Mtodo Cromognico-Fluorognico para la identificacin y/o recuento de

Escherichia coli y coliformes con el empleo del medio

CromoCen CC
BioCen, cdigo 4227
Aplicacin en muestras clnicas
1. INTRODUCCIN
La infeccin urinaria es un proceso inflamatorio de los rganos urinarios o de sus glndulas
anexas. Estas son producidas por los grmenes de la propia flora intestinal que vienen
acompaando las heces que de forma ascendente y por proximidad, van colonizando la vagina. La
bacteria ms frecuentemente aislada en las infecciones es la Escherichia coli, encontrndose en un
porcentaje de 75 al 95 % de los casos segn el tipo de paciente. La incidencia de estas infecciones
va ligadas a la edad y el sexo.
Para poder dar un diagnstico seguro del microorganismo causante de la infeccin los hospitales
requieren de mucho tiempo. El desarrollo alcanzado en la microbiologa a nivel mundial hace
posible diagnosticar los grmenes causantes de esta enfermedad, empleando los medios
cromognicos y fluorognicos, en el menor tiempo.
CromoCen CC es un medio cromognico-fluorognico para la deteccin y enumeracin de
Escherichia coli y coliformes.
El medio basa su funcionamiento en la combinacin de la reaccin cromognica del sustrato 5bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactopiransido (X-gal) para la deteccin de actividad galactosidasa
presente tanto en E. coli, como en el resto de los coliformes, conjuntamente con una sal de 4metil-umbeliferil--D-glucurnido (MUG) para la deteccin de la actividad de E. coli por la
aparicin de fluorescencia azul, permitiendo un procedimiento ms sencillo. En la fase
confirmativa, se comprueba la presencia de E. coli con la prueba de Indol Rpida y/o de
Glutamato descarboxilasa (GAD). La combinacin de nutrientes en el medio, conjuntamente con
inhibidores para los microorganismos Gram-positivos, permite el adecuado crecimiento y
recuperacin de los microorganismos de inters.
La combinacin de nutrientes en el medio, conjuntamente con inhibidores para los
microorganismos Gram-positivos, permite el adecuado crecimiento y recuperacin de los
microorganismos e inters.
En este documento se describe el mtodo alternativo apropiado para la identificacin y/o recuento
de E. coli y coliformes.
2. INDICADORES DE DESEMPEO DEL MEDIO CromoCen CC
Sensibilidad diagnstica para Escherichia coli: 97,6 %
Especificidad diagnstica para Escherichia coli: 97,3 %
Exactitud diagnstica para Escherichia coli: 97,5 %
Sensibilidad diagnstica para coliformes totales: 99,6 %
Especificidad diagnstica para coliformes totales: 98,8 %
Exactitud diagnstica para coliformes totales: 99,3 %
Con el medio CromoCen CC, se logra una sensibilidad analtica de 10 -6 UFC/mL a partir de un
inculo estandarizado a 0,5 de la escala MacFarland.
*El nmero de tubo utilizado de la escala MacFarland, ser el equivalente a 3x10 8 UFC/mL,
equivalente adems al 50 % de transmitancia determinada mediante el espectrofotmetro.

3. CONDICIONES DE SEGURIDAD
1. Manipule los microorganismos con extremo cuidado segn los requisitos de Seguridad
Biolgica. Estos microorganismos se encuentran en el grupo de riesgo 2.
2. En caso de derrame de diluciones de microorganismos o medios inoculados, bloquee la
zona al acceso de cualquier persona. Inmediatamente aada solucin desinfectante
(alcohol al 70 % o fenol al 3 %) y mantngala sobre la superficie aproximadamente 15
min. Recoja el material derramado, limpie la zona.
3. En caso de quemadura en la piel por derrame de medios de cultivo calientes, lave
rpidamente la zona con agua fresca y acuda al mdico si es necesario.
4. Use bata de laboratorio.
4. PROCEDIMIENTO PARA EL CONTROL DE LA CALIDAD
1. Determinacin de pH.
2. Evaluacin microbiolgica.
Ver Anexo A
5. TRMINOS Y DEFINICIONES
Escherichia: Es un gnero de la familia Enterobacteriaceae (Brenner, 1984). En este medio
Escherichia coli se define como aquellas bacterias que producen colonias con centro azul verdoso,
con fluorescencia azul bajo luz ultravioleta (366 nm), pudiendo presentar bordes blancos
regulares o irregulares y halos de color azul o azul verdoso alrededor de las colonias.
Coliformes: Este grupo agrupa a todas las bacterias entricas como por ejemplo Escherichia,
Klebsiella, Enetrobacter, Citrobacter. En este medio se definen como aquellas bacterias que
producen colonias azul verdosas en su centro, o en toda la superficie de la colonia, con o sin
fluorescencia azul bajo luz ultravioleta (366 nm), pudiendo presentar bordes blancos, regulares o
irregulares y halos de color azul o azul verdoso alrededor de las colonias.
6. SIEMBRA EN PLACAS E IDENTIFICACIN
Inocule el medio selectivo:
Medio CromoCen CC
Incube el medio a 35 2 C durante 18-24 h.
El crecimiento tpico de Escherichia en el medio CromoCen CC son colonias azul verdosas con
fluorescencia azul bajo la luz ultravioleta (366 nm), pudiendo presentar bordes blancos regulares
o irregulares y halos de color azul o azul verdoso alrededor de las colonias.
El crecimiento tpico de los coliformes en el medio CromoCen CC son colonias azul-verdoso en su
centro, o en toda la superficie de la colonia, con o sin fluorescencia azul bajo luz ultravioleta (366
nm), pudiendo presentar bordes blancos, regulares o irregulares y halos de color azul o azul
verdoso alrededor de las colonias.
7. CONFIRMACIN DE IDENTIDAD
Si se exige como parte de una norma o regulacin, para conformar la presencia de E. coli, a las
colonias que aparezcan en el medio CromoCen CC de color azul verdosa con flourescencia se le
realiza solamente las pruebas de confirmacin (prueba rpida de GAD y de indol rpido).
Las colonias seleccionadas debern ser de un nmero de al menos 5 por placa.

8. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Ver Anexo B
Medio CromoCen CC
Reactivo para la prueba GAD
Reactivos para prueba rpida de Indol
Solucin salina
9. EQUIPAMIENTO, UTENSILIOS Y SUSTANCIAS ADICIONALES
9.1 Equipamiento y materiales.
Horno o autoclave.
Incubadora (capaz de operar a las temperaturas 35 2 C).
Bao termostatado (capaz de operar a la temperatura de 35 2 C).
pH-metro con una exactitud en la calibracin de 0.1 unidades de pH de 20 C a 25 C.
Lmpara UV de onda larga (366 nm).
Contador de colonias.
Licuadora.
Asa calibrada de 10 L.
Asa de platino.
Frascos e capacidad apropiada.
Pipetas graduadas o automticas, de capacidades de 1 y 10 mL, graduadas en divisiones
de 0,5 y 0,1 mL.
Placas Petri ( 90 mm).
10. MICROORGANISMOS INTERFERENTES Y REACCIONES ATPICAS
En el caso de la deteccin de la actividad de la enzima -D-glucuronidasa (GUD) con el sustrato 4metilumbeliferil--D-glucurnido (MUG) incluido en el medio se debe tener en cuenta que esta
enzima est presente en el 94-96 % de las cepas de E. coli (HARTMAN 1989). Solo unas pocas
cepas de Salmonella, Shigella y Yersinia son capaces de producir esta enzima tambin y pueden
fluorescer en el medio CromoCen CC. En el caso de Salmonella y Shigella, las colonias se
observarn en el medio CromoCen CC de color blanco por lo que no interfieren en la deteccin
de E. coli (centro verde azul, bordes blancos, regulares o irregulares, con posibles halos azules o
verde azules y con fluorescencia azul).
Algunas cepas patognicas de E. coli, por ejemplo E. coli O157:H7, no poseen actividad GUD.
Otras especies de Escherichia no producen la enzima (RICE et al., 1991) y por tanto no fluorescen
en el medio. ALONSO et al. (1996) encontraron cepas de Klebsiella oxytoca, Serratia fonticola y
Yersinia intermedia capaces de producir GUD. Otros autores reportan cepas positivas a esta
enzima en cepas de Citrobacter freundii (GAUTHIER et al., 1991, MANAFI, 1995, PREZ et el.,
1986, SHADIX et al., 1993).
Algunas cepas de Pseudomonas, en especial Pseudomonas aeruginosa, producen un pigmento
que exhibe una fluorescencia verdosa bajo la luz ultravioleta (UV). Cepas de Pseudomonas
fluorescens muestran fluorescencia azulosa, pero la coloracin de sus colonias es blanca. Pueden
presentarse otras cepas de Pseudomonas de coloracin verdosa, pero con fluorescencia verde.
La enzima -D-galactosidasa que escinde al sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolyl--Dgalactopiransido (X-gal) presente en el medio, se puede encontrar en cepas de Aeromonas y
puede generar falsos positivos. A. hydrophila, A. sobria, Vibrio metschnikovii y V. vulnificus
pueden dar reacciones tpicas de coliformes; A. hydrophila incluso a muy bajas densidades (LEY
et al., 1993).

En aquellas muestras, en que se sospeche la presencia de Aeromonas, que puedan interferir en la

identificacin y/o recuento de coliformes, se recomienda adicionar a la muestra lquida solucin
cefsulodina a concentracin de 5 mg/L. Si la muestra es slida se adiciona dicha cantidad al agua
de peptona buferada. Otro procedimiento puede consistir en picar algunas colonias verde-azules
(mnimo 5) y realizar la prueba rpida de citocromo oxidasa para confirmar su ausencia o
presencia. De comprobarse la presencia de Aeromonas, recalcule el recuento para obtener el
recuento confirmado de coliformes ([nmero de colonias verde-azules citocromo oxidasa
negativas/nmero de colonias picadas para la prueba] 100).
Por otra parte, algunas cepas de Serratia, considerada por varios autores como coliformes (Kreig,
1984; Topley, 1997; Swing, 1986; Ballows, 1992), pueden dar una coloracin rosada intensa a roja
en el medio debido a su pigmentacin propia.
Otra consideracin a tener en cuenta es que la fluorescencia puede difundir al medio en un
perodo de tiempo relativamente corto, sobre todo a pH cido, por lo que se recomienda, para la
cuantificacin de E. coli, la lectura de los resultados en las 18-24 h establecidas. El rango de
concentracin de UFC para lograr un recuento efectivo es de 30 a 300 UFC/placa, aunque para
una mejor visualizacin y cuantificacin de E. coli, se obtienen mejores resultados en el rango de
25 a 100 UFC/placa.
Las reacciones tpicas de los microorganismos diana se mantiene estable ms all de las 18-24 h
recomendadas de incubacin. La fluorescencia y el color de las colonias se mantiene hasta las 48 h de
incubacin, observndose colonias de color ms intenso y de mayor tamao, la fluorescencia puede
difundir al medio, y el halo alrededor de la colonia de E. coli, si est presente, puede aumentar su
dimetro.
11. PROCEDIMIENTO
11.1 Muestras
La preparacin de las muestras se ejecuta segn los procedimientos establecidos para la toma,
transportacin, recepcin y tratamiento en dependencia del tipo de muestras: clnicas,
veterinarias y aguas.
El tamao de la muestra debe ser el adecuado para realizar el examen microscpico y el cultivo.
De ser posible, en el caso de las muestras clnicas y veterinarias, deben tomarse antes de iniciar
la terapia antimicrobiana. Si la muestra no va a ser procesada de inmediato debe almacenarse en
refrigeracin a 4 C y trasladarse al laboratorio en un medio de transporte adecuado (ej. Medio
Transporte de Stuart) que proporcione condiciones de pH y humedad.
Es importante que el laboratorio reciba muestras que no hayan sufrido daos o cambios en su
composicin y estado.
Tipos de muestras que pueden ser procesadas por este mtodo: orina, heces fecales,
coprocultivos, vaginales, uretrales, o cualquier otro tipo de muestra donde se sospeche la
presencia de los microorganismos diana.
El mtodo de recogida de orina para el diagnstico de infeccin urinaria debe ser ante todo un
mtodo fiable que permita identificar y tratar el dao renal. Las instrucciones para recoger la
muestra con todo cuidado son:

El frasco tiene que ser estril, suministrado por el Laboratorio.

Es preferible que la muestra sea la PRIMERA de la maana.
Para que la muestra no salga contaminada deber practicarse un lavado con agua y jabn
de la zona genital y luego se enjuaga con abundante agua yodada; la mujer debe separar
4

los labios de la vulva en el momento de la miccin y en el hombre debe practicarse

antisepsia del prepucio.
Deje escapar la porcin inicial de la miccin al inodoro; a continuacin recolecte en el
frasco la porcin media y descarte la porcin final de la miccin nuevamente al inodoro.
Tape bien el frasco y entrguelo rpidamente al Laboratorio (no deben transcurrir ms de
20 min en entregarla).

12. SIEMBRA EN PLACAS E IDENTIFICACIN

El esquema general del mtodo se presenta en el Anexo C.
Los mtodos de siembra en el medio CromoCen CC dependen del tipo de muestras a ensayar y el
propsito (identificacin o recuento).
Para la identificacin se recomienda la siembra por agotamiento del inculo en la superficie por
estras y el mtodo de inundacin de la superficie. Para el recuento, se recomienda el mtodo de
inundacin de la superficie.
El mtodo de siembra por agotamiento del inculo en la superficie (por estras) consiste en
sembrar un inculo con el objetivo de obtener colonias aisladas para su estudio.
Coloque la placa con el medio de cultivo CromoCen CC sobre una superficie lisa. Se esteriliza a la
llama un asa de nicrom, se enfra y se toma el inculo. Se levanta ligeramente la tapa de la placa
de Petri y se va arrastrando el inculo desde un borde de la placa al otro realizando lneas rectas
en zig-zag bien apretadas, avanzando hacia el centro. Se gira la placa en un ngulo de
aproximadamente de 70 a 90 y se realiza el estriado entrecruzando los cuadrantes. En el ltimo
cuadrante se realiza el zig-zag menos frecuente, es decir, con lneas ms separadas para
garantizar el aislamiento de las colonias. Este mtodo puede hacerse flameando el asa al pasar de
un cuadrante a otro, sobre todo si el inculo de partida est muy concentrado. Incube la placa en
una incubadora bacteriolgica a 35 2 C por 18-24 h.
El mtodo de siembra por inundacin de la superficie, se ejecuta distribuyendo homogneamente
la muestra con ayuda de una esptula de Drigalsky.
Coloque la placa sobre una superficie lisa. Levante ligeramente la tapa de la placa de Petri e
inocule, para muestras de orina 5 L (0,005 mL) de la porcin de ensayo, en el centro de la placa
con medio CromoCen CC. Para otras muestras, inocule lo indicado en los procedimientos de
rutina. Distribuya la muestra sobre toda la superficie con una esptula de Drigalsky estril
(embeber en alcohol y flamear), girando esta ltima siempre en posicin totalmente horizontal
con respecto al plano de la placa. Deje la placa en reposo por 510 min para que la muestra
penetre en el lecho del agar. Incube la placa en una incubadora bacteriolgica a 35 2 C por
18-24 h.
En la incubadora, coloque las placas en posicin horizontal, con la tapa hacia abajo, en columnas
de no ms de 4 placas. Al finalizar la incubacin, observe el crecimiento y proceda a identificar el
microorganismo.
Luego de la incubacin, examine las placas para determinar la presencia de colonias tpicas de los
microorganismos diana y las atpicas que pudieran considerarse dentro de estos microorganismos.
Se debe elaborar un informe final con la fecha, la firma del personal tcnico que realiz el anlisis
y el cuo del laboratorio donde se ejecut. Si es positivo se debe reportar el nombre del
microorganismo encontrado, y el resultado del antibiograma, si ste fuese ejecutado.

12.1 Identificacin en el medio CromoCen CC

El crecimiento tpico de Escherichia en el medio CromoCen CC son colonias azul verdosas con
fluorescencia bajo la luz ultravioleta (366 nm), pudiendo presentar bordes blancos regulares o
irregulares y halos de color azul o azul verdoso alrededor de las colonias.
El crecimiento tpico de los coliformes en el medio CromoCen CC son colonias azul verdosas en su
centro, o en toda la superficie de la colonia, con o sin fluorescencia azul bajo luz ultravioleta (366
nm), pudiendo presentar bordes blancos, regulares o irregulares y halos de color azul o azul
verdoso alrededor de las colonias.
Ver respuestas atpicas (acpite 10).
13. CONFIRMACIN
A las colonias que aparezcan en el medio CromoCen CC de color azul verdoso con flourescencia,
si se exige, se les realiza solamente las pruebas de confirmacin (prueba rpida de GAD y/o de
indol rpido).
Las colonias seleccionadas debern ser de un nmero de al menos 5 por placa.
14. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS DEL MEDIO CromoCen CC
En el medio CromoCen CC (Ver Anexo D), el crecimiento tpico de E. coli (excepto E. coli
O157:H7) son colonias con centro azul verdoso, bordes blancos regulares o irregulares, con o sin
halo azul o azul verdoso y fluorescencia azul bajo luz UV. En el resto de los coliformes las colonias
tpicas son azul verdosas que pueden presentar centros ms oscuros y bordes regulares sin
fluorescencia, con o sin halos azules o azul verdosos.
Las colonias incoloras o con pigmentacin propia corresponden a otras bacterias Gram-negativas.
Los microorganismos Gram-positivos resultan inhibidos en el medio.
Nota: Tener en cuenta la respuesta de los microorganismos interferentes y las reacciones atpicas
para el anlisis de los resultados. (Ver acpite 10)
15. RECOMENDACIONES PARA EL RECUENTO DE COLONIAS EN EL MEDIO CromoCen CC
Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de la muestra en ensayo, se presentan las
siguientes orientaciones para muestras de orina:

Placas con menos de 10 000 UFC/mL, el urocultivo es negativo.

Placas con tres ms tipos de colonias, la muestra est contaminada, repetir.
Placas con 10 000 UFC/mL ms UFC/ mL, el urocultivo es positivo.

La identificacin de las colonias en la muestra se realizar como indican los acpites 12.1 y 13.
Para otras muestras, en las cuales se requiera el recuento de UFC de los microorganismos diana,
se procede como se describe a continuacin:

Las placas de al menos una de dos diluciones deben mostrar recuentos en el intervalo de 30 a 300
UFC. Calcule la cuenta promedio de dicha dilucin y reporte el recuento en UFC en la muestra
UFC/unidad de muestra (ejemplo en X gr, X mL).
Utilice un contador de colonias estndar para el recuento. Realice el recuento slo en aquellas
placas en que se detecte un rango contable de colonias (30300 colonias)*.
* Para algunos ensayos de lmite de deteccin se establecern las UFC mnimas a contar por
placa.
Cuando dos diluciones estn en el intervalo apropiado, determine la cuenta promedio dada por
cada dilucin antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para obtener la cuenta en placa
por unidad de muestra, por gramo o mililitro.
Para realizar el clculo de las bacterias diana, multiplique el nmero de colonias por placa por el
recproco de la dilucin empleada.
Cuando realice el recuento de las placas por duplicado de diluciones consecutivas, calcule la media
de las colonias para cada dilucin antes de determinar el recuento promedio.
Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde las placas
presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se presentan las siguientes
orientaciones:
Placas con menos de 30 colonias.- Cuando las placas corridas para la menor dilucin muestran
cuentas de menos de 30 colonias, cuente el nmero de colonias presentes en dicha dilucin,
promedie el nmero de colonias y multiplquelo por el factor de dilucin para obtener el valor
estimado de cuenta en placa. Aclare en su informe esta situacin agregando al valor encontrado la
leyenda "valor < 30".
Placas con ms de 300 colonias.- Cuando el nmero de colonias por placa exceda de 300, cuente
las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribucin de
colonias. Cuente, por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del rea de la placa y multiplique el
valor obtenido por 4 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros,
considere que el fondo de una placa Petri de 90 mm de dimetro contiene 65 cuadros de la
cuadrcula del contador. Aclare en el informe esta situacin agregando al valor encontrado la
leyenda "valor > 300".
Colonias extendidas.- Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes formas
(tipos):

Cadenas de colonias no separadas claramente entre s, que parecen ser causadas por la
desintegracin de un cmulo de bacterias.
Colonias que se desarrollan en pelcula entre el agar y el fondo de la placa.
Colonias que se desarrollan en pelcula en la orilla de la placa sobre la superficie del agar.
Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompaadas de inhibicin del
crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la placa o represin del crecimiento que
por s mismo excede el 25% de la superficie de la placa.

Cuando es necesario contar en placas que contienen colonias extendidas que no estn incluidas en
alguno de los grupos anteriores, cuente cualquiera de los tipos mencionados, como provenientes
de una sola fuente. En el caso de las colonias del primer tipo, si la placa contiene una sola cadena,
cuente como una sola colonia, si la placa contiene varias cadenas que parecen originarse de
fuentes separadas, cuente cada cadena como colonia individual. No cuente cada colonia de la
7

cadena individualmente. Las colonias del segundo y tercer tipo generalmente se observan como
crecimiento diferenciable de otras colonias y se cuentan como tales. Los crecimientos del cuarto
tipo, reprtelos como crecimiento extendido. En caso de que una dilucin se encuentre dentro del
rango y otra dilucin presente colonias de crecimiento extendido, reporte la dilucin en la que se
pueden contar las colonias.
Placas sin colonias.- Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias, reporte la
cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilucin ms baja usada.
Placas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra con ms
de 300 colonias.- Cuando una placa tiene entre 30 y 300 colonias y su duplicado ms de 300
colonias, cuente ambas placas incluyendo la que est fuera del intervalo para determinar la cuenta
en placa.
Placas corridas por duplicado, una placa de cada dilucin dentro del intervalo de 30 a 300
colonias.- Cuando una placa dentro de diferentes diluciones contiene el nmero de colonias
especificadas en el intervalo, cuente el nmero de colonias de las cuatro placas para determinar la
cuenta en placa.
Placas corridas por duplicado, ambas placas de una dilucin dentro del intervalo de 30 a 300 y
slo una de la otra dilucin dentro del mismo. Cuente las cuatro placas incluyendo aquella con
menos de 30 o ms de 300 colonias para calcular la cuenta en placa.
16. BIBLIOGRAFA
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19. Quesada Muiz, V. de J., Rodrguez Martnez, C. (2002). Composicin y mtodo para la
deteccin y recuento diferenciado y temprano de organismos microscpicos Gramnegativos. Certificado de Autor No. 22808. Cuba.
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Tsoraeva, A.; Daz Prez, M.; Durn Vila, A.; Varela Llanes, A.E. (2004). Manual de Medios
de Cultivo. Tercera Edicin, ISBN 959-7160-25-0, BioCen, Habana, Cuba, 265 p.

ANEXO A: Control de la calidad del medio CromoCen CC

1. Determinacin del pH
Condiciones de Seguridad:
Use la bata de laboratorio.
Equipos, Materiales y Materias Primas:
Equipos:
Balanza de precisin de 0,01 g
pH-metro
Licuadora elctrica
Materiales:
Frasco cnico de 250 mL
Embudo de cristal de 120 mm de dimetro
Esptula de acero inoxidable
Papel de filtro neutro
Cilindro graduado de 100 mL
Pinzas con punta amiantada para vasos
Termmetro de 0-100C (valor de divisin 1)
Materias Primas:
Agua destilada o desionizada
Procedimiento:
a) Corte con una esptula el medio contenido de una o ms placas y adicinelo en el vaso de la
licuadora elctrica.
b) Aada un volumen de agua destilada o desionizada, medidos con el cilindro graduado, igual al
volumen de medio contenido en la placa o en las placas tomadas para el ensayo, en varias
porciones para arrastrar en cada una de ellas los restos de medio que queden adheridos a las
paredes de la placa.
c) Adicione todas estas porciones en la licuadora.
d) Homogeneice totalmente la mezcla en la licuadora durante 1 minuto, operando el equipo segn
la instructiva del mismo, y filtre todo el contenido a travs de un papel de filtro neutro para
filtracin rpida colocado en un embudo.
e) Recoja el filtrado en un frasco cnico.
f) Enfre el filtrado a una temperatura de 25 2C y proceda a medir el pH en el pHmetro. Opere
el pHmetro segn la instructiva del mismo.
g) Realice el procedimiento por triplicado para cada muestra.
h) Anote los resultados.
Clculo e Interpretacin de los Resultados:
Calcule la media entre los tres valores obtenidos.
Aproxime los resultados hasta la dcima.
Criterios de aceptacin
El valor del pH debe ser 7,1 0,2.

10

11

ANEXO A (continuacin). Control de la calidad del medio CromoCen CC

Evaluacin microbiolgica del CromoCen CC
Condiciones de Seguridad:
Manipule los microorganismos con extremo cuidado segn los requisitos de Seguridad
Biolgica.
En caso de derrame de diluciones de microorganismos o medios inoculados, bloquee la
zona al acceso de cualquier persona. Inmediatamente aada solucin desinfectante
(alcohol al 70 % o fenol al 3 %) y mantngala sobre la superficie aproximadamente
15 min. Recoja el material derramado, limpie la zona.
En caso de quemadura en la piel por derrame de medios de cultivo calientes, lave
rpidamente la zona con agua fresca y acuda al mdico si es necesario.
Equipos, Materiales y Materias Primas:
Equipos:
Balanza tcnica (precisin 0,01 g)
Incubadora de laboratorio
Microscopio ptico
Bao termostatado de laboratorio
Espectrofotmetro (opcional)
Materiales:
Tubos de cultivo (125 x 15) mm o tubo con tapa de rosca (150 x 20) mm
Asa y aguja de nicrom
Gradillas para tubos
Frascos cnicos de vidrio sin tapa de 250, 500 y 1 000 mL
Quemador de gas
Pipetas de 1 y 2 mL estriles
Portapipetas
Placas de Petri de (100 x 13) mm
Cilindros graduados de cristal de 100 mL
Lmina portaobjetos
Lmina cubreobjetos
Lpiz cristalogrfico
Tubo 0,5 de la escala MacFarland (opcional)
Pinza de acero inoxidable
Materias Primas:
Alcohol al 70 % o fenol al 3 %
Medio de cultivo agar triptona soya en tubos, con agar en plano inclinado
Medio de cultivo, de referencia o control, semejante al que se evaluar
Cepas ATCC de referencia o control Salmonella Typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli
ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y Enterococcus faecalis ATCC 29212
Algodn
Tubos con medio agarizado de uso general en plano inclinado, preparado
Tubo con caldo triptona soya
Bata sanitaria
Botas cubrecalzado
12

 Gorro
Agua destilada o desionizada
Reactivos para la tincin de Gram
Operaciones Preliminares:
a) Compruebe que se ha realizado la limpieza de la meseta y el cuarto segn lo establecido,
observando el registro correspondiente.
b) Prepare el inculo segn los siguientes pasos.
c) Partiendo de cuas de los cultivos microbianos en conservacin (refrigeracin de 4 8 C),
siembre por estras cada uno de los microorganismos de referencia en dos tubos de agar triptona
soya con agar inclinado o en caldo triptona soya, de las bacterias a ensayar.
d) Incube a 35 2 C de 18 a 24 h para las bacterias.
e) Realice la Tincin de Gram, para comprobar la pureza del cultivo a sembrar.
f) La evaluacin del medio se realizar a partir de inculos estandarizados, ya sea a partir del
cultivo con 50 % de transmitancia en el espectrofotmetro, o del tubo correspondiente a la escala
0,5 de MacFarland, para lo cual, estandarice el inculo y prepare diluciones seriadas del mismo.
g) Rotule las placas que contienen el medio a evaluar.
Procedimiento:
Agrupe las placas rotuladas por microorganismo dentro del cuarto de siembra.
Inoculacin del medio de cultivo
Mtodo de siembra por inundacin de la superficie
Inoculacin del medio de cultivo.
a) Tome una pipeta de 1 2 mL estril del portapipetas al lado del mechero y flamee la boca del
portapipetas antes de cerrarlo, cuidando de mantener la pipeta cerca de la llama. Si se trabaja en
flujo laminar o se tiene experiencia de manera que la punta de la pipeta quede cerca de la llama,
puede dejar abierto el portapipetas mientras trabaja. Con el dedo meique y la palma de la
mano, quite el tapn o desenrosque la tapa del tubo que contiene la dilucin a sembrar y tome
cuidadosamente, con la pipeta en esa misma mano, 0,2 mL de dilucin. Cierre el tubo con la tapa
que mantuvo sostenida con el dedo meique, mantenga la pipeta en posicin vertical cerca del
mechero.
b) Abra cuidadosamente, cerca del mechero, la placa con una mano y adicione la cantidad de
inculo contenida en la pipeta en el centro de la placa, cirrela cuidadosamente y devuelva la
pipeta contaminada a un portapipetas para material contaminado. Gire la placa de manera tal que
el inculo se distribuya lo ms homogneamente posible por toda la superficie del medio.
c) Realice la misma operacin con el medio control utilizado.
Criterios de aceptacin
Criterios de aceptacin de la evaluacin microbiolgica se muestran en la tabla No. 1.
Tabla 1. Criterios de aceptacin para el mtodo de siembra por inundacin en la superficie hasta
obtener colonias aisladas para el medio CromoCen CC
Microorganismo de
ensayo
Escherichia coli
ATCC 25922
Enterobacter
aerogenes
ATCC 13048
Salmonella

Crecimiento en la
dilucin 10-5
Bueno

Fluorescencia a 366 nm

Bueno

Caractersticas de las
colonias
Centro azul verdoso,
bordes blancos
Azul verdosas

Bueno

Incoloras

+ (azul)
-

13

typhimurium
ATCC14028
Enterococcus
faecalis
ATCC 29212

De inhibido a escaso
(recuperacin 0,01 %
para el inculo 105
UFC/mL)*

Preparacin de patrones de la escala MacFarland

Condiciones de Seguridad:
Use bata de laboratorio.
Manipule con cuidado el cido sulfrico concentrado ya que puede causar quemaduras
severas en los ojos y la piel.
Equipos, Materiales y Materias primas:
Equipos:
Estufa con circulacin forzada de aire de 50 a 200 C
Agitador magntico
Balanza de 0,01 g de precisin
Materiales:
Bulbos de vidrio 2R
Tapones de clorobutilo 13 mm
Sellos de aluminio de 13 mm
Matraz de un solo trazo de 100 mL
Frasco cnico de 250 mL
Esptula
Vaso para precipitado de 25 mL
Pipeta automtica de 1 a 5 mL
Puntas para pipeta automtica de 1 a 5 mL
Bandeja de acero inoxidable (160 x 270) mm
Barra magntica (40 x 8) mm
Selladora manual para bulbos 2R
Pipetas de vidrio graduadas de 1 mL y 10 mL
Materias primas:
Agua potable
Detergente industrial
Agua desionizada
Acido sulfrico 98 % (p.a) (r=1,84 g/cm3)
Cloruro de bario dihidratado (p.a.)
Operaciones Preliminares:
Fregado de los bulbos y tapones.
a) Sumerja los bulbos y tapones en una solucin de detergente.
b) Mantngalos en esta solucin durante 15 min.
c) Saque los bulbos y tapones del detergente y enjuguelos con suficiente agua potable, hasta
eliminar todo el detergente.
d) Enjuague los bulbos y tapones dos veces con agua desionizada.
e) Escrralos y colquelos en una bandeja de acero inoxidable.
f) Coloque la bandeja en una estufa con circulacin forzada de aire y seque los bulbos y tapones a
70 C durante 2 h.
g) Una vez transcurrido el tiempo de secado, saque la bandeja de la estufa y deje enfriar los
bulbos y tapones hasta temperatura ambiente.
14

Preparacin de la solucin de cido sulfrico al 1 % .

a) Tome con una pipeta graduada 0,55 mL de cido sulfrico (p.a.) al 98 %, (r=1,84 g/cm3) y
depostelo en un matraz de un solo trazo de 100 mL.
b) Complete el volumen con agua desionizada.
c) Homogeneice bien la solucin, agitndola manualmente.

Preparacin de la solucin de cloruro de bario al 1 %.

a) Pese en una balanza de 0,01 g de precisin, con una esptula en un frasco cnico de 250 mL,
1,17 g de cloruro de bario dihidratado. Opere el equipo segn instructiva del mismo.
b) Aada agua desionizada hasta completar 100 g.
c) Homogeneice bien la solucin, agitndola manualmente.
Procedimiento:
Preparacin de la suspensin.
a) Endulce una pipeta graduada de 10 mL con la solucin preparada de cido sulfrico al 1 %
b) Endulce una pipeta graduada de 1 mL con la solucin preparada de cloruro de bario al 1 %.
c) Mezcle en un frasco cnico de 250 mL los volmenes deseados de soluciones segn las
proporciones indicadas en la tabla No. 1. Segn el patrn que se desea preparar.
d) Agite durante 5 min.
Tabla No. 1. Proporciones de los reactivos para la preparacin de la escala MacFarland

Tubo
0,5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Escala de MacFarland
H2SO4 1 (mL)
9,95
9,9
9,8
9,7
9,6
9,5
9,4
9,3
9,2
9,1
9,0

BaCl2 1 (mL)
0,05
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0

Llenado de los bulbos.

a) Coloque el frasco cnico con la suspensin en el agitador magntico e introduzca una barra
magntica.
b) Comience a agitar a 500 r/min.
c) Grade la pipeta automtica para 3 mL.
d) Coloque la punta en la pipeta automtica.
e) Manteniendo en agitacin la suspensin dispense en cada bulbo 3 mL de la misma con ayuda
de la pipeta automtica.
Tapado y sellado de los bulbos.
a) Coloque los tapones y los sellos de aluminio sobre los bulbos.
b) Tome los bulbos uno a uno, colquelos fuera de la bandeja y vaya sellndolos con la selladora
manual para bulbos 2R.
Revisin.
15

a) Observe los bulbos individualmente a travs de la luz y elimine los que tengan partculas
extraas.
Rotulado.
a) Rotule los frascos con la etiqueta correspondiente.
Almacenamiento.
a) Almacnese en la oscuridad.
Preparacin de las cepas de trabajo
Condiciones de Seguridad:
Manipule los microorganismos con extremo cuidado segn los requisitos de Seguridad
Biolgica.
En caso de derrame de diluciones de microorganismos o medios inoculados, bloquee la
zona al acceso de cualquier persona. Inmediatamente aada solucin desinfectante
(alcohol al 70 % o fenol al 3 %) y mantngala sobre la superficie aproximadamente 15
min. Recoja el material derramado, limpie la zona.
En caso de quemadura en la piel por derrame de medios de cultivo calientes, lave
rpidamente la zona con agua fresca y acuda al mdico si es necesario.
Equipos, Materiales y Materias Primas:
Equipos:
Incubadora de laboratorio
Microscopio ptico
Espectrofotmetro
Agitador de tubos
Materiales:
Tubos de cultivo (125 x 15) mm o tubo con tapa de rosca (150 x 20) mm
Asa y aguja de nicrom
Gradillas para tubos
Quemador de gas
Pipetas de 1 y 2 mL estriles
Portapipetas
Lmina portaobjetos
Lpiz cristalogrfico
Pinza de acero inoxidable
Materias Primas:
Alcohol al 70 % o fenol al 3 %
Algodn
Tubos con medio agarizado de uso general en plano inclinado, preparado
Tubo con caldo triptona soya
Bata sanitaria
Botas cubrecalzado
Gorro
Agua destilada o desionizada
Reactivos para la tincin de Gram
Formaldehdo al 37 %
Solucin salina estril
Agar Triptona Soya

16

Operaciones preliminares.
Preparacin de la solucin de formaldehdo al 12 %
a) Vierta en un matraz de un solo trazo de 100 mL, 32,4 mL de formol al 37 %.
b) Complete el volumen con agua destilada o desionizada.
c) Homogeneice la preparacin invirtiendo el frasco de 4 a 5 veces el matraz.
d) Trasvase el contenido a un frasco mbar.
e) Rotule el frasco para identificar la solucin.

Preparacin del cultivo para su posterior estandarizacin

Preparacin del cultivo puro (18-24 h)
a) Tome con un asa de nicrom previamente esterilizada a la llama del quemador parte de la
biomasa del microorganismo procedente de una cua de conservacin (Cepa certificada) e inocule
en un tubo de vidrio que contenga un medio slido de uso general en plano inclinado (Ej: agar
triptona soya). Rotule el tubo con el nombre del microorganismo en cuestin. En caso de contar
con una cepa salvaje proveniente de una muestra, tomar una colonia aislada y proceder de igual
forma.
b) Incube el tubo inoculado en condiciones de tiempo y temperatura segn los requisitos del
microorganismo. (Bacterias generalmente a 35 2 C).
c) Si desea comprobar la pureza del cultivo despus de pasado el tiempo de incubacin realice
una tincin de Gram.
Preparacin de la suspensin
a) Tome el tubo de cultivo fresco y aada 5 mL de solucin salina estril.
b) Arrastre el cultivo del agar rotando el tubo con movimientos manuales, manteniendo el tubo en
posicin horizontal.
c) Vierta la suspensin final a un tubo de (150 x 20) mm con tapa de rosca, estril. Rotule el
nombre de la cepa y la fecha. (Tubo A).
d) Si desea compruebe la pureza del cultivo del tubo A realizando una Tincin de Gram.
Preparacin de la solucin salina
Pese 8,5 g de NaCl y adicione a 1 litro de agua destilada o desionizada.
Estandarizacin de la cepa al 50 2 % de transmitancia utilizando un espectrofotmetro a una
longitud de onda de 580 nm
a) Encienda el espectrofotmetro 30 min antes de ser utilizado.
b) Ajuste el equipo a 0 y 100 de transmitancia.
c) Extraiga con una pipeta estril de 1mL en condiciones aspticas 1mL del contenido del tubo A y
transfiralo a un tubo de (150x20) mL con tapa de rosca, no necesariamente estril en este caso,
indicando el nombre de la cepa y rotulndolo como tubo B.
d) Aada 1 mL de formaldehdo al 12 % al tubo B.
e) Mantenga en contacto la suspensin de la cepa y el formaldehdo de 15-30 min.
f) Agite el tubo B, aada de su contenido aproximadamente 8 mL al tubo de lectura del equipo,
colquelo en el espectrofotmetro y observe el porcentaje de transmitancia que mide el equipo.
g) Si el porcentaje de transmitancia est por debajo del 50 %, adale con cuidado
aproximadamente 1 mL menos de solucin salina al 0,85 %. Anote en su libreta de trabajo los
volmenes de solucin salina que va aadiendo.
h) Repita la operacin descrita en el apartado f.
i) Repita las operaciones descritas en los apartados g y h hasta alcanzar el 50 2 % de
transmitancia.

17

j) En caso de que el valor de la transmitancia exceda el 50 %, extraiga con una pipeta estril de 1
mL en condiciones aspticas 1 mL del contenido del tubo A y transfiralo al tubo B, aada 1 mL de
formaldehdo al 12 % y contine la lectura despus de haber transcurrido los 15 minutos.
k) Sume los volmenes de solucin salina al 0,85 % y de formaldehdo incorporados al mL de
suspensin microbiana.
Ejemplo:
1 mL de formaldehdo + S mL de solucin salina = X mL de solvente
Entonces:
1 mL de suspensin microbiana + X mL de solvente (Formaldehdo y solucin salina) ~ 50%

Estandarizacin por turbiedad similar al tubo # 5 de MacFarland

a) Tome un tubo de cultivo de vidrio (150 x 20) mm con tapa de rosca que contenga en su interior
9 mL solucin salina, colquelo en una gradilla para tubos y rotlelo con el nombre del
microorganismo, la fecha y las iniciales M.F# 5 que significa MacFarland # 5 lo que corresponde
aproximadamente a 3,0x108 clulas/mL.
b) Coloque el tubo A en la gradilla referida en el apartado anterior.
c) Tome el tubo # 5 de la escala de MacFarland y colquelo en la gradilla.
d) Extraiga con una pipeta de 1 mL estril en condiciones aspticas 0,5 mL del contenido del tubo
A y transfiralo al tubo de (150 x 20) mm con tapa de rosca rotulado con M.F. # 5 hasta alcanzar
una turbiedad al tubo # 5 de la escala de MacFarland.
Cuenta de viables de la suspensin estandarizada (Para determinar las Unidades Formadoras de
Colonias (UFC)).
a) Prepare la suspensin microbiana estandarizada (Tubo A).
b) Coloque en una gradilla 10 tubos de cultivo de vidrio (150 x 20) mm con tapa de rosca, estril.
Rotule los tubos indicando el nombre del microorganismo y diluciones desde 10-1 hasta 1010.
c) Adicione aspticamente 9 mL de solucin salina estril a cada tubo con una pipeta de 10 mL
estril y portapipetas automticos si posee.
d) Agite el tubo A con un agitador vortex de tubos, si lo posee, o con la mano durante 5
segundos.
e) Tome 1 mL aspticamente con una pipeta de 1 mL estril y portapipetas automtico, del tubo A
y adalo al tubo 10-1. Agite durante 2 3 segundos.
f) Transfiera de igual forma, 1 mL del tubo 10 -1 al tubo 10-2. Agite. Repita esta operacin hasta el
tubo marcado con 10-10.
g) Rotule 2 placas de Petri con el medio agar para conteo en placas segn corresponda por
microorganismo y por dilucin e identifquelas con el nombre de la cepa, dilucin y fecha de
inoculacin.
Inoculacin
a) Agite la dilucin 10-5 durante 2 3 segundos y tome 0,2 mL de la misma con una pipeta de 1
mL estril e inocule esta cantidad en cada una de las 2 placas que contienen el medio de cultivo.
b) Aplique rotacin manual en forma de 8 a las placas.
c) Repita las operaciones a y b para todas las diluciones restantes hasta 10-10.
d) Deje reposar las placas con las tapas hacia arriba durante 15 minutos.
e) Incube las placas a la temperatura y el tiempo que se describe para el microorganismo del
ensayo.
f) Si desea comprobar la pureza del inculo a las placas incubadas realice Tincin de Gram
despus del tiempo de incubacin.
Lectura de las placas
Cuente las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en cada una de las 2 placas
sembradas. Haga un promedio y tome el valor promedio (de no obtenerse crecimiento en
18

una de ellas, desechar el resultado de esa placa y solo tomar en cuenta el de la placa
restante) y antelo en el registro de cuentas de viables. Nota: Si en lugar de partir de la
cepa estandarizada con el espectrofotmetro parte de la cepa estandarizada por
MacFarland, realice los mismos pasos para hacer las diluciones pero partiendo del tubo que
contiene la suspensin estandarizada al 0,5 de MacFarland. El resto de los pasos se realiza
de la misma forma.
Se considerar vlido el ensayo si:
a) En las diluciones de trabajo se encuentran las Unidades Formadoras de Colonias necesarias
para realizar nuestro ensayo en al menos 1 placa (de 10 a 100 UFC).
b) No existe contaminacin en las inoculaciones realizadas.
ANEXO B. Composicin y preparacin de los medios de cultivo y reactivos
1. Medio CromoCen CC
Composicin
Bases nutritivas
Cloruro de sodio
Mezcla cromognica-flourognica
Agar

11,0 g
5,0 g
1,4 g
13,0 g

1.1 Preparacin
De acuerdo a la cantidad deseada, pesar el polvo en proporcin de 30,4 g/L de agua destilada o
desionizada. Hervir hasta disolucin completa. Ajustar el pH, de ser necesario, el cual despus de
fundir deber encontrase en pH 7,1 0,2. No esterilizar en autoclave.
1.2 Preparacin de las placas del medio CromoCen CC
Transfiera inmediatamente a un bao con temperatura de 44 a 47 C. Dispense el medio en
placas y deje solidificar. Inmediatamente ante de su uso, seque las placas en el horno con
temperatura entre 35-55 C, por un tiempo suficiente hasta que la superficie del medio est seca.
Almacene las placas por un perodo no ms de 30 das a temperatura de 2 a 8 C.
2. Prueba Rpida de GAD
El reactivo de la prueba rpida de glutamato descarboxilasa (GAD) se prepara a partir de los
ingredientes siguientes:
Composicin
Acido L-glutmico
Cloruro de sodio
Verde de bromocresol
Tritn X-100
agua destilada

0,1 g
9,0 g
0,005 g
0,3 mL
100 mL

2.1 Preparacin
El reactivo debe tener el pH 3,5, tener color amarillo y estar transparente.
Esterilice el reactivo por filtracin y envselo aspticamente en un frasco de vidrio de color mbar
para su posterior almacenamiento en refrigeracin a temperatura de 2 a 8 C. Se ha comprobado
una estabilidad satisfactoria del reactivo en dichas condiciones en un perodo de 5 meses de
almacenamiento.
2.2 Procedimiento
Pique una colonia de inters y prepare una suspensin concentrada en 0,5 mL de solucin salina
estril. A esta suspensin adale 0,2 mL del reactivo de GAD e incube a 35 C durante 10-13 h
observando cada 30 min. Cualquier cambio de color amarillo a verde o azul considrelo como
19

reaccin positiva. Existen algunas cepas de E. coli que responden de manera ms rpida y por
tanto su respuesta se observa en menor tiempo.
3. Prueba Rpida de indol
Se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima triptofanasa o triptfano-desaminasa,
capaz de desdoblar el triptfano (aminocido) en indol ms alanina. Se detecta la presencia de
esta enzima mediante la reaccin de indol producido con el reactivo pdimetilaminobenzaldehdo.
Prueba de Arnold Weaver
Medios de cultivo:
- Caldo de triptona (Agua de peptona) conteniendo triptfano.
Composicin
Hidrolizado enzimtico de casena
Cloruro de sodio

10,0
5,0

3.1 Preparacin
Suspender 15 g en 1 L de agua destilada o desionizada, mezclar bien, distribuir y esterilizar a
121 C por 15 min.
3.2 Procedimiento
1. Inocule con gran abundancia un cultivo puro proveniente en cantidades de 0,4 mL
caldo de triptona (agua de triptona) conteniendo triptfano.
2. Incube a 37 C durante 2 h.
3. Agregue reactivo de Kovacs y agite suavemente.

de

Interpretacin:
El color rojo en la capa reactiva indica formacin de indol.

20

Anexo C
Diagrama de flujo para la determinacin de E. coli y coliformes en muestras clnicas.
Anlisis de orina

21

Anexo D. Ejemplos de reacciones tpicas y atpicas de los microorganismos diana y de

otros Gram-negativos

E. coli, centro azul verdoso, bordes

blancos, bajo luz visible

Enterobacter aerogenes
(coliforme), colonias azul
verdosas, bordes regulares

E. coli, bordes irregulares,

fluorescencia azul bajo luz UV

Citrobacter freundii (coliforme),

colonias azul verdosas, bordes
regulares, halo azul

22

Serratia marcescens (coliforme),

colonias rosadas intensas, bordes
regulares

Shigella flexneri, no coliforme

(incolora bajo luz visible)

E. coli O157:H7 (coliforme),

colonias azul verdosas, bordes
regulares

Shigella sp., no coliforme

(fluorescente bajo luz UV)

23

Shigella sonnei, no coliforme

(verde azules, bordes irregulares bajo
luz visible)

Aeromonas spp., verde azules, sin

fluorescencia, citocromo oxidasa
positivas

Salmonella Typhi, incoloras

Pseudomonas spp., blancas, con o

sin fluorescencia azul verdosa

24

E. coli
coliforme

Gram
no coliforme

Microorganismos Gramnegativos bajo luz visible

(E. coli, coliformes y otros )

Microorganismos Gram-negativos
bajo luz UV
(E. coli, coliformes y otros )

25