Introduccién EI ADN de todas las especies de organismos conocicas tie- nea misma estructura qulmica; sin embargo, cada organs ‘mo es completamente diferente a otro; la diferencia se debe al orden de las bases nitrogenadas en la molécula de ADN. Los organismos de una misma especie comparten secuen cias en su molécula de ADN, pero atin dentro de la misma especie existen variaciones entre individuos. Organismos de una misma especie compartiran regiones de su secuen cia hasta en més de 99%, lo que les confiere caracteristicas similares; més ain, los familiares cercanos tendrén secuen- cias con mayor parecido entre ellos, pero nunca serén igua Jes, lo que definelavariabilidad genéticaintrac interespecies. En l caso del ADN humane, las secuencias que contie- nen alos genes son poco variables dentro de la especie; no obstante, el resto de Ia secuencia es muy propenso a la variabilidad y, debido a que hay millones de pares de bases por molécula de ADN y un alto porcentaje de ésta no codi fica para una proteina, ada persona tiene una secuencia de ADN tinica, lo que permite identificarlo tan sélo por el orden de sus pares de bases. Estas secuencias variables se dlenominan polimorismos. Existen clos tipos de polimorfismos genéticos: los que ruestran cambio de un solo nucleétido por sustitucién de bases ylos que implican cambios en el tamarto dela secuencias esto puede deberse a inserciones o deleciones de secuen- cias de ADN, o bien ala repeticin de bases (0 combinacién de bases) de manera continua en un segmento del ADN. Esta variabilidad es un proceso biol6gico comiin, ya que 30% de Ta secuencia de ADN es altamente repetitivo, lo ue permite establecer patrones genéticos especificos para identficarindividuos, es decir, para establecer una huella genética 0 huella de ADN (ADN fingerprinting) Por elo, ls cientificos han desarrollado estrategias para poder identifica individuos al analiza patrones repetitivos m Polimorfismos de ADN y huella genética Belinda Claudia Gémez Meda / Ana Lourdes Zamora Pérez ‘Maria Guadalupe Sénchez Parada de ADN, los cuales no son un selloexacto, pero si permiten relacionar muestras de un mismo origen © de personas emparentadas familiares, ancestros comunes). Estas secuen- cias se elgieron porque se conoce que varian entre indivi duos no relacionados, de tal manera que el andlisis de un grupo de ellas para encontrar concoréancias permite inferir asociaciones con probabilidades alta de que tener un mismo origen o ser de la misma persona. ‘Un gen esté representado como una seccién de exomoso- sma, que equivale a un segmento de ADN con una secuencia, dleterminada, con la informacién necesaria para crear una proteina especifica. Los genes de un organismo contienen toda lainformacién de manera precisa acerca de cada aspec! toy proceso de la formacién y desarrollo de un individuo:s bien, los genes no pueden dictar su comportamiento, por lo que hay que consierar que el ambiente desempetia un papel ‘uy importante en e6mo estos genes se expresan a lo largo dea vida del organismo. Un gen se presenta en doble dosis, uno que aporta el padre y otro la madre; a estas copias se le lama alos, por Jo que hay dos alelos por cada gen, uno de origen materno y otto paterno. Estas formas aélicas de un mismo gen existen porque la secuencia del ADN esté sometida a cambios, en ocasiones debiclo a mutaciones que suceden al azar pero que originan formas alternas de un gen, estables y hereda bles, a veces con una funcién diferente a alelo original o silvestre. La mutacién es la base de la variacién gradual de Ia estructura genética de las poblaciones; esto es, la base de a evolucisn La posicién fisica donde se ubica un gen en el genoma se denomina locus (loc en plural), por tanto los aelos si vestres © modifieados de un mismo gen residen en un mis mo locus. Cuando un individuo tiene diferentes formas alélicas en el locus se dice que es heterocigoto, ya que la secuencia de cada alelo puede generar variantes de la mis ‘ma proteina, Por el contrario, un homocigoto seria identifi-172 PARTENL © Metocologia Gel ADN rcombinante cado cuando el individuo presente la misma forma allica (de origen paterno y materno) en el focus, el resultado de la expresion génica ser un mismo producto proteico, ya seaa partir del alelo silvestre o del modificado. Polimorfismos Las secuencias variables son mltiples en los organismos, los andlisis de genética poblacional han permitid detectar dos o més alelos por cada una, y cuantos mAs alelos diferen- tes hay es mas polimérfico; es decir, hay mayor poder de identificacién, ya que como existe mayor variabilidad en las secuencias, seri menos probable que dos individuos com- partan las mismas regiones polimsrficas. Se considera que hay un polimorfismo genético cuando existen miltiplesalelos de un gen en una poblacién definida 6, de manera més especiica, cuando la secuencia de bases nitrogenadas de la molécula de ADN de un focus en particu- lar es variable entre los organismos de una poblacién. La palabra polimorfismo esti compuesta por poli (rmchos), morfo (forma) e imo (proceso 0 estado); es decir, “de muchas formas’ Los écidos nucleicos y las proteinas tie- nen a propiedad de presentarse en diferentes formas molecu iplesalelos, lo que puede tener implicaciones en las patologias moleculares. Un polimorfismo puede observarse en un individuo completo (polimorfismo fenott- pico), en formas variables de proteinas o grupos sanguineos (polimortismo bioquimico), en las caracteristicas morfol6- gicas de los cromosomas (polimorfismo cromossmico) 0 en el ADN, por diferencias en la secuencia nucleotidica (polimoriismos del ADN). Las variantes alélicas de las secuencias codificantes de genes en el ADN, debidas 2 procesos normales de a funcién celular, propician la produccién de codones polimérficos y, con ello, de formas alternas de las proteinas, aunque gene ralmente sin que se altere la funcién del producto sintetiza- do, lo que permite diferenciar un polimorfismo de una mutacidn, lo que se da generalmente al azar E1 polimorfismo puede presentarse en la regién promo- tora del gen, lo cual influye en la expresién génica del ARN ‘mensajero y, por ello, en la proteina que codifica (diferentes fenotipos) 0 inclusive identificarse en regiones no traduci- das (intrones), de tal forma que no se tiene una interpreta cidn de su funcidn, al menos conocida hasta ahora, pero siguen siendo secuencias que permiten diferenciar indivi- duos y especies. Los polimorfismos, como las mutaciones, pueden ela ficarse, de acuerdo con st efecto, como polimorfismos sinénimos o silentes (los que no cambian la traduccién del producto proteico en la variacién de la secuencia; estos, Jos que, cuando la secuencia nucleatidica cambia, el co- ddén que codificaba al aminodcido original se cambia por otro que codifiea para el mismo aminodcido 0 por otro con caracteristicas quimicas similares), y polimorfismos no sindnimos (los que si producen variacién en la lectura del cédigo genético, por alterar codones que cambian el senti- do de la traduccién de un aminodcido por otro, Ademés, se considera que los polimorfismos neutros, que son los que varfan en su secuencia en regiones no codificables del ADN, también son silentes, Un polimorfismo se considera neutro sila presencia o ausencia del alelo no confiere ninguna ven- {aja o desventaja al individuo. Ademés, un polimorfismo puede representar ventajas evolutivas para una determina- da poblacién, como conferirle resistencia a condiciones medioambientales, de acuerdo eon la zona geogréfica en la que habita El término polimérsico es itil para definir genes o alelos, ¢ incluso se observan secuencias que varian mucho, como enllosalelos que definen los grupos sanguineos ylas molécu- las de los antigenos leucocitarios humanos (HLA, human leukocyte antigen, que constituye el complejo mayor de his- tocompatibilidad), a los que se considera altamente poli- mérficos. En genética, el concepto basico de polimorfismo mencio- nna que cuando un alelo en un focus en la poblacién presenta tuna frecuencia de més de 1% se denomina polimérfic. Este porcentaje indica que la presencia de estas variantes es comin y no se da porazar, es decir, que el alelo menos comin no puede mantener su frecuencia simplemente por muta- cin Los polimorfismos se acumulan en las poblaciones hasta aque se tornan comunes entre las especies; entonces se deno- rminan divergencia genética. Asi, con el paso del tiempo, un polimorfismo podria legar a presentarse en un alto porcen- taje de una poblacién e incluso ser tan comin como un alelo silvestre. Por tanto, un alelo que originalmente pudo consi- derarse polimérfico puede llegar a ser el alelo més comiin en tuna poblacién. {a combinacién de secuencias en los alelos que se here- dan es tinica para cada descendiente; as, el andlisis de sus polimorfismos permite obtener un patrén o perfil definiéo “nico para cada organismo, semejante a cédigo de barras de los productos de los supermercados. A esto se le denomina ella genética individual, por su semejanza a las huellas dactilares, tambign Ginicas y caractersticas de cada persona. Los polimorfismos se utilizan como marcadores genéti~ cos para identificar o relacionar a personas, ya que al ser heredables, generalmente sin cambios de padres a hijos, permiten establecer parentescos biol6gicos directos, ya que Comparten los mismos marcadores. Para poder llevar a cabo estos estudios de marcadores, en primer lugar hay que definir los tipos de polimorfismos genéticos, ya que pueden clasficarse de acuerdo con dife- rencias de estructura, forma de transmisién, distribucion, estabilidad, tamafio, Dado a que los métodos de estudio identificacién de polimorfismos son diversos y cada opcién tiene ventajas y desventajas, la uilizaci6n de varios tipos de polimorfismos que aporten diferente informacién sobre su herencia e individualidad permite obtener resultados mas amplios y les para una interpretacién adecuada,Tipos de polimorfismos Las caracteristicas de las secuencias que permiten detectar sitios polimérficos son muy variables, Asi, pueden diferen- ciarse dos tipos de polimorfismos: los que involucran cam- bios en un solo nucleétido y en los que intervienen deleciones o inserciones de pocos o muchos pares de bases. De acuerdo con esta clasificacién, los marcadores poli- miérficos mAs utilizados para realizar un perfil genético son: + Polimorfismos de un solo nuclestido o nuclestido tinico {single nucleotide polymorphism, SNP). + Polimorfismos de longitu de fragmentos de restriceién restriction fragments length polymorphism, RELP), + Nimero variable de repeticiones continuas 0 en tén- dem (variable numbers of tandem repeats, VNTR). De estos polimorfismos se diferencian dos tipos: minisaté- lites y microsatéltes. + Repeticiones cortas y continua (short tandem repeats, STR). + Polimorfismos del cromosoma ¥. + Marcadores mitocondriales, + Insertion-deletion (InDel) Polimorfismos de un solo nucleétido o nucledtido Gnico ‘Como sit nombre lo indica, los SNP son variaciones en un solo nuclestido o par de bases en una secuencia dada (figu- xa 18-1). Estos polimorfismos pueden estar representados porla delecién, insercién o sustitucién de una base nitroge- nada enla secuencia nucleotidica normal. Este tipo de poli- ‘morfismo es muy frecuente, yse ha deserito que es posible encontrar un SNP en el ADN humane cada 1000 a 3000 pb, en secuencias codificantes de proteinas. Adem&s, es posible que estén presentes de manera més cercana en el ADN no codificante, inclusive entre 500 a 1000 pb en promedio, Las ventajas de los SNP como biomarcadores son bisi- camente su amplia distribucidn a través de todo el genoma hhumano, st frecuencia y su estabilidad: ademés, debido a su alta frecuencia, muchas enfermedades genéticas estin cau- sadas por un SNP o se relacionan con laidentificacién de un SNP especifico. Polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccién Este tipo de polimorfismos se evidencian mediante el uso de enzimas de restriccién, que cortarin determinadas secuencias de ADN. De este modo se generan fragmentos (de restriceién), que pueden hibridar con sondas especifi- cas para poder reconocerlos. Si un SNP afecta el sitio de restricciOn de una enzima, se evidenciaré un polimorfismo de restriccién 0 RFLP. Cuando el cambio de un nuclestido altera la secuencia diana para una determinada enzima de restriccion puede detectarse el polimorfismo en funcién de la variacién que éste genera en el patrén de restriccién. En los casos en que el sitio de restriccidn se reconozca en ambas cadenas de ADN, se consideraré un homocigoto, yal CAPITULO 18 » Poliorfimos de ADNy huell genética 173) Polmorfismes genéticas CODONES POLIMGRFICOS Sogento exbevintrn Nelo L TEPTRTETETATTEE Melo? CEPETTTETTTTET ‘codon polmértica CoA Figura 18-1. Polimorfismo SNP. Representado por el cambio de Una base por oa. resolver los fragmentos en un corrimiento electroforético se obtendré como resultado una sola banda en el gel, a una distancia determinada (figura 18-2). Elhecho de que un individuo sea heterocigoto significa que tiene alelos diferentes en un determinado locus, por Jo queal identifica su secuencia en un gel se observard mas de una banda: una para el fragmento sin corte de restriceién y otras con el corte, En este caso, el niimero de variantes alé- licas es siempre dos (C: corta/NC: no corta) y se maneja en fancién de la identificacin del sitio de restriecién por la enzima utiizada en la digestin es decir, si corta ono corta en la secuencia analizada. En cambio, pueden identificarse tues genotipos: homocigoto para corte C/C, heterocigoto CINC y homocigoto para no corte NCINC (figura 18-3). De esta manera se identifica alos individuos con reconoe 40090 Piso mm Sond “Sia de reconacimientoy carte Figure 18-2. Polmorfismos genétieos RFLP Sitio de reconocimiento de la enzima de restriccién en un fragmento de ADN, me~ diante el cual se pueden evidenciar segmentos de diferente longtud de acuerdo con el fragmenta de restriccién generaco. Rosultado de la cigestion.Alelo 1. Bandas variables (nay reconacimiento del sitio de restriccién y hay corte enzimatico; se evidencian dos fragmentos ce 400 y 160 pb). Alla 2. Banca Ainica (na hay reconacimiento del sito de restriccién por la tenzima, y por Io tanto no hay corte observando s6lo una banda de 560 po),174 ——-PARTEML + Metocologia Gel ADN recombinante Marcador 2po AA ne 300 pb 275 pb 250 pb 225 ob 200 ab 178 ab 150 pb 19900 125 pb 4135 00 100 pb 795 Hi 00 Figura 18-3. SNP THFRI-383 A>, identitead por PORSRFLP. Frag rmentos de digestisn esperados para el polmortismo TNFRI -282 ADC. Se muestra el patién de bandeo obtenido de un gel 1e electroforesis donde se eviiencia la digestion con la enzima Bg I para cl polimorfismo TNFR1-383 ASC y se identifican siferentes genotipos: AA (136 y 64 pb, que identifica el homo- cigoto para corte de la enzima de restriccin; AC (199, 135 y 64 po), donde se observa un heleroc!got, el cual muestra una ‘banda sin corte debido @ que no hubo recanacimiento por la lenzima, y oo par de bandas que muestran el corte enzimatico por el reccnacimiento del sitio de restriccién, y CC (199 pa, {ue muestra al hamocigato sin corte, es decir, que na presenta el sito de recanocimiento gare el carte par la enzima, y por lo ‘anio, ambos alelos se evidencian con una sole banda, miento de la enzima de restriccién en ambos alelos, en uno solo o en ninguno de ellos figura 18-3). Elhecho de poder diferenciar homocigotos de heteroci- gotos mediante este tipo de polimorfismos permite definir alos RFLP como codominantes; es decir, que ambos alelos se manifiestan sin dominar la expresién de uno sobre el otro. Sin embargo, a pesar de que los RFLP son prueba de que existe variacidn heredable en el ADN, este tipo de poli- mortismos suele ser dificil de encontrar, y en todo caso, sélo permite determinar si se presenta o no un sitio pol mérfico en una secuencia especifica, Por ello, su utilizacién enel diagnéstico indirecto es limitada, ya que normalmente presentan un niimero de alelos bajo. Satélites, microsatélites y minisatélites EL ADN satélite se define como secuencias repetitivas de tamafio variable, que pueden ir desde los 100 a los 200 rnucledtidos repetidos en bloque uno tras otvo (en tandem), Polimorsmos gensticos NICROSATELITES Gen gy Segment INTRON ES exdninttn —— Aelol FEEETTELETERATR (60s elo 2 er (Cy Nucletiidos potinértices Fgura 18-4. Deteccidn de mcrosatéltes. La detecci6n de micro- salélites se realiza ex regoones no codificantes del ADN, en el cual se muestran alelos con diferencia en la repeticién de ruclestidos de una secuencia analizada, cientos o miles de veces a lo largo del genoma. Estas secuen- cias estin localizadas en la heterocromatina constitutiva (por ejemplo, en los centrémeros o en regiones cercanas a los telémeros), aunque en ocasiones estén presentes en algunas regiones intracromosémicas. Asimismo, ao largo de la secuencia de ADN es posible encontrar secuencias en las que se repiten de 2a 9 pb, deno- minados microsatéltes, 0 repeticiones de 10 a 60 pb, llama- dos minisatélfes, que son mas ttiles para estudios de identificacién que los satélites. Su identificacién se lleva a cabo mediante reaccién en cadens de la polimerasa (PCR) con iniciadores especificos que flanquean el sitio de la secuencia donde estan localizados los mini o microsatélites, y su variaci6n se identifica de acuerdo con el ntimero de secuencias repetidas presentes, que puede ir deste dos repeticiones hasta cientos. Los mini o microsatélites se encuentran muy distribuidos a lo largo del genoma, aunque los minisatéites, en particular, se localizan con frecuencia cerca de la regidn telomérica. Se consideran polimorfismos codominantes, de tal forma que un heterocigoto generars dos bandas en un corrimiento electroforético, mientras que los homocigotos generarén slo una banda con tamafo variable, de acuerdo con el ntimera de repeticiones existen- tes en ol individuo (figura 18-4). Estas regiones de ADN repetidas en blogue o en tan- dem estén sujetas @ procesos como duplicacién o recombi nacién, por lo que pueden ser altamente variables y diferir ‘mucho entre individuos, lo que las convierte en marcadores genéticos muy informativos. Polimorfismos con nimero variable de repeticiones con- tinuas 0 en tandem, y con repeticiones cortas y continuas Los VNTR y STR se consideran microsatélites 0 minisatéli- tes, es decir, loci que corresponden a secuencias cortas de ADN (un par o trio de bases), repetidas en bloque o tandem tun niimero espeeifica de veces. La longitud de estas secuen- cias puede ser de pocas bases hasta algunas decenas dePolmorfismes gersticos VNTR Ae mE 2 eters 7 RIED) 5 pcicones A SP 1 ciclones = Sonda (southern blot nied repetica en tandem Figur 18-5 Anlisis de VNTR, Se muestra el andlisis ce VNTR tn alelos de diferentes individuos, en el cual se abserva la vatiacién en el niimero de secuencias epetidas en bloque 0 tandem, que seré distintivo para cada incividuo, de acuerdo con el marcador evaluado, nucleétidos, y la cantidad de repeticiones determinars la variabilidad de alelos distintos en un mismo focus. Asi, en un mismo cromosoma pueden exist regiones con diferen- te ntimero de repeticiones en la poblacién (figura 18-5). Fstos polimorfismos se localizan con frecuencia en regiones intrénicas 0 no codificantes, su longitud es varia~ ble, de entre 20 y 100 pb repetidas y su variabilidad es alta dentro de las poblaciones, lo que permite su uso confiable en la identificaciin de individuos. Debido a que los polimorfismos son heredables, una persona podré presentar VNTR heredados de su madee y padre, pero no podria presentar VNTR que sus padres no tengan. De esta manera, las secuencias repetidas de un indi- Viduo presentan un patrn tnico, y mientras més VNTR sean analizados mas distintivo e individualizado seré el per- filo patrén polimérfico obtenido, tal como las huellas dac- tilares, slo que a escala molecular (figura 18-6). El andlisis con STR se basa en los microsatélites y se diferencian en motivos repetidos, denominados perfectos cuando se presentan sin interrupcién y de forma ordenada (por ejemplo, TATATATATATATA); en caso contrario, se trata de repeticiones interrumpidas (TATATAGCTATAT) ‘© combinadas (TATATAGCGCGCGCGCTATATA), La desventaja principal de este tipo de polimorfismos es que no estén distribuidos por todo el genoma, lo que limita su uso para determinadas condiciones o enfermedades; sin embargo, su aplicacién ha sido amplia en pruebas de pater- nidad y en genética forense. Polimorfismos del cromosoma Y El eromosoma ¥ tiene recombinacién genética con suhomé- Jogo (cromosoma X) sélo en aproximadamente 1% de st secuencia; por ello, la porcién no recombinante es de espe- cial interés, ya que contiene secuencias que no se encuentran, en otras regiones del ADN nuclear, ademas de que son pura- ‘mente de herencia paterna a hijos varones. Sie interés es determinar relaciones familiares de heren- cia paterna, compara familiares o descendientes varones, los. CAPITULO 18 » Poliorfismos de ADNy huella genética 175) A Abuelos AP 2 Bc an Fa Padres FG Fe, L ° Fa Hos FORA sa-= 8 - ¢ -- =-+ > —— E - rm --- 6 = H - +--+ Figur 188. Mentificacién de pareneseo. De acuerdo con el patrén dde bandeo de un andls's de marcadores heredados de padres a hijos se reaiza la identficacién del parentesco, polimorfismos de utilidad serfan secuencias especiticas del cromosoma Y, las cuales se identifican mediante amplifica- idm de regiones determinadas, utilizando iniciadores espe- cificos La secuencia de la heterocromatina del cromosoma ¥ es variable yao largo de la molécula se han identificado secuen- cias repetitivas tipo microsatélites, como repeticiones AC. ‘Ademés, hay que considerar que el indice de mutacin para cl cromosoma Y es muy bajo y no tiene implicaciones nega~ tivas para la reproduccién, de manera que son variaciones ‘muy tiles para identifiar parentescos 0 rastrear deseen- dientes por linea paterna. Esto también ha servido, en los estudios evolutivos dela especie humana, para ia determina- cin de un origen comtin, producto de una sola migracién procedente de Africa Marcadores polimérficos mitocondriales La mitocondria es un organelo celular que existe en milti- ples copias segtin el tipo de célula. Las mitocondrias son exclusivamente de herencia materna es decit, todos los des- cendientes tendrn en sus células mitocondrias de su madre. Esto se debe a que en e! momento de la fecundacién el évulo conserva las mitocondrias en el ctoplasma, mientras que las mitocondirias de espermatoroide, que se encuentran en el cuello, entre la cabeza y a cola, se eliminan y no se integran al interior del évulo para la formacién del embrién. Este método permite identifica a individuos de acuerdo con parentescos por linea materna, ya que todos los hermanos, hombres y mujeres, compattirén a misma informacién en st ADN mitocondrial (ADNm).Las ventajas del andlisis del178 ——-PARTENL © Metocologia Ge ADN rcombinante ADNm es que existen miiltiples mitoconddrias (1x 10-1 x 108 copias) por célula, cada una con varias moléculas de ADNm, caracterizado por ser una doble hebra circular y tener un genoma pequeno (16569 pb, que codifica para 37 genes). Ademés, este genoma presenta una alta tasa de ‘mutacién (5 a 10 veces més que el ADN nuclear), lo que le confiete hipervariabilidad, Este tipo de anslisis es iil, sobre todo para anilisis evolutivos, antropolégicos o forenses, 0 cuando no se tiene facil acceso al ADN nuclear, éste esta doteriorado o existe en infimas cantidades. Para llevar a cabo este tipo de anilisis, es necesario extraer el ADNm. Para ello, se requiere amplificar regiones determinadas del ADNm, en particular las regiones hiper- variables HV1 (16024-16035, 342 pb) y HV2 (73-340, 267 pb), localizadas en la regién control, que es la zona que regula la transcripcién de fa molécula, Estos segmentos de ADNm son luego secuenciados y comparados con mues- tras de familiares provenientes por linea materna, por cl tipo de herencia mitocondral, para detectar diferencias en la secuencia génica. Insertion-deletion Se han descrito polimorfismos que consisten en bases inser- tadas o suprimidas. Las secuencias involucradas son peque- fas, en general de hasta 10 pb; sin embargo, es posible que se presenten secuencias de hasta 1000 a 1500 pb, como en el caso dela insercién de elementos transponibles 0 transposo- nes (fenémeno de transposicin, presente en algunos genes que pueden moverse a través del genoma y reinsertarse en lugares definidos en otra regién cromosémica) Polimorfismos de secuencias aleatorias Es posible analizar polimorfismos de fragmentos 0 secuen- cias de ADN amplificado de forma aleatoria (Random Amplified Polymorphic ADN, RAPD). La ventaja de esta técnica es que no se requiere conocimiento previo de la secuencia ni sondas homélogas, como en los RELP, lo que la convierte en una opcién como prueba tamiz. En este caso, para la amplificacion se utilizan iniciado- res de 8 a 10 pb con secuencia aleatoria, de manera que, de encontrarse las secuencias de complementariedad entre el iniciador y la muestra de estudio, puede amplificarse una ‘muestra representativa del genoma.. Al realizar anélisis por electroforesis se evidenciarsn rmiltiples bandas que muestran fragmentos de ADN; es deci, si existiera homologia en las secuencias éstas s amplificadas y evidenciadas como una sola banda, mientras que sino existiera homologia entre el iniciador ya muestra, debido a algin cambio en la secuencia que hiciera perder la regién de acoplamiento del iniciador, entonces el fragmento no amplificaria y no habria banda, Con este método no es posible diferenciar heterocigotos de homocigotos que pre- senten la secuencia, ya que en ambos se presentaria la ban- dacen el gel, por es0 se dice que es una prueba tamiz, ya que sélo identifica si se encuentra la secuencia en la muestra, pero no si esta secuencia se presenta en miltiples alelos © s6lo en uno. Polimorfismos de proteinas Pueden realizarse estudios de polimorfismos de proteinas, mediante la identificacién de la secuencia de aminascidos. Esto es especialmente itil para la diferenciacién de isoenzi- ‘mas en el citoplasma celular, mediante la deteceién de ‘mutaciones no sinénimas en el ADN, que ocasionarian que Ia estructura primaria de la proteina tuviera variaciones, aunque sin alterar su accién sobre un mismo sustrato, sino que sélo afectaria su afinidad por el mismo. Este andlisis se lleva a cabo mediante electroforesis, bbasado en que, al cambiar en la secuencia un aminoscido por otro con propiedades fisicaquimicas diferentes (por ejemplo, un aminoscido por uno bésico, o uno polar por uno ro polar), la estructura final de la proteina seria diferente y sus patrones de migracién en la electroforesis se verian afectadas, ya que las cargas ¢ interacciones entre aminoéci- dos tendrian variaciones. Estas variantes se consideran polimorfismos codominantes, ya que pueden tener funcién proteica ala par de su homélogo silvestre. Este analisses itl para identificar polimorfismos en pro- {einas que tienen funcién enzimatica. Las variantes pue~ den dar diferente respuesta metabética y ocasionar que la homeostasis se altere. Hay que considerar, sin embargo, la influencia ambiental, ya que sista es minima es mas seneillo analizar las consecuencias de un polimorfismo en la activi- dad de Ia enzima. Como ejemplo cabe mencionar las enzi- mas metabilicas de la familia citocroma P-450 (CYP450), que intervienen en la transformacién, neutralizacién y elimi- nacién de compuestos, por ejemplo, de los medicamentos. Utilidad del andlisis de patrones polimérficos o huella genética de ADN Los métodos de estudio, cada vex. més precisos, permiten llevar a cabo los anslisis de marcadores genéticos casi con certeza absoluta. Sin embargo, el estudio de polimorfismos requiere de conocimientos técnicos y cientficos adecuados, ademés de una gran experiencia en la interpretacién de los resultados, afin de que éstos sean confiables. a creacién de perfiles genéticas por medio de polimor- fismos se realiza con marcagores 0 regiones con patrones de repeticién definidas (micro 0 minisatéites). £1 perfil genético, o huella de ADN, determinaré el genotipo de un individu de acuerdo con los marcadores genéticos analizados. Cuanto ‘mayor seael niimero de marcadores analizados, mayor seri la certeza para la identificacién del individuo o para la confir- macién de la relacién filial lo que permite realizar estudios de patemnidad, filogenéticos,o de genética forense o criminalisti- a, para la identificacién molecular de individu. Los polimorfismos pueden asociarse directa o indirec- tamente a patologias o procesos de enfermedad especificos,© incluso servir para establecer asociaciones entre Ia pre~ sencia del polimorfismo con un gen defectuoso cercano 41, por estudios de desequilibrio de ligamiento o solamente como marcadores de susceptibilidad, en los que su identifi- cacién permite establecer riesgos para el desarrollo de enfermedades multifactoriales. Los polimorfismos conocidos y més tiles son general- ‘mente modificaciones puntuales de la secuencia de ADN. Estas modificaciones se estudian principalmente para estu- dios de riesgo genético para diversas enfermedades, aunque también se consideran las variaciones de secuencia de frag ‘mentos de cromosomas, como las alteraciones cromos6mi- cas estudiadas en el cariotipo, los segmentos polimérficos en Ia heterocromatina del cromosoma ¥, o las secuencias repetitivas, inserciones o deleciones, entre otras. Estas iti- ras, si bien también sirven para el diagndstico genético, son més titiles para estudios de identificacién familar, filia~ cin, identificacion de individuos en accidentes, criminalis- tica y ciencia forense, entre otros. La identificacién de SNP tiene una gran importancia en Ja investigacién biomédica, ya que ha permitido conocer y entender el proceso de enfermedad, asi como poder esta- blecer estrategias de tratamiento, control y prevencidn. Su aplicacién clinica incluye, por ejemplo, la identifica- cidn de genotipo F del gen de apolipoprotesna E humano (APOE), que se ha asociado con enfermedades del metabo- lismo de lipidos y con susceptibilidad a desarrollar la enfer- medad de Alzheimer Enel gen del meti-tetrahidrofolato reductasa (MTHRE), involucrado en el metabolismo de folatos, se reconoce como distintivo el polimorfismo Cis677Tre, que genera una enzi- ‘ma termolabil menos activa. Esto produce niveles bajos de folato en plasma y niveles elevados de homocisteina, lo que estéligado a enfermedad cardiovascular Los polimorfismos en enzimas metabolizadoras de fér- ‘macos ocasionan diferencias en la respuesta al tratamiento yen efectos de éste entre pacientes, ya que la biotransfor- macién de cada compuesto puede varia, segiin el genotipo del individuo. Los SNP en estas enzimas han servido para identificar de forma temprana efectos secundarios a férma- os, incompatibilidad o resistencia a terapias y variacién enla eficacia de medicamentos. Todo esto ayuda al médico en Ja toma de decisiones de la terapéutica adecuada para cada paciente. A este proceso se le conace como medicina perso- nalizada, ara la farmacogenética es de gran utilidad el estudio de los genes CYP4S0, entre ellos el CYP2D6, que metaboliza tuna gran cantidad de farmacos y presenta miltiples varian- tes alélicas. Se definen cuatro fenotipos, de acuerdo con la actividad que presente su producto génico, es decir si seran metabolizadores répidos, funcionales, Ientos o pobres (sin fancién enzimsatia). Todo ello conlleva implicaciones clini cas importantes. Por un lado, en un metabolizador lento o pobre la permanencia en la célula de los compuestos o sus formas reactivas més tiempo del necesario podria ocasio- CAPITULO 18 » Poliorfsmos deADNy huell genética 177) nat toxicidad, debido a la falta de uno de los alelos funcio- nales (lento) 0 por teneralelos que producen variantes poco fancionales de la enzima (isoenzimas) o carecer de la enzi- rma (pobre). Por otro lado, un metabolizador répido (0 ultrarrépido) puede tener mas de dos copias del alelo activo, lo que produce enzimas altamente funcionales con activi- dad enzimstica acelerada, de manera que el compuesto se metaboliza tan répido que posiblemente pierda eficacia. ‘También son importantes los polimorfismos de acetila- cidn de genes involucrados en el metabolismo de una gran variedad de compuestos con arilaminas e hidracinas, ade- ris de carcinégenos. Estos compuestos son metabolizados por la enzima citosélica N-acctiltransferasa (NAT2), donde Ia identificacién de polimorfismos se ha asocindo con una fancién disminuida de la enzima. A esto se le conoce como fenotipo acetilador lento y conlleva riesgo o susceptibilidad aumentada a padecer céncer colorrectal o de vejiga. Para el diagnéstico genético, el estudio de polimorfis- mos tipo SNP permite idemtticar variantes allicas que se han asociado con riesgo de presentar enfermedades, sobre todo multifactoriales. Estas determinaciones ayudan a esta- blecer programas de prevencidn, ya que al ser mulifacto- rial, el componente ambiental tiene una gran importancia. Asi, si se sospecha o existe la certeza de tener variantes génicas de riesgo es posible hacer cambios en diversos fac- tores del estilo de vida que puedan desencadenar la enfer- medad. Por ejemplo, diversos SNP se han asociado con la predisposicién a padecer diabetes tipo 2, entre ellos SNP en el gen PPARG (peroxisome proliferator-activated receptor gamma o receptor de gltazona NR1C3, 181801282 Pro12Ala, C/G), receptor nuclear implicado en el metabolismo de ghi- cosa y en el catabolismo y almacenamiento de los scidos sgrasos. El gen ENPPI (ecto-nucleétido pirofosfatasa/fosto- diesterasa | 0 PCI, 151044498 Lis121GIn, C/A), que codifi- ca para una glucoproteina de membrana clase 2, se ha asociado con resistencia a la insulina. Ademés, el gen 1L6 {interleucina 6, 151800795 -174, G/C) es citocina con fun- iones bioldgicas diversas, incluida Ia respuesta inmune. ‘Ademés, en muchos de los SNP asociados se han encontra- do variantes no sinénimas, de tal manera que el producto génico dela secuencia modificada tendria una alta probabi- lidad de conferir alteraciones funcionales. Por otro lado, la tipifiaciéa de genomas microbianos per- rite determinar la distribucién de los tipos microbianos en determinada poblacién, su patogenicidad y resistencia atrata- :ientos o inmunogenicidad, Esto permite monitorizar pobla- ciones en riesgo de manera anticipada,identiicar patrones de transmision y crear nuevos férmacos 0 vacunas. Métodos de deteccién de patrones polimérficos o huella de ADN A fin de encontrar secuencias especificas con un patron determinado que permitan el corte con enzimas de restric- cidn o que puedan hibridarse para su deteccién, se emplean178 -PARTENL © Metocologia Gel ADN rcombinante varios abordajes comunes, basados en la homologia de las secuencias de ADN con sondas especificas. Segiin las reglas de Chargaff, el grado en el cual dos secuencias de ADN se complementen © emparejan se Ie Il ‘ma homologia. Una complementariedad total entre dos frag mentos de ADN demuestra una alta homologia, mientras que una complementariedad s6lo en una pequefa porcién de pares de bases pone de manifesto una baja homologis Para detectar polimorfismos se pueden emplear diversas téenicas el Southern blot es un método ideal para detectar polimorfismos en el ADN, ya que mediante el uso de sondas especificas para identificar secuencias repetidas (VNTR 0 STR), localiza regiones de hibridacién homélogas a una secuencia de interés. Asimismo, la PCR con enzimas de res- triecién y electroforesis permite localizar secuencias blanco (vor el capitulo 15, Téenicas de hibridacion). Existe también una técnica en la cual, mediante PCR, se amplifican regiones polimérficas gue incluyen varios poli- morfismos (AmpFLP). Esta técnica se ha automatizado y permite estudiar y crear arboles filogenéticos, basados en anilisis comparativo de muestras de ADN individuales. Ast, pueden distinguirse VNTR de manera sencilla ya.un costo relativamente bajo, lo que hace a este tipo de métodos populares aun en laboratorios o paises con bajos recursos. Para el anslisis de STR, los loci con STR, en primer lugar, se tratan con iniciadores especificos para amplificar fragmentos que contengan secuencias cortas (cuatro bases repetidas) con repeticiones continuas, para después ser separadas por electroforesis en gel o capila, afin de docu- ‘mentar el niimero de repeticiones y distinguir patrones de repeticién que puedan compararse y asociarse con un estindar 0 blanco, Se debe contar con una secuencia de referencia para establecer o descartar asociaciones, por ejemplo, en una investigacién criminal, contar con mucs- tras de ADN obtenidas de una victima, para que puedan compararse con la muestra del sospechoso. Los STR son comunes, los comparten 5 a 20% de las personas, lo que obliga ala biisqueda de combinaciones de loci en reacciones multiplex, para lograr un método ade- cuado de discriminacién e identificacion precisa, al con derar siempre una secuencia base o de referencia con la cual hacer la comparacién. Controversias en el andlisis de la huella genética La identificacién de polimorfismos para establecer un patrén genético o huella genética es itil en diversos campos de estudio, Por ejemplo, en ciencias forenses permite com- parar sospechosos mediante muestras de sangre, cabello, saliva o semen, afin de determinar responsabilidad o exone- racidn en jucios criminales. También es itil en la identifica cién de restos humanos, familiares extraviados, pruebas de paternidad, identificacién de inmigrantes 0 personas indo- cumentadas, para establecer relaciones biol6gicas familiares para confirmar, por ejemplo, la situacién legal de un menor, su nacionalidad w origen, y también son titles para determi- nar la compatibilidad de érganos en trasplantes, asi como para definir el origen y/o la composicién de alimentos: inclu- so puede usarse en estudios evolutivos de poblaciones ani- rales slvajes 0 para postular hipétesis acerca de a genética poblacional yas migraciones hurmanas através del tiempo. A pesar de que este método de identificacién mediante la huella de ADN se considera equivalente al cédigo de barras de un producto comercial, ya que cada persona tiene tun patrén genético especifico, hasta ahora los VNTR sélo dan evidencia de probabilidad (mayor o menor) de que el patrén genético analizado sea homélogo 0 concuerde con el de una persona en particular. Sin embargo, esta probabi- lidad estaria definida como de homologia de 1 en 2 mil millones, lo que no descarta la posibilidad de que no lo sea 6,10 que es mas comiin, de que la técnica se haya llevado a cabo de manera poco confiable y haya error 0 falsos positi- vos. Esto se ha abordado con prontitud y actualmente exis- ten normas y reglamentaciones universales de seguridad y precisién en el anilisis de huella de ADN, que permiten rinimizar el error técnico Para solventar estos problemas es itil la automatizacién de los procesos, asi como el andlisis de combinaciones de polimorfismos raros (0 poco comunes entre las personas). Estos permiten crear patrones que incrementan la probabi- lidad de que las muestras en comparacin efectivamente coincidan, en el caso de identificar que provengan de la misma persona, o que correlacionen, en el caso de estable- cer relaciones biol6gicas familiares, considerando las varia ciones debido a diferencias en raza o etnia, Todo ello involucra en gran medica a la genética de poblaciones para establecer relaciones entre lineas racials. En un futuro le huella del ADN podria ser una herra- mienta ttil de identificacién para todas las personas al racer, aunque sobre este tema todavia existe controversia respecto a asuntos bioéticos. Hasta el momento existen bases de datos, sobre todo de earscter judicial, que permi- ten identificar a sospechosos en juicios criminales, lo que doja faera a todas las personas que no hayan pasado por algiin proceso de este tipo, Se plantea que solicitar la huella genética de cualquier persona sin alguna razén de carécter penal podria considerarse discriminator. Fsto seria fécil~ mente rebatible si la prueba se aplicase a toda persona al racer, ya que seria una forma de identificacién personal Vilida y contiable; sin embargo, los costos que implica llevar a cabo of anilisis para cada persona atin son muy altos, lo que lo vuelve de momento una alternativa no préctica y poco viable. tra implicacién de cardcter ético se refere al diagnés- tico genético, ya que realizar andlisis de polimorfismos aso- ciados a enfermedades produce resultados (positives 0 negativos) que atafien ala familia por completo y no sélo al ‘propositus 0 individuo en estudio. Ello, en ocasiones, ante enfermedades o situaciones delicadas, genera conflictosentre lo que deben o no saber los demés miembros de la familia y/o cuanto poder tiene el propositus para evitar que dicha informacién pueda difundirse o utilizarse para otros fines, de cardeter comercial o legal que pudieran afectarle en sutvida laboral o personal. Este seria el caso silas compa- fifas aseguradoras pudieran definir primas especificas a personas con determinado patrén genético, Por otra parte, Ejercicios de repaso |. Identificacién de fragmentos de restriccién para genotpi- car de forma diferencial homocigotos de heterocigotos: 11, Indique en la linea inferior de cada carril os genctipas correspondientes a los siguentes tragmentos de diges- tién, para cada una de las muestras de los pacientes re- presentadas en el siguiente gel Fragmentos de cigestion esperados: GG (131, 103, 60 pb), GC (163, 131,103, 60 pb), cc (131 y 163 pb. Enzima de resiricci6n utlizada: Bgl! Gel donde se muestra la digestion para el polimorismo TGFB1+S15 CoG PACIENTES 203 300 po 275 po 250 po 225 po 200 po 175 pb 250 pb 225 pb 200 po 75 pp 50 po 2505 | Identficacin de parentesco a partir de la herencia de ale- los. De acuerdo con el siguiente patrén de bandeo, identi. aque en la linea el genotipo de cada uno de los hijos en esta genealogia. CAPITULO 18 » Poliorfismos de ADNy huella genética 179 Ja identificacién de factores de riesgo 0 predisposicion a diversas enfermedades seria sumamente ttil para la pre- vvencién y el tratamiento adecuados de las enfermedades y sgeneraria beneficios médicos y socioeconémicos evidentes, sin dejar de lado por supuesto el estudio y el control del factor ambiental, con grandes implicaciones en el desarro- Ilo y la expresion de cierto perfil genético. A Abuelos 12 [34 56 | 78 2 acres 14 Py Hios 1 2 3 2 5 5 7 a 2. Considere el siguiente andls's de marcadores de una fa- mila y, tomanéo como base los alelos cistintivos de am- bos padtes, identiique y explique la iiacién de cada uno de los hijo. Madre Padre Hio1 Hio2 Hijo3— Hio4180 —-PARTEML + Metocologia Gel ADN recombinante SUEDE Daniels M., owern A. Phaemacogenomics SNPing away. Biocke mist 2003-23. Hot D. A primer of population genetics, 3d, Boston: Sinauer Associates; 2000 Joireys A, Wiso® V, Theln S.L. 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