CONTENIDO DE GLICOSIDOS DE FLAVONOIDES EN FRUTOS INMADUROS DE Citrus aurantium Y Citrus sinensis DEL NOROESTE ARGENTINO H. Geronazzo, S. Blanco y J.H. Rebin Inst. de Investigaciones para ‘a Industria Quimica (CIUNSa), Buenos Aires N'177, (4400) Salta - Argentina RESUNEN El objetivo fue determinar el potencial de frutos inmaduros de seis clones de naranjas agries (Citrus aurentium) y cinco variedades de naranjas dulces (Citys sinensis) del noroeste argentino, para la produccién de nechesperidina y hesperidina respectivamente. El contenido de flavonoides se determind por HPLC. Las naranjtas agrias con diémetros hasta 10-1mm del cion Resisterte a Sara, y las provenientes de Yuto (Jujuy) y Salta, presentaron las mayores concentraciones de neohesperidina (25- 30% base seca, 7-10% en fruta fresca), y una elevada relacion de neohesperidina a naringina. Para tamanos mayores, estos valores decaen notablemente. En Citrus sinensis, la hesperidina represento entre el 85 al 95% del total de flavonoldes, siendo su concentracion muy dependiente de la variedad y el tamaiio. Se concluye que la relacién nehohesperidina/naringina y los contenidos de neohesperidina y hesperidina son mas elevados en frutas pequefias, pero solo determinados clones y variedades presentan valores atractivos para su explotacién comercial FLAVONOID GLYCOSIDE CONTENT IN NORTHWESTERN ARGENTINEAN IMMATURE Citrus aurantium AND Citrus sinensis FRUITS ABSTRACT The aim of this work was to assess the potential productivity in immature fruits of neohesperidine in six sour-orange clones (Citrus aurantium) an hespericine in five sweet-orange strains (Citrus sinensis) from the Argentinian Northwest Flavonoid content was determined by HPLC. The small sour oranges from the ‘Mange Resistant clone (10-15 mm diameter), and those from Yuto (Jujuy) and Salta, showed the highest neohesperidine concentrations (25-30% cried base, 7-10% fresh fruit) and an elevated nechesperdine- naranghne relation. These values decline notoriously in fruits of larger sizes. For Citrus sinensis, hesperdine was between 85 and 95% of total flavonoids, and its concentration was highly dependent on strain and siza. it Is concluded that the relaton neohesperidine-nerangine and the nechespendine and hesperdine contents are higher in smal fruits, but only certain clones and strains show the most attractive values for commercial exploitation. Keywords: cus flavonoids, neohesperidine, naringine, hespenidine, oranges Informacion Tecnologica - Vol. 13 N° 3 - 2002 4gINTRODUCCION Las frutas pequefias inmaduras derramadas raturalmente de naranjas dulces (Citrus si- rnensis) y de pomelos (Citrus paradisi), y !as recolectadas de naranjas agrias o amargas (Citrus aurantium), constitayen una importante. fuerte de flavenoides (Ortuho et_al..1997: Castillo et al., 1997; Det Rio et al., 1997). La hesperidina es el flavonoide més abun- danie en naranjas dulces (Di Mauro et al, 1999) y Ja naringina en pomeles 0 toronjas (Einawawi, 1995), alcanzando valores mayo- res al 30% en frutas pequenas y hasta un 5% fen cascaras de frutas maduras, sobre base seca. Durante el crecimiento ce los trutos la concentracién de estos flavonoides decrece, ‘p9r0 al contenide totai por unidad se mantiene eercano a un gramo (Braddock, 1999). Para la exportacién de las frutas maduras suele ser necesario que en las plantaciones se eliminen las truttas derramadas naturatmente a fin de impedir la proliferacién de hongos, razén por la cual podria disponerse de esta matera pri- ma.a bajo costo. Nuevos procesos ya fueron desarrollados para la obtencion de hesperidi- na a partir de naranjitas de derrame (Macori to et al., 2001) y de naringina a partir de po- melitos de derrame (Geronazzo et al., 2000). En naranjas agrias amargas la neohesperi- dina y la naringina son las flavononas mas abundantes. El contenido sobre base seca de Jos frutas inmacuras puede aicanzar valores cercanos al 30% para neohesperidina y del 10% para neringina, dependiendo del tipo de clon estudiado (Del Rio et al., 1997). ta ob- tenci6n de neohesperidina suele ser el princi- pal objetivo y la relacion de neohesperidina a naringina es un factor importante para estos fines. El corteride de nochosperidina on C. aurantium decrece notablemente con et ta- mario de} fruto (Castillo et al., 1992; Del Rio et al., 1997). La nechesperidina tiene una importante apli- cacién industrial en la produccién de ta dihi- drochaicona correspondiente. un eduicorante no ealérico mil veces més dulce que la saca- rosa (Bar et al., 1990). La hespendina se uti- liza preterentemente en fa industria farmaceu- ica en tratamientos tales como fragiided ca- pilar (Struckman, 1999), ofecto preventive de tumores inducidos (Tanaka et al., 1998), ac- cién analgésica y antiiflamatoria (Galati et al., 1994), etc.. La naringina y sus derivados, ramnosa y prunina, se aplican en las indus- 20 trias quimicotarmaceuticas y alimenticias (Benavente-Garcia et al., 1997) En ésta publicacin se informa sobre fos re- Sultadlos obtenidos al estudiar ei contenido de glicésidos de flavonoides en frutas inmaduras de C, aurantum y C. sinensis. En naranjtes agrias de distintos clones se determiné la va- tiacién de la concentracién de neohesperidina con e! tamafio, su conlenido en frutas frescas y la relacion de neohesperidina a naringina. En naranjitas dulces se estudid ef nivel de hosperidina, narirutina, naringina y nechespe- ridina para dos !amafios en cinco variedades distintas. MATERIALES Y METODOS, Materiales La fruttas frescas fueron provistas por dos Estaciones Experimentales det Instituto Na- Gonal de Tecnologia Agropecuaria (|NTA- Argentina). Los clones de C. aurantium WN, Brazilian Orange (Bro), Riverside (Riv) y Re- sistente a Sarna (Ras) proceden de la Esia- Gin Experimental de Famaillé. (Tucumén), otras muestras de naranjas agrias proceden de las localidades ce Yuto (Jujuy) y Salta, Las variedades de naranjtas duices estudiadas: Pineapple, Mar's Early, Wastin, Valencia y Hamlin, proceden de la Estacion Experimental de Yuto, La neohesperidina, hesperidina, naringina y raritutina fueron adquiridas en SIGMA y los estdndares para cromatogratia liquida HPLC a Extrasynthese (Francia). Los demés reacti- vos utilizados fueron de grado snaiitico, Métodes anatiticos Para la extraccién de flavonoides, de acuerdo al tamario, se utiizaron entre 10 y 50 frutas inmaduras frescas. Estas fueron picadas en Un procesador @ cuchilas, secadas @ 50°C, y molidas hasta polvo fino. Porciones de 100 mg de las muestras fueron exiraidas con 20 mi de N. N-dimetiformamida: agua en rela- cién 2:1 durante al menos 6 horas a 60°C bajo agitacién y luego difuidas conveniente- mente para su determinacion anaittica Los flavonoides fueron determinados por HPLC usando un equipo Shimadzu LC-4A con una columna Ce y un detector UY 280 am. Informacion Tecnologica - Vol. 13 N° 3 - 2002Se empies una separacién isovrdtica con ura mozcla de _agua:motanol:acetonitrio:4cido acético (15:2:2:1, VV) y un flujo de 0.8 mi min” a temperatura ambiente. RESULTADOS Y DISCUSION Neohesperidina en Citrus aurantium La figura 1 muestra como varia la concentra- ion de neohespericina con el didmetro de las frutitas frescas, para los seis clones estudia- dos. Se observa en todos los casos una caida notable en el nivei de esta flavonona a medi- da que crecen las frutas. Los mayores conte- nigos de neohespericina tueron para las muesties de Ras y las procedentes de Yuto y do Salta, con valores maximes entro e! 25 y el 30% en base seca, para frutos _ pequenos con diémetros alrededor de 10 mm. Para tamafios mayores la concentracién de Reohesperidina cayo notablemente hasta al- canzar valores cercanos al 5% para diametros de 49 mm o mas. Para estos tres clones co muestra, en la figura 2a, que fa relacién de neohesperidina a naringina es elevada para ciametros pequefios y decae rapidamente con el aumento de los mismos, En la figura 2b se observa como disrninuye con el tamafto el contenido de neohesperidi- na por cada 100 g de fruta fresca. Para la obtencién de neohesperidina a partir de frutas inmaduras de C. aurantium es con- veniente contar con materia prima con un alto contenido de neohesperidina y una elevada relacién de neohesperidina a naringina. . » wo a¢ me Bs ay ie ta ol _______] o 1 7 3 4 Bf Démavotom gas itn 7 Bo) eT Be OS i le o 1% % 3 0 6 @ idmatro (mony Figura 2 (a) Relacién de neohesperidina a Naringina, (b) Contenido de neohesperidina en 100 g de fruta fresca Estos pardmetros deben ser considerados para determiner el tipo 0 clon de naranjas agrias a cutivar y los tiempos de cosecha. En las Figuras 1 y 2 se observa ave las frutitas del clon Rasy las provenientes de Yuto y Salta con diémetros hasta los diez-quince miimetros resultaron ser las mas apropiadas. Frutas mas grandes aportan menor cantidad de nechesperidina y mayor masa de com- puestos indeseables, que encarecen el pro- ceso de extraccién y purificacion de este fla- vonoide. Se determing también que el nivel de hesperdina en las naranjitas agnas es- tudiadas esté por debejo del 2% del total de flavonoiées, La figura 3 muestra un cromato: grama tipico de naranjitas agrias. = hee yx 2 ie ‘Sata a i, sa z speasaees : ae 4 4 2 Hesperidina 3 mh Ela. ¢ 5 Neohespericina ie he gp ts 5| 20-09 a ° : a ow ¢ Didmateo on mm Figura 1. Nechesperidina en frutos inmaduros. de C. Aurantium Informacion Tecnolégica - Vol. 13 N° 3 - 2002 ‘Absorbancia (60 nm) Figura 3. Cromatograma caracterstico de extractes de naranjitas dei clon Ras. 5stTabla 1. Contenido de Glicésidos de Flavonoides en Frutos Inmaduros de Citrus sinensis Giametro _____ Flavonoides (mg/100 9 de peso sec: Variedad (mm) Hesperidina——“Nerirutina. ~—Naringina Fania Tear eS ree 547+ 78 72e 1 War's Early 20 T6723 + 62 Ba4e _ 40 1.968 + 75 9x0 Pineapple 20 1.027 +52 342 40 515+ 18, 2040 Valencia 20 : 46+ 54 eer 407.050 4925 _577+29 S653 Weetin 20 7600+ 450 1342+ 60 4841 40 65504 325 1,045 + 46 8742 Hespevidina en Citrus sinensis La tabla 1 muestra el contenido de glicdsidos de flavonvides en cinco variedades distintas de naranjtas duices derramadas naturalmente En todos los casos la hesperidina fue la sus: tancia de mayer concentracién con valores entre | 85-05 % del total de flavonoides. La presencia de narirutina, naringina y neohespe- ridina no corstituyen un problema para la pro- duccién de hesperidina debido a las diferen- ‘las en las solubiidades de estos compuestos (Larrauri et al., 1998; Macoritto et al., 2001) ‘Se observa que la concentracién de hesperi- dina cambia notablemente segtin 'a variedad y tamafio de fruto estudiado. La variedad Mar's Early se presento como la mejor, ya que sus frutos contienen mayores niveles de este fla venoide para los didmetros analizados: 28.250 y 19.400 mg por 100 9 de peso seco para 20 y 40 mm, respectivamente. Para tamafos pe- quefios hasta aproximadamente 20 mm, que se corresponden con el derrame mayontanio ‘que ocurre en naranjas dulces entre septiem- bre y noviembre, también resultaron intere- santes las variedades Valencia y Pineapple CONCLUSIONES Los resultados y su andiisis permiten obtener las siguientes conclusiones: a) las naranjitas frascas agrias (Citrus auran- tium) estudiadas muestran una_concentracién de neohesperidna mas elevada para didme- tros pequenios, decayendo notabiemente con el tamario de los mismos. Un componamiente similar sigue la relacién neohespericina a na- ringina, b) en las naranjitas dulces (Citrus si- 82 nensis) la hesperidina es priicticamente el tinico flavoncide presente y su concentracién varia notablemente sequin el tamafio y la va- fiedad, c) \a utlizacién de frutos inmaduros de citricos como materia prima para la produc- Gon indusinal de neohespendina y nespenai- na, tequiere estudios previos ya que solo de- terminados clones y variedades presantan valores atraciives para su explotacion comer- ial REFERENCIAS Bar, A., F. Borrego, ©. Bonavento, J. Castile y J. A. Del Rio; Neonesperidin Dihydrochal- cone: Properiies and Aplications. Lebens M.~ Wiss. U. ~Technol,, 23, 371-376 (1990). Benavente-Garcia 0., J. Castilio, F.R. Marin, A. Ortuto, y JA. Del Rio; Uses and propor: ties of Citrus Flavonoids. Joumal of Agricul- tural and Food Chemistry: 45 (1997), Braddock RJ; Handbook of citrus By- Producis and Processing Technology. Join Wiley & Sons. Chichester, UK (1999) Casillo, J., ©. Benavente Garcia, F. Sabater, F. Marin, A. Ortufio, A. y J.A. Del Rio; Flavo- none Nechesperidosices Distribution in Citrus, aurantium Stems. Evidense tor a Posible Transiccalién Process in Relation with Bio synthesis in Leaves and Fruits, Current Topics. in Phytochermistry: 1, 77-84(1997). Di Mauro A., B. Fallico, A. Passerini, P. Ra- pisarda, y E. Maccarone; Recovery of Hes- peridin from Orange Peel by Concentration of Extracts on Siyrene-divinylbenzene Resin, Journal of Agricultural and Food Chemistry: 47 (10), 4391-4397 (1999). Informacion Tecnologica - Vol. 13 N° 3 - 2002De! Rio, J.A, M.D. Foster, F. Sabater, J. Por ras, A, Garcia Lidon, y A. Ontuio; Seloetion of Citrus Varieties Highly Productive for the Neo- hesperidin Dihydrachalcone Precursor, Food Chemistry: 59(3), 433-437 (1997). Elnawawi S. A.. Extraction of Citrus Gluco- sides, Carbohydrate Polymers. 27. 1-4 (1995). Galati, E.M., MT. Monforte, S. Kiravainen, A. M, Forestieri, y M.M. Tripodo. Biological Et- fects of Hesperidin, @ Citrus Flavonoid: Antiin- tiamatory and Anelgesic Activity, Farmaco, 49 (11), 708-712 (1994). Geronazz0 H.. J. Robin, S. Blanco, C. Cuevas, ¥ G. Bllenrieder, Aprovechamiento Integral de Residuos de Produccién y Procesamiento de Pomeios, Un Proyecto de Innovacion Tecnois- gica. Anales del VIII Congreso Argentino de Ciencia y Tecnologia de Alimentos (2000). Larauri J.A., B. Borroto, y T. Boys, Naringina, Procesos para su Obtencion a Partir de Informacion Tecnolégica - Vol. 13 N° 3 - 2002 Hollejes de Toronjas, Alimentacion, Equipos y Tecnologia: 115-118 (Abril 1996). Macoritto A, H. Geronazzo, y G. Ellenvieder, Obtencién de Hesperdina a Partir de Naran- jas de Derrame, Informacion Tecnologica: 12(4), 3-8(2001). Ortuo A., |. Reynaldo, M.D. Foster, J. Batia, D. Garcia Puig. F. Sabater, A. Garcia Lidon, |. Poras y J.A. Del Rio, Citrus Cultivars with High Flavonoid Contents in the Fruits, Scien- tia Horiiculturae: 68, 231-236 (1997). Struckmann, J. R., Clinical Efficacy of Mi- cronized Purified Flavonoid Fraction. An Overview, Journal of Vascular Research.: 36 (suppl. 1), 37-41 (1999). Tanaka, T., T. Sumida y H. Ogawa; Chemo- preventive Effects of Hesperidin and Diosmin, Citrus Flavonoids, alone and in Combination, Foods Food Ingredients Journal.; 177, 43-48 (1998) 53