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Contenido
Bebidas Mexicanas | Junio 2013

tecnologa
Efecto de la fermentacin
espontnea y el aejamiento en la
calidad quimiosensorial de cacha a
brasilea orgnica
Afra Vital Matos Dias Gabriel, Marta Regina Verruma-Bernardi,
2 Luiz Antnio Corra Margarido, Maria Teresa Mendes Ribeiro
Borges, Renata Tieko Nassu, Norberto Antonio Lavorenti y
Sandra Regina Ceccato-Antonini

12
tecnologa
Iniciador mltiple de la viticultura
orgnica para la produccin de vino
tinto Montepulciano dAbruzzo
Giovanna Suzzi, Maria Schirone, Manuel Sergi, Rosa Maria
Marianella, Giuseppe Fasoli, Irene Aguzzi y Rosanna Tofalo

30
Contenido

Junio 2013 l Volumen 2, No. 6


www.alfaeditores.com | buzon@alfaeditores.com

Editor Fundador

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Editorial 6
Lic. Elsa Ramrez Zamorano Cruz

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Q.B.P. Ana Mara Ramrez Ornelas
Bebidas Mexicanas | Junio 2013

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4 Dr. Mariano Garca Garibay


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Dr. Valente B. lvarez

Direccin Tcnica

Q.F.B. Rosa Isela de la Paz G.

Direccin Comercial

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La funcin principal de BEBIDAS MEXICANAS es dar difusin a los servicios de apoyo que las em-
Prensa presas proveedoras (de materias primas, maquinaria, laboratorios de control de calidad, etc.) ofrecen
a la Industria de Bebidas, a la vez servir de medio para que los tcnicos, especialistas e investiga-
Lic. Vctor M. Snchez Pimentel
dores de las reas relacionadas con el sector indicado anteriormente, expongan sus conocimientos
y experiencias. El contenido de la revista es actualizado debido a la aportacin del conocimiento de
Diseo muchas personas especializadas en el rea. Adicionalmente se incluye informacin tecnolgica de
aplicacin bsica y prctica, con la finalidad de que ayude a resolver los problemas que enfrentan los
Mara Teresa Baales Yerena industriales procesadores del ramo.
Lucio Eduardo Romero Mungua
BEBIDAS MEXICANAS se edita mensualmente y es una publicacin ms de ALFA EDITORES
Ventas TCNICOS, S.A. de C.V. Av. Unidad Modelo No. 34, Col. Unidad Modelo, C.P. 09089, Mxico, D.F.
Tels./Fax: (55) 55 82 33 42, 78, 96 con 6 lneas. E-mail: buzon@alfaeditores.com o bien nuestra pgi-
na: www.alfaeditores.com
Cristina Garduo Torres
Edith Lpez Hernndez Todos los derechos reservados. Prohibida la reproduccin total o parcial, sin permiso escrito del edi-
Juan Carlos Gonzlez Lora tor. El contenido de los artculos firmados es responsabilidad del autor. El contenido de los artculos
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los anuncios publicados en esta revista son responsabilidad de la empresa anunciante. Se aceptan
ventas@alfaeditores.com colaboraciones. No se devuelven originales. Se acepta intercambio de publicaciones similares.
Editorial

La naturaleza hecha bebida


De acuerdo con el Global Organic Market Access (GOMA), que es un proyecto impulsado por la
FAO, IFOAM y UNCTAD, tanto en Amrica como en otros continentes el mercado internacional de
alimentos y bebidas orgnicas se ha estado recuperando de la desaceleracin econmica que perme
a las industrias a inicios de esta dcada. A pesar de ello, aunque Estados Unidos ha registrado un
considerable incremento de reas orgnicas, la oferta de comestibles de esta naturaleza continu
siendo menor a la demanda durante 2011; mientras que Latinoamrica y Asia son las regiones que ms
han mostrado un crecimiento saludable desde el punto de vista de las ventas y consumo, aunque no
llegan a ser sus pases los que ms ganancias dejen a los productores, donde Europa y Norteamrica
encabezan los ingresos.
Bebidas Mexicanas | Junio 2013

Parte de esta expansin se ejemplifica con hechos como el que en Chile, el sector de alimentos
especiales (que abarcan a aquellos libres de ingredientes que producen intolerancias, como lactosa
y gluten; orgnicos, como el t verde e integrales; bajos en caloras, fortificados o funcionales, y bajos
en sodio y sin azcar) representa actualmente un 13% del mercado total de comestibles envasados; en
tanto que las bebidas con mismas caractersticas significaron el ao pasado un 23% del mercado de los
bebestibles sin alcohol, segn informacin de la agencia Euromonitor International.

Con el objetivo de explorar las posibilidades de xito de los productos orgnicos tanto en Mxico
como en la regin, dedicamos este nmero de junio de Bebidas Mexicanas a las bebidas orgnicas, un

6
mercado que promete ganancias tanto en Amrica Latina y Asia como en pases ms desarrollados.

As, en esta edicin le presentamos un estudio que verific el efecto de la fermentacin espontnea o
fermento natural en la calidad quimiosensorial de la cachaa (bebida alcohlica destilada ms popular
de Brasil), en comparacin con el fermento comercial; y el reporte de un trabajo que confirm que
las levaduras que no son Saccharomyces tienen un papel importante en los vinos orgnicos, cuya
actividad podra modularse mediante la seleccin de cepas apropiadas que interacten correctamente
con S. cerevisiae. Adems, como es costumbre, hallar nuestras interesantes y tiles secciones de
Novedades y Calendario de Eventos.

Le damos la bienvenida a Bebidas Mexicanas de junio 2013, publicacin que le invita a formar parte
de TecnoAlimentos Expo 2013, feria considerada por la industria como la ms importante en Mxico
y Centroamrica para la proveedura de soluciones para los fabricantes de alimentos y bebidas. Para
obtener ms informacin sobre este trascendente evento, donde destacar el Seminario de Tecnologa
de Bebidas, visite www.expotecnoalimentos.com.

Lic. Elsa Ramrez-Zamorano Cruz


Directora General
Novedades

Disean aromas estables


de limn para bebidas

Una tesis doctoral dirigida por los


profesores Jos Laencina Snchez
y Miguel Moliner Goslbez, de la
Facultad de Veterinaria de la Uni-
versidad de Murcia (Espaa), ha per-
mitido disear aromas de limn que
tienen una mayor estabilidad para Un consumo moderado de Esta bebida puede ayudar al orga-
su utilizacin en bebidas, y han con- cerveza ayuda a reponer la nismo a restituir los carbohidratos y
seguido un alto nivel de aceptacin hidratacin electrolitos perdidos durante la prc-
entre los consumidores. tica deportiva, sin embargo no debe
Bebidas Mexicanas | Junio 2013

La cerveza, rica en antioxidantes beberse en exceso pues la ingesta


El estudio indica que las bebidas con y vitaminas y de bajo contenido de grandes cantidades de alcohol
aromas de limn sufren cambios alcohlico, puede ser una opcin aumenta la diuresis, retrasando as
significativos con el paso del tiempo, para recuperar la hidratacin tras la recuperacin del estado de hidra-
lo que motiva el rechazo por parte de la prctica deportiva, siempre y tacin ptimo.
los ciudadanos, adems, identifi- cuando se consuma moderada-
ca las causas de la inestabilidad de mente y no sustituya al consumo Adems, Peas-Ruiz destac que lo
estos aromas, lo que se consigui de agua. Es imprescindible para ms importante es reponer la pr-
con el uso de tcnicas de evaluacin la rehidratacin tras el ejercicio, dida de agua, glucgeno y sodio
sensorial y tambin mediante la rea- segn el Dr. Carlos Peas-Ruiz, despus del ejercicio, para ello se
lizacin de anlisis de cromatografa investigador de la Universidad de recomienda la ingesta de agua y,
de gases. Swansea (Inglaterra). posteriormente, podra combinarse
8 con una o dos cervezas.

Agua de coco, bebida


isotnica y rica en potasio

El agua de coco es la nueva bebi-


da de moda de la que habla todo el
mundo. El lquido claro que se obtie-
ne de los cocos jvenes y verdes, es
isotnico y muy rico en potasio. Esta
bebida resulta perfecta como refres-
co para restablecer el equilibrio de
nutrientes en el organismo tras la
prctica del deporte.

El tratamiento UHT y el llenado en


envases de cartn aspticos, son la
combinacin perfecta para garanti-
zar que la nutritiva agua de coco, que
se deteriora fcilmente al procesar-
se, sea tratada y envasada delicada-
mente. Tipco, el principal fabricante
asitico de alimentos y bebidas, ha
Novedades

soluble, producido en su fbrica


en Orbe, bajo la marca Nescaf. La
marca se introdujo posteriormente
en el Reino Unido y Estados Unidos.
En abril de 1940, Nescaf se comer-
cializaba ya en 30 pases de todo el
mundo.

Coca-Cola lanza su primer t


verde embotellado en Taiwn
Bebidas Mexicanas | Junio 2013

optado por ofrecer agua de coco en cia del agua de coco. Desde 2012,
envases de cartn aspticos. bajo la etiqueta Agua de coco,
la compaa ofrece las variedades
Por su parte, en Europa la firma Pura y Pia en envases de car-
suiza Bischofszell Food Ltd. (BINA) tn de pequeo tamao con popote
confa en el potencial de la tenden- para beber.

El caf soluble instantneo vestigaciones en las que dedujo


cumple 75 aos que el secreto para conservar el
10 aroma del caf radicaba en crear
La invencin del caf soluble instan- un caf soluble que contuviera sufi- Coca-Cola ha lanzado su primer t
tneo se remonta a principios de los cientes carbohidratos. Con base en verde embotellado en Taiwn, con
aos 30 del siglo pasado, cuando esto, emple una tcnica especfi- el objetivo de forjar su presencia en
Brasil, el gran productor de caf, se ca para producir muestras de caf este mercado, anunci la compaa.
encontr con un gran excedente de soluble apto para beber con estas
esta materia prima. caractersticas. El Director General de Coca-Cola
en Taiwn, seal que con este
El cientfico Max Morgenthaler, El 1 de abril de 1938, luego de varios nuevo producto la empresa preten-
quien formaba parte de Nestl en aos de investigacin, Nestl lanz de aumentar su participacin en el
aquellos aos, llev a cabo las in- al mercado en Suiza el primer caf mercado del t. Actualmente, Coca-
Cola tiene una participacin del 5%
en este rubro, el cual representa el
40% del mercado total de bebidas
de Taiwn.

El nuevo producto, llamado Yuan


Tsui, se anuncia como el primer t
verde embotellado en el mercado
domstico de Taiwn; la bebida con-
tiene matcha japonesa, una harina
fabricada con hojas de t que no
contiene azcares.
Tecnologa

Efecto de la fermentacin
espontnea y el
aejamiento en la calidad
quimiosensorial de
cachaa brasilea orgnica
Bebidas Mexicanas | Junio 2013

Effect of the spontaneous fermentation


and the ageing on the chemo-sensory
quality of Brazilian organic cachaa

12 Afra Vital Matos Dias Gabriel 1,2, Marta RESUMEN


Regina Verruma-Bernardi 2, Luiz Antnio
Corra Margarido 2, Maria Teresa Mendes Este estudio verific el efecto de la fermentacin espon-
Ribeiro Borges 2, Renata Tieko Nassu 3, tnea o fermento natural (FN) en la calidad quimiosen-
Norberto Antonio Lavorenti 2 y Sandra sorial de la cachaa, en comparacin con el fermento
Regina Ceccato-Antonini 1,2* comercial (FC). Tambin se analiz el efecto del aeja-
miento (maduracin) en la bebida. Se realizaron anli-
sis microbiolgicos (placas de medios selectivos para
recuento de levaduras totales/silvestres y bacterias)
y fisicoqumicos (pH, acidez y slidos solubles) en las
muestras del mosto y el fermento recolectado durante
tres ciclos de fermentacin a escala semi-industrial. Las
muestras de cachaa se almacenaron en contenedores
de madera de roble de 5 L durante 45 das y subsecuen-
temente se analizaron sus caractersticas fisicoqumicas

1
Programa de Ps-graduao em Agroecologia e
Desenvolvimento Rural, Universidade Federal de So Carlos
(UFSCar), Campus de Araras, Araras, SP, Brasil.
2
Departamento de Tecnologia Agroindustrial e Socioeconomia
Rural, UFSCar, Campus de Araras, 13600-970, Araras, SP,
Brasil.
3
Embrapa Pecuria Sudeste, So Carlos, SP, Brasil.
*E-mail: antonini@cca.ufscar.br
Tecnologa

(pH, acidez, contenido de alcohol, cobre y compuestos (CF). The effect of ageing (maturation) was also analysed
secundarios) y aceptabilidad sensorial (aroma, sabor, in the beverage. Microbiological analysis (plating on
color, cuerpo e impresin global). La fermentacin con selective media for total/wild yeast and bacteria counting)
FN mostr un mayor nmero de levaduras silvestres; sin and physicochemical analysis (pH, acidity and soluble
embargo, no hubo diferencia en el nmero de bacterias solids) were performed in the samples of the must and the
en comparacin con el FC. Ocurri una intensa acidifi- ferment collected during three cycles of fermentation in a
cacin durante la preparacin del FN, que tambin se semi-industrial scale. Samples of cachaa were stored in
observ en los ciclos iniciales de fermentacin, pero que 5 L oak containers for 45 days, subsequently analyzing
disminuy posteriormente. Las grandes alteraciones en the physico-chemical characteristics (pH, acidity, alcohol
la composicin de la cachaa resultaron estar exclusiva- content, copper and secondary compounds) and sensory
mente ms relacionadas con la maduracin que con el acceptability (aroma, flavour, colour, body and global
tipo de fermento, a excepcin de la acidez. Sin embargo, impression). The fermentation with NF showed higher
hubo una prdida significativa de aroma, sabor e impre- number of wild yeasts; however there was no difference
Bebidas Mexicanas | Junio 2013

sin global despus de la maduracin pero nicamen- in the number of bacteria comparing to CF. An intense
te en la cachaa producida con el FC. Los resultados acidification occurred during the preparation of NF, which
revelaron una fuerte interaccin entre el fermento y la was also observed in the initial cycles of fermentation,
maduracin de la bebida, sugiriendo que las sustancias but decreased afterwards. Greater alterations in cachaa
producidas por los microorganismos de los diferentes composition were found to be more exclusively related
inculos reaccionaron de manera distinta con los com- to the maturation than to the type of ferment, except
ponentes de la madera de los barriles, lo que influenci for the acidity. However, there was a significant loss of
los atributos sensoriales. aroma, flavour and global impression after maturation
but only in cachaa produced with the CF. The results
Palabras clave: Bebida alcohlica; calidad fisicoqumica; revealed a strong interaction between ferment and
calidad sensorial. maturation of the beverage, suggesting that substances
produced by the microorganisms from different inocula
14 during fermentation reacted differently with the wood
ABSTRACT components of the barrels influencing the sensory
attributes.
This study verified the effect of the spontaneous
fermentation/natural ferment (NF) on the chemo-sensory Key words: Alcoholic beverage; physicochemical quality;
quality of cachaa, comparing to the commercial ferment sensorial quality.
Tecnologa

INTRODUCCIN

Aproximadamente 30% de la pro-


duccin anual en Brasil, que se
estima en 1,300 millones de litros,
se constituye por la cachaa arte-
sanal, en la cual la fermentacin
inicia por levaduras autctonas
del jugo de caa de azcar, el
llamado fermento natural (PATA-
RO et al., 2000). La preparacin de este
fermento iniciador tradicional no sigue una
receta estndar y consiste bsicamente en agre-
Bebidas Mexicanas | Junio 2013

gar jugo de caa de azcar a maz molido y arroz


pulverizado (ROSA et al., 2009). Es una fermenta-
cin espontnea utilizando levaduras silvestres (no-
Saccharomyces) y Saccharomyces cerevisiae, con
predominancia de esta ltima especie (MORAIS et
al., 1997; PATARO et al., 1998). Como consecuencia,
la cachaa artesanal tiene una calidad sensorial
diferente debido a los metabolitos y compuestos
voltiles producidos por la diversidad de levaduras
presentes durante el proceso de fermentacin. Por
lo tanto, la composicin de las levaduras es un fac-
tor clave en la calidad de la cachaa (NOVA et al.,
16 2009). Las levaduras no-Saccharomyces estudia-
das por OLIVEIRA et al. (2005) en fermentaciones
de caa de azcar a pequea escala, no ejercieron
una influencia negativa en la calidad sensorial de
la cachaa. Las levaduras silvestres (Pichia silvico-
la, Pichia anomala y Dekkera bruxellensis) tambin
fueron adecuadas para la produccin de cachaa
de alta calidad ya que estos microorganismos pro-
ducen concentraciones aceptables de compuestos
secundarios (DATO et al., 2005).

Los estudios sobre la calidad quimiosensorial de la


cachaa orgnica artesanal producida con fermen-
to natural son escasos. Adems, aunque el aeja-
miento es opcional para la cachaa, es una tcnica
comn para las bebidas destiladas en varios pases,
que da como resultado una mejor calidad sensorial
y constituye el paso final en la produccin de be-
bidas destiladas de diferentes calidades (FARIA et
al., 2003). En este contexto, este trabajo evalu la
influencia de la fermentacin espontnea en las
caractersticas quimiosensoriales de la cachaa or-
gnica artesanal, en comparacin con el fer-
mento comercial. Tambin se evalu el
Tecnologa

efecto de la maduracin (envejecimiento o aejamiento) Las fermentaciones se llevaron a cabo en cuatro tanques
en barriles de madera de roble, como una contribucin de 1000 L (200 L de volumen de trabajo), dos para cada
a aquellos pequeos productores que quieren crear una fermento (FN; y FC como levadura fresca para reposte-
bebida de calidad diferente. ra Fleishmann, en una proporcin de 8 g/L, hidratada
en agua tibia antes de la inoculacin en el tanque), en un
proceso de reciclaje de clulas de levadura para tres ci-
MATERIALES Y MTODOS clos consecutivos, a temperatura ambiente (30 C-32 C).
La concentracin celular inicial fue 106-107 clulas vivas
Inicialmente, el inculo de levadura natural (FN) se prepa- por mL para ambos inculos. Despus de terminada la
r mezclando 2 kg de salvado de arroz, 1 kg de migajas fermentacin, se destil el mosto y aproximadamente el
de pan y 1 kg de harina de maz, que se envolvieron en 20% v/v del fermento permaneci en el tanque para el si-
un pauelo de algodn dentro de un contenedor con al- guiente ciclo.
rededor de 30 L de jugo de caa de azcar diluido (6-7
Bebidas Mexicanas | Junio 2013

Brix) y posteriormente se calent a 28 C-35 C. En cinco La destilacin (150 - 200 L de mosto fermentado) se rea-
ocasiones, se agregaron 15 L de jugo de caa de azcar liz en alambiques de cobre de 300 L con pre-calentador
diluido, en un periodo de 10 das, hasta que se obtuvo un y enfriador descartando las fracciones de la cabeza y
volumen de aproximadamente 100 L para agregarse a los la cola (aproximadamente 10% del destilado inicial y fi-
tanques de fermentacin. Se extrajo el jugo de la caa nal, respectivamente). La fraccin corazn se diluy en
de azcar de variedad RB855156, cultivada bajo condicio- agua destilada y se destil nuevamente de acuerdo con
nes orgnicas en Araras, So Paulo, Brasil. La cosecha se FRANCO (2008). Las muestras destiladas fueron separa-
realiz manualmente sin quema y las caas de azcar se das en fracciones cabeza, cola y corazn una vez
molieron en el da de la cosecha. ms y la ltima fraccin se guard en contenedores de
vidrio para el anlisis quimiosensorial (a 40 GL) y se al-
macen (a 42 GL) en barriles de roble de 5 litros durante
45 das, con base en el trabajo de BORRAGINI (2009).
18
Tecnologa
Bebidas Mexicanas | Junio 2013

Las muestras de cachaa (a 42 GL) se analizaron para ble a muy agradable. Las muestras de cachaa (20
cobre, como medicin directa por espectrofotometra mL) se sirvieron en contenedores transparentes y sin
de absorcin atmica - Perkin-Elmer 313 (AOAC, 1995); color, etiquetados con un cdigo de tres dgitos y pre-
acetaldehdo, acetato de etilo, metanol, n-propanol, iso- sentados en enfoque mondico (MacFIE et al., 1989). Se
butanol y alcohol isoamlico, utilizando cromatografa de utiliz luz blanca en las cabinas individuales, con una
gases con detector de ionizacin de flama (INSTITUTO presentacin balanceada de las muestras de cachaa
ADOLFO LUTZ, 1985); pH, con medicin directa con un de acuerdo con un diseo de bloques completamente al
20 peachmetro digital; contenido de alcohol (GL), utilizando azar. Las pruebas sensoriales se aprobaron por el Comi-
un densmetro digital; y acidez total, voltil y fija, por titu- t de tica de la Universidad (CAAE 0026.0.135.000-09).
lacin (AMORIM et al., 1979). Se calcul la concentracin
de alcoholes superiores (suma de n-propanol, alcohol Se utiliz el anlisis de varianza y la prueba de Tukey (P
isoamlico e isobutanol) y compuestos voltiles totales < 0.05) para las comparaciones, pero para los datos del
(suma de acidez voltil, alcoholes superiores, acetaldeh- anlisis sensorial, se emple la prueba no paramtrica de
do y acetato de etilo). Se tomaron muestras del fermento Kruskall-Wallis.
natural (durante la preparacin), del mosto (al comienzo
del ciclo fermentativo) y del fermento, y se analizaron
para pH, acidez total y slidos solubles (Brix) utilizan- RESULTADOS Y DISCUSIN
do un refractmetro. Para el anlisis microbiolgico, las
muestras del mosto y del fermento se centrifugaron a Durante la preparacin del fermento, los valores de los
3,000 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante lavado se slidos solubles se mantuvieron constantes debido a la
diluy de forma serial y se coloc en placas de agar WLN, adicin peridica de jugo de caa de azcar; en contraste,
WLD y lisina para levadura, y agar nutritivo para recuen- la acidez total aument de manera significativa probable-
tos de bacterias (CECCATO-ANTONINI, 2010). Las placas mente debido a la produccin de cido orgnico, pero sin
se incubaron a 30 C por 2 y 3 das (para bacterias y leva- una disminucin relevante en el pH despus de 2 das de
duras, respectivamente). preparacin. Un aumento progresivo en el recuento total
de levaduras (a partir del medio WLN), un nmero estable
Para el anlisis sensorial de aceptabilidad (prueba afec- de levaduras silvestres resistentes a la cicloheximida (a
tiva), un panel de 62 jueces no entrenados evalu las partir de agar WLD) y un bajo nmero de levaduras no-
muestras con respecto al aroma, sabor, color, cuerpo Saccharomyces (a partir de agar lisina), demostr que el
(astringencia) e impresin general, utilizando una escala nmero de Saccharomyces aument considerablemen-
hednica de 7 puntos en un rango de muy desagrada- te con la adicin de jugo de caa de azcar (Figura 1).
Tecnologa

El recuento de levaduras aument 5 ciclos logartmi- durante la fermentacin. Los valores de los slidos so-
cos en un periodo de 10 das, sugiriendo que ocurri lubles en el mosto de FC fueron mayores; sin embargo,
una seleccin de levaduras durante la preparacin del nicamente hubo diferencias significativas en el ltimo
FN, especialmente Saccharomyces, que estn ms ciclo (Figura 3).
adaptadas a altas concentraciones de azcar del jugo
de caa de azcar. La alta acidificacin del mosto y el Los resultados del anlisis qumico para la cachaa re-
contenido de alcohol tambin contribuyen a la selec- destilada se muestran en la Tabla 1. El pH de la cachaa
cin de levaduras que prevalecen en la produccin de difiri de forma significativa, nicamente en respuesta a
la cachaa (MORAIS et al., 1997; PATARO et al., 2000).
El alto nmero de bacterias al final de la preparacin
sera un punto negativo para el FN, pero el anlisis mi- Figura 1. Anlisis fisicoqumico (A) y microbiolgico (B) del
crobiolgico del mosto y el fermento dentro del tanque fermento natural durante un periodo de 10 das de preparacin.
de fermentacin, durante el primer ciclo fermentativo, En (B), se utiliz agar WLN, WLD y lisina para el recuento de
Bebidas Mexicanas | Junio 2013

mostr un recuento bacteriano mucho menor que el levaduras (totales, resistentes a la cicloheximida y levaduras
observado en el FN al final de la preparacin. Este he- no-Saccharomyces, respectivamente).
cho podra explicarse por el efecto de dilucin causado
por la introduccin del fermento en el tanque o por la 7 300

Acidez total (mg/100 mL de cido actico)


muerte bacteriana causada por la alta concentracin
6 250
de azcar. Adems, el FN no constituye una fuente pri-
maria de contaminacin bacteriana (Figura 1). pH, slidos solubles (Brix)
5
200
El anlisis microbiolgico del fermento despus de los 4
ciclos fermentativos, revel que se encontr un nmero 150
3
mayor de levaduras en el FC, pero para ambos fermentos
hubo una disminucin durante los ciclos. El nmero de le- 100

22 vaduras silvestres tendi a disminuir a lo largo de los ciclos


2

50
fermentativos con el FN, mientras que se verific un au- 1
mento o estabilizacin para el FC (Figura 2). La naturaleza
0 0
caracterstica de los fermentos podra explicar estos resul-
0 2 4 6 8 10
tados una vez que en el FC la poblacin de levaduras sea
exclusivamente S. cerevisiae, pero con el reciclaje de clu- Preparacin del fermento (das)
las y con el nuevo jugo de caa de azcar que se introdujo pH Slidos solubles Acidez total
en los tanques, el fermento se contamina con levaduras in- A.
dgenas. Con el FN, aunque estos hechos tambin haban
ocurrido, la poblacin de levaduras es ms estable debido
Nmero de microorganismos (UFC/mL)

a que hubo una adaptacin y seleccin previa durante su 1.0E+12

propagacin. Por lo tanto, el FN podra ser ms resistente 1.0E+10


a la contaminacin por levaduras silvestres. La acidez del
FN fue significativamente mayor y los slidos residuales 1.0E+08

(Brix) para ambos fermentos fueron muy bajos, como se


1.0E+06
esperaba (Figura 3).
1.0E+04

El mosto de FN present un nmero mayor de levaduras


1.0E+02
silvestres mientras que no hubo diferencia en el nme-
ro total de levaduras y bacterias, en comparacin con el 1.0E+00
0 2 4 6 8 10
mosto de FC (Figura 2). Los valores de pH fueron signi-
ficativamente menores en el mosto de FN, pero a pesar Preparacin del fermento (das)

de la alta acidez total en este inculo inicial, los valores WLN WLD Lisina Bacteria
disminuyeron significativamente para ambos fermentos B.
Figura 2. Registro del nmero de microorganismos aislados del fermento y del mosto durante los ciclos de fermentacin para la

Tecnologa
produccin de cachaa con fermento comercial (FC) y fermento natural (FN). Se utiliz agar WLN, WLD y lisina para el recuento de levaduras
(levaduras totales, resistentes a la cicloheximida y levaduras no-Saccharomyces, respectivamente). Las letras minsculas diferentes
sobre las barras indican diferencias significativas entre los ciclos de fermentacin, mientras que las letras maysculas diferentes indican
diferencias significativas entre los fermentos y mostos sin importar el ciclo de fermentacin (P<0.05 por la prueba de Tukey).

FERMENTO MOSTO
Registro del nmero de levaduras (WLN)

Registro del nmero de levaduras (WLN)


10 10

8 8

6 6

4 4

2 2

0 0

Bebidas Mexicanas | Junio 2013


1 FN 1 FN
2 2
3 FC 3 FC
Promedio Promedio
Ciclos de fermentacin Ciclos de fermentacin

10 10
Registro del nmero de levaduras

Registro del nmero de levaduras


8 8

6 6
(Agar Lisina)

(Agar Lisina)

4 4

2 2

0 0
1 2
3
Promedio FC
FN
1 2 3
Promedio FC
FN 23
Ciclos de fermentacin Ciclos de fermentacin

10 10
Registro del nmero de levaduras (WLD)

8 8
Registro del nmero de
levaduras (WLD)

6 6

4 4

2 2

0 0
1 2 FN FN
1 2
3 3 FC
Promedio FC Promedio
Ciclos de fermentacin Ciclos de fermentacin

10 10
Registro del nmero de bacterias

Registro del nmero de bacterias

8 8

6 6

4 4

2 2

0 0
1 2 FN 1 FN
3 FC 2 FC
3
Promedio Promedio
Ciclos de fermentacin Ciclos de fermentacin
Tecnologa

Figura 3. Anlisis fisicoqumico del fermento y el mosto durante los ciclos de fermentacin para la produccin de cachaa con
fermento comercial (FC) y natural (FN). Las letras minsculas diferentes sobre las barras indican diferencias significativas entre los
ciclos de fermentacin, mientras que las letras maysculas diferentes indican diferencias significativas entre los fermentos y mostos
sin importar el ciclo de fermentacin (P<0.05 por la prueba de Tukey).

FERMENTO MOSTO
6 6

5 5

4 4

3 3
pH

pH
Bebidas Mexicanas | Junio 2013

2 2

1 1

0 0
1 2 FN 1 2 FN
3 FC 3 FC
Promedio Promedio
Ciclos de fermentacin Ciclos de fermentacin

400 400
Acidez total (mg/100 mL de cido actico)
Acidez total (mg/100 mL de cido actico)

350 350

24
300 300

250 250

200 200

150 150

100 100

50 50
1 FN 1 FN
2 3 2
FC 3 FC
Promedio Promedio
Ciclos de fermentacin Ciclos de fermentacin

12
12

10
10
Slidos solubles (Brix)

Slidos solubles (Brix)

8
8

6
6

4
4

2
2
0
1 FN 0
2 3 FC 1 FN
Promedio 2
3 FC
Promedio
Ciclos de fermentacin Ciclos de fermentacin
Tecnologa
la maduracin, con una disminucin significativa en los de los lmites de las leyes brasileas (BRASIL, 2005). Ni
valores, como se haba observado antes (PARAZZI et al., el fermento ni la maduracin influenciaron la concen-
2008). No hubo variaciones significativas en los valores tracin de metanol, acetato de etilo y alcohol isoamlico
de cobre y no excedieron el lmite de 5 mg/L (CARDO- en la cachaa. Las concentraciones de n-propanol e iso-
SO et al., 2003), lo cual se debi a la redestilacin (los butanol y, consecuentemente, de alcoholes superiores,
valores disminuyeron de 6.5 a 0.4 mg/L). Se descubri mejoraron significativamente con la maduracin, pero
que la maduracin tiene un impacto significativo en la no difirieron en cuanto al fermento a excepcin de los
acidez total y fija, lo que causa que aumente tres veces la compuestos voltiles totales, cuya concentracin au-
acidez total. Despus de la maduracin, la acidez voltil ment significativamente en el cachaa producida con el
se increment con el FC, mientras que la acidez fija fue FN despus de la maduracin.
significativamente mayor con el FN. La influencia de la
composicin de las levaduras (fermento) en la calidad de Al parecer, la eleccin de un fermento natural o comer-
la cachaa fue evidente, pero dependi de la maduracin cial no impact considerablemente los parmetros de

Bebidas Mexicanas | Junio 2013


de la bebida en los barriles de roble. El contenido de alco- fermentacin ni, consecuentemente, la composicin
hol y el nivel de metanol de la bebida permaneci dentro fisicoqumica de la cachaa, aunque se encontraron

Tabla 1. Anlisis qumico de la cachaa producida con fermento comercial y natural.

Fermento comercial Fermento natural


Parmetro
Sin madurar Madura Sin madurar Madura

Acidez fija1 1.14a 6.76b 1.13a 9.39c

Acidez voltil1 3.29a 4.89b 3.27a 3.63ab


25
Acidez total1 4.43a 11.65b 4.40a 13.02b

pH 6.44b 4.70a 6.92b 4.27a

Alcohol (GL) 42.0a 40.2b 42.0a 40.5ab

Cobre2 0.39a 0.31a 0.44a 0.37a

Acetaldehdo2 6.42ab 10.02b 5.62a 8.85ab

Metanol2 9.31a 10.70a 8.50a 10.23a

Acetato de etilo2 8.35a 10.63a 6.34a 8.84a

n-propanol2 40.58a 50.99b 37.64a 49.35b

Isobutanol2 45.50a 50.52b 36.26a 48.92b

Alcohol isoamlico2 131.01a 145.60a 120.83a 134.68a

Alcoholes superiores2 217.08a 247.11b 194.73a 232.95b

Compuestos voltiles totales2 235.13ab 272.65b 209.97a 254.27b

Letras diferentes en las filas indican diferencia significativa (P<0.05 por la prueba de Tukey). Resultados expresados en 1mg/100 mL de cido actico o 2mg/100
mL de alcohol anhidro.
Tecnologa

ms levaduras silvestres cuando se utiliz el fermento han demostrado que las cachaas producidas por cepas
natural. Se descubri que las principales alteraciones en iniciadoras de S. cerevisiae, aisladas como cultivos ind-
la composicin de cachaa estaban relacionadas exclu- genas a partir de fermentaciones naturales y destileras,
sivamente con el periodo de maduracin en los barriles recibieron mejores evaluaciones sensoriales (SILVA et al.,
de roble. Sin embargo, considerando que la cachaa es 2009a,b).
una bebida y, por esta razn, las caractersticas senso-
riales tambin son relevantes, es crucial la evaluacin de Un aspecto importante a considerar en este estudio, es
hasta qu punto la utilizacin del fermento natural altera el volumen de los barriles y el tiempo de aejamiento. El
estas caractersticas. tiempo ideal para el almacenamiento de la cachaa vara
de acuerdo con las caractersticas del barril (tipo de ma-
Hubo una prdida significativa de aroma, sabor e impre- dera, edad y tamao) y con las condiciones ambientales
sin general despus de la maduracin, pero nicamente de almacenamiento (temperatura y humedad). Las reduc-
en la cachaa producida con el FC. Tal vez un estudio ex- ciones volumtricas pueden ocurrir durante el proceso
Bebidas Mexicanas | Junio 2013

tensivo de los compuestos (diferentes a los establecidos de maduracin y entre ms grande sea el barril, menor
por la legislacin brasilea) producidos por los microor- ser la prdida por evaporacin. Tambin se asume que
ganismos, podra ayudar a corroborar este resultado, ya entre ms corto es el barril, mejor ser la extraccin de
que el aejamiento (maduracin) comnmente ocasiona las sustancias de la madera, debido a que el contacto
un aumento en la calidad sensorial de las bebidas. Para entre la bebida y la madera es ms cercano (mayor su-
el color, hubo un efecto pronunciado (y negativo) de la perficie especfica). Para evadir la reduccin excesiva de
maduracin sin importar el fermento, lo cual puede ex- volumen en los barriles de 5 L, se consider un periodo
plicarse probablemente por el hecho de que la cachaa de 45 das para el aejamiento, mejor conocido como ma-
toma color (amarronado) debido a la interaccin con la duracin. BORRAGINI (2009) mostr un aumento en los
madera del barril, lo cual puede impresionar a los jueces compuestos secundarios y la acidez, con un mayor tiem-
acostumbrados a probar cachaa sin color (sin madurar) po de maduracin; sin embargo, la calidad sensorial de la
(Tabla 2). Los resultados revelaron una fuerte interaccin cachaa no difiri sustancialmente a los 30 o 60 das de
26 entre el fermento y el aejamiento (maduracin) de la be- aejamiento en los barriles de 5 L, en comparacin con
bida, sugiriendo que algunas sustancias desconocidas periodos ms largos de hasta 180 das para la mayora de
producidas por los microorganismos de diferentes in- los atributos.
culos durante la fermentacin, reaccionaron de manera
diferente con los componentes de la madera de los barri- Una investigacin profunda sobre la composicin qumica
les, influenciando los atributos sensoriales. Los estudios de la cachaa, adems de los parmetros considerados en

Tabla 2. Promedios y rangos de aceptabilidad sensorial para la cachaa madura y sin madurar, producida con fermento natural y comercial.

Fermento comercial Fermento natural


Atributo
Sin madurar Madura Sin madurar Madura

Color 5.66 818.02a 5.16 653.77b 5.62 807.80a 5.29 698.41b

Aroma 5.36 798.74a 4.91 669.71b 5.36 766.34a 5.29 743.20ab

Sabor 4.62 802.45a 4.06 662.89b 4.53 786.49a 4.31 726.17ab

Cuerpo 4.77 763.31a 4.47 692.67a 4.76 762.95a 4.72 759.07a

Impresin general 4.82 783.99a 4.31 652.31b 4.77 780.50a 4.69 761.21a

Letras diferentes en las filas para los rangos, indican diferencias significativas (P<0.05 por la prueba no-paramtrica de Kruskall-Wallis); n = 62 jueces
(1 = "muy desagradable" a 7 = "muy agradable").
Tecnologa
Bebidas Mexicanas | Junio 2013
la legislacin, podra confirmar la razn por la que la madu- REFERENCIAS
racin de la cachaa puede dar como resultado un producto
diferente dependiendo del tipo de inculo, ya que debido a AMORIM, H.V. et al. Mtodo rpido para controle da 27
la diversidad de microorganismos se debieron producir mu- fermentao e destilao. Saccharum/ STAB, v.2,
chos compuestos desconocidos, especialmente al utilizar n.4, p.31- 34, 1979.
FN. Aunque la falta de control y homogeneidad en la prepa- AOAC. Association of Official Analytical Chemists.
racin puede impactar negativamente el fermento natural, Official methods of analysis. 16. ed. Arlington, 1995.
no se debera ignorar los resultados de ste y otros estudios. V.1, p.31-65.
Se requieren estrategias tecnolgicas para apoyar y calificar BORRAGINI, M.C.C.B. Envelhecimento da cachaa
a los productores de cachaa en caso de que se estimule com circulao forada e aerao. 2009. 90f. Dis-
y extienda esta importante agroindustria, asegurando la sertao (Mestrado em Cincia dos Alimentos) -
competitividad y supervivencia de los pequeos producto- Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universida-
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El tipo de fermento (natural o comercial) no influenci ho). Regulamento tcnico para fixao dos padres
significativamente la composicin fisicoqumica de la ca- de identidade e qualidade para aguardente de cana
chaa, la cual se vio alterada notablemente por el periodo e para cachaa. Dirio Oficial da Unio, Seo 1.
de maduracin en los contenedores de roble. Sin embar- 2005. 7p.
go, se comprob la prdida de aceptabilidad de la bebida CARDOSO, D.R. et al. Influncia do material do
madurada producida con fermento comercial, lo cual no destilador na composio qumica das aguar-
ocurri con la cachaa de la fermentacin espontnea del dentes de cana. Parte II. Quimica Nova, v.26, n.2,
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OLIVEIRA, E.S. et al. The influence of different
yeast fermentation, composition and sensory
Tecnologa
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30
Iniciador mltiple de la
viticultura orgnica para la
produccin de vino tinto
Montepulciano dAbruzzo
Multi starter from organic viticulture for red
wine Montepulciano dAbruzzo production
Giovanna Suzzi 1*, Maria Schirone 1, Manuel Sergi 1,
Rosa Maria Marianella 2, Giuseppe Fasoli 1, 1
Departamento de Ciencias de los Alimentos, Universidad de
Irene Aguzzi 1 y Rosanna Tofalo 1 Teramo, Teramo, Italia.
2
Direccin General para la Prevencin y Represin del Fraude,
Ministerio de las Polticas Agrcolas, Alimentarias y Forestales,
Roma, Italia.
*Giovanna Suzzi, Departamento de Ciencias de los Alimentos,
Universidad de Teramo, 64023 Mosciano SantAngelo, Teramo,
Italia. E-mail: gsuzzi@unite.it
Tecnologa
RESUMEN The course of fermentation has been controlled through
classical determinations (CO2 evolution, ethanol, glycerol,
En los ltimos aos, se ha propuesto el uso de un proceso pH, total titratable acidity, sugar content, free sulfur
de fermentacin con iniciador mltiple para mejorar las dioxide (SO2), dry extract, sugars, organic acids, and
caractersticas organolpticas de los vinos. En el presente volatile compounds). Moreover, the yeast population was
estudio se investigaron los rendimientos de fermentacin determined by both culture-dependent and independent
y las interacciones de cultivos mixtos y secuenciales de approaches. In particular, the pure culture of H. uvarum
Hanseniaspora uvarum, Candida zemplinina y una cepa and C. zemplinina did not end the fermentation. On the
de Saccharomyces cerevisiae aisladas de mostos org- contrary, when S. cerevisiae was added, fermentations
nicos. Para evaluar los desempeos enolgicos de las were faster confirming that yeast interactions influence
cepas probadas, se compararon microvinificaciones en the fermentation kinetics. Moreover, C. zemplinina
jugo de uva roja pasteurizado del cultivar Montepulciano showed a good interaction with S. cerevisiae by increasing
dAbruzzo. El curso de la fermentacin se control a tra- the fermentation kinetic in high gravity Montepulciano

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vs de determinaciones clsicas (evolucin de CO2, eta- must, with low ethyl acetate and acetic acid production.
nol, glicerol, pH, acidez titulable total, contenido de az- This study confirmed that non-Saccharomyces yeasts
car, dixido de azufre libre (SO2), extracto seco, azcares, play a crucial role also in organic wines and their activity
cidos orgnicos y compuestos voltiles). Adems, se could be modulated through the selection of appropriate
determin la poblacin de levaduras por enfoques tanto strains that correctly interact with S. cerevisiae.
dependientes como independientes del cultivo. En parti-
cular, los cultivos puros de H. uvarum y C. zemplinina no
finalizaron la fermentacin. Por el contrario, cuando se
agreg S. cerevisiae las fermentaciones fueron ms r-
pidas, confirmando que la interaccin de las levaduras
influencia la cintica de fermentacin. Adems, C. zem-
plinina mostr una buena interaccin con S. cerevisiae al
aumentar la cintica de fermentacin en el mosto Mon- 31
tepulciano de alta gravedad, con baja produccin de ace-
tato de etilo y cido actico. Este estudio confirm que
las levaduras que no son Saccharomyces tambin tienen
un papel importante en los vinos orgnicos y su actividad
podra modularse mediante la seleccin de cepas apro-
piadas que interacten correctamente con S. cerevisiae.

Palabras clave: Fermentacin mixta; iniciador mltiple;


levadura no-Saccharomyces para vino; perfil metablico.

ABSTRACT

In the last years the use of a multistarter fermentation


process has been proposed to improve the organoleptic
characteristics of wines. In the present study the
fermentation performances and the interactions of
mixed and sequential cultures of Hanseniaspora uvarum,
Candida zemplinina, and a strain of Saccharomyces
cerevisiae isolated from organic musts were investigated.
To evaluate the oenological performances of the tested
strains microvinifications in pasteurized red grape juice
from Montepulciano dAbruzzo cultivar were compared.
Tecnologa

Key words: Metabolic profile; mixed fermentation; Saccharomyces cerevisiae, 106- 108 clulas/mL (Flee et
multistarter; non-Saccharomyces wine yeast. al., 1984; Gafner y Schultz, 1996). De hecho, como han
sugerido diferentes autores (Zironi et al., 1993; Gil et al.,
1996; Lema et al., 1996; Toro y Vazquez, 2002; Ciani et
INTRODUCCIN al., 2006; Viana et al., 2008), hay cada vez ms evidencia
de que las levaduras NS juegan un papel importante en
En la ltima dcada, el fenmeno de los productos or- la calidad del vino. Fleet (2008) discuti las posibilidades
gnicos se ha apoderado de grandes segmentos de de utilizar levaduras diferentes a las del gnero Saccha-
consumidores. En su nivel ms bsico, el vino orgnico romyces para futuras fermentaciones de vino, adems de
est hecho de uvas que han sido cultivadas con el menor la viabilidad comercial de cultivos mixtos, ya que las es-
impacto humano posible. El vino orgnico es un vino ob- pecies NS tienen un gran potencial de introducir caracte-
tenido de uvas cultivadas orgnicamente, es decir, sin la rsticas atractivas al vino, que pueden mejorar su calidad
ayuda o necesidad de fertilizantes sintticos, tratamien- organolptica. Consecuentemente, no se puede ignorar
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tos sintticos para plantas o herbicidas (Trioli y Hofmann, el impacto de las levaduras NS sobre la fermentacin del
2009). Se han realizado estudios precisos sobre el ma- vino. Las principales levaduras NS presentes durante la
nejo de suelo y de los viedos en la fabricacin de vino
orgnico, mientras que, hasta donde se sabe, no existen
o existen pocos datos disponibles sobre las poblaciones
microbianas de las uvas de viedos orgnicos as como
de los vinos orgnicos. En un estudio anterior (Tofa-
lo et al., 2011) se evaluaron las poblaciones de le-
vaduras presentes en las uvas y en el mosto de
viedos orgnicos de los cultivares de vino tin-
to Montepulciano dAbruzzo y vino blanco
Trebbiano. En particular, a nivel especie se
32 identificaron levaduras del vino que no
eran Saccharomyces (NS). Adems,
las cepas se tipificaron y caracte-
rizaron para algunos parmetros
enolgicos. En aos recientes,
muchos estudios evaluaron las
especies NS presentes en el
ecosistema de los vinos y de-
mostraron el impacto de las
condiciones de las uvas en
las poblaciones NS (Fer-
nndez et al., 2000; Ras-
por et al., 2006; Gonzlez
et al., 2007). El papel de
las levaduras no Sac-
charomyces en la pro-
duccin del vino, ha sido
extensamente debatido y
varios investigadores han
demostrado que las leva-
duras NS sobreviven durante
la fermentacin y podran al-
canzar concentraciones celula-
res similares a las alcanzadas por
Tecnologa
fermentacin del mosto orgnico de los
cultivares Trebbiano y Montepulciano,
fueron Hanseniaspora uvarum, Metsch-
nikowia fructicola y Candida zemplinina,
representando el 43%, 31% y 11%, respectiva-
mente del total de la poblacin aislada de
NS. Aunque el tamao de la poblacin de
estas especias se redujo mediante las fer-
mentaciones del vino, no se reprimi com-
pletamente su crecimiento y las levaduras
NS an estaban presentes al final del pro-
ceso de fermentacin (Tofalo et al., 2011).
Estas levaduras de vino orgnico compar-

Bebidas Mexicanas | Junio 2013


tan muchas caractersticas, lo que sugiere
que la fuerte presin de seleccin ejercida
por el sistema de cultivo y la variedad del
vino, pudo generar variabilidad a diferentes
niveles. El conocimiento sobre la biodiver-
sidad de levaduras nativas es esencial para
la conservacin y explotacin del potencial
enolgico de las regiones de cultivo de uva
para vino. Hace varios aos, se propuso el
uso de un iniciador mltiple seleccionado
(cultivos mixtos controlados). A mediados
del siglo pasado, para reducir el contenido
de cido actico del vino, Cantarelli (1955) y 33
Castelli (1969) fomentaron el uso secuen-
cial de Torulaspora delbrueckii (previamen-
te conocida como Saccharomyces rosei)
y S. cerevisiae. Ms adelante, los cultivos
mixtos se propusieron tambin para otros
objetivos como la desacidificacin biol-
gica del mosto o el aumento del conteni-
do de glicerol, pero uno de los usos ms
investigados de los cultivos mixtos se re-
laciona con otorgar mayor complejidad al
vino, mejorando as su perfil organolptico
(Ciani et al., 2010). Se han realizado dife-
rentes estudios sobre las fermentaciones
mixtas que contienen levaduras del vino
tales como S. cerevisiae y NS, para evaluar
la posibilidad de utilizar cultivos controla-
dos de iniciador mltiple y as mejorar la
calidad del vino (Mora et al., 1990; Zironi et
al., 1993; Toro y Vazquez, 2002; Ciani et al.,
2006; Andorr et al., 2010). Con este pro-
psito, se utilizaron diferentes especies
NS para estudiar la fermentacin mixta:
Hanseniaspora guilliermondii, H. uvarum,
Tecnologa

Candida pulcherrima (Metschnikowia), Pichia kluyve- MATERIALES Y MTODOS


ri, Pichia fermentans, Candida cantarellii, T. delbrueckii,
Kluyveromyces thermotolerans, Candida stellata (recien- Cepas de levaduras
temente reclasificada como Starmerella bombicola). Las Las cepas no Saccharomyces (C. zemplinina STS12 y H.
levaduras presentes en las uvas y el mosto de viedos uvarum STS45) fueron aisladas en un estudio previo a
orgnicos podran tener una composicin nica y estas partir de fermentacin espontnea de uvas orgnicas de
levaduras indgenas imparten distintas caractersticas los cultivares Montepulciano dAbruzzo y Trebbiano (To-
regionales y deseadas a los vinos. En este contexto, po- falo et al., 2011). Todas las cepas se analizaron previamen-
dran elegirse las cepas NS autctonas para co-fermentar te por secuenciacin de la regin D1/D2 de aproximada-
mostos orgnicos junto con S. cerevisiae. mente 600 pb de la subunidad ribosomal 26S, utilizando
los primers NL1 y NL4. Estas cepas naturales de vino
El objetivo de esta investigacin es evaluar el rendimiento pertenecen a la coleccin de cultivos del Departamento
de fermentacin y las interacciones de los cultivos mixtos de Ciencias de la Alimentacin (Universidad de Teramo,
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y secuenciales de H. uvarum, C. zemplinina y una cepa de Italia). Tambin se utiliz un cultivo iniciador autctono de
S. cerevisiae aisladas de mosto orgnico. Los resultados S. cerevisiae (STS1) (Tofalo et al., 2011). Las cepas se man-
de la cintica de fermentacin, formacin de compuestos tuvieron a -80 C en glicerol al 20% (v/v) y, en paralelo, en
secundarios y anlisis sensorial, podran ser tiles para agar inclinado bajo una capa de aceite de parafina a 4 C.
formular cultivos iniciadores mixtos.
Microvinificaciones
Para evaluar los rendimientos enolgicos, se analizaron las
cepas en pruebas experimentales de microvinificacin
utilizando mosto pasteurizado sin la piel de las uvas del
cultivar Montepulciano dAbruzzo (280 g/L de azca-
res fermentables, 7.4 g/L de acidez titulable (AT) y pH
de 3.2). Las fermentaciones se realizaron utilizando
34 diferentes combinaciones de la cepa S. cerevisiae
STS1 con las cepas C. zemplinina STS12 y H. uvarum
STS45. Se inocularon los mostos con 106 clulas/mL
de la siguiente manera: S. cerevisiae (S), C. zemplinina
(C), H. uvarum (H), C. zemplinina/S. cerevisiae (CS), H.
uvarum/S. cerevisiae (HS), C. zemplinina/H. uvarum/S.
cerevisiae (CHS) y C. zemplinina/H. uvarum/S. cerevi-
siae (RCHS) en proporciones de 25:25:50. Se inocul
una fermentacin secuencial (QS) con 106 clulas/mL
de C. zemplinina/H. uvarum y despus de 48 horas, se
agreg S. cerevisiae para cada cepa.

Las muestras de mosto (95 mL) se inocularon con 5 mL


de un pre-cultivo madurado durante 48 horas en el mis-
mo mosto, como describieron Tofalo et al. (2011). Las fer-
mentaciones se llevaron a cabo por duplicado para cada
cepa a temperatura controlada de 25 C. La cintica de
las fermentaciones se monitore diariamente por deter-
minaciones gravimtricas, evaluando la prdida de peso
debido a la produccin de CO2. Cuando la evolucin de
CO2 se detuvo (es decir, en peso constante), las mues-
tras se refrigeraron durante 2 das a 4 C, se colocaron en
estantes y se almacenaron a -20 C hasta su anlisis. El
mosto sin inocular se utiliz como control negativo.
Tecnologa
Determinacin de crecimiento
microbiano y enumeracin diferencial
A partir de cada frasco, se tomaron las muestras a lo largo
del proceso de fermentacin para evaluar los recuentos de
clulas viables de las especies inoculadas. Se colocaron
alcuotas de cien microlitros de diluciones seriales de cada
muestra en agar lisina (medio LA, Oxoid Unipath, Hamp-
shire, Reino Unido) y medio de agar nutritivo Wallerstein
Laboratory (medio WLN, Oxoid; Pallmann et al., 2001),
para calcular las levaduras NS y la poblacin total de le-
vaduras, respectivamente. Adems, se utiliz un enfoque
independiente del cultivo. Se realizaron pruebas de PCR
cuantitativa especfica (qPCR) en S. cerevisiae, H. uvarum

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y C. zemplinina, de acuerdo con Hierro et al. (2007) y Zott
et al. (2010), respectivamente. Se extrajo ADN utilizando el
kit de aislamiento de ADN PowerSoil (Mobio Laborato-
ries, Inc.), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las amplificaciones en tiempo real se realizaron en un


volumen de reaccin de 25 L, utilizando 1 x 2XIQ SYBR
Green PCR Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, Estados
Unidos), 0.2 M de cada primer y 5 L de suspensin de
ADN. Todas las amplificaciones se realizaron en placas
pticas de 96 pocillos en un sistema Cycle IQ (Bio-Rad).
El ciclo umbral (Ct) de la qPCR fue determinado autom-
ticamente por el instrumento. Se prepararon muestras 35
con cantidades conocidas de clulas de levaduras para
generar las curvas estndar. El jugo de uva esterilizado se
inocul con las cepas de levaduras y se coloc en placas siguiendo los mtodos de anlisis oficiales de la Organi-
con medio WLN para los recuentos de microorganismos zacin Internacional de la Vid y el Vino (2011). Se deter-
viables. Las muestras contadas se extrajeron inmediata- minaron las concentraciones de cido orgnico, glucosa
mente (por triplicado), como se describi anteriormente. y fructosa de acuerdo con Tofalo et al. (2011) y Lopez-Ta-
El ADN obtenido se utiliz para preparar diluciones en se- mames et al. (1996), respectivamente. La produccin de
rie, de 108 a 10 clulas/mL. El coeficiente de correlacin aminas biognicas se determin de acuerdo con Tofalo
entre Ct y los valores del recuento se analiz e interpret et al. (2007). Todos los anlisis se realizaron por triplicado.
utilizando la funcin adecuada en Microsoft Excel. Cada
Ct fue el promedio de cuatro medidas obtenidas al ampli- Anlisis de compuestos voltiles por
ficar cuatro extractos de ADN a partir de la misma mues- microextraccin en fase slida-cromatografa
tra inoculada artificialmente. En todas las series de PCR, de gases
los controles negativos (agua esterilizada), los controles Se colocaron 5 mL de muestras de vino en viales de vidrio
positivos y las muestras se realizaron por triplicado. La de 10 mL con 1 g de NaCl y se agregaron 10 L de 4-metil-
sensibilidad de las pruebas de qPCR se evalu en refe- 2-pentanol (concentracin final, 4 mg/L) como estndar
rencia a otros informes (Hierro et al., 2006). interno. Tanto la fase de equilibrio como de adsorcin se
realizaron por agitacin durante 30 min a 40 C. Se utiliz
Determinaciones fisicoqumicas una fibra recubierta de carboxeno y polidimetilsiloxano (85
Los productos principales (etanol, glicerol, pH, AT, con- m) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos). Bajo
tenido de azcar, dixido de azufre libre (SO2) y extracto las condiciones de extraccin descritas anteriormente, la
seco del vino) y el mosto en fermentacin se determina- recuperacin de los compuestos voltiles fue entre 88.9%
ron en las muestras tomadas al final de la fermentacin, y 103.5%. Para la determinacin cuantitativa, se utiliz un
Tecnologa

cromatgrafo capilar de gases CP 380 equipado con un in- RESULTADOS


yector automtico 8200 y sistema SPME III (Varian, Italia).
La columna capilar de slice fundido fue una CP-Wax 52 CB Curso de la fermentacin y desarrollo
(50 m x 0.32 mm) de Crompack (Holanda), recubierta con de levaduras durante la fermentacin
polietilenglicol (1.2 m de grosor de la pelcula), como fase El curso de las tasas de fermentacin con cultivos pu-
estacionaria. La temperatura del inyector y del detector de ros, mixtos y secuenciales, se presenta en la Figura 1. El
ionizacin de flama fue 250 C. Despus de la extraccin, cultivo puro de H. uvarum fue incapaz de terminar la fer-
la fibra se coloc en el inyector del cromatgrafo de ga- mentacin de acuerdo con la baja capacidad fermenta-
ses durante 15 minutos. El programa de temperatura fue el tiva de esta especie, pero tampoco el cultivo puro de C.
siguiente: temperatura inicial (50 C) mantenida por 2 mi- zemplinina finaliz la fermentacin. Las interacciones de
nutos; primer incremento, 1 C por minuto hasta 65 C (se las levaduras tuvieron un claro impacto en la cintica de
mantuvo durante 10 minutos); segundo incremento, 10 C la fermentacin y la presencia de S. cerevisiae provoc
por minuto hasta 150 C (se mantuvo durante 10 minutos); fermentaciones ms rpidas.
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tercer incremento, 10 C por minuto hasta 200 C (se man-


tuvo durante 1 minuto). La tasa de flujo del gas portador De hecho, la cintica de fermentacin de los cultivos mix-
(N2) fue 2.5 mL/min. Se identificaron los compuestos res- tos, HS, CHS, RCHS fue comparable a la del cultivo puro
ponsables de impartir aroma al vino, al comparar el tiempo de S. cerevisiae. nicamente la prueba CS mostr un gran
de retencin de los estndares y se confirm su identifi- mejoramiento de la cintica de fermentacin durante los
cacin utilizando cromatografa de gases-espectrometra primeros 15 das de fermentacin, lo cual destac la ade-
de masas (GC-MS). El anlisis de GC-MS se llev a cabo cuada asociacin entre C. zemplinina y S. cerevisiae. La
utilizando un espectrmetro de masas y cromatografa de prueba RCHS, caracterizada por el inculo de C. zemplini-
gases Finnigan Trace DSQ Quadrupole (Thermo Finnigan, na y H. uvarum junto con S. cerevisiae, mostr una cintica
San Jose, CA, Estados Unidos). Las condiciones del es- de fermentacin peor que la prueba CS, probablemente
pectrmetro de masas fueron: Fuente de iones: ionizacin por la menor proporcin de clulas de las dos levaduras
por electrones (EI); Polaridad de iones: POS; Temperatura NS con respecto a S. cerevisiae. La prueba secuencial QS
36 de la fuente de iones: 250 C; Lnea de transferencia del
espectrmetro de masas: 220 C; Bomba turbomolecular:
70 L/s; Adquisicin: barrido completo; Rango de masa: 30- Figura 1. Cintica de la fermentacin de mostos Montepulciano
400 m/z; Gas portador: Helio. Los datos se procesaron uti- dAbruzzo mediante cultivos iniciadores puros, mixtos y
lizando el software Xcalibur Data System 1.4.1 SP3 (Thermo secuenciales. C, C. zemplinina; S, S. cerevisiae; H, H. uvarum; CS,
Finnigan, San Jose, CA, Estados Unidos). El anlisis cuan- C. zemplinina/S. cerevisiae; HS, H. uvarum/S. cerevisiae; CHS,
titativo de los compuestos de aroma del vino se realiz con C. zemplinina/H. uvarum/S. cerevisiae; RCHS, C. zemplinina/H.
uvarum/S. cerevisiae; QS, Fermentacin secuencial.
base en el rea relativa del pico (Qi) calculada a partir de los
cromatogramas headspace SPME (HS/SPME) despus de
18
la adicin de cantidades conocidas de los estndares ana-
16
lticos, as como del estndar interno de acuerdo con De
la Calle-Garcia et al. (1998). Los anlisis qumicos se reali- 14

zaron en el mismo periodo del anlisis sensorial. Cada de- 12

terminacin se realiz por duplicado. Los datos presenta- 10


g CO2/100 mL

dos son los promedios de tres determinaciones. Todos los 8


reactivos se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,
6
Estados Unidos) con una pureza mayor a 99%.
4

Anlisis estadstico 2

Se calcul el promedio y la desviacin estndar para cada 0


1 2 5 6 7 8 9 13 14 15 16 19 20 21 22 23
parmetro experimental. El anlisis de componentes prin-
cipales (PCA) se realiz utilizando el software estadstico
C S H CS HS CHS RCHS QS
STATISTICA para Windows (STAT, versin 8.0, StatSoft
Inc., Tulsa, OK, Estados Unidos). Tiempo (das)
Tecnologa
present una disminucin dramtica de la tasa de fermen- Los recuentos viables de las poblaciones de leva-
tacin probablemente porque S. cerevisiae se inocul 48 duras de las ocho pruebas se reportan en la Tabla 1.
horas despus del inculo de C. zemplinina y H. uvarum. Las poblaciones de levaduras de cultivos puros de

Tabla 1. Recuento de levaduras (log UFC/mL) y cuantificacin por qPCR (entre parntesis)* en la fermentacin pura, mixta y
secuencial de mostos orgnicos Montepulciano d'Abruzzo.

Cepas
Prueba Tiempo (das)
S. cerevisiae C. zemplinina H. uvarum

0 6.79 0.05
2 7.09 0.04
C
14 7.36 0.04

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24 5.64 0.06
0 6.88 0.03
2 7.21 0.03
S
14 7.27 0.01
24 7.15 0.04
0 6.68 0.02
2 6.87 0.03
H
14 5.32 0.03
24 nd
0 6.82 0.04 6.85 0.02

CS
2 6.50 0.02 6.08 0.11 37
14 6.74 0.07 nd
24 7.11 0.04 nd
0 6.89 0.04 6.68 0.02
2 6.67 0.02 5.32 0.03
HS
14 7.08 0.02 nd
24 6.78 0.014 nd
0 6.88 0.03 (6.98 0.03) 6.81 0.02 (6.34 0.03) 6.67 0.01 (6.45 0.04)
2 6.87 0.03 (7.24 0.01) 6.69 0.03 (6.45 0.09) 6.29 0.02 (6.39 0.01)
CHS
14 7.09 0.04 (7.48 0.04) nd (4.03 0.03) nd (5.28 0.01)
24 6.72 0.03 (7.48 0.01) nd (3.76 0.01) nd (4.83 0.02)
0 6.88 0.03 (6.98 0.04) 3.84 0.01 (3.36 0.05) 3.68 0.01 (3.50 0.11)
2 7.08 0.02 (7.24 0.01) 5.06 0.08 (5.01 0.01) nd (3.58 0.03)
RCHS
14 7.44 0.02 (7.48 0.04) 5.04 0.04 (5.09 0.04) nd (5.60 0.07)
24 7.46 0.04 (7.48 0.01) nd (4.91 0.02) nd (5.40 0.09)
0 - 6.85 0.02 (6.45 0.02) 6.68 0.02 (6.34 0.03)
2 6.9 0.01 (6.98 0.01) 7.16 0.03 (7.24 0.01) 7.19 0.01 (7.35 0.02)
QS
14 6.14 0.04 (6.15 0.02) 6.89 0.01 (6.90 0.04) nd (4.43 0.01)
24 5.92 0.04 (7.16 0.01) 6.08 0.02 (6.29 0.01) nd (4.05 0.1)

C, C. zemplinina; S, S. cerevisiae; H, H. uvarum; CS, C. zemplinina/S. cerevisiae; HS, H. uvarum/S. cerevisiae; CHS, C. zemplinina/H. uvarum/S. cerevisiae;
RCHS, C. zemplinina/H. uvarum/S. cerevisiae; QS, Fermentacin secuencial. *Datos expresados como promedio DE; nd: no inoculado.
Tecnologa

S. cerevisiae y C. zemplinina fueron similares, alcanzan- UFC/mL y S. cerevisiae alcanz la poblacin mxima de
do una poblacin mxima de aproximadamente 107 UFC/ aproximadamente 107 UFC/mL en el da 14. En general,
mL despus de 48 horas. En el caso del cultivo puro de S. cerevisiae alcanz rpidamente la poblacin mxima
H. uvarum, la poblacin mxima (aproximadamente 106 y se mantuvo estable durante las vinificaciones, con ex-
UFC/mL) se alcanz despus de 48 horas, pero comen- cepcin de la fermentacin secuencial QS, durante la
zando el da 14 disminuy a 105 UFC/mL y ya no fue con- cual S. cerevisiae no logr aumentar despus de 48 ho-
table en el da 24. En cuanto a las fermentaciones mixtas ras de crecimiento de la levadura de vino NS. De hecho,
HS y CS, no se encontraron levaduras NS en el da 14, el nmero de clulas viables de S. cerevisiae disminuy
mientras que S. cerevisiae retras que se alcanzara la hasta 105 UFC/mL al da 24. En cambio, H. uvarum, y C.
poblacin mxima. Con relacin a las clulas viables de zemplinina alcanzaron la poblacin mxima de 107 UFC/
las tres especies durante la fermentacin mixta de CHS mL despus de 48 horas, pero durante el progreso de la
y RCHS, se observaron diferencias nicamente en esta fermentacin, la primera dusminuy hasta que no fue
ltima. De hecho, H. uvarum desapareci despus de las contable, mientras que C. zemplinina disminuy hasta
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48 horas, mientras que C. zemplinina aument hasta 105 106 UFC/mL.

Tabla 2. Perfil qumico de los vinos obtenidos con cultivos iniciadores puros, mixtos y secuenciales.

Vinos
Parmetros
C S H CS HS CHS RCHS QS
pH 3.14 0.02 a
3.06 0.01 bc
3.26 0.01 d
3.19 0.01 a
3.05 0.06 bc
3.03 0.01 c
3.08 0.01 b
3.08 0.01b

Etanol
8.96 0.02b 9.43 0.03e 5.64 0.02c 9.38 0.01f 9.14 0.03g 8.93 0.02b 8.78 0.01d 8.35 0.01a
(% v/v)

Azcares
residuales 41.83 0.04d 21.67 0.03b 76.82 0.02h 24.57 0.03a 23.15 0.01c 43.95 0.04f 42.55 0.01g 48.25 0.05e

38 (g/L)
Acidez
titulable total
5.55 0.04d 5.33 0.02a 5.47 0.02b 5.82 0.01f 5.15 0.04c 5.65 0.04g 5.44 0.01b 6.05 0.05e
(g/L de cido
tartrico)
Acidez
voltil
0.78 0.04b 0.67 0.01a 1.23 0.03g 0.84 0.01bc 0.86 0.05c 0.84 0.01bc 0.98 0.01d 0.72 0.01a
(g/L de cido
actico)
Glicerol (g/L) 10.20 0.01e 5.24 0.05b 10.33 0.03h 9.26 0.04f 8.14 0.05a 7.88 0.03c 8.25 0.05d 8.92 0.01g
Extracto
89.34 0.04b 87.76 0.03f 83.37 0.02d 89.29 0.00b 91.97 0.01e 78.72 0.01c 83.28 0.01a 84.64 0.04g
seco (g/L)

SO2 libre
6.10 0.03d 4.09 0.01b 3.23 0.04c 4.05 0.06b 4.05 0.05b 3.87 0.04a 6.44 0.06g 3.23 0.04c
(mg/L)

cido
0.42 0.01bc 0.47 0.01a 0.44 0.01cd 0.40 0.02b 0.48 0.02a 0.45 0.01ad 0.39 0.01b 0.41 0.01bc
mlico (g/L)

cido
tartrico 5.85 0.03g 5.53 0.04a 5.26 0.03b 5.71 0.03d 6.55 0.02f 5.34 0.05bc 5.34 0.01c 5.48 0.04a
(g/L)

cido ctrico
0.15 0.01b 0.16 0.01b 0.15 0.01b 0.15 0.01b 0.16 0.01b 0.15 0.02b 0.16 0.01b 0.14 0.01b
(g/L)

cido
0.62 0.01b 0.66 0.03b 0.66 0.03b 0.73 0.01c 0.54 0.01d 0.84 0.02g 0.74 0.02ba 0.78 0.01a
actico (g/L)

C, C. zemplinina; S, S. cerevisiae; H, H. uvarum; CS, C. zemplinina/S. cerevisiae; HS, H. uvarum/S. cerevisiae; CHS, C. zemplinina/H. uvarum/S. cerevisiae;
RCHS, C. zemplinina/H. uvarum/S. cerevisiae; QS, Fermentacin secuencial. *Datos expresados como promedio DE. a-hLetras diferentes en la misma fila
corresponden a diferencias estadsticamente significativas (P<0.05).
Tecnologa
Cuantificacin de la poblacin del cultivo mltiple no finalizaron las fermentaciones, la primera dej glu-
mediante qPCR durante la fermentacin cosa y fructosa en el medio de cultivo, y la segunda dej
Ya que las tcnicas dependientes de los cultivos pueden nicamente glucosa en el medio. Tambin, la prueba QS
subestimar el tamao y la diversidad de cierta poblacin tuvo 50 g/L de glucosa residual, tal como se espera-
debido a que no consideran las poblaciones no-cultiva- ba en el anlisis de cintica de fermentacin. La mayor
bles, los datos sobre las poblaciones de S. cerevisiae y concentracin de etanol se determin en el cultivo puro
NS obtenidos en las placas durante la fermentacin de S. cerevisiae. Todas las fermentaciones de iniciador
mixta, se compararon con aqullos obtenidos por qPCR, mltiple alcanzaron una concentracin menor de eta-
como se report en la seccin Materiales y Mtodos. nol que oscilaba entre 8.35% y 9.38%. Por el contrario, la
Las pruebas CHS, RCHS y QS en particular, fueron anali- produccin de glicerol fue mayor con las levaduras NS y
zadas por PCR en tiempo real y los resultados obtenidos con los cultivos mixtos. A pesar de la alta produccin de
se reportan en la Tabla 1. S. cerevisiae result estar pre- cido actico en el cultivo puro, H. uvarum no incremen-
sente todo el tiempo en un alto nivel (106-107 clulas/mL), t la acidez voltil en las fermentaciones de iniciador

Bebidas Mexicanas | Junio 2013


pero tambin H. uvarum y C. zemplinina se encontraron al mltiple. No se encontraron diferencias significativas
final de la fermentacin, generalmente en un aproximado en los otros compuestos. Se descubrieron algunas dis-
de 104 clulas/mL. En particular H. uvarum, al final de la crepancias entre el etanol, azcares residuales y otros
fermentacin de la prueba CHS, mostr un valor Ct de 25, compuestos metablicos secundarios. Lo sorprenden-
correspondiente a 104 clulas/mL (datos no mostrados). te en nuestros experimentos fue que todas las cepas
mostraron un rendimiento de etanol extremadamente
Productos principales de la fermentacin bajo a partir del azcar consumido, lo cual no puede
y compuestos voltiles explicarse por la sobreproduccin de cualquier otro pro-
La Tabla 2 reporta algunos parmetros enolgicos de ducto metablico investigado en este estudio. Magyar
las fermentaciones de cultivos puros, mixtos y secuen- y Toth (2011) y Tofalo et al. (2012) obtuvieron resultados
ciales. Los cultivos puros de H. uvarum y C. zemplinina similares previamente.

Figura 2. Contenido de aminas biognicas en los vinos obtenidos con cultivos iniciadores puros, mixtos y secuenciales. C, C.
39
zemplinina; S, S. cerevisiae; H, H. uvarum; CS, C. zemplinina/S. cerevisiae; HS, H. uvarum/S. cerevisiae; CHS, C. zemplinina/H.
uvarum/S. cerevisiae; RCHS, C. zemplinina/H. uvarum/S. cerevisiae; QS, Fermentacin secuencial.

Etilamina
mg/L

Putrescina
3

2 Cadaverina

1
Aminas
biognicas
totales
0
C S H CS HS CHS RCHS QS
Fermentaciones
Tecnologa

Las aminas biognicas se detectaron en niveles bajos en la mayor formacin de alcoholes isoamlicos y acetato de
las ocho microvinificaciones (Figura 2). En particular, la etilo. La fermentacin secuencial QS mostr una situa-
prueba CS tiene el mayor valor de aminas biognicas y cin completamente diferente entre las fermentaciones
QS tiene el menor valor. Los cultivos puros de H. uvarum, de iniciadores mltiples, con el menor contenido de ace-
C. zemplinina y S. cerevisiae no produjeron cadaverina, tato de etilo y alcoholes isoamlicos y el mayor contenido
la cual se form en todas las fermentaciones de cultivos de acetona, 2-feniletanol y alcohol isobutlico.
mltiples a excepcin de QS. La tiramina, histamina, 2-fe-
niletilamina, espermidina y metilamina, no fueron detec- Se utiliz el anlisis de componentes principales para ob-
tables en ninguna de las muestras analizadas. tener las huellas bioqumicas de los vinos y elucidar las di-
ferencias en los componentes del vino fermentado por las
La Tabla 3 muestra algunos compuestos voltiles que di- diferentes cepas de Saccharomyces o por cultivos de ini-
ferenciaron los perfiles aromticos de las tres especies ciadores mltiples (Nurgel et al., 2002; Howell et al., 2006).
de levaduras de vino. Los cultivos puros de C. zemplinina
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y S. cerevisiae produjeron cantidades bajas de acetato de Algunos compuestos producidos por los cultivos de le-
etilo y acetona y altas cantidades de alcoholes isoam- vaduras puros y mltiples se analizaron utilizando PCA
licos y -feniletanol; y C. zemplinina tuvo mayores pro- (Figuras 3A y 3B). En primer lugar, se calcul la matriz de
ducciones con respecto a S. cerevisiae. En este estudio, correlacin para discriminar las variables y, por lo tanto, se-
el cultivo puro de H. uvarum produjo grandes cantidades leccionar 10 parmetros (acetona, 2,3 butanodiol, etanol,
de acetato de etilo y acetona y cantidades muy bajas de acetato de etilo, acidez titulable y voltil, glicerol, azcares
alcoholes isoamlicos y -feniletanol. Las fermentaciones reductores, alcohol fenil etlico y alcoholes isoamlicos). El
de cultivos mixtos CS, HS y RCHS presentaron niveles PCA explic el 70.6% de la varianza total. El PC 1 explic
bajos de acetato de etilo y disminuyeron la cantidad de al- el 53.55% de la varianza y el segmento negativo del gr-
coholes isoamlicos y 2-feniletanol, con respecto a S. ce- fico de cargas para esta dimensin (Figura 3B) estaba
revisiae. La fermentacin del cultivo mixto CHS present fuertemente relacionado con los niveles de acidez voltil,

40 Tabla 3. Compuestos aromticos (mg/L) de los vinos obtenidos con cultivos iniciadores puros, mixtos y secuenciales.

Compuestos Vinos
aromticos
(%) C S H CS HS CHS RCHS QS

Acetato de
0.644 0.001a 1.850 0.003b 5.384 0.002c 0.441 0.003d 0.674 0.001e 1.959 0.001f 0.511 0.003g 0.369 0.004h
etilo

Acetona 0.020 0.001dg 0.027 0.002h 0.533 0.002b 0.028 0.004h 0.075 0.001a 0.023 0.003h 0.014 0.004d 0.479 0.003e

Alcoholes
8.673 0.003f 5.104 0.001e 1.237 0.004h 4.590 0.001a 3.750 0.001g 9.283 0.004c 5.174 0.004b 2.528 0.001d
isoamlicos

n-heptano 0.264 0.069d 0.839 0.001e 1.283 0.002f 0.761 0.001a 0.913 0.003b 1.663 0.002c 0.106 0.004h 0.692 0.002g

n-butanol 0.107 0.001b 0.058 0.001d 0.025 0.004h 0.082 0.003a 0.018 0.001g 0.093 0.003e 0.062 0.001d 0.028 0.001h

1-hexanol 0.031 0.0dg 0.026 0.003hd 0.027 0.003hd 0.018 0.002e 0.00 0.0a 0.025 0.001h 0.00 0.0a 0.034 0.005g

1-octanol 16.933 0.004f 0.170 0.003a 0.049 0.003h 0.085 0.002g 0.218 0.001e 0.043 0.003h 0.059 0.003d 0.407 0.003b

Alcohol fenil
2.928 0.004c 2.268 0.002b 0.00 0.00h 1.383 0.003d 1.859 0.002e 1.469 0.003g 1.684 0.001a 2.394 0.002f
etlico
Alcohol
0.277 0.003e 0.285 0.002b 0.219 0.001g 0.190 0.001d 0.663 0.002f 0.267 0.003a 0.156 0.001h 1.020 0.001c
isobutlico
C, C. zemplinina; S, S. cerevisiae; H, H. uvarum; CS, C. zemplinina/S. cerevisiae; HS, H. uvarum/S. cerevisiae; CHS, C. zemplinina/H. uvarum/S. cerevisiae;
RCHS, C. zemplinina/H. uvarum/S. cerevisiae; QS, Fermentacin secuencial. *Datos expresados como promedio DE. a-hLetras diferentes en la misma fila
corresponden a diferencias estadsticamente significativas (P<0.05).
Tecnologa
mientras que su contraparte positiva estaba relacionada acetona y acidez voltil; mientras que C, CS y CHS fueron
principalmente con el etanol. El PC 2 explic el 17.05% de la muy similares a excepcin de la concentracin de alcoho-
varianza; esta dimensin estaba relacionada positivamen- les isoamlicos, 2, 3 butanodiol y azcares reductores (en C
te con la acidez titulable. Posteriormente, en el grfico de y CS, los valores fueron mayores que en CHS).
puntuaciones (Figura 3A) es posible distinguir tres grupos
diferentes de vinos producidos por las cepas. La fermen-
tacin llevada a cabo por H. uvarum se diferenci de las DISCUSIN
otras por la alta concentracin de acetato de etilo, glicerol,
Uno de los avances ms estudiados tecnolgicamente en
la fabricacin de vino es la inoculacin del jugo de uva con
Figura 3. Grfico de puntuaciones (A) y grfico de cargas (B) cultivos mixtos de S. cerevisiae y levaduras NS. En este es-
de los componentes principales (PC) 1 y 2 obtenidos a partir del tudio, se compar la cintica de fermentacin y los com-
PCA, mediante los cultivos puros y mltiples. C, C. zemplinina; puestos metablicos producidos por iniciadores mltiples

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S, S. cerevisiae; H, H. uvarum; CS, C. zemplinina/S. cerevisiae; durante la fermentacin de mostos orgnicos. General-
HS, H. uvarum/S. cerevisiae; CHS, C. zemplinina/H. uvarum/S.
mente, la cintica de fermentacin de cultivos puros de S.
cerevisiae; RCHS, C. zemplinina/H. uvarum/S. cerevisiae; QS,
cerevisiae, H. uvarum y C. zemplinina concordaba con la
Fermentacin secuencial.
esperada y la reportada en otros estudios (Egli et al., 1998;
Toro y Vazquez, 2002; Zohre y Erten, 2002; Mendoza et al.,
A 2007; Fleet, 2008; Ciani et al., 2010). El cultivo puro de H.
uvarum fue incapaz de finalizar la fermentacin de acuer-
do con la baja capacidad fermentativa de esta especie,
pero tampoco el cultivo puro de C. zemplinina termin la
Componente 2: 17.05%

fermentacin. Estas dos cepas fueron elegidas con base


en su capacidad fermentativa en un mosto que contena
180 g/L de azcares (Tofalo et al., 2011) y probablemente
los productos metablicos fermentativos del mosto Mon- 41
tepulciano con alto contenido de azcar (280 g/L) afecta-
ron su rendimiento. En particular, se ha reportado que C.
zemplinina completa la fermentacin de mosto Macabeo
que contiene 180 g/L de azcares (Andorr et al., 2010)
incluso con un ligero retraso en comparacin con la fer-
Componente 1: 53.55%
mentacin de S. cerevisiae (Sipiczki et al., 2005; Tofalo et
al., 2009, 2012). Las interacciones de las levaduras tuvie-
B ron un impacto evidente en la cintica de fermentacin y
Acidez
la presencia de S. cerevisiae gener fermentaciones ms
titulable rpidas. Sin embargo, la asociacin de C. zemplinina y S.
Glicerol
cerevisiae (prueba CS) mostr un mejoramiento de la cin-
Acetona
Componente 2: 17.05%

Alcohol fenil etlico tica durante los primeros 15 das de fermentacin. C. zem-
Azcares reductores plinina es una levadura osmotolerante y fructoflica, que
2,3-Butanodiol
generalmente produce bajas cantidades de cido actico
Etanol
y cantidades relevantes de glicerol a partir de la fermenta-
Acidez voltil cin del azcar (Sipiczki et al., 2005; Magyar y Toth, 2011;
Alcohol isoamlico
Tofalo et al., 2011), lo cual puede sugerir que sera capaz
Acetato de etilo
de consumir los azcares al inicio de la fermentacin, evi-
tando el estrs osmtico de S. cerevisiae y mejorando as
la cintica de fermentacin (Rantsiou et al., 2012). Como
se demostr anteriormente, para las especies de S. cere-
visiae, las diferentes cepas de C. zemplinina pueden te-
Componente 1: 53.55% ner un efecto especfico, tal como reportaron Tofalo et al.
Tecnologa

(2012). Adems esta interaccin positiva entre S. cerevisiae


y C. zemplinina en la cintica de fermentacin, puede tener
una importante aplicacin en mosto con altos contenidos
de azcares o vinos especiales como el vino congelado
(icewine), passito y vinos botritizados (Rantsiou et al.,
2012). Por el contrario, los inculos de C. zemplinina y H.
uvarum junto con S. cerevisiae (RCHS) no produjeron los
mismos resultados que la prueba CS, probablemente por
la baja proporcin de clulas de las dos levaduras NS con
respecto a S. cerevisiae.

El inculo de S. cerevisiae aadido 48 horas despus que


los de C. zemplinina y H. uvarum (prueba QS) provoc
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que la fermentacin se detuviera. En otros estudios se


han reportado resultados similares y los mecanismos de
esta reduccin de rendimiento de S. cerevisiae an no se
han explicado. Cuando S. cerevisiae y C. cantarelli inte-
ractan durante la fermentacin, la poblacin mxima de
S. cerevisiae disminuye (Toro y Vazquez, 2002). Este he- nes clula-clula se presentan como significativas al
cho puede deberse al consumo de aminocidos y vitami- afectar la sucesin de levadura (Ciani y Pepe, 2002;
nas durante los primeros das de la fermentacin que Fleet, 2003; Nissen et al., 2003). La muerte prematura de
pueden inhabilitar el crecimiento subsecuente y la capa- C. zemplinina y H. uvarum durante la fermentacin mixta,
cidad fermentativa de S. cerevisiae (Fleet, 2003). Por otro incluso con diferencias cuantitativas, parece deberse al
lado, estos datos fueron confirmados por los recuentos efecto antagnico de S. cerevisiae como reportaron tam-
en placa. S. cerevisiae domin todas las fermentaciones bin Andorr et al. (2010) para la misma especie. En las
42 de iniciador mltiple y parcialmente la prueba QS en la fermentaciones mixtas, las levaduras NS disminuyeron
que C. zemplinina tuvo su mejor desempeo. La mayor conforme avanzaba la fermentacin. Por el contrario,
habilidad de S. cerevisiae de soportar las condiciones de otros autores (Ciani et al., 2006; Mendoza et al., 2007)
estrs como el aumento de etanol, disminucin del pH y reportaron que la presencia tanto de Saccharomyces
el agotamiento de nutrientes, generalmente se conside- como de levaduras NS promueve un aumento en la per-
ra como el impulso de la dinmica de la poblacin de sistencia de las levaduras NS durante el proceso de
levaduras (Pretorius, 2000). Actualmente se cuestionan fermentacin. Sin embargo, es claro que S. cerevisiae tie-
estas presiones selectivas, mientras que las interaccio- ne un efecto antagonista relevante sobre C. zemplinina y
Tecnologa
H. uvarum, pero tambin, que la misma NS puede afectar del cultivo. De hecho, las clulas con lesiones subletales
a S. cerevisiae, dependiendo de la secuencia de creci- y/o viables pero no cultivables (VBNC), podran no crecer
miento, el nmero de clulas viables y la especificidad de en las placas y son comunes en el vino (Millet y Lonvaud-
la cepa. Se han realizado pocos estudios para dilucidar Funel, 2000; Andorr et al., 2011). El mtodo qPCR utiliza-
los mecanismos de estos fenmenos antagnicos (Nis- do ya se haba desarrollado anteriormente para monito-
sen et al., 2003; Arneborg et al., 2005; Prez-Nevado et rear la evolucin de las levaduras durante las
al., 2002). Durante la fermentacin alcohlica, las leva- fermentaciones alcohlicas (Hierro et al., 2007; Andorr
duras pueden producir compuestos con efectos inhibi- et al., 2011). Sin embargo, la qPCR cuyo blanco es el ADN,
dores hacia otras especies o cepas de levaduras, como tambin cuantifica las levaduras muertas debido a la es-
cidos grasos de cadena corta o larga (Ludovico et al., tabilidad del ADN (Hierro et al., 2006). Nuestros datos
2001; Fleet, 2003), toxinas killer (Schmitt y Breinig, confirmaron los de Andorr et al. (2011), quien encontr
2002) y condiciones nutritivas y de crecimiento (Fleet, grandes poblaciones de H. uvarum (hasta 108 clulas/
2003). Sin embargo, en los estudios mencionados ante- mL) en las fermentaciones mixtas por medio de mtodos

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riormente el mecanismo mediado por el contacto clula- qPCR. Definitivamente estos descubrimientos no res-
clula parece crear antagonismo entre las levaduras. ponden la pregunta de si estas poblaciones correspon-
Para confirmar los datos obtenidos por el recuento en den a clulas VBNC, lesionadas y/o muertas o cuntas
placa, se utiliz qPCR como un mtodo independiente de estas clulas estn activas metablicamente y cmo
a su vez pueden influenciar los vinos finales (Andorr et
al., 2011). Este aspecto necesita ms investigacin y
avances. Cuando algunas levaduras se desarrollan jun-
tas bajo condiciones de fermentacin, no coexisten pasi-
vamente, sino que interactan y pueden producir dife-
rentes niveles de productos de fermentacin, que
pueden afectar la composicin qumica y aromtica de
los vinos (Howell et al., 2006; Anfang et al., 2009). Las
fermentaciones de mosto de uva realizadas por cultivos 43
puros, mixtos o secuenciales de levaduras NS con S. ce-
revisiae, pueden producir vinos con diferencias significa-
tivas en la composicin qumica (Herraiz et al., 1990; Cia-
ni y Picciotti, 1995; Gil et al., 1996; Lambrechts y Pretorius,
2000; Rojas et al., 2003; Romano et al., 2003; Moreira et
al., 2008). Una consecuencia relevante de las levaduras
NS fue el incremento de glicerol en todas las fermenta-
ciones de iniciadores mltiples, debido a la caracterstica
intrnseca de C. zemplinina y H. uvarum. De manera simi-
lar, la produccin de cido actico es considerada como
un patrn comn en las levaduras apiculadas, que por
esta razn han sido consideradas por largo tiempo como
levaduras causantes de descomposicin (Romano et al.,
2003). A pesar de la alta produccin de cido actico en
el cultivo puro, H. uvarum no aument la acidez voltil en
las fermentaciones de iniciadores mltiples. Estos resul-
tados concuerdan completamente con los reportados
por otros autores (Ciani et al., 2006; Mendoza et al.,
2007; Andorr et al., 2010). En cuanto a las aminas bio-
gnicas, se han llevado a cabo pocos estudios sobre su
formacin por levaduras, comparando diferentes espe-
cies de levaduras y cuantificando nicamente la histami-
na (Torrea y Ancin, 2002). Su presencia en el vino iba
Tecnologa

desde pocos miligramos por litro hasta aproximadamen-


te 50 mg/L, dependiendo del vino. Este estudio confirm
la baja cantidad de amino-descarboxilasa de las levadu-
ras del vino, aun cuando se determinaron algunas dife-
rencias en las ocho pruebas. Incluso si algunos autores
sugieren que las levaduras no parecen ser responsables
de la produccin de la mayora de las aminas en los vinos
tintos comerciales industriales (Marcobal et al., 2006;
Smit et al., 2008), la contribucin de las levaduras a la
produccin de aminas biognicas podra entonces ser
indirecta: las levaduras pueden alterar la composicin de
los mostos de uvas al utilizar algunos aminocidos y al
secretar otros durante la fermentacin alcohlica y la au-
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tolisis, cambiando as la concentracin de los aminoci-


dos precursores en el vino, que pueden ser utilizados por
otros microorganismos en pasos subsecuentes de la fer-
mentacin (Soufleros et al., 1998). De acuerdo con la ca-
racterstica intrnseca de las especies individuales, la
produccin de los principales compuestos aromticos Candida zemplinina mostr caractersticas interesantes
estuvo bien diferenciada en las pruebas. Las bajas canti- para la fermentacin mixta con S. cerevisiae, aumen-
dades de acetato de etilo y acetona y la alta cantidad de tando particularmente la cintica de fermentacin en el
alcoholes isoamlicos y -feniletanol fueron producidas mosto Montepulciano de alta gravedad y disminuyendo
por cultivos puros de C. zemplinina y S. cerevisiae, tal la produccin de acetato de etilo y cido actico. El uso
como reportaron Andorr et al. (2010). En este estudio, el combinado de tres cultivos iniciadores (CHS y RCHS)
cultivo puro de H. uvarum produjo grandes cantidades de podra permitir el mejoramiento de las caractersticas
44 acetato de etilo y acetona y muy bajas cantidades de al- organolpticas de un vino. Se necesitan ms estudios
coholes isoamlicos y -feniletanol. La produccin de para clarificar la interaccin entre los diferentes inicia-
grandes cantidades de acetato de etilo y cido actico dores y para optimizar la fermentacin y las modalida-
producidas por H. uvarum siempre han sido considera- des de inoculacin. Efectivamente, el uso de levaduras
das como una caracterstica negativa (Ciani y Picciotti, NS del vino junto con cepas Saccharomyces en fermen-
1995), mientras que existe controversia en cuanto a la taciones mixtas podra recomendarse como una herra-
produccin de alcoholes superiores. Gil et al. (1996) des- mienta para obtener las ventajas de la fermentacin
cubri que H. uvarum y K. apiculata fueron los producto- espontnea de los vinos orgnicos como los obtenidos
res principales de alcoholes superiores. Sin embargo, al- con Montepulciano, mientras se evitan los riesgos de
gunos autores (Herraiz et al., 1990; Rojas et al., 2003; que se detenga la fermentacin (Rojas et al., 2003; Ro-
Romano et al., 2003) reportaron que las levaduras apicu- mano et al., 2003; Jolly et al., 2006; Ciani et al., 2010).
ladas producen pocos alcoholes superiores y pueden Debido a la biodiversidad de las cepas de levadura NS
promover la esterificacin de varios alcoholes como el sobre su nivel de produccin de actividades enzimti-
etanol, geraniol, alcoholes isoamlicos y 2-feniletanol. cas (Manzanares et al., 1999, 2000; Mendes-Ferreira
Probablemente, la alta produccin de alcoholes superio- et al., 2001; Strauss et al., 2001) y los metabolitos de
res podra ser una caracterstica dependiente de la cepa, fermentacin (Romano et al., 1992, 2003; Capece et al.,
tambin en algunas levaduras NS del vino (Capece et al., 2005) de importancia enolgica, se deberan seleccio-
2005). Los compuestos voltiles secundarios produci- nar cepas adecuadas para poder disear un iniciador
dos por cultivos mixtos fueron una combinacin de los mixto capaz de aportar beneficios tambin para los vi-
producidos por las diferentes cepas. El PCA destac es- nos obtenidos por medio de la viticultura orgnica. C.
tas diferencias, indicando que las caractersticas finales zemplinina, en particular, mostr una buena interaccin
de los vinos se pueden modular por medio de diferentes con S. cerevisiae al aumentar la cintica de fermenta-
combinaciones o especies y secuencia de inculos (Nur- cin en el mosto Montepulciano de alta gravedad, con
gel et al., 2002; Howell et al., 2006). baja produccin de acetato de etilo y cido actico.
Tecnologa
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Bebidas Mexicanas | Junio 2013


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fermentations from the Apulia region (South Italy).
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