Recuperacin de ADN genmico del gametforo de

Physcomitrella patens
1. Precalentar el buffer de extraccin cTAB a 60C por 30 min.
Buffer cTAB
4% cTAB (2% cTAB)
1.4 M NaCl
20 mM EDTA pH 8
100 mM Tris HCl pH 8
2. Colocar 3mL de Buffer de extraccin en un mortero y agregar de
250-300 mg de musgo. Moler vigorosamente. Para 30mg se
adicion 300 L de Buffer.
3. Transferir el homogenizado a microtubos de 1.5 L. Incubar a 60C
por 30 min
4. Centrifugar a 10 000 rpm por 15 min.
5. Transferir el sobrenadante a nuevos tubos. Agregar 50 L de
RNAsa (20 g/mL). Incubar a 37C por 30 min.
6. Agregar 1 volumen de cloroformo-alcohol isoamlico (24:1).
Centrifugar a 10 000 rpm por 15 min.
7. Recuperar el sobrenadante en tubos nuevos y adicionar 1 volumen
de cloroformo-alcohol isoamlico (24:1). Centrifugar 10 000 rpm
por 15 min.
8. Recuperar el sobrenadante en tubos nuevos. Adicionar 2/3 partes
del volumen de isopropanol y dejar que precipite toda la noche a
-20C.
9. Centrifugar el tubo a 14 000 rpm/ 15 min y decantar el
sobrenadante.
10.
Lavar el pellet con etanol al 70% por 10 min. Centrifugar a
14 000 rpm por 5 min. Decantar el sobrenadante y secar el pellet
al aire libre.
11.
Resuspender el ADN genmico en 50 L de agua libre de
RNAsas.