EXTRACCIN Y CARACTERIZACIN DE LOS GLICSIDOS DE LA

Stevia rebaudiana
Lirged Delgado*, Mara Anglica Torres**, Carlos Andrs Prez G.***, lvaro
Calero****
Evaluadores:

Ral Alberto Cuervo Mulet*****

Tiberio Augusto Mesa Gaviria******

Tipo de Artculo: Investigacin Cientfica y Tecnolgica

RESUMEN
El presente trabajo, se efecto con el fin de realizar una nueva metodologa de
extraccin de la Stevia rebaudiana y posteriormente la

caracterizacin de sus

glicsidos. Se investigaron diversos mtodos de extraccin: basados en solventes,

intercambio de iones, cromatografa de absorcin, fluidos presurizados. Analizando cada
procedimiento, se propone una metodologa, ajustndola a un nuevo mtodo de
extraccin y con reactivos de fcil adquisicin, teniendo como base, las extracciones de
glicsidos investigadas.

Despus de realizar ensayos de extracciones (Soxhlet,

Reflujo) con solventes, a diferentes concentraciones, variacin de temperaturas y

presiones, se opto por aquellas condiciones que permitieron obtener la mejor pureza de
la mezcla. El proceso, consiste en: secado, extraccin, precipitacin, clarificacin y
purificacin. La extraccin por soxhlet, permiti que durante el procedimiento de
Estudiante del programa de Qumica, Universidad Santiago de Cali, lirged@hotmail.com
Estudiante del programa de Qumica, Universidad Santiago de Cali, angelica.torres02@gmail.com
***
Director Centro de Investigaciones en Ciencias Bsicas, Ambientales y Desarrollo Tecnolgico (CICBA) y del
Grupo de Investigacin en Biotecnologa y Medio Ambiente (GIBMA), es Bilogo con nfasis en Gentica, especialista
en Simulacin Molecular, maestra en Bioinformtica, estudios avanzados y doctorales en Biotecnologa. Profesor de
dedicacin exclusiva de la Universidad Santiago de Cali. caperez@usc.edu.co
****
Profesor programa de Qumica, Codirector del Grupo de Investigacin en Biotecnologa y Medio Ambiente
(GIBMA), Es Qumico, maestra en Biotecnologa, exdirector de Investigaciones de la USC, coordinador del rea de
bio-remediacin, acalero@usc.edu.co
*****
Bilogo Universidad del Valle (1998), Mejor trabajo de investigacin en biologa molecular para estudiante de
pregrado, Asociacin Colombiana de Ciencias Biolgicas - A.C.C.B. -. Maestra en Ciencias Biolgicas de la
Universidad del Valle (2002). Tesis de Maestra Meritoria, Universidad Del Valle. Profesor tiempo completo
Universidad San Buenaventura Cali. racuervo@usbcali.edu.co
******
Qumico de la Universidad de Antioquia (1994), Maestra en Ciencias Qumicas de la Universidad de Antioquia
(1998). Director del programa de Qumica de la Universidad Santiago de Cali. tibermesa@yahoo.com
*

**

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purificacin, su poder endulzante permaneciera en buena cantidad. Contrario a la
extraccin por reflujo. Los controles del proceso fueron realizados mediante los anlisis
de cromatografa en placa delgada e infrarrojo (IR).

Para la identificacin de los

glicsidos presentes en una muestra de Stevia, se debe buscar sus estndares

infrarrojos (en este caso se encontr el IR de estevisido y rebaudisido A) que luego
sirven para comparar con el espectro de el extracto obtenido.
PALABRAS CLAVE: Stevia, glicsidos, estevisidos, rebaudisidos.

ABSTRACT
This research was performed to realize a new extraction methodology for the Stevia
Rebaudiana, and characterize its glucosides. Several methods were researched: solvent
based, ion exchange, absorption chromatography, and pressurized fluids; analyzing
each procedure, adjusting it to a new extraction method and with reagents of easy
acquisition, basing it on the researched glucoside extractions. After performing several
extraction trials (Soxhlet, Reflux), with solvents at different concentrations, temperature
and pressure variations, the conditions yielding the best mixture purity were chosen. The
process steps are: Drying, extraction, precipitation, clarification, and purification. The
Soxhlet extraction allowed for a good deal of the sweetening power to remain intact
during the purification step, as opposed to the reflux extraction. The process was
controlled using thin plate chromatography and IR. To identify the glucosides present in
the Stevia sample, their infrared standards were looked up. In this case the stevioside
and rebaudioside A infrared standards were found, which can be compared with the
produced extract's spectrum.
KEY WORDS: Stevia, Glucosides, Steviosides, Rebaudiosides.

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INTRODUCCIN
La Stevia rebaudiana, Ca-ch o hierba dulce, crece en forma silvestre en algunas
zonas de Paraguay, Brasil y provincias del nordeste argentino1. Es utilizada desde hace
ms de 1000 aos por los aborgenes del lugar para endulzar sus alimentos.
Sus hojas tienen un intenso sabor dulce, propiedad que se debe al contenido de
glicsidos, de los cuales el estevisido es el que se halla en mayor proporcin, seguido
del rebaudisido A, B, C, D, E, dulcsido A y B, esteviol 2. Presentan caractersticas de
estabilidad al calor (198-200C), al pH en un rango de tres a nueve, no se fermentan, y
son de 200 a 300 veces ms dulce que la sacarosa.3
Adems, desde hace tiempo se sabe que el rebaudisido A es el que tiene mejor
propiedades sensoriales (es ms dulce y menos amargo) de los cuatro4.
El motivo que llevo a realizar este proyecto, es la necesidad de implementar un nuevo
mtodo de extraccin del edulcorante, contenido en la hoja de la planta, debido a que en
la actualidad, no se ha implementado este procedimiento a nivel nacional, sino en el
exterior. Las extracciones conocidas tienen costos muy elevados y no son favorables
econmicamente. En Colombia, las personas se han dedicado al cultivo de Stevia tipo
morita II, por ser el tipo de planta ms dulce y su fcil adaptacin en varias regiones del
pas, pero no han realizado investigaciones en la planta.

Alicia Ester Soto1 y Susana Del Val2. Extraccin de los principios edulcorantes de la stevia rebaudiana.
URL: http://www2.uca.edu.ar/esp/sec-fagrarias/esp/docs-revista/volumenes/pdf/vol20_1.pdf
2
LAURA DAYANA LPEZ TORRES y LUIS GUILLERMO PEA GUEVARA. Plan Estratgico Para La Creacin De
Una Empresa, Dedicada A La Produccin Y Comercializacin De Edulcorante A Base De stevia. Tesis De Grado.
Biocomercio sostenible. Stevia Rebaudiana Bertoni Instituto de Investigacin de Recursos Biolgicos Alexander von
Humboldt. 2002. URL: http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ingenieria/tesis17.pdf
3
David I. Habeych; Catalina Giraldo1; Luz D. Marn. Universidad EAFIT. Departamento de Ingeniera de Procesos.
Desarrollo de un proceso de extraccin y purificacin de glicsidos de Stevia rebaudiana. En: XXIII Congreso
Colombiano de Ingeniera. Qumica. ...
URL: http://www.eafit.edu.co/NR/rdonlyres/16CF7453-10B0-468D-801AD E561FF5A1F 5/0/Cuaderno41.pdf
4
Eustas, European stevia association: componente botanic de stevia.
URL: http://www.eustas.org/esp/botanic_esp.htm

55
El consumo de Stevia es cada vez mayor, por lo cual se debe investigar y desarrollar
una alternativa de extraccin econmica y socialmente viable, favoreciendo as su
consumo regional y nacional. Adems, existen motivos para a nivel de la salud para su
consumo, por ejemplo: puede ser consumida por personas con diabetes, obesidad,
ayuda a la prevencin de caries, etc. La planta ha llamado la atencin en un momento
de incremento en la demanda de los alimentos alternativos bajos en caloras y se ha
demostrado resultados prometedores en investigaciones mdicas en el tratamiento de la
obesidad y presin arterial. La Stevia no tiene ningn efecto en el azcar en sangre, y es
por esta razn, que resulta un edulcorante natural atractivo para el uso de pacientes
diabticos y los que se encuentran bajo dietas con control de hidratos de carbono5.
Por tanto, es necesario buscar un endulzante como la Stevia, que cumpla con las
necesidades actuales de las personas, y que ante todo no tiene efectos txicos. En
Argentina y en Colombia su uso esta avalado tanto por la Liga Argentina de Proteccin
al Diabtico como por la Federacin Diabetolgica Colombiana respectivamente6.

1. MATERIALES Y METODOS
Para el desarrollo de la investigacin se utilizaron equipos a reflujo y soxhlet,
rotoevaporador, plancha de calentamiento, erlenmeyer, horno, molino de cuchillas,
equipo de extraccin al vacio, beackers, platillo de pruebas, papel filtro, frasco lavador,
balanza de precisin, esptula, varilla de agitacin, agua destilada, magneto, baln
aforado, pipeta, gotero, cromatografa infrarroja, carbn activado, hidrxido de calcio,
etanol, cloroformo, anhdrido actico, cido sulfrico, dixido de titanio.

Todo sobre stevia. Instituto de Estudios Salud Natural de Chile. IESN-Chile. Informe del IESN - Noviembre 2001.
URL: http://www.geocities.com/iesnchile/todostevia.html
6
LAURA DAYANA LPEZ TORRES y LUIS GUILLERMO PEA GUEVARA. Plan Estratgico Para La Creacin De
Una Empresa, Dedicada A La Produccin Y Comercializacin De Edulcorante A Base De stevia. Tesis De Grado.
Biocomercio sostenible. Stevia Rebaudiana Bertoni Instituto de Investigacin de Recursos Biolgicos Alexander von
Humboldt. 2002. 18. URL: http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ingenieria/tesis17.pdf

56
El mtodo, consiste en secar las hojas de stevia en un horno aproximadamente a unos
35C, luego se busca obtener el extracto de la planta por los mtodos de extraccin
soxhlet y reflujo, con el fin de determinar por cual de los dos mtodos se obtiene un
extracto que tenga el mejor dulzor y pureza. Una vez obtenida las muestras se
precipitan sus impurezas y luego se someten a clarificacin y purificacin. Por ultimo se
realiza a las muestras la prueba de Liebermann Burchard (identifica la presencia de
terpenos) y un anlisis de infrarrojo (para la caracterizacin de los glicsidos de la
Stevia).
El proceso se inicia, secando en un horno aproximadamente a 35C, 671g de hojas
Stevia para evaporar el agua contenida en ellas.
Posteriormente se pasa a triturar a un molino de cuchillas tipo Willey Mill con el objetivo
que durante la extraccin se obtenga la mayor parte de los glicsidos responsable del
sabor dulce.
Para la obtencin del extracto de Stevia, se utiliza dos mtodos de extraccin:
Soxhlet. En este mtodo la muestra (15.5g de hojas trituradas) se coloca en un filtro de
tela poroso. El filtro se coloca en el cartucho de extraccin y en el baln el solvente
(150mL de etanol). Se deja trabajar el equipo durante cinco horas.
El extracto obtenido, pasa por rotoevaporacin recuperando parte del etanol utilizado,
luego le sigue un proceso de purificacin con sal de calcio que se utiliza para precipitar
las impurezas que dan el sabor amargo y se filtran al vaco.
El producto de la filtracin pasa aun reflujo por unos 15 minutos con carbn activado que
ayudara a remover algunos pigmentos y sustancias de alto peso molecular, aclarando el
extracto; seguido de una filtracin.

57
De nuevo, la mezcla se somete a una purificacin y rotoevaporacin (para eliminar agua
de la muestra), pero adems pasa por un proceso de fotocatlisis con el objetivo de
aclarar aun ms el extracto y por ultimo se le realiza la espectroscopia de infrarrojo.
Reflujo. Al baln del equipo a reflujo, se le agrega 40g de hojas molidas secas, con
798mL de alcohol, y se deja cinco horas trabajando.
El extracto obtenido, pasan por un proceso de filtracin al vaci para remover partculas
en suspensin y posteriormente se pasan a rotoevaporar cuyo objetivo, es el de
recuperar el etanol utilizado y dejar la muestra libre de este solvente.
Luego el extracto, es tratado con una sal de calcio, y se pasa a filtrar al vaci. El
producto del proceso descrito anteriormente, se mezcla con carbn activado; para mejor
remocin de sustancias no deseadas, se coloca a reflujo la muestra, por unos 15
minutos, seguido de una filtracin. Despus la muestra es sometida de nuevo a
procesos de purificacin y una segunda rotoevaporacin, que eliminara ahora el exceso
de agua en el extracto.
Para aclarar aun ms las muestras, se somete a un proceso fotocatalitico en muy poca
cantidad. El contiguo es realizar los anlisis de caracterizacin (espectroscopia de
infrarrojo), que servirn para la identificacin de grupos funcionales y el tipo de glicsido
presente.
Prueba de identificacin de terpenos.

Para esta prueba se utilizo los extractos

obtenidos del mtodo de reflujo, soxhlet y adems el extracto de Stevia Erbal Dolce
comprada en el comercio (para comparar el cambio de color de la reaccin con las otras
dos muestras). Estas muestras fueron sometidas a la prueba de Liebermann Burchard
que identifica los terpenos. Esta reaccin consiste en agregar a un platillo de pruebas,
unas gotas de los extractos, disolverlo en cloroformo y a cada una de las muestras,
ponerlas en contacto con tres gotas de anhdrido actico y una gota de cido sulfrico
concentrado. Un cambio de color rojo, rosado o violeta en las mezclas reaccionantes en

58
el platillo de pruebas, indica la presencia de triterpenos; pero un cambio de color a
amarillo claro, indica la presencia de triterpenos saturados.

2. RESULTADOS

1. Obtencin del extracto de Stevia

El producto obtenido de los dos procedimientos (extraccin por reflujo y soxhlet)
presento una coloracin verde oscura debido los pigmentos de las hojas, arrastrados
durante el procedimiento.
Cantidad de extracto obtenido (reflujo): 607mL
Cantidad de extracto obtenido (Soxhlet) : 113mL
La cantidad de muestra obtenida de los dos equipos varia, ya que se utilizaron
cantidades diferentes de hojas de Stevia trituradas y de alcohol, debido a la capacidad
de los equipos.
2. Rotaevaporacin soxhlet
Condicin de rotoevaporacin: temperatura de 50C el bao de mara y a una
presin de 131mmHg
Cantidad de alcohol recuperado: 33.5mL
Cantidad de extracto obtenido: 23Ml
3. Rotaevaporacin reflujo
Condicin de rotoevaporacin: temperatura de 60C el bao de mara y a una
presin de 190mmHg
Cantidad de alcohol recuperado: 538mL

Cantidad de extracto obtenido: 50mL

59
4. Perdida de extracto y etanol
Soxhlet: 56.5mL ~ 56.5%
Reflujo: 191mL ~ 23.9%
5. Precipitacin con sal de calcio
Con la sal de calcio se obtuvo una buena precipitacin de impurezas y clarificacin del
extracto, adems presenta una poca reduccin del sabor dulce.
6. Purificacin
La utilizacin de carbn activado, logro precipitar aun ms impurezas y aclarar aun mas
el extracto, pero igual que el procedimiento anterior pierde algo de dulzor el producto.
Hay que tener en cuenta, que una cantidad mayor a 2g de carbn activado, logra aclarar
completamente el extracto, pero a la vez hace perder todo su dulzor. Por ello se
necesita utilizar poca cantidad de este reactivo.
Cantidad de extracto obtenido (reflujo): 100mL
Cantidad de extracto obtenido (soxhlet): 100mL
7. Segunda rotoevaporacin

Rotaevaporacin soxhlet
Cantidad rotoevaporada: 100mL de extracto
Condicin de rotoevaporacin: temperatura de 45C el bao de maria y a una
presin de 250mmHg.
Cantidad de H2O recuperada: 37mL ~ 37%
Cantidad de extracto total obtenido: 40mL
Rotaevaporacin reflujo
Cantidad rotoevaporada: 100mL

60
Condicin de rotoevaporacin: temperatura de 50C el bao de maria y a una
presin de 450mmHg.
Cantidad de H2O recuperada: 20mL ~ 20%
Cantidad de extracto total obtenido: 60mL
8. Proceso fotocataltico
Este procedimiento a base de TiO2 se utilizo para aclarar el extracto, y dio un muy buen
resultado, el color paso a ser de un amarillo mucho mas claro del que se haba obtenido.
Se debe tener cuidado al utilizar el reactivo ya que el exceso de este, en la muestra
produce la desaparicin completa del sabor dulce.
9. Reaccin de identificacin de terpenos
En este procedimiento se pudo determinar la existencia de terpenos en los extractos de
reflujo, soxhlet y de la muestra comprada en el comercio por la prueba de Liebermann
Burchard. El cambio de color de la reaccin amarillo, indico la presencia de terpenos.
10. Anlisis de caracterizacin
Para la caracterizacin de los glicsidos de la Stevia, se realizo anlisis de infrarrojo a
los extractos resultantes del reflujo, soxhlet, y a un extracto de Stevia (estandarizado a
un mnimo de 90% de estevisido, incluido un 60% de rebaudisido A, segn las
indicaciones de la etiqueta del producto) comprado en el comercio para tener una
muestra patrn. A parte se encontr los IR estndar del estevisido y rebaudiosido A.
Espectro infrarrojo de extracto de Stevia (reflujo)
Al comparar el espectro del extracto obtenido a reflujo con el infrarrojo estndar de
rebaudisido A y del estevisido, se destaca la similitud del espectro IR estndar del
rebaudisido A, con el espectro IR de la figura 1. Adems si se compara con la figura
2, de nuevo se ve una similitud que indica la presencia de algn tipo de glicsido.
En la figura 1, se puede observar la presencia de algunos grupos funcionales que
hacen parte de la estructura de los glicsidos como son: una tensin OH entre (3300-

61
2500cm-1), tensin C-O (1232.43cm-1) y un alqueno a (2918cm-1) que puede ser el
siguiente:

Figura 1. Infrarrojo de muestra obtenida por reflujo

Es posible que la falta de presencia de ms grupos funcionales en los resultados de

infrarrojo se deba a la presencia de agua en el extracto que interfiere en el anlisis;
durante el desarrollo de la investigacin, los extractos se sometieron a
rotoevaporacin, para separar el agua de la muestra.
Vale la pena sealar, que se utiliz otro mtodo para eliminar lo que todava exista
de agua en el extracto; con un desecador al vacio con sulfato de magnesio (MgSO 4)
y otra prueba con sulfato de sodio (NaSO4); pero estos procedimientos, modificaron
el sabor dulce del extracto dando un sabor desagradable.

62

Figura 2. Infrarrojo de extracto liquido de Stevia, adquirido en el comercio

11.

Espectro infrarrojo de extracto de Stevia (soxhlet)

Figura 3. Infrarrojo de muestra obtenida por soxhlet

63
De acuerdo a los resultados del anlisis, se plantea por similitud de los espectros de
la figura 3 y el estndar de rebaudisido A, la presencia del rebaudisido A en la
muestra obtenida. La similitud de la figura 2 con la figura 3, permite plantear la
presencia de componentes dulces en la planta.
Se logra identificar en la grafica, la presencia de un alqueno a 1078.13 de la forma:

Tambin se puede ver a 1253.64 un alcohol primario (-CH2-OH), y de un alcohol

secundario (-CH-OH) a 3269.12.
12. Porcentaje de rendimiento del procedimiento a reflujo

% de rendimiento

Rendimiento de la reaccin
x 100
rendimiento terico

Porcentaje de rendimiento del Reflujo

Porcentaje de rendimiento: 607/798*100%=76%
Perdida de etanol y extracto: 798-607=191mL
191/798*100%=23.9% perdida de etanol y extracto.
Porcentaje de rendimiento de la primera rotoevaporacin
Porcentaje de rendimiento : 538/798*100% = 67.4%
Total de la mezcla obtenida: 538+50 = 588 mL
Perdida de mezcla: 607-588 = 19mL
19/607*100% = 3.1% perdida de mezcla
Perdida de etanol: 607-50 = 557mL
557/607*100% = 91.7%
Porcentaje de rendimiento de filtracin y purificacin
Porcentaje de rendimiento de la mezcla: 100/123*100% = 81.3%

64
Perdida de mezcla: 123-100= 23mL
23/123*100% =18.7% perdida de mezcla
Porcentaje de rendimiento de la segunda rotoevaporacin
Porcentaje de rendimiento: 60/100*100% = 60%
Total de la mezcla obtenida: 20+60 = 80mL
Perdida de agua: 100-60 = 40mL
40/100*100% = 40% perdida de agua
Perdida de mezcla: 100-80 = 20mL
20/100*100% = 40% perdida de mezcla

13. Porcentaje de rendimiento del procedimiento en soxhlet

Porcentaje de rendimiento del soxhlet

Porcentaje de rendimiento: 113/150*100% = 75.3%

Perdida de etanol y extracto: 150-113 = 37mL
37/150*100% = 24.6% perdida de etanol y extracto.
Porcentaje de rendimiento de la primera rotoevaporacin

Porcentaje de rendimiento: 33.5/150*100 = 22.3%

Total de la mezcla obtenida: 33.5+23 = 56.5mL
Perdida de la mezcla: 11356.5 = 56.5mL
56.5/113*100 = 50% perdida de mezcla
Perdida de etanol: 113-23 = 90mL
90/113*100% = 79.6% perdida de etanol
Porcentaje de rendimiento de filtracin y purificacin

Porcentaje de rendimiento: 100/123*100 = 81.3%

Perdida de mezcla: 123-100 = 23mL
23/123*100 = 18.7% perdida de mezcla

65
Porcentaje de rendimiento de la segunda rotoevaporacin

Porcentaje de rendimiento: 40/100*100 = 40%

Total de la mezcla obtenida: 37+40 = 77mL
Perdida de agua: 100-40 = 60mL
60/100*100 = 60% perdida de agua

Perdida de la mezcla: 100-77 = 23mL

23/100*100 = 23%
14. Recuperacin de solventes y reactivos
El procedimiento que se ejecuto en el laboratorio tiene beneficios tales,

como la

recuperacin de solventes como el etanol, carbono activado, y el agua. Siendo tiles en

el proceso como reutilizables.

3. CONCLUSIONES
Durante el procedimiento de extraccin se utilizaron dos mtodos,

extraccin por

reflujo y soxhlet, es este ultimo dio mejores resultados, ya que tiene el poder de
extraer ms el dulzor de la planta pero no proporcion el mejor rendimiento con
respecto al otro procedimiento.
De los dos mtodos de extraccin utilizados, se concluyo que la extraccin a reflujo
arrastra mayor componentes no deseados que provocan el mal sabor.
La extraccin es econmicamente rentable, ya que los reactivos principales,
utilizados en el proceso, se utilizan en poca cantidad, y sus precios son asequibles.
Los anlisis de infrarrojo a las muestras obtenidas durante la investigacin, plantean
la presencia del rebaudisido A, ya que sus espectros tienen similitud con el
estndar de este tipo de glicsido.

66
La presencia de rebaudisido A, nos indica que el extracto lquido, tiene un buen
sabor dulce y muy poca presencia de sabor amargo, ya que es caracterstico de
este glicsido.
La prueba de Liebermann Burchard, permiti identificar los terpenos en los
extractos obtenidos en el laboratorio, lo que nos indica que si existe la presencia de
glicsidos (es un tipo de terpeno) causantes el sabor dulce en las muestras.
Si se compara el espectro infrarrojo del extracto de Stevia adquirido en el comercio
(figura 2), que presenta rebaudisido A y estevisido, con los espectros infrarrojos de
los extractos obtenidos en el laboratorios (figuras 1 y 3), se puede observar que
presentan picos a la misma longitud de onda, as que comparten los mismos grupos
funcionales, caractersticos de la estructura de los glicsidos de la Stevia.
Existe tcnicas (ejemplo: centrifugacin, variacin de pH, resinas inicas) utilizadas
para obtener un mejor extracto de Stevia, pero involucran altos costos, donde a
veces no se obtienen buen rendimiento y utilizan reactivos que no se pueden
reutilizar; en comparacin con el mtodo implementado en esta investigacin, donde
existe un buen rendimiento e involucra reactivos reutilizables y de bajo costo.
El rendimiento del proceso de extraccin de glicsidos depende de condiciones de
cultivo de la Stevia y la eficacia del mtodo de extraccin de los componentes dulces
de la planta.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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Stevia rebaudiana.
URL:http://www2.uca.edu.ar/esp/secfagrarias/esp/docsrevista/volumenes/pdf/vol20_1
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67

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the Stevia rebaudiana plant.Canadian Intellectual Property Office. 1999.
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