidad
2
Ausencia: 2 Lectura = 100 Lectura = 20% criterio de
Presencia: 8 10 repetibilidad
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Fuentes de Incertidumbre
Distribucin de los microorganismos en la muestra;
Efecto de la matriz;
Personal operativo;
Mediciones (pesada o medicin de la muestra);
Diluciones y volmenes;
Homogeneizacin;
Calidad de los medios;
Tiempo hasta la inoculacin;
Temperatura de incubacin;
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5.6.2 Repetibilidad.
La determinacin de la repetibilidad (r) sirve para verificar el grado de concordancia entre los
resultados obtenidos en diferentes repeticiones realizadas por el mismo analista, en las mismas
condiciones, en la misma muestra, en intervalos cortos de tiempo.
Ejemplo
Cuando el mtodo de prueba indica que se deben contar cajas con cuentas entre 25 y 250 UFC,
se utilizan 25 g de muestra y se coloca 1 ml de cada dilucin por placa. El inculo en la muestra
debe ser tal que despus del mtodo de anlisis se recuperen aproximadamente 80 UFC
Si se considera que se realizar una sola dilucin entonces la concentracin del microorganismo
en la dilucin 10-1 deber ser de aproximadamente 800 UFC, pero considerando que el tamao
de la muestra es de 25 g entonces se deberan inocular aproximadamente 2000 UFC
Nota 3: Todos los inculos deben ser verificados utilizando la tcnica de vaciado en placa,
empleando para el clculo 6 cajas.
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Desarrollo
Partiendo de 30 porciones inoculadas de la muestra o de muestras naturalmente contaminadas,
proceder como se indica en el mtodo de prueba.
Clculos
Calcular el log de las UFC contadas por placa en cada repeticin
A B C D E
1 Repeticin Placa 1 Placa 2 log(Placa 1) log(Placa 2)
2 Repeticin 1 70 UFC 90 UFC 1.85 1.95
3 Repeticin 2 71 UFC 91 UFC 1.85 1.96
4 Repeticin 3 80 UFC 80 UFC 1.90 1.90
5 Repeticin 4 76 UFC 82 UFC 1.88 1.91
6 Repeticin 5 78 UFC 82 UFC 1.89 1.91
7 Repeticin 6 77 UFC 88 UFC 1.89 1.94
8 Repeticin 7 56 UFC 80 UFC 1.75 1.90
9 Repeticin 8 87 UFC 80 UFC 1.94 1.90
10 Repeticin 9 77 UFC 86 UFC 1.89 1.93
Excel texto # "UFC" # "UFC" =LOG(B2) =LOG(C2)
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Para determinar la repetibilidad del mtodo se multiplica la RSD por 2.8 que es el valor de la distribucin
normal de Z con 95% de confianza.
I J K
DSR2 DSR(a) r
0.001651
0.001600
0.000000
0.000151
0.000065 0.0299 0.0836
0.000458
0.003600
0.000180
0.000316
"=H2^2 "=RAIZ((SUMA(I2:I10)/CONTAR(I2:I10))) "=J2*2.28
5.6.3 Reproducibilidad
Desarrollo.
Utilizando el mtodo de referencia, al menos dos analistas en momentos diferentes
procedern como se describi para repetibilidad hasta el clculo del cuadrado de la DSR
Ejemplo:
A B C D E F G H I
Log Log
1 Analista
Repeticin Placa 1 Placa 2 (Placa 1) (Placa 2) D.E. MEDIA DSR DSR2
2 Repeticin 1 79 UFC 80 UFC 1.90 1.90 0.004 1.900 0.0020 0.000004
3 Repeticin 2 60 UFC 67 UFC 1.78 1.83 0.034 1.802 0.0188 0.000354
4 Repeticin 3 77 UFC 86 UFC 1.89 1.93 0.034 1.910 0.0178 0.000316
5 Repeticin 4 77 UFC 70 UFC 1.89 1.85 0.029 1.866 0.0157 0.000246
6 A Repeticin 5 89 UFC 70 UFC 1.95 1.85 0.074 1.897 0.0389 0.001511
7 Repeticin 6 69 UFC 89 UFC 1.84 1.95 0.078 1.894 0.0413 0.001703
8 Repeticin 7 77 UFC 80 UFC 1.89 1.90 0.012 1.895 0.0062 0.000038
9 Repeticin 8 80 UFC 80 UFC 1.90 1.90 0.000 1.903 0.0000 0.000000
10 Repeticin 9 78 UFC 83 UFC 1.89 1.92 0.019 1.906 0.0100 0.000100
Log Log
11 Analista
Repeticin Placa 1 Placa 2 (Placa 1) (Placa 2) D.E. MEDIA DSR DSR2
12 Repeticin 1 70 UFC 79 UFC 1.85 1.90 0.037 1.871 0.0198 0.000394
13 Repeticin 2 89 UFC 80 UFC 1.95 1.90 0.033 1.926 0.0170 0.000289
14 Repeticin 3 80 UFC 77 UFC 1.90 1.89 0.012 1.895 0.0062 0.000038
15 Repeticin 4 70 UFC 77 UFC 1.85 1.89 0.029 1.866 0.0157 0.000246
16 B Repeticin 5 70 UFC 89 UFC 1.85 1.95 0.074 1.897 0.0389 0.001511
17 Repeticin 6 89 UFC 69 UFC 1.95 1.84 0.078 1.894 0.0413 0.001703
18 Repeticin 7 80 UFC 77 UFC 1.90 1.89 0.012 1.895 0.0062 0.000038
19 Repeticin 8 80 UFC 80 UFC 1.90 1.90 0.000 1.903 0.0000 0.000000
20 Repeticin 9 83 UFC 78 UFC 1.92 1.89 0.019 1.906 0.0100 0.000100
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5.6.4 Recuperacin
Es la cantidad de UFC que el mtodo de prueba es capaz de recuperar cuando es inoculado un
numero conocido de microorganismos.
Con los datos obtenidos en repetibilidad en muestras fortificadas calcular la cantidad de UFC,
en cada repeticin y calcular el logaritmo de cada cuenta, promediar los logaritmos. Calcular el
logaritmo del inculo verificado.
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5.6.5 Sesgo
El sesgo es la diferencia absoluta entre el valor conocido como verdadero y el valor obtenido
experimentalmente.
Sesgo=
Donde Ve= valor esperado
Vo= valor obtenido
5.6.6 Incertidumbre.
Especificar el mensurando.
Identificar las fuentes de incertidumbre
Cuantitativos
Cualitativos
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Cuando se realice un cambio con respecto al protocolo establecido, este deber estar
documentado y autorizado.
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9. Desarrollo Detallar como se llevaron a cabo los ensayos de cada uno de los
experimental parmetros de desempeo.
Presentacin de resultados en forma de tablas, sealando fechas de inicio
10. Resultados y trmino, analistas, laboratorio, microorganismo(s) de prueba, matriz,
unidades y clave de bitcora o registro primario
Presentar en forma de tabla los criterios de aceptacin considerados y los
11. Anlisis de resultados
resultados obtenidos y hacer las observaciones correspondientes.
Efectuar una conclusin final en donde se seale que el mtodo se ajusta al
12. Conclusin
uso propuesto (Numeral 5.4.3 17025)
13. Bibliografa Referencias utilizadas.
Los que aplique:
Registros primarios,
Bases de datos utilizadas
Certificados de equipos,
14. Anexos
Medios de cultivo
Cepas
Formatos de verificacin,
Grficos de control, etc.
Nota: El informe de resultados debe incluir firmas de quien elabor, revis y aprob.
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Se otorga un periodo de transicin de 180 das contados a partir de la fecha de publicacin para que
los laboratorios que se encuentren autorizados o en proceso del mismo se apeguen a stos criterios.
Para los laboratorios que soliciten autorizacin posterior a la fecha de publicacin, debern cumplir
stos criterios de inicio.
Estos criterios se aplicarn en todos los procesos de evaluacin que se realicen a los 180 das
naturales, a partir de la fecha de publicacin del documento en la pgina web de la COFEPRIS.
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Anexo Informativo 1
Gua Informativa para la fortificacin de una matriz
Hacer recuento por triplicado de las diluciones, 10-6, 10-7, 10-8 y 10-9 en agar soya tripticaseina o Agar
cuenta estndar.
Realizar las lecturas y clculos de los nmeros de clulas en cada una de las diluciones para establecer
la dilucin que ser usada en la fortificacin de la matriz y registrar los resultados de los recuentos y
clculo.
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Anexo Informativo 2
Gua informativa de formatos
Cuadro 1: VALIDACIN PARCIAL DE:
FASE ESTACIONARIA
Analista: Fecha:
Nombre del microorganismo:
Horas vol. de inculo Dilucin Cuenta UFC Cuenta UFC Promedio de UFC/mL
en placa Placa 1 Placa 2 cuentas
Clculos:
CLCULO DE INCULOS
Analista: Fecha:
Nombre del microorganismo:
Parmetro de desempeo:
FE en UFC/mL=
Clculos:
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Parmetro de desempeo:
Cuadro 4: Clculos para la obtencin de los datos de la dilucin y el volumen seleccionado de la FE para
fortificar las alcuotas de la matriz en estudio del LD.
Matriz: Analista(s):
Fecha: Mtodo de prueba:
Parmetro de desempeo: Analito: ________________________________________
Lmite de deteccin
No. de UFC/mL en FE: ____________________________
Nivel a confirmar: Niveles que se prueban:
LD no declarado: _______ UFC/25g
LD declarado:_______
Nivel: ________
Dilucin seleccionada de la FE:
Concentracin en UFC/mL que corresponde a la dilucin seleccionada:
Clculos:
RESULTADOS:
Dilucin de FE:___________
Volumen de FE:___________
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Anexo Informativo 3
Gua informativa para la construccin de hojas de clculo
Porcentaje de recuperacin
Repeti Placa Placa =CONCATENAR("log(",E =CONCATENAR("Media =CONCATENAR("log %
Analista
cin 1 2 Cuenta 1,")") (",F1,")") Inculo (",H1,")") Recuperacin
=PROMEDIO(C2:D2) =LOG(E2)
=PROMEDIO(C3:D3) =LOG(E3)
=PROMEDIO(C4:D4) =LOG(E4)
=PROMEDIO(C5:D5) =LOG(E5)
=PROMEDIO(C6:D6) =LOG(E6) =PROMEDIO(F2:F10) =LOG(H2) =G2/$I$2
=PROMEDIO(C7:D7) =LOG(E7)
=PROMEDIO(C8:D8) =LOG(E8)
=PROMEDIO(C9:D9) =LOG(E9)
=PROMEDIO(C10:D10) =LOG(E10)
Sesgo
Repeti Placa Placa =CONCATENATE("log(",E =CONCATENATE("Media =CONCATENATE("log
Analista
cin 1 2 Cuenta 1,")") (",F1,")") Inculo (",H1,")") SESGO
=AVERAGE(C2:D2) =LOG(E2)
=AVERAGE(C3:D3) =LOG(E3)
=AVERAGE(C4:D4) =LOG(E4)
=AVERAGE(C5:D5) =LOG(E5)
=ABS(G2-
=AVERAGE(C6:D6) =LOG(E6) =AVERAGE(F2:F10) =LOG(H2)
I2)
=AVERAGE(C7:D7) =LOG(E7)
=AVERAGE(C8:D8) =LOG(E8)
=AVERAGE(C9:D9) =LOG(E9)
=AVERAGE(C10:D10) =LOG(E10)
Reproducibilidad
R
ep
Analista eti
ci Plac Plac =CONCATENAR("log( =CONCATENAR("log( Desviacin DSR
n a1 a2 ",C1,")") ",D1,")") Estandar MEDIA DSR 2 DSR(ab) R
=DESVEST(E2 =PROMEDIO(E =G2/H =I2^
=LOG(C2) =LOG(D2) :F2) 2:F2) 2 2
=DESVEST(E3 =PROMEDIO(E =G3/H =I3^
=LOG(C3) =LOG(D3) :F3) 3:F3) 3 2
=DESVEST(E4 =PROMEDIO(E =G4/H =I4^
=LOG(C4) =LOG(D4) :F4) 4:F4) 4 2
=DESVEST(E5 =PROMEDIO(E =G5/H =I5^
=LOG(C5) =LOG(D5) :F5) 5:F5) 5 2
=DESVEST(E6 =PROMEDIO(E =G6/H =I6^
=LOG(C6) =LOG(D6) :F6) 6:F6) 6 2
=DESVEST(E7 =PROMEDIO(E =G7/H =I7^
=LOG(C7) =LOG(D7) :F7) 7:F7) 7 2
=DESVEST(E8 =PROMEDIO(E =G8/H =I8^
=LOG(C8) =LOG(D8) :F8) 8:F8) 8 2
=DESVEST(E9 =PROMEDIO(E =G9/H =I9^
=LOG(C9) =LOG(D9) :F9) 9:F9) 9 2
=DESVEST(E1 =PROMEDIO(E =G10/ =I10
=LOG(C10) =LOG(D10) 0:F10) 10:F10) H10 ^2
R
ep
=RAIZ((SUMA(J2:J10,J12:J20)/CO =K2*
Analista eti
NTAR(J2:J10))) 2.8
ci Plac Plac =CONCATENAR("log( =CONCATENAR("log( Desviacin DSR
n a1 a2 ",C11,")") ",D11,")") Estandar MEDIA DSR 2
=DESVEST(E1 =PROMEDIO(E =G12/ =I12
=LOG(C12) =LOG(D12) 2:F12) 12:F12) H12 ^2
=DESVEST(E1 =PROMEDIO(E =G13/ =I13
=LOG(C13) =LOG(D13) 3:F13) 13:F13) H13 ^2
=DESVEST(E1 =PROMEDIO(E =G14/ =I14
=LOG(C14) =LOG(D14) 4:F14) 14:F14) H14 ^2
=DESVEST(E1 =PROMEDIO(E =G15/ =I15
=LOG(C15) =LOG(D15) 5:F15) 15:F15) H15 ^2
=DESVEST(E1 =PROMEDIO(E =G16/ =I16
=LOG(C16) =LOG(D16) 6:F16) 16:F16) H16 ^2
=DESVEST(E1 =PROMEDIO(E =G17/ =I17
=LOG(C17) =LOG(D17) 7:F17) 17:F17) H17 ^2
=DESVEST(E1 =PROMEDIO(E =G18/ =I18
=LOG(C18) =LOG(D18) 8:F18) 18:F18) H18 ^2
=DESVEST(E1 =PROMEDIO(E =G19/ =I19
=LOG(C19) =LOG(D19) 9:F19) 19:F19) H19 ^2
=DESVEST(E2 =PROMEDIO(E =G20/ =I20
=LOG(C20) =LOG(D20) 0:F20) 20:F20) H20 ^2
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Repetibilidad
Repetici Placa Placa =CONCATENAR("log(", =CONCATENAR("log(", Desviacin
n 1 2 B1,")") C1,")") Estandar MEDIA DSR DSR2 DSR(a) r
=DESVEST(D2:E =PROMEDIO(D2: =H2^
=LOG(B2) =LOG(C2) 2) E2) =F2/G2 2
=DESVEST(D3:E =PROMEDIO(D3: =H3^
=LOG(B3) =LOG(C3) 3) E3) =F3/G3 2
=DESVEST(D4:E =PROMEDIO(D4: =H4^
=LOG(B4) =LOG(C4) 4) E4) =F4/G4 2
=DESVEST(D5:E =PROMEDIO(D5: =H5^
=LOG(B5) =LOG(C5) 5) E5) =F5/G5 2
=DESVEST(D6:E =PROMEDIO(D6: =H6^
=LOG(B6) =LOG(C6) 6) E6) =F6/G6 2
=DESVEST(D7:E =PROMEDIO(D7: =H7^
=LOG(B7) =LOG(C7) 7) E7) =F7/G7 2
=DESVEST(D8:E =PROMEDIO(D8: =H8^
=LOG(B8) =LOG(C8) 8) E8) =F8/G8 2
=DESVEST(D9:E =PROMEDIO(D9: =H9^
=LOG(B9) =LOG(C9) 9) E9) =F9/G9 2
=DESVEST(D10: =PROMEDIO(D10: =F10/G =H10 =RAIZ((SUMA(I2:I10)/CONTAR =J2*2
=LOG(B10) =LOG(C10) E10) E10) 10 ^2 (I2:I10))) .8
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