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CROMATOGRAFÍA INSTRUMENTAL

HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Performance

Se pueden hacer distintas clasificaciones:


Se denomina Cromatografía líquida a todo proceso cromatográfico en el cual la Fase Móvil es
un líquido, en contraste con la Cromatografía gaseosa, donde la Fase Móvil es un gas.

1 1) C. Columna Tradicional
Cromatografía
Líquida 2) C. Capa delgada (TLC) o Papel

2) HPLC

Se denomina Cromatografía en columna a todo proceso cromatográfico en el cual el desarrollo


se produce en una columna, pudiendo ser la Fase Móvil un líquido o un gas.

2 1) C. Columna abierta
Cromatografía
en columna 2) HPLC

2) Cromatografía gaseosa

La diferencia entre HPLC y columna abierta, papel y TLC radica en el mejoramiento de los
equipos, materiales y técnicas, logrando así ventajas en los resultados, tales como mayor rapidez,
precisión y posibilidad de separación de mezclas complejas.

En cuanto a la diferencia entre Cromatografía Líquida y Gaseosa, radica fundamentalmente en


el tipo de muestra que se puede analizar en cada caso. Alrededor del 20 % de los compuestos
orgánicos conocidos, pueden ser cromatografiados por CG, sin ser modificados previamente
mediante una reacción química.

En HPLC, por el contrario, la muestra no está limitada por su volatilidad o estabilidad térmica,
y se puede aplicar, por lo tanto a cualquier tipo de compuesto orgánico: extractos vegetales,
productos naturales lábiles, macromoléculas, productos farmacéuticos y a una enorme variedad de
compuestos de alto peso molecular como: proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos, pigmentos,
metabolitos vegetales o animales, etc.

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I.- Esquema del aparato. Recorrido de la Fase Móvil:

Pump: Bomba
Vacuum Degasser: Degasificador de la FM
Mobile Phase Mixing: mezclador de la FM
Waste: Desecho

Recorrido de la Fase Móvil:

El tamaño reducido de las fases estacionarias, obligó al desarrollo de un instrumento que


permitiera el flujo de la Fase Móvil a través de la columna a una velocidad adecuada. Este
instrumento, fundamental en un cromatógrafo líquido, es la Bomba.
La mejor manera de comprender un cromatógrafo de HPLC es conocer el recorrido de la
FM:
 La Fase Móvil, que debe ser de calidad cromatográfica (es decir libre de sustancias
orgánicas y de partículas mayores de 0,5 µ ), se encuentra en un reservorio adecuado.
 De allí pasa a la línea principal, para llegar a la bomba, que debe suministrar un flujo
continuo y constante, libre de pulsos.
 Luego pasa por la válvula de inyección. Las válvulas de inyección son mayormente de
volumen fijo, de manera de evitar error en la carga de muestra en la columna.
Los inyectores tienen una posición de carga y de inyección, ya que no pueden ser
inyectados directamente en el sistema que está bajo presión. Existen también los inyectores
automáticos (autosampler) donde la inyección la hace directamente el aparato.

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Las válvulas de inyección de volumen fijo permiten cuantificar por el método del standard
externo.
 Si en el inyector hay muestra, la Fase Móvil la arrastra hacia la columna.
 Al atravesar la columna, se produce la separación de las sustancias según su afinidad con el
sistema y finalmente la Fase Móvil llega al detector.
 Una vez detectadas las sustancias que pudiera haber en la Fase móvil, ésta pasa por una
válvula que permite su colectado o su descarga.

II.- Fases Estacionarias y Fases Móviles

Recordemos que la separación cromatográfica es el resultado de la interacción entre las


moléculas de la muestra, la fase estacionaria y la fase móvil.
En el caso de HPLC, se usan fases estacionarias muy divididas, es decir de un tamaño entre 5 a
10 µ , (contra los 60 o 100µ de los materiales cromatográficos comunes), logrando así aumentar
las interacciones, y por lo tanto la eficiencia de la separación de los componentes de una muestra.
Además la cantidad de fase estacionaria necesaria es mucho menor, con lo que se utilizan
columnas de menor tamaño, con la resultante de obtener una disminución en la duración de la
cromatografía.
Se han desarrollado una gran variedad de fases estacionarias para lograr la separación de
sustancias de estructuras químicas tan diversas como las que pueden separarse por HPLC.

Tipos de F.E.:
1.- Adsorción:
a) Sílica: Tiene la desventaja que adsorbe agua de los solventes orgánicos que pasan por la
columna, los cuales tienen muchas veces trazas de agua que fueron retenidas por ellos del
medio ambiente.
Este es el factor limitante que tiene la sílica en HPLC, pues las columnas no pueden
“activarse”, como se hace en las columnas convencionales.
 Usos: isómeros en Fase Normal

2.- Fases Químicamente unidas (BPC):


Son Fases Estacionarias que tienen sílica como soporte, a cuyos grupos silanoles se les unieron
químicamente distintas estructuras, para modificar su polaridad.
Estas Fases Estacionarias tienen diferentes comportamientos cromatográficos, de acuerdo al
“líquido” que está químicamente unido a la sílica.
Los más empleados son:

a) C8, C18: Son las más utilizadas. Son de baja polaridad, lipofílicas, funcionan en Fase
Reversa con Fases Móviles que contengan agua. Se debe respetar el ph de estabilidad para
la unión éster de las fases estacionarias (entre 2 y 8,5).
 Fases Móviles: Se usan mezclas de agua (o soluciones buffers), con solventes
orgánicos (acetonitrilo, metanol y en menor escala: isopropanol, tetrahidrofurano)
 Usos: para casi todos los compuestos con excepción de los muy hidrofílicos
(azúcares, aminoácidos), y de los muy lipofílicos (grasas, terpenos).

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b) CN, NH2: Son fases estacionarias de polaridad intermedia, son hidrofílicas y actúan de
distinta manera:
CN: es de mediana polaridad. Puede actuar tanto en Fase Normal (con Fase Móvil de
solventes orgánicos, sin agua) o Fase Reversa (con Fases Móviles que contengan agua).
NH2: es un poco más polar: Puede actuar en Fase Normal o Reversa.

Siempre el tipo de Fase Móvil depende de la muestra que se va a analizar, por ejemplo:
 Si la muestra es una mezcla de azúcares, la FM puede ser una mezcla de agua y
acetonitrilo.(Fase Reversa)
 Si se utiliza para separar por ej: vitaminas oleosolubles; la FM sería una mezcla de
solventes de baja polaridad (hexano, isopropanol, acetato de etilo, etc) (Fase Normal).
.
c) Diol: Es sumamente polar, reemplaza a la sílica y se usa en Fase Normal, con solventes
orgánicos sin agua

d) Intercambio iónico: Estas fases estacionarias tienen sílica o resinas de poliestireno


entrecruzadas con divinilbenceno (PS-DVB) como soporte.
 Tienen unidos grupos ácidos: ej. Ácido sulfónico en el caso de ser un
intercambiador de cationes.
Se utiliza para compuestos básicos, tipo alcaloides, aminas, aminoácidos.
 Tienen unidos grupos básicos: ej. tetrametilamonio en caso de ser un
intercambiador de aniones.
Se utiliza para compuestos ácidos, como ser: ácidos carboxílicos, aminoácidos, etc.
Utilizan Fases Móviles acuosas con variaciones de ph.
Este tipo de cromatografía se usa para compuestos a los cuales no se les puede suprimir la
ionización dentro de los límites de ph para las F.E. antes mencionadas.

e) Exclusión:
 Cromatografía de permeación por geles (GPC): son resinas de PV-DVB. Sirve para
separar polímeros insolubles en agua.
Las Fases Móviles usadas son solventes de baja polaridad (decalina, tolueno).
 Cromatografía de filtración por geles (GFC): se utiliza un tipo de sílica recubierta o
derivados del dextrano (Sephadex), son hidrofílicas.
Sirve para compuestos tipo proteínas, enzimas, y las Fases Móviles deben ser acuosas.
Este tipo de cromatografía se usa para compuestos de PM superior a 2000.

III Columnas

Las Fases Estacionarias están contenidas en columnas que son en general de acero inoxidable,
para evitar fenómenos de corrosión por los solventes y soportar la presión a la que trabajan.
Tienen tamaños variables (por ej. 25 a 30 cm y entre 2 y 4mm de diámetro interno)

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También están las columnas High Speed LC, que son de 3 a 5 cm de largo y partículas de 3µ , o
las columnas Micro Bore LC, que tienen de 40 a 50 cm de largo por 1 a 2 mm de diámetro interno.
Para HPLC preparativa: se usan columnas de 30cm por 1 a 3 cm de diámetro interno.

IV Detectores

Condiciones básicas que debe tener un detector ideal para HPLC:


1) Versatilidad: que pueda aplicarse a todo tipo de muestras
2) Sensibilidad: que detecte bajas concentraciones de la muestra
3) Confiabilidad y fácil manejo
4) Baja sensibilidad a los cambios de temperatura y de flujo
5) No destructivo: que pueda recuperarse la muestra.

Los más usados son:


a) UV: Este tipo de detector es el más usado, debido a su versatilidad, sensibilidad y facilidad
de manejo. Su funcionamiento se basa en la absorbancia registrada a la salida de la
columna, que es propia de la sustancia presente.
b) Indice de refracción: Es el más usado, luego del UV. Su funcionamiento se basa en la
medida de la diferencia entre el índice de refracción de la Fase Móvil pura y el eluído de la
columna. Es menos sensible que el UV, y no puede ser utilizado cuando la cromatografía
se realiza en gradiente.
Otros detectores:
a) Fluorescencia: Presenta la desventaja que no todos los compuestos tienen fluorescencia
natural:
b) Electroquímico: Se usa para compuestos electroxidables o electroreducibles, La ventaja es
su alta sensibilidad, pero la desventaja es que necesita una Fase Móvil que sea conductora
y la muestra debe ser electroactiva. Sirve para trazas, por ej de insecticidas

V Optimización del sistema cromatográfico

Los parámetros son los mismos que para cromatografía general: N, k, α .


Se agregan otros factores a tener en cuenta como ser:
 Velocidad lineal de la Fase Móvil: (flujo), existe un flujo ideal para cada tipo de columna.
 Viscosidad de la Fase Móvil: a menor viscosidad, mayor difusión y por consiguiente,
menor altura del plato teórico.
Gráficamente los datos que
obtengo de un cromatograma
son:
W: ancho de la banda

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t0: es el tiempo muerto, el tiempo que tarda la FM ( o alguna sustancia que no es retenida por la
FE) en llegar al detector.
tr: es el tiempo de retención de las diferentes sustancias que eluyen de la columna, se mide en la
altura del pico.
t’r: tiempo de retención corregido, descontando el tiempo muerto

Interpretación de los cromatogramas:

Resolución (Rs) es la capacidad del sistema cromatográfico para lograr la separación adecuada de
los componentes de una muestra dada:

Se expresa matemáticamente como:

Rs = t2 - t1______

½ ( w1 +w2)

Es decir, se define como la relación entre la diferencia de los tr de dos bandas contiguas y el
promedio del ancho de las mismas. La resolución debe tener una valor de 1 o más para que el
sistema se pueda considerar adecuado.

Para mejorar la resolución de un sistema en la práctica, existen tres factores básicos a tener en
cuenta:
1.- K: capacidad
2.- α : selectividad
3.- N: eficiencia

Veamos como influye cada uno de ellos en detalle:

1.- Capacidad ( k):


Matemáticamente:

k = tr - t0______ = ____t’r______

t0 t0

Por lo tanto, la capacidad de un sistema es el cociente entre el tiempo transcurrido de la sustancia


(corregido por el tiempo muerto) y el tiempo muerto. De aquí se deduce que el valor de k puede
oscilar entre 0 e infinito; 0 si la sustancia no es retenida por el sistema e infinito si la sustancia
tiene demasiada afinidad por el sistema y no puede ser eluída del mismo.
En la práctica es conveniente lograr valores entre 2 a 10, ya que un valor demasiado alto para este
parámetro implicaría una retención excesiva del sistema por las sustancias a cromatografiar.

¿Cómo se modifica k? Es fácil concluir que para modificarlo debemos cambiar la fuerza de la FM,
si aumentamos la fuerza de la FM vamos a disminuir el k, y si la disminuimos, aumentamos el k.

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El k se analiza con un parámetro que equivale al Rf en TLC, y es el tr o tiempo de retención de una
sustancia en un sistema cromatográfico, (en este caso, en la columna).
Se relaciona con el k de la siguiente manera:
A > tr significa que el tiempo de retención es alto y que la sustancia está muy retenida en la
columna ⇒ el k es también alto.
A< tr significa que el tiempo de retención es bajo, y que la sustancia casi no interactuó con
la columna y sale rápidamente de la misma ⇒ el k es también bajo.

2.- Selectividad ( α )
Es la capacidad que tiene el sistema de discernir entre dos sustancias con un tr muy próximo.

α = t’2_____ __tr2 - t0_

t’1 tr1 - t0
Es un cociente entre el tiempo de retención de las sustancias a separar.
Cuanto mayor sea el valor de este cociente, mayor va a ser la separación de las sustancias y
representa, por lo tanto, una medida de la selectividad de la columna para las mismas.
Es evidente que si dos sustancias tienen el mismo tr, se superponen, α es igual a 1, y no existe
separación entre ambas.

¿Cómo puedo aumentar α para mejorar la resolución?


Las siguientes soluciones están en orden decreciente de aplicabilidad.
a. Agregando a la FM determinados modificadores químicos, que son sustancias o solventes que
se agregan en pequeña cantidad (por ej 0,01%) y que, por una afinidad especial con alguna de
las sustancias a separar, o por formación de complejos, entre otros mecanismos, producen
cambios drásticos en la separación de las sustancias. También puede lograrse con cambios de
ph.
b. Cambiando cualitativamente la FM, teniendo en cuenta de mantener un k adecuado.
(2 < k < 10)
c. Cambio u optimización de la FE: eligiendo una FE diferente a la usada o tratando de mejorar
la columna en uso mediante un lavado (regeneración) para eliminar sustancias que pudieran
estar retenidas de corridas anteriores.

3.- Eficiencia (N)


La eficiencia de la columna es una medida de su habilidad para lograr una buena separación de los
componentes de una mezcla y se refleja en el cromatograma como picos angostos, es decir con w
pequeños y no superpuestos.
Este parámetro está relacionado con el número de platos teóricos de la columna, que se calcula
mediante la siguiente ecuación matemática:

2 2

N = 16 tr____ N = 5, 54 t’r___

W W1/2

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En la cual tr es el tiempo de retención de la sustancia, W es el ancho del pico en su base, obtenido
al extrapolar los lados del pico con la línea de base y t’r es la diferencia entre el tiempo de
retención de la sustancia y el tiempo de elución de una sustancia que no es retenida (tiempo
muerto).
El ancho máximo a media altura, W1/2, es obtenido directamente por integradores electrónicos.

N, es aproximadamente constante para diferentes sustancias en un cromatograma, para un


determinado sistema cromatográfico ( una misma columna, con flujo y temperatura fijos).

El N es proporcional al largo de la columna (L) e inversamente proporcional a la altura de un


plato teórico (H)

N= L___
H
Los factores que inciden sobre la eficiencia de un sistema determinado son:
a.- Tamaño de la partícula de la FE: cuanto menor sea, mayor será la eficiencia.
b.- Velocidad lineal de la FM (flujo): Existe un flujo ideal para cada tipo de columna (longitud,
diámetro y tamaño de partícula) con el cual se logra el máximo de eficiencia.
c.- Viscosidad de la FM: a menor viscosidad, mayor difusión de la muestra y por consiguiente
menor la altura del plato teórico.

Gráficamente la influencia de cada parámetro se puede representar de la siguiente manera:

Inicial

Varía k

Aumenta N

Aumenta α

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Bibliografía:
 Farmacopea Argentina VII Ed, Vol I, 2003
 “Cromatografía Instrumental” Secretaría de apuntes CEFyB, U.B.A.
 MTS, Mourne Training Services, “A Brief Guide to HPLC Instruments”
 “Cromatografía en papel y en capa delgada”, X.A.Dominguez. Editado por la Secretaría
General de la Organización de los Estados Americanos, Washington 1975.
 “Introducción a la Cromatografía”, David Abbott y R.S.Andrews, 2ª Ed., Editorial
Alhambra, S.A., Madrid 1970.
 “Thin layer chromatography”, E.Stahl. Springer Verlag, Berlín, 1969.