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Uv V PDF
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II.3.2.1. Introduccin.
La absorcin de radiacin ultravioleta o visible proviene de la excitacin de los
electrones enlazantes y como consecuencia, las longitudes de onda de los picos de absorcin
pueden correlacionarse con los tipos de enlaces que existen en las especies en estudio. La
espectroscopia de absorcin molecular es por tanto valiosa para la identificacin de los grupos
funcionales de una molcula. Sin embargo, son ms importantes las aplicaciones de la
espectroscopia de absorcin ultravioleta y visible para la determinacin cuantitativa de
compuestos que contienen grupos absorbentes o tambin llamados cromforos. De hecho la
aplicacin mas generalizada de relevancia biolgica es la medida de concentraciones de
protenas, NADH y cidos nucleicos, porque en la mayora de los casos hay una relacin
directa y simple entre el nmero de molculas presentes y la absorcin. No obstante, en
algunos casos la absorcin depende notablemente del entorno molecular; as los cambios en el
espectro con cambios de entorno pueden interpretarse en trminos de procesos tales como
fusin de cidos nucleicos, interacciones protena-ligandos (ensayos de actividad enzimtica,
enzima-cofactor, activador, inhibidor), etc. El espectro UV/V de un biopolmero es una huella
dactilar y como tal puede usarse en ocasiones para identificarlo. La gran utilidad de tales
medidas radica en la alta sensibilidad, la sencillez de la medida y el hecho de hacerse en
disolucin; aunque no es posible estas medidas en sistemas biolgicos intactos, es decir in
vivo, tales como tejidos debido a que esta radiacin es fuertemente dispersada.
II.3.2.2. Parmetros de los espectros electrnicos.
Los espectros electrnicos se representan normalmente como una grafica de la
absorbancia o densidad ptica, definida en la tabla II.3.2.I, frente a la longitud de onda de la
radiacin incidente, frecuentemente expresada en nm. Dos parmetros caracterizan una
determina da banda espectral, la posicin del mximo, mx , y su intensidad.
En la tabla II.3.2.I se recogen todos los parmetros que se usan en este tipo de
espectroscopia. Los nombres de los parmetros en la columna de la izquierda responde a la
terminologa recomendada por Analytical Chemistry (Anal. Chem., 1990, 62, 91.). En la figura
II.3.2.1 se representa un esquema que ilustra alguna de las definiciones de la tabla II.3.2.I.
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Estructura de Macromolculas
TABLA II.3.2.I
Trminos y smbolos de los parmetros ms importantes utilizados en la
espectroscopia electrnica.
Parmetrosa
Definicin
Trminos
alternativos
Potencia radiante, P, P0
Absorbancia, A
log
Transmitancia, T
Longitud de la trayectoria
de la radiacin en cm, b
P0
P
Transmisin, T
___
l, d
Absortividad, a
A
; c en g.L-1, b en cm
bc
Coeficiente de
extincin, k
Absortividad molarc,
A
; c en mol.L-1, b en cm
bc
Coeficiente de
extincin molar
P0
Disolucin conteniendo
molculas absorbentes de
la radiacin UV/V.
Clula espectrofotomtrica
de cuarzo.
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Estructura de Macromolculas
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Estructura de Macromolculas
Se han propuesto dos teoras para explicar la absorcin de radiacin de los iones de los
metales de transicin y la profunda influencia del entorno qumico sobre las longitudes de onda
correspondientes; a saber, la teora del campo cristalino, que es la ms sencilla y es adecuada
desde un punto de vista cualitativo; y el tratamiento ms riguroso y complejo a partir de la
teora de orbitales moleculares, que un mejor tratamiento cuantitativo del fenmeno.
Ambas teoras se basan en la premisa de que las energas de los orbitales d de los iones
de los metales de transicin en solucin no son idnticas y que la absorcin implica la
transicin de electrones desde un orbital d de baja energa a uno de energa superior. En
ausencia de un campo magntico o elctrico externo (como en el estado gaseoso diluido), las
energas de los cinco orbitales d son idnticas y no es necesaria la absorcin de la radiacin
para mover un electrn de un orbital a otro. Por otro lado, cuando tiene lugar la formacin de
complejos en solucin entre el in metlico y agua o algn otro ligando, tiene lugar la
separacin de la energa de los orbitales. Este efecto resulta de las fuerzas diferenciales de
repulsin electrosttica entre el par de electrones del dador y los electrones de los diversos
orbitales d del in metlico central. Esta separacin de energas, se explica considerando la
distribucin espacial de los electrones en los diversos orbitales d; aunque no entramos en
detalles en la figura II.3.2.4 mostramos el efecto del campo ligando sobre los niveles de
energa para la configuracin octadrica de complejos con un nmero de coordinacin 6 y para
la configuracin tetradrica y plano-cuadrada de complejos con un nmero de coordinacin 4.
Podemos observar que las energas de todos los orbitales d aumenta en presencia de un campo
ligando pero, adems, que los orbitales d se dividen en niveles que difieren en un de energa
que determina lo que se llama fuerza del campo ligando.
Figura II.3.2.4. Efecto del campo ligando sobre los niveles de energa de los orbitales d.
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Estructura de Macromolculas
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Estructura de Macromolculas
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biopolmero midiendo la absorbancia a 280 nm. En aquellas protenas que no contienen Trp
pero contienen Tyr, es posible y fiable determinar concentraciones a travs de la absorbancia a
280 nm. La Tyr , aunque con un coeficiente de extincin menor que el de Trp, presenta una
absorcin importante a esta . La absortividad de la Phe es mucho mas pequea que las de Trp
y Tyr, por lo que es prcticamente observar su contribucin si cualquiera de los otros dos
aminocidos estn presentes.
La cadena lateral de la Cys no presenta una banda de absorcin til en protenas porque
su principal transicin est sumergida en la regin peptdico; no obstante, los puentes disulfuro
presentan una absortividad de 300 cm2.mol-1 a 250 nm. Aunque esta absorcin no es lo
suficientemente fuerte para se til en medidas de concentracin, si tienen aplicacin en
medidas de actividad ptica (DC y DOR).
TABLA II.3.2.II
Mximos de absorcin y coeficiente de extincin molar de
varios aminocidos a pH neutro
Molecula
Triptfano
Tirosina
Fenilalanina
Histidina
Cistina
mx(nm)
280
219
274
222
193
257
206
188
211
250
a mx (cm2.mol-1)
5600
47000
1400
8000
48000
200
9300
60000
5900
300
Estructura de Macromolculas
momento dipolar de transicin, ab , neto mayor o menor, tal como se ilustra en la figura
II.3.2.6 para dos ordenamientos lmites.
a)
b)
Figura
II.3.2.6. Diagrama representando esquemticamente el fenmeno del
hipocromismo e hipercromismo.a) Ordenamiento paralelo de los dipolos inducidos y del
momento dipolar de transicin ab (color rojo) produciendo hipocromismo. b) Ordenamiento
colineal de los dipolos inducidos y del momento dipolar de transicin ab (color rojo)
produciendo hipercromismo.
En las hlices con bases apiladas o en las dobles hlices de los cidos nucleicos los
momentos dipolares inducidos y los ab de transicin se disponen en paralelamente, como
consecuencia se produce hipocromismo y el momento dipolar de transicin observado es
menor del que tendra el cromforo aislado.
II.3.2.4.I. Transiciones en sistemas altamente conjugados.
En las molculas que contienen muchos grupos insaturados, todos ellos conjugados, el
espectro cae con frecuencia en el intervalo visible del espectro. Esto es consecuencia del alto
grado de deslocalizacin de los electrones y la consiguiente disminucin de la energa
requerida para una transicin electrnica.
Un ejemplo bien conocido es el del anillo porfirnico de los grupos hemos, responsable
del color de las hemoprotenas (hemoglobinas, hemocianinas, citocromo C, etc.), figura
II.3.2.7.
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TABLA II.3.2.III
Mximos de absorcin y coeficiente de extincin molar de
bases pricas y pirimidnicas y sus derivados.
Molecula
Adenina
Adenosina
NADH
Guanina
Guanosina
Citosina
Citidina
Uracilo
Uridina
Timina
Timidita
DNA
RNA
mx(nm)
2605
2955
260
275
276
267
271
2595
2611
2645
267
258
258
a mx (cm2.mol-1)
13400
14900
18000
8100
9000
6100
9100
8200
10100
7900
9700
6600
7400
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