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Ingeniera

de las enzimas. 1

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA -amilasa


Johanna Elizabeth Fiallos Nez
Laboratorio de Ingeniera de las Enzimas. Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos. Ingeniera
Bioqumica. Universidad Tcnica de Ambato. Ambato Ecuador.


RESUMEN
La actividad cataltica de la enzima -amilasa se determin mediante el estudio del efecto del pH
sobre la misma; la enzima fue sometida a distintos valores de pH, realizando en total 6 ensayos.
Para la obtencin del pH ptimo de la enzima, en donde alcanza su mxima actividad cataltica, se
calcul el porcentaje de actividad mediante la aparicin de maltosa como producto. El pH de la
enzima donde se evidenci mayor actividad es de 5,4598; sin embargo al calcular el pH ptimo de
la enzima se obtuvo un valor de 4,9948, siendo este el pH en donde la enzima presenta una buena
actividad cataltica.

INTRODUCCIN
La actividad cataltica de un enzima se determina midiendo la velocidad inicial de reaccin, que es
la pendiente de la curva de progreso (curva de producto formado sustrato transformado frente
al tiempo) en el tiempo cero. Inicialmente, las reacciones transcurren linealmente, pudindose
tomar la pendiente de esta recta como velocidad inicial. A tiempos ms largos, el progreso de la
reaccin se aparta de la linealidad. Esta cada de la velocidad de reaccin se debe a la disminucin
significativa de la concentracin de sustrato, aunque tambin pueden influir otros factores como
el aumento de la concentracin de producto, cambios de pH, inactivacin del enzima, etc. La
mxima fiabilidad en la determinacin de la actividad de un enzima la suministra el valor de
velocidad inicial o velocidad durante el tramo inicial de progreso lineal de la reaccin (ALDAVE,
2011).
La actividad de un enzima se ve afectada por el pH al cual se lleva a cabo la reaccin. La curva
actividad-pH puede ser diferente para cada tipo de enzima. En el caso ms general la curva tiene
forma de campana. El valor de pH al cual la actividad es mxima se denomina pH optimo; dicho pH
no tiene porqu coincidir con el pH intracelular. La relacin entre el pH y la actividad depende del
comportamiento cido-base del enzima y del propio sustrato. Sustrato y enzima (centro activo)
pueden contener grupos funcionales cidos y bsicos, siendo su grado de disociacin dependiente
del pH, lo que determinar, entre otros aspectos, la conformacin de la protena, la capacidad de
unin del sustrato al centro activo del enzima (Km) y la capacidad de transformacin del sustrato
(kcat). Los estudios cinticos a diferentes valores de pH nos proporcionan informacin sobre el
mecanismo cataltico de los enzimas y la naturaleza de los aminocidos ms directamente
implicados en la catlisis (ALDAVE, 2011).
El presente trabajo tiene como objetivo determinar la influencia del pH sobre la actividad de la
enzima B-amilasa as como tambin su pH ptimo.

MATERIALES Y MTODOS
Preparacin del tampn acetato de sodio 0,02M de pH 4,5 (100 ml): Se prepar las soluciones de
cido actico y acetato de sodio 0,02M y se las mezclo hasta conseguir que el pH de la mezcla sea
de 4,5 (relacin de mezcla aproximada de 1:1).
Soluciones tampn citrato-fosfato de pH 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 y 7,0 (50 ml): Se
mezclaron las soluciones de cido ctrico (0,05 M) y fosfato dibsico de sodio (0,1 M) de modo que
el pH final de cada una de ellas alcance los valores antes indicados.
Soluciones de almidn al 1% (20 ml) en cada uno de los tampones citrato-fosfato: Se pes la
cantidad de almidn soluble correspondiente y se suspendi en 20 ml de tampn citrato-fosfato,
se calent la suspensin bajo agitacin y se dej hervir durante 3 min. Se enfri y restituyo el agua
evaporada. Se midi el valor de pH de cada sustrato (valor real que ser usado para la grfica y el
clculo del pH ptimo).
Solucin de enzima 1/40 en tampn acetato (10 ml).- Se prepar la dilucin final de la enzima por
diluciones sucesivas (1 dil 1/10; 3,0 mL) y (2 ; 10 mL).
Preparacin de la curva estndar de Maltosa: Se utilizaron los valores de absorbancia y
concentraciones de la curva estndar de maltosa de la prctica 1.
Determinacin de la actividad inicial a 20 C: Se coloc en una gradilla 36 tubos bacteriolgicos
perfectamente lavados y marcados con el valor de pH; 3 tubos por cada valor de pH ms un
blanco. Se aadi a cada tubo 0,4 ml de la solucin de sustrato y se los termostatiz a 20C al igual
que la solucin de enzima por 10 minutos. Se agregaron 0,1 ml de la solucin de enzima a cada
una de las rplicas, se dej que la reaccin proceda durante 3 minutos y se detuvo la reaccin con
la adicin de 0,5 ml de solucin de DNS. Se mezcl bien, se dej hervir por 5 minutos, se enfri, se
aadi 5 ml de agua destilada y se ley la absorbancia a 540 nm frente a un blanco preparado
invirtiendo el orden de adicin de los reactivos (enzima, DNS y sustrato).

RESULTADOS
La estructura tridimensional de una enzima de origen proteico determina su sitio cataltico y, por
lo tanto, su actividad. Dicha estructura se encuentra estabilizada por una serie de enlaces no
covalentes (hidrofbicos, puentes de hidrgeno, atracciones electrostticas) y covalentes (puentes
de disulfuro) que existen entre los grupos R de los aminocidos. Los cambios de pH modifican las
cargas de los grupos R de los aminocidos que no son neutros, e interfieren con las atracciones
electrostticas y su estabilidad estructural tridimensional, lo que provoca una prdida total o
parcial de la actividad enzimtica. (QUESADA, 2008)

Las enzimas son protenas, como tales poseen grupos ionizables cuyo estado depende del valor del
pH; por lo tanto la accin de las enzimas se altera al variar ste parmetro y es preciso controlarlo
por medio de un tampn si se quiere obtener resultados concordantes. La influencia del pH sobre
la actividad cataltica de la enzima -amilasa fue estudiada experimentalmente mediante la

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realizacin de 8 ensayos en donde los pH a los cuales la enzima fue sometida son los siguientes:
3.0, 3.5, 4.0, 6.0, 6.5, 7.0. Experimentalmente, se estudi la actividad de la enzima -amilasa a
distintos valores de pH, la cual se ve afectada por la concentracin de iones de hidrgeno
presentes en el medio afectando el grado de ionizacin de los aminocidos presentes en el sitio
activo. En general, la mayora de las enzimas son activas dentro de un estrecho rango de pH,
siendo de 5 a 9. Esto es consecuencia de los efectos de pH sobre la unin del sustrato a la enzima,
la actividad cataltica de la enzima, la ionizacin del sustrato y la variacin de la estructura
proteica. Se utiliz almidn como sustrato para la enzima -amilasa, la cual gener como
producto maltosa; la generacin de producto permite evidenciar la actividad de la enzima -
amilasa sometida a distintos valores de pH.



In.luencia del pH sobre la velocidad


cataltica de la
-amilasa

% Actividad

85,00
65,00

y = -8,9776x2 + 89,682x - 126,31


R = 0,8667

45,00
0.003 0.003 0.004 0.004 0.005 0.005 0.006 0.006 0.007 0.007
pH


Figura # 1: Efecto del pH sobre la actividad cataltica de la -amilasa

A cierto pH las cargas de los residuos de los aminocidos que participan en el sitio activo estn en
condiciones ptimas para la actividad cataltica sobre el sustrato correspondiente. Por lo tanto, a
ese pH la velocidad de la reaccin ser mxima y ese pH es conocido como pH optimo de la
enzima. Por supuesto, en valores de pH demasiado cidos o alcalinos, no solamente podr estar
modificado el sitio activo, sino que la estructura terciaria de toda la molcula se encontrara
alterada y no habr actividad enzimtica. El pH ptimo de la enzima -amilasa es de 4,9948, en
donde la enzima adquiri su mayor actividad cataltica y este fue calculado mediante regresin
cuadrtica ya que la grafica presenta una curva en forma de campana lo que refleja la ionizacin
de residuos de aminocidos que deben estar en un estado de ionizacin especifico para tener
actividad enzimtica.
El pH ptimo de la enzima -amilasa bibliogrfico es de 5 a 6 lo cual indica que el obtenido en el
laboratorio esta dentro del rango ya que presenta un pH ptimo de 4,9948.


CONCLUSIN

Se determin la influencia que tiene el parmetro de pH sobre la actividad de la enzima -amilasa,
en donde se puede concluir que la enzima presenta mayor porcentaje de actividad a 5,4598 ya que
ah se observa mayor produccin de maltosa a partir del sustrato que es el almidn. Sin embargo,
el porcentaje de actividad no esta estrechamente ligado con el pH ptimo; ya que el pH ptimo es
aquel en donde la enzima tiene condiciones adecuadas para su actividad enzimtica sin afectar a
su estructura para as evitar la desnaturalizacin de la misma. El pH ptimo obtenido
experimentalmente de la -amilasa es 4,9948, el cual indica que a este pH la enzima no se ve
afectada tanto en su estructura como en su porcentaje de actividad. Tambin, se puede concluir
que el pH ptimo experimental se asemeja al bibliogrfico ya que la -amilasa tiene un pH optimo
bibliogrfico de 5 a 6.

BIBLIOGRAFA

ALDAVE, M. (2011). Estudio cintico de la actividad invertasa de levadura de panadera.


Recuperado de:
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/32%20INVERTASA%20CINTICA.pdf

FERSHT, A. (2009). Estructura y mecanismo de las enzimas. Ed. Reverte. P.p: 149

KOLMAN, J. (2008). Color Atlas of Biochemestry. Segunda edicin. New York, USA. pp:
90,91

QUESADA, S. (2008). Manual de experimentos para laboratorio de Bioqumica.


Recuperado
de:
https://books.google.com.ec/books?id=8SAtkthrFEkC&dq=efectos+del+ph+sobre+la+activi
dad+enzimatica&hl=es&source=gbs_navlinks_s

TESIFONTE, T. (2012). Mtodo para disear alfa-amilasa con propiedades


predeterminadas. Recuperado de: http://www.oepm.es/pdf/ES/0000/000/02/39/09/ES-
2390901_T3.pdf

VOET, D. (2008). Fundamental of Biochemestry. pp: 361-370

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ANEXOS
CLCULOS:
a) Curva estndar de maltosa.

Tabla # 1: Curva estndar de maltosa
Tubo
Vol maltosa (ml) Peso (g) Vol agua (ml)
Blanco
0,000
0,000
0,600
Std 1
0,120
0,110
0,480
Std 2
0,240
0,230
0,360
Std 3
0,360
0,370
0,240
Std 4
0,480
0,480
0,120
Std 5
0,600
0,590
0,000
Fuente: Laboratorio de Ingeniera de las Enzimas
Elaborado por: Fiallos, J. (2015)

Peso T (g)
0,600
0,600
0,600
0,630
0,600
0,590

Abs
0,000
0,116
0,306
0,463
0,614
0,777

Maltosa (mg/ml)
0,0000
0,3703
0,7743
1,1863
1,6160
2,0200

Solucin m adre.
Peso: 0,0101 g
Volumen solucin: 5 ml


Concentracin solucin madre:

()

()

0,0101

5

= 2,02





Concentracin Maltosa:

= [. ]

= 2,02

0,110

0,60

= 0,3703

()

()


0,9

0,8
Absorbancia (540 nm)

0,7
0,6
0,5
0,4

y = 0,3885x - 0,0071
R = 0,99826

0,3
0,2
0,1
0
-0,1 0

0,5

1
1,5
[Maltosa] mg/ml

Figura # 2: Curva estndar de maltosa



Ecuacin para obtener la concentracin de maltosa.

= 0,3885 0,0071

= 0,3885 [] 0,0071

+ 0,0071
=

0,3885

= 2,574 + 0,01827

b) pH real de la reaccin.
Tabla # 2: Valores de pH








pH
3,0
3,5
4,0
6,0
6,5
7,0

pH sustrato
2,424
2,999
3,559
5,806
6,335
6,949

pH real
2,7542
3,2142
3,6622
5,4598
5,8830
6,3742

Fuente: Laboratorio de Ingeniera d e las Enzimas


Elaborado por: Fiallos, J. (2015)

2,5

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Ecuacin para determinar el pH real de la reaccin:
pH de la enzima: 4,075
=

4
1
= (2,424) + (4,075)
5
5

= 2,7542

Ecuacin para determinar la velocidad inicial relativa:

= !

!!"#
=

3 0

!!"#


! =

0,7107

! = 0,2369


Ecuacin para determinar el % de actividad relativa:
(%) =

% =

0,2609
100
0,5089


% = 51,2674

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