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1.

ASPECTOS MICROBIOLGICOS
El mayor riesgo microbiano del agua es el relacionado con el consumo de agua
contaminada con excrementos humanos o animales, aunque puede haber otras
fuentes y vas de exposicin significativas.
Este captulo trata sobre los microorganismos que, segn pruebas obtenidas en
estudios epidemiolgicos o en estudios prospectivos en situaciones no
epidmicas, ocasionan enfermedades por ingestin, inhalacin de gotculas o
contacto con agua de consumo, as como sobre el control de dichos
microorganismos.
1.1. Peligros microbianos relacionados con el agua de consumo
Los riesgos para la salud relacionados con el agua de consumo ms comunes y
extendidos son las enfermedades infecciosas ocasionadas por agentes patgenos
como bacterias, virus y parsitos (por ejemplo, protozoos y helmintos). La carga
para la salud pblica es funcin de la gravedad de la enfermedad o
enfermedades relacionadas con los agentes patgenos, de su infectividad y de la
poblacin expuesta.
Un fallo general del sistema de sistema de proteccin de la seguridad del
abastecimiento de agua puede ocasionar una contaminacin a gran escala del
agua y, potencialmente, epidemias detectables. Otras averas y la contaminacin
leve, posiblemente en ocasiones repetidas, pueden ocasionar brotes espordicos
significativos de enfermedades, pero no es probable que las autoridades de
vigilancia de la salud pblica los asocien con la fuente de abastecimiento de
agua de consumo.
La evaluacin y cuantificacin de los riesgos puede ayudar a comprenderlos y
gestionarlos, sobre todo los relacionados con casos de enfermedad espordicos.
1.1.1. Infecciones transmitidas por el agua
Existen diversos tipos de agentes patgenos que pueden transmitirse por el
agua de consumo contaminada. El cuadro 7.1 y la figura 7.1 proporcionan
informacin general sobre agentes patgenos importantes en la gestin de
sistemas de abastecimiento de agua de consumo. La gama de agentes patgenos
cambia en funcin de factores variables como el aumento de las poblaciones de
personas y animales, el incremento del uso de aguas residuales, los cambios de
los hbitos de la poblacin o de las intervenciones mdicas, las migraciones y
viajes de la poblacin, y presiones selectivas que favorecen la aparicin de
agentes patgenos nuevos o mutantes, o de recombinaciones de los agentes
patgenos existentes. Tambin existe una considerable variabilidad en la
inmunidad de las personas, ya sea adquirida por contacto con un agente

patgeno o determinada por factores como la edad, el sexo, el estado de salud y


las condiciones de vida.

Nota: La transmisin por el agua de los agentes patgenos incluidos en el cuadro ha sido confirmada mediante estudios
epidemiolgicos e historias clnicas. La comprobacin de la patogenicidad se basa, en parte, en la reproduccin de la
enfermedad en hospedadores adecuados. El valor de la informacin de estudios experimentales en los que se expone a
voluntarios a concentraciones conocidas de agentes patgenos es relativo; como la mayora de los estudios se realizan
con voluntarios adultos sanos, la informacin obtenida slo es aplicable a una parte de la poblacin expuesta y la
extrapolacin a grupos ms vulnera bles debe estudiarse ms a fondo.
a
Periodo de deteccin del estado infeccioso en agua a 20 C: persistencia corta: hasta 1 semana; moderada: de 1
semana a 1 mes; larga: ms de 1 mes.
b
Estando el estado infeccioso en suspensin libre en agua tratada con dosis y tiempos de contacto convencionales. La
resistenc ia es moderada si es posible que el agente no sea destruido completamente.
c
Determinada en experimentos con voluntarios o basndose en informacin epidemiolgica.
d
Incluye los tipos enteropatgenos, enterotoxgenos y enteroinvasivos.
e
La va de infeccin principal es por contacto con la piel, pero puede infectar a enfermos de cncer o personas
inmunodeficientes por va oral.
f
En agua templada.

La transmisin por el agua de consumo es slo uno de los vehculos de


transmisin de los agentes patgenos transmitidos por la va fecal-oral. Pueden
ser tambin vehculo de transmisin los alimentos contaminados, las manos, los

utensilios y la ropa, sobre todo cuando el saneamiento e higiene domsticos son


deficientes. Para reducir la transmisin de enfermedades por la va fecaloral es
importante mejorar la calidad del agua y su disponibilidad, as como los
sistemas de eliminacin de excrementos y la higiene general.

Figura 7.1

Vas de transmisin y ejemplos de agentes patgenos relacionados con el agua


Los riesgos para la salud relacionados con el agua de consumo ms comunes y extendidos son las
enfermedades infecciosas ocasionadas por agentes patgenos como bacterias, virus, protozoos y helmintos.

La inocuidad del agua de consumo no depende nicamente de la


contaminacin fecal. Algunos microorganismos proliferan en las redes de
distribucin de agua (por ejemplo, Legionella), mientras que otros se encuentran
en las aguas de origen (el dracnculo, Dracunculus medinensis) y pueden
ocasionar epidemias y casos aislados. Para otros microbios (por ejemplo, las
cianobacterias txicas) deben adoptarse medidas de gestin especficas, que se
abordan en otro captulo de las presentes Guas (vase el apartado 11.5).
Ciertas enfermedades graves se producen por inhalacin de gotculas de agua
(aerosoles) en las que los microorganismos causantes de la enfermedad
pueden multiplicarse si contienen nutrientes y la temperatura es clida. Son
ejemplos de tales enfermedades las legionelosis, como la legionelosis
neumnica o enfermedad del legionario, ocasionadas por Legionella spp., y las
enfermedades causadas por la ameba Naegleria fowleri (meningoencefalitis
amebiana primaria [MAP]) y por Acanthamoeba spp. (meningitis amebiana,
infecciones pulmonares).
La esquistosomiasis (bilharziasis) es una importante enfermedad parasitaria de
las regiones tropicales y subtropicales que se transmite por la penetracin en la
piel de la larva del parsito (cercaria), liberada por caracoles acuticos

infectados. Se transmite principalmente por contacto con el agua. La


disponibilidad de agua inocua contribuye a prevenir la enfermedad, ya que
reduce la necesidad de contacto con agua contaminada, por ejemplo, al
recogerla para transportarla al hogar o al utilizarla para lavar la ropa o para la
higiene personal.
El agua de consumo insalubre, contaminada con tierra o heces, puede reactuar
como vehculo de otras infecciones parasitarias como la balantidiasis
(Balantidium coli) y determinados helmintos (especies de los gneros Fasciola,
Fasciolopsis, Echinococcus, Spirometra, Ascaris, Trichuris, Toxocara, Necator,
Ancylostoma y Strongyloides, y la especie Taenia solium). No obstante, en la
mayora de estas especies, el modo de transmisin normal no es la ingestin de
agua de consumo contaminada, sino la ingestin de los huevos presentes en
alimentos contaminados con heces o con tierra contaminada con heces o, en el
caso de Taenia solium, la ingestin del cisticerco por consumo de carne de cerdo
no cocinada.
Otros agentes patgenos que pueden estar presentes de forma natural en el
medio ambiente pueden hacer enfermar a personas con inmunodeficiencia
local o sistmica, como los ancianos o las personas de muy corta edad, los
pacientes con quemaduras o heridas extensas, las sometidas a tratamientos
inmunodepresores o las afectadas por el sndrome de inmunodeficiencia
adquirida (SIDA). Si el agua que beben o usan estas personas para baarse
contiene cantidades suficientes de estos organismos, pueden producir diversas
infecciones cutneas y de las mucosas de los ojos, odos, nariz y garganta. Son
ejemplos de agentes patgenos de este tipo la especie Pseudomonas aeruginosa y
especies de los gneros Flavobacterium, Acinetobacter, Klebsiella, Serratia y
Aeromonas, as como determinadas micobacterias (no tuberculosas) de
crecimiento.
La mayora de los agentes patgenos del ser humano indicados en el cuadro 7.
estn distribuidos por todo el mundo; no obstante, algunos, como los que
ocasionan epidemias de clera o dracunculosis, son endmicos de
determinadas regiones. La erradicacin de D. medinensis es un objetivo
reconocido de la Asamblea Mundial de la Salud (1991).
Probablemente existan otros agentes patgenos transmitidos por el agua no
incluidos en el cuadro 7.1, ya que el nmero de patgenos transmitidos por
el agua conocidos contina aumentando conforme se descubren patgenos
nuevos o no identificados anteriormente (vase OMS, 2003a).
1.1.2. Persistencia y proliferacin en el agua
Aunque los agentes patgenos transmitidos por el agua tpicos son capaces de
sobrevivir en el agua de consumo, la mayora no crecen ni proliferan en el
agua. Microorganismos como E. coli y Campylobacter pueden acumularse en los

sedimentos y movilizarse al aumentar el caudal de agua.


Tras abandonar el organismo de su hospedador, la viabilidad y capacidad
infecciosa de la mayora de los agentes patgenos disminuyen gradualmente.
Su nmero disminuye normalmente de forma exponencial, y transcurrido
cierto tiempo no podr detectarse su presencia. Los agentes patgenos con
persistencia baja deben encontrar rpidamente nuevos hospedadores y es ms
probable su transmisin por contacto de persona a persona o por una higiene
personal deficiente que por el agua de consumo. Varios factores influyen en la
persistencia, de los que la temperatura es el ms importante. El nmero de
microorganismos disminuye habitualmente con mayor rapidez a temperaturas
ms altas y la tasa de disminucin puede verse potenciada por los efectos
letales de la radiacin UV de la luz solar que incide en la zona superficial del
agua.
Los agentes patgenos y parsitos transmitidos por el agua ms comunes son
los que poseen una infectividad alta y o pueden proliferar en el agua o poseen
una resistencia alta fuera del organismo.
Los virus y las formas latentes de los parsitos (quistes, ooquistes, huevos) no
pueden multiplicarse en el agua. Por el contrario, la presencia de cantidades
relativamente altas de carbono orgnico biodegradable, junto con temperaturas
clidas y concentraciones residuales bajas de cloro, pueden permitir la
proliferacin de Legionella, V. cholerae, Naegleria fowleri, Acanthamoeba y
organismos molestos en algunas aguas superficiales y en los sistemas de
distribucin de agua (vase tambin el documento complementario
Heterotrophic Plate Counts and Drinking-water Safety; apartado 1.3).
La calidad microbiolgica del agua puede variar muy rpidamente y en gran
medida. Pueden producirse aumentos repentinos de la concentracin de
agentes patgenos que pueden aumentar considerablemente el riesgo de
enfermedades y desencadenar brotes de enfermedades transmitidas por el
agua. Los anlisis de la calidad microbiolgica del agua normalmente tardan
demasiado para que sus resultados puedan ser tenidos en cuenta por los
responsables de la adopcin de medidas para evitar el suministro de agua
insalubre.
1.1.3 Aspectos relativos a la salud pblica
Las epidemias de enfermedades transmitidas por el agua pueden afectar a
numerosas personas, y la prioridad principal de la elaboracin y aplicacin de
controles de la calidad del agua de consumo debe ser el control de estas
epidemias. La informacin disponible sugiere tambin que el agua de
consumo puede contribuir a la morbilidad general en ausencia de epidemias,
de modo que una finalidad adicional del control de la calidad del agua de
consumo debe ser reducir la morbilidad por enfermedades transmitidas por el

agua en el conjunto de la poblacin.


La experiencia ha demostrado que los sistemas de deteccin de epidemias de
enfermedades transmitidas por el agua suelen ser ineficientes en pases con
cualquier grado de desarrollo socioeconmico, y el que no se detecten brotes no
garantiza que no existan, ni indica necesariamente que el agua de consumo
pueda considerarse inocua.
Algunos de los agentes patgenos cuya transmisin por agua de consumo
contaminada es conocida producen enfermedades graves y que, en ocasiones,
pueden ser mortales. Algunas de estas enfermedades son la fiebre tifoidea, el
clera, la hepatitis infecciosa (causada por el virus de la hepatitis A [VHA] o el
de la hepatitis E [VHE]) y las enfermedades causadas por Shigella spp. y por E.
coli O157.
Otras enfermedades conllevan tpicamente desenlaces menos graves, como la
diarrea de resolucin espontnea (por ejemplo, los norovirus y
Cryptosporidium).
La exposicin a agentes patgenos no produce los mismos efectos en todas las
personas ni, por consiguiente, en todas las poblaciones. Gracias a los efectos
de la inmunidad adquirida, la exposicin repetida a un agente patgeno
puede conllevar una menor probabilidad de enfermar o una menor gravedad
de la enfermedad ocasionada. La inmunidad frente a algunos agentes patgenos
(por ejemplo, el VHA) dura toda la vida, mientras que en otros casos (por
ejemplo, Campylobacter) los efectos protectores pueden durar nicamente unos
pocos meses o aos. Por otro lado, los subgrupos de poblacin vulnerables (por
ejemplo, los nios, los ancianos, las mujeres embarazadas y las personas con
inmunodeficiencia) pueden estar expuestos a un mayor riesgo de enfermar o
la enfermedad puede ser ms grave, incluso mortal. No todos los agentes
patgenos producen efectos ms intensos en todos los subgrupos de poblacin
vulnerables.
Algunas personas infectadas no contraern la enfermedad sintomtica. La
proporcin de la poblacin infectada que es asintomtica (incluidos los
portadores) es diferente para cada agente patgeno y tambin vara en funcin
de caractersticas demogrficas, como la prevalencia de inmunidad. Los
portadores y las personas con infecciones asintomticas, as como aquellas que
an no han desarrollado los sntomas, pueden contribuir a la propagacin
secundaria de agentes patgenos.
1.2 Formulacin de metas de proteccin de la salud
1.2.1 Metas de proteccin de la salud aplicadas a los peligros microbianos
Puede obtenerse informacin sobre riesgos para la salud de fuentes
epidemiolgicas o de evaluaciones de riesgos; por lo general, se utilizan ambas
fuentes de forma complementaria.

En situaciones en las que la carga de morbilidad de enfermedades


transmitidas por el agua se considere suficientemente alta para permitir la
medicin del efecto de las intervenciones, es decir, de las reducciones de la
carga de morbilidad que puede atribuirse al agua de consumo, tambin
pueden establecerse metas de proteccin de la salud mediante un enfoque
basado en dichos resultados sanitarios.
La evaluacin de riesgos es particularmente til cuando la proporcin de la
morbilidad atribuible al agua de consumo es baja o difcil de medir
directamente mediante la vigilancia de la salud pblica o estudios
epidemiolgicos analticos.
Para muchos agentes patgenos, se cuenta con escasos datos tanto
epidemiolgicos como de evaluacin de riesgos en los que basar la
formulacin de metas de proteccin de la salud, pero se producen cada vez
ms datos. Para la formulacin de metas nacionales, siempre ser de gran
utilidad la informacin generada en el pas.
El tipo ms frecuente de metas de proteccin de la salud aplicadas para el
control de los peligros microbianos son las metas relativas a las relacionadas
con una carga de morbilidad tolerable. Normalmente, no se fijan metas de
calidad del agua para el control de agentes patgenos, porque el anlisis de la
presencia de dichos agentes en el agua tratada no se considera una opcin
factible ni costoeficaz.
1.2.2 Mtodo de evaluacin de riesgos
En muchas circunstancias, es posible calcular los efectos de la mejora de la
calidad del agua de consumo sobre los riesgos para la salud de la poblacin
mediante la elaboracin y aplicacin de modelos de evaluacin de riesgos.
La evaluacin cuantitativa de los riesgos microbianos es una disciplina en
rpido desarrollo que combina de forma sistemtica la informacin disponible
sobre exposicin al riesgo y sobre la relacin entre dosis y respuesta para
calcular valores estimados de la carga de morbilidad relacionada con la
exposicin a agentes patgenos. Se utilizan modelos matemticos para estimar
los efectos que producen, en poblaciones y subgrupos de poblacin,
concentraciones bajas de agentes patgenos en el agua de consumo.
Para interpretar y aplicar informacin obtenida en estudios
epidemiolgicos analticos para determinar metas de proteccin de la salud
de mbito de aplicacin nacional o local, es preciso tener en cuenta
diversos factores, incluidos los siguientes:

Deben proporcionarse valores estimados especficos de reduccin de la


morbilidad o bien intervalos indicativos de las reducciones esperadas?
En qu medida es representativa de la poblacin objetivo la muestra de

estudio? Se puede confiar en la validez de los resultados para un grupo de


poblacin ms amplio?
En qu medida afectarn a los efectos esperados pequeas variaciones en
las condiciones demogrficas o socioeconmicas?
La evaluacin de riesgos comienza con la formulacin del problema, cuya
finalidad es determinar todos los peligros posibles y sus vas de
transmisin de la fuente o fuentes a la persona o personas afectadas. A
continuacin, se caracterizan los riesgos combinando la informacin sobre
exposicin de las personas a los agentes patgenos seleccionados
(concentraciones medioambientales y volmenes ingeridos) y la relativa a
la relacin entre dosis y respuesta. Esta informacin, junto con informacin
adicional
(factores
sociales,
culturales,
polticos,
econmicos,
medioambientales, etc.), permite establecer prioridades entre las diferentes
opciones de gestin. Para fomentar el apoyo y la participacin de las partes
interesadas, es importante aplicar, en cada etapa del proceso, un
procedimiento transparente y una comunicacin activa de los riesgos. En el
cuadro 7.2 se expone un ejemplo de mtodo de evaluacin de riesgos, que
se describe a continuacin.
Formulacin del problema y determinacin de los peligros
Deben determinarse y documentarse, para cada componente del sistema de
abastecimiento de agua de consumo, todos los posibles peligros, las
fuentes de peligro y los sucesos que pudieran dar lugar a dichos peligros
(es decir, qu puede pasar y cmo), con independencia de si el proveedor
de agua de consumo controla o no directamente dicho compone nte. Se
incluyen las fuentes de contaminacin puntuales (por ejemplo, los vertidos
de residuos humanos e industriales) y las difusas (por ejemplo, las
generadas por actividades agropecuarias). Deben tenerse en cuenta
tambin las pautas temporales de la contaminacin, que puede ser
continua, intermitente o estacional, as como los sucesos extremos e
infrecuentes, como sequas e inundaciones.
La determinacin de los peligros, en su sentido ms amplio, se centra en
las situaciones de peligro, que son sucesos que pueden hacer que los
consumidores se vean expuestos a microorganismos patgenos especficos.
En estos casos, puede utilizarse el trmino peligro en referencia al suceso
peligroso (por ejemplo, los picos de contaminacin del agua de origen con
aguas residuales domsticas).
Se seleccionan microorganismos representativos cuyo control garantizara
el control de todos los agentes patgenos peligrosos. Tpicamente, esto
conlleva la inclusin de al menos una bacteria, un virus y un protozoo
patgenos.

Evaluacin de la exposicin
La evaluacin de la exposicin consiste en el clculo del nmero de
microbios patgenos a los que se expone una persona, principalmente por
ingestin. La evaluacin de la exposicin es una actividad de prediccin
basada frecuentemente en juicios subjetivos. Conlleva, inevitablemente,
incertidumbre y debe tener en cuenta la variabilidad de factores como las
concentraciones de microorganismos (que varan en el tiempo), los
volmenes ingeridos, etctera.
La exposicin puede considerarse en trminos de una dosis nica de
agentes patgenos ingerida por un consumidor en un momento
determinado, o bien en trminos de la cantidad total ingerida en varias
exposiciones (por ejemplo, a lo largo de un ao). Se determina en funcin
de la concentracin de microbios en el agua de consumo y del volumen de
agua consumida.
Rara vez es posible o pertinente medir directamente y de forma sistemtica
la concentracin de agentes patgenos presentes en el agua de consumo.
Lo habitual es medir las concentraciones en las aguas de origen, o suponer
su valor, y aplicar reducciones estimadas de las concentraciones por
ejemplo, debidas al tratamiento del agua para calcular la concentracin
en el agua consumida. Si se mide la concentracin de agentes patgenos, es
mejor, por lo general, hacerlo donde es mxima (generalmente en las aguas
de origen). La reduccin de la concentracin de agentes patgenos lograda
mediante la aplicacin de sucesivas medidas de control se determina
generalmente por medio de indicadores, como E. Coli, en el caso de las
bacterias
entricas
patgenas
(vase
tambin
el
documento
complementario Water Treatment and Pathogen Control; apartado 1.3).
El otro componente de la evaluacin de la exposicin, que e s
independiente del agente patgeno objeto de evaluacin, es el volumen de
agua no hervida consumida por la poblacin, teniendo en cuenta las
variaciones de los hbitos de consumo entre personas diferentes y, sobre
todo, entre grupos de riesgo diferentes. En la evaluacin de los riesgos
derivados de peligros microbianos, es importante basarse en el volumen de

agua no hervida consumida, tanto directamente como en la elaboracin de


alimentos, ya que el calentamiento del agua inactivar rpidamente los
agentes patgenos que contenga. Este volumen es menor que el utilizado
para determinar los valores de referencia de sustancias qumicas y las
metas relativas a la calidad del agua.
La exposicin diaria de un consumidor puede calcularse multiplicando la
concentracin de agentes patgenos en el agua de consumo por el volumen
de agua consumida. Para los fines de las Guas, se supone un consumo
diario de 1 litro de agua de consumo no hervida.
Evaluacin de la relacin entre dosis y respuesta
La probabilidad de que la exposicin a uno o ms organismos patgenos
ocasione un efecto perjudicial para la salud se determina mediante un
modelo de relacin entre dosis y respuesta. Los datos disponibles sobre
relaciones entre dosis y respuesta proceden principalmente de estudios con
voluntarios adultos sanos. Varios subgrupos de poblacin, como los nios,
los ancianos y las personas con inmunodeficiencia, son ms vulnerables a
las enfermedades infecciosas; sin embargo, no se dispone actualmente de
datos que lo tengan adecuadamente en cuenta.
Conceptualmente, el modelo de infeccin se basa en la observacin de que
la probabilidad de infeccin como consecuencia de la exposicin a la dosis
descrita es funcin de las probabilidades de una serie de acontecimientos.
Para que se produzca un caso de infeccin, la persona infectada deber
haber ingerido uno o ms agentes patgenos viables; adems, uno o ms
de los agentes patgenos ingeridos deber haber sobrevivido en el
organismo del hospedador. Un concepto importante es el principio de
infectividad por un nico agente patgeno: que es posible, aunque la
probabilidad pueda ser baja, que incluso un nico microorganismo pueda
producir una infeccin y hacer enfermar a la persona infectada. Este
concepto sustituye al concepto de dosis infecciosa (mnima) utilizado con
frecuencia en la bibliografa menos reciente (vase el documento
complementario Caracterizacin de peligros de patgenos en los alimentos
y el agua; apartado 1.3).
En general, se considera que si los agentes patgenos estn dispersos
uniformemente en el agua, su distribucin puede describirse mediante una
distribucin de Poisson. Si la probabilidad de supervivencia e infeccin de
cualquier microorganismo individual es la misma, la relacin entre dosis y
respuesta se simplifica mediante una funcin de tipo exponencial. No
obstante, si la probabilidad individual de infeccin es heterognea, la
relacin entre dosis y respuesta ser de tipo beta-Poisson, en la que la
beta representa la distribucin de las probabilidades individuales entre
agentes patgenos (y hospedadores). Con niveles de exposicin bajos,
como los tpicos del agua de consumo, el modelo de relacin entre dosis y

respuesta es aproximadamente lineal y puede representarse simplemente


como la probabilidad de infeccin resultante de la exposicin a un nico
microorganismo (vase el documento complementario Caracterizacin de
peligros de patgenos en los alimentos y el agua; apartado 1.3).
Caracterizacin de los riesgos
La caracterizacin de los riesgos rene diversos tipos de datos: exposicin a
agentes patgenos, relacin entre dosis y respuesta, gravedad de la enfermedad
y carga de morbilidad.
La probabilidad de infeccin puede calcularse como el producto de la
exposicin por el agua de consumo y la probabilidad de infeccin por
exposicin a un nico microorganismo. La probabilidad de infeccin diaria se
multiplica por 365 para calcular la probabilidad de infeccin anual. En este
clculo, suponemos que las diferentes exposiciones son independientes; es
decir, que no se genera inmunidad protectora. Esta simplificacin nicamente
est justificada para niveles de riesgo bajos.
No todas las personas infectadas contraern la enfermedad clnica; la mayora
de los agentes patgenos generan habitualmente infecciones asintomticas. El
porcentaje de personas infectadas que sufrirn la enfermedad clnica es funcin
del agente patgeno, pero tambin de otros factores, como el estado inmunitario
del hospedador. El riesgo de enfermar anual se determina multiplicando la
probabilidad de inf eccin por la probabilidad de enfermar en caso de infeccin.
Las cifras bajas del cuadro 7.3 pueden interpretarse como indicativas de la
probabilidad de que una persona contraiga la enfermedad en un ao
determinado. Por ejemplo, un riesgo de enfermar por infeccin de
Campylobacter de 2,5 10-4 al ao indica que, por trmino medio, 1 de cada
4000 consumidores de agua de consumo contraeran campilobacteriosis por
consumir dicha agua.
La magnitud aos de vida ajustados en funcin de la discapacidad (AVAD)
permite traducir el riesgo de contraer una enfermedad especfica a unidades de
carga de morbilidad por caso. Esta magnitud debe reflejar, adems de los
efectos de los desenlaces agudos (por ejemplo, diarrea), la mortalidad y los
efectos de desenlaces ms graves (por ejemplo, el sndrome de Guillain-Barr
asociado a Campylobacter). La carga de morbilidad por caso es muy variable. Por
ejemplo, en regiones con ingresos bajos, con altas tasas de mortalidad en la
niez, la carga de morbilidad por 1000 casos de diarrea por rotavirus es de
480 AVAD. No obstante, en regiones con ingresos altos, donde la gran
mayora de la poblacin tiene acceso a instalaciones hospitalarias, es de slo 14
AVAD por 1000 casos (vase el documento complementario Quantifying Public
Health Risk in the WHO Guidelines for Drinking-water Quality; apartado 1.3).

Debido a esta diferencia considerable de carga de morbilidad, para reducir


el riesgo a niveles iguales (expresados en AVAD anuales), los requisitos de
tratamiento deben ser mucho ms rigurosos, para la misma calidad del agua de
origen, en las regiones con ingresos bajos. Idneamente, las estimaciones
generales de carga de morbilidad del cuadro 7.3 deberan adaptarse a las
situaciones nacionales especficas. En el cuadro 7.3 no se tienen en cuenta los
efectos en personas con inmunodeficiencia (por ejemplo, de la
criptosporidiosis en enfermos de VIH/SIDA), que en algunos pases
constituyen una proporcin significativa de la poblacin.
En el caso de algunos agentes patgenos, es posible que slo una parte de la
poblacin sea vulnerable, porque la inmunidad generada tras un episodio
inicial de infeccin o enfermedad puede proporcionar una proteccin vitalicia.
Son ejemplos de tales agentes patgenos el virus de la hepatitis A y los
rotavirus. Se considera que en los pases en desarrollo todos los nios
mayores de cinco aos son inmunes a los rotavirus debido a la exposicin
reiterada a los mismos en los primeros aos de vida. As, por trmino medio, el
17% de la poblacin de los pases en desarrollo es vulnerable a enfermedades

ocasionadas por rotavirus. En pases desarrollados, la infeccin por rotavirus es


tambin comn en los primeros aos de vida, y la enfermedad se diagnostica
principalmente en nios de corta edad, pero la proporcin de nios de corta
edad en el conjunto de la poblacin es menor; por ello, en los pases
desarrollados es vulnerable un promedio del 6% de la poblacin.
La incertidumbre de la estimacin del riesgo es consecuencia de la
incertidumbre y la variabilidad de los datos obtenidos en las diversas etapas de
la evaluacin de riesgos. Idneamente, los modelos de evaluacin de riesgos
deberan tener en cuenta esta variabilidad e incertidumbre, aunque aqu se
ofrecen nicamente estimaciones puntuales.
Es importante elegir la estimacin puntual ms adecuada para cada una de las
variables. Segn se deduce de consideraciones tericas, los riesgos son
directamente proporcionales a la media aritmtica de las dosis ingeridas. Por
ello, se recomienda el uso de medias aritmticas de variables como la
concentracin de agentes patgenos en el agua bruta, la tasa de eliminacin
mediante tratamiento y el consumo de agua de consumo. Esta recomendacin
difiere de la prctica habitual de los microbilogos e ingenieros de convertir las
concentraciones y efectos de los tratamientos en valores logartmicos y basar los
clculos o las especificaciones en la escala logartmica. Estos clculos generan
estimaciones de la media geomtrica y no de la media aritmtica, y dichas
estimaciones pueden subestimar el riesgo significativamente. Por consiguiente,
para analizar los datos de lugares especficos puede ser preciso basar los clculos
en los datos brutos en lugar de en los valores logartmicos notificados.
1.2.3 Formulacin de metas relativas a la eficacia basadas en la evaluacin de
riesgos
El procedimiento descrito en el apartado anterior sirve para calcular el riesgo
para el conjunto de la poblacin, teniendo en cuenta la calidad del agua de
origen y el efecto de las medidas de control. Este valor puede compararse con
el nivel de riesgo de referencia o con un nivel de riesgo tolerable determinado
a nivel local. Los clculos permiten cuantificar el grado de proteccin o
tratamiento del agua de origen necesario para lograr un nivel de riesgo
aceptable especificado y analizar el efecto estimado de modificaciones en las
medidas de control.
Las metas relativas a la eficacia suelen aplicarse a la eficacia de los
tratamientos, es decir, para determinar la reduccin de la carga microbiana
necesaria para garantizar la inocuidad del agua. Una meta relativa a la eficacia
puede aplicarse a un sistema especfico (es decir, pueden tenerse en cuenta las
caractersticas especficas del agua de origen) o general (por ejemplo,
suponer unas caractersticas de calidad del agua de origen comunes a todos
los sistemas de un determinado tipo o que se alimentan de agua de un
determinado tipo de fuente) (vase tambin el documento complementario
Water Treatment and Pathogen Control; apartado 1.3).

La figura 7.2 ilustra las metas relativas a la eficacia de los tratamientos


correspondientes a diversos agentes patgenos presentes en el agua bruta. Por
ejemplo, para una concentracin de 10 microorganismos por litro de agua de
origen, la meta relativa a la eficacia ser una reduccin de 4,2 en escala
logartmica (del 99,994%) para Cryptosporidium, o de 5,5 en escala logartmica
(del 99,99968%) para rotavirus en regiones con ingresos altos (vase tambin el
cuadro 7.4, a continuacin). La diferencia entre las metas relativas a la eficacia
correspondiente a rotavirus en pases con ingresos altos y la correspondiente a
pases con ingresos bajos (5,5 y 7,6 unidades logartmicas, respectivamente;
figura 7.2) se debe a que la gravedad de la enfermedad provocada por este
microorganismo es diferente en uno y otro tipo de pases. En pases con
ingresos bajos, la tasa de letalidad en la niez es relativamente alta y, por
consiguiente, la carga de morbilidad es mayor. Adems, en los pases con
ingresos bajos, es mayor la proporcin de la poblacin menor de cinco aos,
vulnerable a la infeccin por rotavirus.

Figura 7.2
Metas de eficacia correspondientes a bacterias, virus y protozoos patgenos
seleccionados, con respecto a la calidad del agua bruta (para alcanzar un valor de 10 -6
AVAD por persona y ao)

El clculo de estas metas relativas a la eficacia se describe en el cuadro 7.4,


que ofrece un ejemplo de los datos y clculos que se utilizaran normalmente
para construir un modelo de evaluacin de los riesgos correspondientes a
agentes patgenos transmitidos por el agua. El cuadro presenta datos
correspondientes a agentes patgenos representantes de los tres grupos
principales (bacterias, virus y protozoos) de diversas fuentes. La finalidad de
estos ejemplos de clculo es determinar el nivel de riesgo de referencia de 10 6 AVAD por persona y ao. Los datos del cuadro ilustran los clculos

necesarios para determinar un valor estimado del riesgo y no son valores de


referencia

.
1.2.4 Presentacin del resultado de la determinacin de metas relativas a la eficacia
El cuadro 7.4 presenta algunos datos del cuadro 7.3 en un formato ms
significativo para los responsables de la gestin de riesgos. Se incluye la
concentracin media de agentes patgenos en el agua de consumo, a efectos de
informacin. No es una metrfa relativa a la calidad del agua ni tiene por
finalidad fomentar la medicin de la concentracin de agentes patgenos en
-4

el agua tratada. Por ejemplo, una concentracin de 6,3 10 criptosporidios


por litro (vase el cuadro 7.3) corresponde a 1 ooquiste por 1600 litros (vase
el cuadro 7.4). La meta relativa a la eficacia (en la fila Efecto del tratamiento
del cuadro 7.3), expresada como reduccin porcentual, es el dato ms
importante del cuadro de evaluacin de riesgos desde el punto de vista de la
gestin. Puede expresarse tambin como valor de reduccin en escala
logartmica. Por ejemplo, una reduccin de la concentracin de rotavirus del
99,99968% corresponde a 5,5 unidades en la escala logartmica decimal.
1.2.5

Problemas que plantea la adaptacin a las circunstancias nacionales o locales


de la formulacin de metas de eficacia basadas en la evaluacin de riesgos
La eleccin de agentes patgenos del cuadro 7.4 se bas principalmente en la
disponibilidad de datos sobre resistencia al tratamiento del agua, infectividad y
carga de morbilidad. Los agentes patgenos elegidos pueden no ser prioritarios
en todas las regiones del mundo; sin embargo, normalmente, la seleccin de
otros agentes patgenos no afectara en gran medida a las conclusiones
generales derivadas de la aplicacin del modelo.
Siempre que sea posible, en las evaluaciones de este tipo, debera utilizarse
informacin especfica de los pases o lugares pertinentes. Si no se dispone de
datos especficos, los riesgos pueden calcularse de forma aproximada basndose
en valores estimados generales (vase el cuadro 7.5, a continuacin).
Cuadro 7.5 Ejemplos de concentraciones detectables mximas (por litro)
notificadas en publicaciones cientficas de agentes patgenos entricos e
indicadores de contaminacin fecal en diferentes tipos de aguas de origen

El cuadro 7.4 nicamente tiene en cuenta los cambios en la calidad del agua
derivados del tratamiento y no las medidas de proteccin de la fuente, que
contribuyen con frecuencia en gran medida a la inocuidad general, ya que afectan
a la concentracin de agentes patgenos, a su variabilidad, o a ambas cosas.
Adems, las estimaciones de riesgos presentadas en el cuadro 7.3 presuponen que
la calidad del agua no se degrada en la red de distribucin. Estos supuestos
pueden no ser realistas en todas las circunstancias, y es aconsejable tomar estos
factores en consideracin siempre que sea posible.
El cuadro 7.4 presenta nicamente estimaciones puntuales y no tiene en cuenta la
variabilidad y la incertidumbre. Los modelos completos de evaluacin de riesgos
incorporaran dichos factores representando las variables independientes como
distribuciones estadsticas en lugar de como estimaciones puntuales. No obstante,
la elaboracin de modelos de este tipo no est actualmente al alcance de muchos
pases y escasean los datos necesarios para definir las distribuciones mencionadas.
Para obtener este tipo de datos puede ser necesario invertir tiempo y recursos
considerables, pero ayudan mucho a conocer la calidad real del agua de origen y la
eficacia de su tratamiento.
El grado de tratamiento necesario depende tambin de los valores adoptados como
variables independientes del modelo de evaluacin de riesgos (por ejemplo,
consumo de agua de consumo o proporcin de la poblacin que es vulnerable). La
figura 7.3 muestra el efecto de la variacin en el consumo de agua de consumo no
hervida en las metas de eficacia correspondientes a Cryptosporidium parvum. Por
ejemplo, para una concentracin de 1 ooquiste por litro de agua bruta, las metas de
eficacia correspondientes a valores de consumo de 0,25 a 2 litros al da son de 2,6 a
3,5 unidades en la escala logartmica decimal. Segn algunos datos
epidemiolgicos, en los pases desarrollados una proporcin significativa de la
poblacin de edad superior a cinco aos puede no ser inmune a enfermedades
causadas por rotavirus. La figura 7.4 muestra el efecto de la variacin de la
proporcin de la poblacin que es vulnerable. Por ejemplo, para una concentracin
de 10 partculas vricas por litro de agua bruta, la meta de eficacia aumenta de 5,5 a
6,7 cuando la proporcin de personas vulnerables aumenta del 6 al 100%.

Figura 7.3 Metas de eficacia correspondientes a Cryptosporidium parvum, con respecto al


consumo diario de agua sin hervir (para alcanzar un valor de 10-6 AVAD por persona y ao)

Figura 7.4 Metas de eficacia correspondientes a rotavirus, con respecto a la proporcin de


la poblacin que es vulnerable a la enfermedad (para alcanzar un valor de 10 -6 AVAD por
persona y ao)

1.2.6 Metas sanitarias


En los planes de seguridad del agua (PSA) elaborados para intervenciones
especificadas de mejora de la calidad del agua en comunidades y hogares,
pueden aplicarse metas sanitarias relativas a la reduccin de la morbilidad en
una comunidad. Estas metas sealaran las reducciones de la morbilidad que
se prev lograr en las comunidades en las que se aplican las intervenciones.
Para determinar las medidas de mejora de la calidad del agua prioritarias, es
preciso centrarse en aquellos aspectos que se calcula que contribuyen en una
proporcin superior a, por ejemplo, el 5% a la carga de morbilidad de una

enfermedad dada (por ejemplo, el 5% de los casos de diarrea). En muchos


lugares del mundo, la ejecucin de una medida de fomento de la calidad del
agua que mejore previsiblemente la salud en ms del 5% se considerara
extremadamente deseable. En situaciones con carga de morbilidad alta, la
aplicacin de medidas eficaces puede suponer una demostracin directa de las
ventajas para la salud derivadas de la mejora de la calidad del agua
evaluadas, por ejemplo, mediante la disminucin de los recuentos de E. coli en
el lugar de consumo, lo que sera un instrumento muy eficaz para poner de
manifiesto un primer avance en un proceso de mejora progresiva de la
seguridad del agua.
Cuando se determina como meta sanitaria una reduccin especificada y
cuantificada de la morbilidad, puede ser aconsejable realizar una vigilancia
activa y contina de la salud pblica en comunidades representativas, en lugar
de basarse en una vigilancia pasiva.
1.3 Presencia de agentes patgenos en el agua y su tratamiento
Segn se explic en el apartado 4.1, en la evaluacin del sistema se determina si
la cadena de suministro de agua de consumo, en su conjunto, puede suministrar
agua cuya calidad sea acorde co n las metas establecidas. Para ello, es preciso
conocer la calidad del agua de origen y la eficacia de las medidas de control.
Es fundamental conocer la presencia de agentes patgenos en las aguas de
origen, ya que facilita la seleccin de la fuente de mayor calidad para alimentar
el sistema de abastecimiento de agua de consumo y permite determinar los
nmeros y concentraciones de agentes patgenos en las aguas de origen y las
necesidades de tratamiento del agua para cumplir las metas de proteccin de la
salud establecidas en un PSA.
La validacin (vanse los apartados 2.1.2 y 4.1.7) de las medidas de control
contribuye a conocer su eficacia. Adems de para garantizar que el tratamiento
lograr alcanzar los objetivos deseados (metas de eficacia), la validacin es
importante para determinar aspectos de la eficacia que pueden mejorarse (por
ejemplo, comparando la eficacia alcanzada con la que, segn se ha comprobado,
puede alcanzarse mediante la ejecucin correcta de los procesos).
1.3.1 Presencia de agentes patgenos
La presencia de agentes patgenos y de microorganismos indicadores en
fuentes de aguas subterrneas y superficiales depende de varios factores, como
las caractersticas fsicas y qumicas intrnsecas de la zona de captacin, y la
magnitud y diversidad de las actividades humanas y fuentes animales que
liberan patgenos al medio ambiente.
En las aguas superficiales, las fuentes de agentes patgenos pueden ser
puntuales, como los desbordamientos de los sistemas municipales de

alcantarillado y conduccin de aguas pluviales urbanas; y no puntuales, como


el agua de escorrenta contaminada procedente de zonas agrcolas y de zonas
con sistemas de saneamiento que transcurren por fosas spticas y letrinas. Otras
fuentes son la fauna silvestre y el acceso directo del ganado a masas de agua
superficiales. La concentracin de muchos de los agentes patgenos presentes
en masas de agua superficiales se reducir por efecto de la dilucin, la
sedimentacin y la destruccin de los patgenos debida a efectos
medioambientales (calor, luz solar, depredacin, etc.).
Las aguas subterrneas son frecuentemente menos vulnerables a la influencia
directa de las fuentes de contaminacin, debido a los efectos de barrera que
ejercen el terreno que las recubre y su zona vadosa. La contaminacin de las
aguas subterrneas es ms frecuente en los lugares en los que han sido
alteradas estas barreras protectoras, permitiendo la contaminacin directa, por
ejemplo a travs de pozos contaminados o abandonados, o por fuentes de
contaminacin subterrneas, como letrinas y conducciones de alcantarillado.
No obstante, varios estudios han mostrado la presencia de agentes patgenos y
microorganismos indicadores en aguas subterrneas, incluso en profundidad y
en ausencia de circunstancias de peligro como las mencionadas, sobre todo
cuando la contaminacin superficial es intensa, por ejemplo por el abonado de
tierras con estircol o la presencia de otras fuentes de materia fecal derivadas de
la ganadera intensiva (por ejemplo, parcelas de engorde). Los efectos de estas
fuentes de contaminacin pueden reducirse en gran medida mediante, por
ejemplo, medidas de proteccin de los acuferos, y la construccin y diseo
correctos de pozos.
Si desea obtener informacin adicional sobre las fuentes de agentes
patgenos y los factores fundamentales que los afectan, consulte los
documentos complementario Protecting Surface Waters for Health y Protecting
Groundwaters for Health.
El cuadro 7.5 presenta valores estimados de concentraciones mximas de
patgenos entricos y de indicadores microbianos en diferentes tipos de aguas
superficiales y subterrneas, obtenidos principalmente del examen de datos
publicados. Se han presentado los valores mximos porque representan
situaciones de mayor riesgo y, por consiguiente, mayores grados de
vulnerabilidad. El cuadro incluye dos categoras de datos correspondientes a
ros y arroyos: uno para fuentes de abastecimiento afectadas y otro para
fuentes menos afectadas. Diversas publicaciones, incluidos varios artculos
citados en Dangendorf et al. (2003), ofrecen informacin ms detallada sobre
estos datos.
Los datos del cuadro 7.5 constituyen una orientacin til acerca de las
concentraciones de agentes patgenos entricos y microorganismos
indicadores presentes en diversas fuentes. No obstante, los datos presentan
varias limitaciones y fuentes de incertidumbre, como las siguientes:

- no se conoce la relacin entre los lugares de toma de muestras y las fuentes de


contaminacin;
- problemas relativos a la sensibilidad de las tcnicas analticas, particularmente
las utilizadas para virus y protozoos; y
- no se conoce la viabilidad ni la capacidad de infectar al ser humano de los
ooquistes de Cryptosporidium, de los quistes de Giardia ni de los virus
detectados en los diferentes estudios, porque los diversos mtodos utilizados
(por ejemplo, microscopa o anlisis molecular o de cidos nucleicos) no se basan
en el cultivo de los microorganismos.
Si bien el cuadro proporciona una indicacin de las concentraciones posibles en
fuentes de agua, la forma ms exacta, con mucho, de determinar los nmeros y
concentraciones de agentes patgenos en cuencas de captacin y otras fuentes
de agua especficas es analizar la calidad del agua durante cierto periodo,
asegurndose de incluir las variaciones estacionales y las debidas a
acontecimientos puntuales, como tormentas. Se recomienda, siempre que sea
posible, la medicin directa de los agentes patgenos e indicadores en las
aguas de origen especficas para las que se est elaborando un PSA y
determinndose la presencia de patgenos, ya que se obtendrn as las
estimaciones ms exactas de nmeros y concentraciones de microorganismos.
1.3.2 Tratamiento
En el caso de aguas de calidad muy alta por ejemplo, las aguas
subterrneas de acuferos confinados pueden utilizarse la proteccin del
agua de origen y del sistema de distribucin como medidas principales de
control para el suministro de agua inocua. Sin embargo, lo ms frecuente es
que sea necesario someter el agua a tratamiento para retirar o destruir los
microorganismos patgenos. En muchos casos (por ejemplo, con aguas
superficiales de calidad deficiente) es preciso aplicar mltiples etapas de
tratamiento, incluidas, por ejemplo, la coagulacin, floculacin, sedimentacin,
filtracin y desinfeccin. El cuadro 7.6 ofrece informacin resumida sobre los
procesos de tratamiento comnmente aplicados, ya sea de forma independiente
o
combinados,
para
reducir
la
carga
microbiana.

Las reducciones de la carga microbiana indicadas en el cuadro 7.6


corresponden a grupos o categoras generales de microbios: bacterias, virus y
protozoos. Esto se debe a que, por lo general, la eficacia de reduccin de la
carga microbiana de los tratamientos es diferente para cada grupo de
microbios, debido a las diferentes propiedades inherentes de los mismos (por
ejemplo, su tamao, la naturaleza de sus capas protectoras exteriores, las
propiedades fisicoqumicas de sus superficies, etc.). Dentro de cada grupo de
microbios, las diferencias de eficacia de los procesos de tratamiento entre
especies, tipos o cepas de microbios especficos son menores. No obstante, estas
diferencias existen y el cuadro proporciona estimaciones conservadoras de las
reducciones de la carga microbiana basadas en los tipos de microorganismos
patgenos ms resistentes o persistentes de cada grupo. Los resultados
correspondientes a tipos especficos de microbios de un grupo general cuyas
tasas de eliminacin mediante el tratamiento son considerablemente diferentes
se presentan en el cuadro por separado.
El agua de sistemas de abastecimiento sin tuberas, como la obtenida mediante
sistemas de captacin de agua de lluvia en tejados y la extrada de pozos o
manantiales, puede estar frecuentemente contaminada con agentes patgenos.
Para que el agua de estas fuentes sea inocua, normalmente deber ser tratada y
almacenarse protegida de la contaminacin. Muchos de los procesos de
tratamiento del agua utilizados en los hogares son los mismos que los
empleados en sistemas de abastecimiento gestionados por comunidades y
otros sistemas de abastecimiento de agua entubada (cuadro 7.6). La eficacia
de eliminacin de microbios de estos procesos de tratamiento en el mbito
domstico es probablemente similar a la tasa de referencia indicada en el
cuadro 7.6. No obstante, existen otras tcnicas de tratamiento de agua
recomendadas para uso en sistemas de abastecimiento de agua sin tuberas en
el mbito domstico que no se utilizan normalmente para sistemas de
abastecimiento de agua entubada.
Se proporciona informacin adicional ms detallada sobre estos procesos de
tratamiento del agua, su operacin y su eficacia de reduccin de la
concentracin de agentes patgenos en los documentos complementarios

siguientes: para sistemas de abastecimiento de agua entubada: Water Treatment


and Pathogen Control; para sistemas de abastecimiento de agua sin tuberas
(principalmente domsticos): Managing Water in the Home.
1.4

Verificacin de la inocuidad y calidad microbiolgicas

Los agentes patgenos tienen varias propiedades que los distinguen de otros
contaminantes del agua de consumo:

Son componentes discretos y no estn en solucin.


Con frecuencia forman agregados, o se adhieren a slidos suspendidos en el
agua.
La probabilidad de infeccin por la exposicin a un agente patgeno depende
de su invasividad y virulencia, as como de la inmunidad de la persona
expuesta.
Si la infeccin arraiga, los agentes patgenos se multiplican en su hospedador.
Ciertas bacterias patgenas son tambin capaces de multiplicarse en alimentos
o bebidas, de modo que perpetan o incluso aumentan las posibilidades de
infeccin.
A diferencia de muchos agentes qumicos, la relacin entre dosis y respuesta de
los agentes patgenos no es acumulativa.
Las bacterias indicadoras de contaminacin fecal, incluida E. coli, son
parmetros importantes en la verificacin de la calidad microbiolgica del
agua. Esta verificacin de la calidad del agua complementa el monitoreo
operativo y las evaluaciones de los riesgos de contaminacin, por ejemplo,
mediante auditora de las plantas de tratamiento, evaluacin del control de los
procesos e inspeccin sanitaria.
Para proporcionar resultados significativos, las bacterias indicadoras de
contaminacin fecal deben cumplir determinados criterios. Deben estar
presentes universalmente, en concentraciones elevadas, en las heces humanas y
de otros animales de sangre caliente, ser fcilmente detectables mediante
mtodos sencillos y no proliferar en aguas naturales.
El microorganismo elegido como indicador de contaminacin fecal es E. coli.
En muchas circunstancias, en lugar de E. coli puede analizarse la presencia de
bacterias coliformes termotolerantes.
El agua destinada al consumo humano no debera contener microorganismos
indicadores. En la mayora de los casos, el anlisis de la presencia de bacterias
indicadoras proporciona un alto grado de seguridad, ya se encuentran en
cantidades abundantes en aguas contaminadas.
El agua de consumo tratada puede no contener E. coli y sin embargo contener
agentes patgenos ms resistentes a las condiciones medioambientales o

tcnicas de tratamiento convencionales. Estudios retrospectivos de epidemias


de enfermedades transmitidas por el agua y avances en el conocimiento del
comportamiento de los agentes patgenos en el agua han mostrado que la
confianza sistemtica en hiptesis relacionadas con la ausencia o presencia de
E. coli no garantiza la adopcin de decisiones ptimas relativas a la seguridad
del agua.
Los protozoos y algunos enterovirus son ms resistentes a muchos
desinfectantes, incluido el cloro, y pueden seguir siendo viables (y mantener su
capacidad patgena) en el agua de consumo tras su desinfeccin. Otros
microorganismos pueden ser indicadores ms adecuados de peligros
microbianos persistentes, y debera evaluarse su seleccin como indicadores
adicionales a tenor de las circunstancias locales y los conocimientos cientficos.
Por consiguiente, para verificar la calidad microbiolgica del agua puede ser
preciso analizar diversos microorganismos, como enterococos intestinales,
(esporas de) Clostridium perfringens y bacterifagos.
El cuadro 7.7 indica valores de referencia para la verificacin de la calidad
microbiolgica del agua de consumo. No se deben aplicar valores de referencia
individuales tomados directamente de los cuadros, sino que deben utilizarse e
interpretarse junto con la informacin de las presentes Guas y otros
documentos complementarios.
Una consecuencia de la diversa vulnerabilidad de las personas a los agentes
patgenos es que la exposicin a agua de consumo de una calidad particular
puede producir efectos sobre la salud diferentes en poblaciones diferentes.
Para la determinacin de valores de referencia es necesario definir las
poblaciones de referencia o, en algunos casos, centrarse en grupos de poblacin
vulnerables especficos. Al determinar las normas nacionales, puede ser
oportuno que las autoridades nacionales o locales tengan en cuenta las
caractersticas especficas de las poblaciones afectadas.

1.5

Mtodos de deteccin de bacterias indicadoras de contaminacin


fecal

El anlisis de las bacterias indicadoras de contaminacin fecal proporciona una


indicacin sensible, aunque no la ms rpida, de la contaminacin del agua
de consumo. Dado que el medio de cultivo y las condiciones de incubacin,
as como la naturaleza y antigedad de la muestra de agua, pueden influir
en la especie aislada y en el recuento, la exactitud de los anlisis
microbiolgicos puede ser variable. Es, por consiguiente, muy importante
normalizar los mtodos y los procedimientos de laboratorio para poder aplicar
criterios de calidad microbiolgica del agua uniformes, entre laboratorios
diferentes y a nivel internacional.
Los mtodos normalizados internacionales deben evaluarse, antes de
adoptarlos, en las circunstancias locales. Existen mtodos normalizados
establecidos, como los de la ISO (cuadro 7.8), y tambin mtodos de eficacia y
fiabilidad equivalentes. Para los exmenes sistemticos conviene utilizar
mtodos normalizados establecidos. Sea cual sea el mtodo de deteccin de
E. coli o de coliformes termotolerantes elegido, debe considerarse la
importancia de resucitar o recuperar las cepas daadas por las condiciones
medioambientales o por la accin de desinfectantes.

1.6

Determinacin de medidas locales de respuesta a problemas y


situaciones de emergencia relativos a la calidad microbiolgica del
agua

Durante una situacin de emergencia en la que se tienen pruebas de


contaminacin fecal del agua de consumo, puede ser necesario utilizar
temporalmente otras fuentes de agua o bien modificar el tratamiento de las
fuentes existentes, intensificando la desinfeccin del agua en la fuente, tras su
tratamiento o durante su distribucin.
Si no puede mantenerse la calidad microbiolgica, puede ser necesario
recomendar a los consumidores que hiervan el agua mientras dure la
situacin de emergencia (vase el apartado 1.6.1). Cuando sea posible
reaccionar con rapidez suficiente para impedir que cantidades significativas
de agua contaminada lleguen a los consumidores, puede ser preferible
efectuar una supercloracin y aplicar medidas correctoras inmediatas.
Durante epidemias de enfermedades potencialmente transmitidas por el agua
o cuando se detecte la contaminacin fecal de un sistema de abastecimiento de
agua de consumo, una respuesta inmediata mnima debe ser aumentar la
concentracin de cloro libre a ms de 0,5 mg/l en todo el sistema. Es
fundamental que las decisiones se adopten tras consultar a las autoridades de
salud pblica y, en caso pertinente, a las autoridades civiles.
1.6.1 Recomendaciones de hervir el agua o de evitar su consumo
Los proveedores de agua, conjuntamente con las autoridades de salud
pblica, deben elaborar protocolos para la promulgacin de rdenes de hervir
el agua y recomendaciones de evitar su consumo. Los protocolos deben
elaborarse antes de que se produzcan incidentes y deben incorporarse a los
planes de gestin. Las decisiones de promulgar recomendaciones se realizan
frecuentemente en un plazo corto, y el desarrollo de medidas durante un
incidente puede complicar la toma de decisiones, dificultar la comunicacin y
socavar la confianza de la poblacin.
Adems de la informacin descrita anteriormente, los protocolos deben
proporcionar la informacin siguiente:
- criterios que determinarn la promulgacin y revocacin de las
recomendaciones;
- informacin que debe proporcionarse a la poblacin general y a grupos
especficos; y
- actividades afectadas por la recomendacin.
Los protocolos deben especificar mecanismos de comunicacin de las
recomendaciones de hervir el agua o de evitar su consumo. Pueden
disponerse mecanismos diferentes en funcin de la naturaleza del sistema de

abastecimiento y del tamao de la comunidad afectada, por ejemplo:


comunicados difundidos por televisin, radio, o prensa;
comunicacin, por telfono, correo electrnico o fax, a centros, grupos
comunitarios y autoridades locales especficos;
colocacin de anuncios en lugares bien visibles;
comunicacin en persona; y
comunicacin por correo.
Los mtodos elegidos deben proporcionar una garanta razonable de que la
recomendacin se notifica, a la mayor brevedad posible, a todos los afectados,
incluidos los residentes en el lugar, quienes trabajen en el mismo y quienes se
encuentren all de viaje.
Las recomendaciones de hervir agua deben indicar que el agua puede
potabilizarse calentndola hasta que hierva vivamente. Tras hervirla, debe
dejarse que el agua se enfre sola, sin aadir hielo. Este procedimiento es
eficaz a cualquier altitud y aunque el agua est turbia.
Deber considerarse la necesidad de promulgar recomendaciones de hervir el
agua cuando se produzcan los siguientes tipos de incidentes:

- deterioro substancial de la calidad del agua de origen;


- averas graves que afectan a los procesos de tratamiento o a la integridad de
los sistemas de distribucin;
- desinfeccin insuficiente;
- deteccin de agentes patgenos o de indicadores de contaminacin fecal en el
agua de consumo; y
- datos epidemiolgicos indicativos de una epidemia originada por el agua de
consumo.
La recomendacin de hervir el agua es una medida drstica que puede tener
consecuencias adversas importantes. Puede tener repercusiones perjudiciales
para la salud pblica, como lesiones por escaldaduras, y puede generar
ansiedad en la poblacin, incluso despus de haberse anulado la
recomendacin. Adems, no todos los consumidores cumplirn la
recomendacin de hervir el agua, ni siquiera al principio; si la recomendacin
se anuncia con frecuencia o se mantiene durante periodos largos, disminuir
el grado de acatamiento. Por consiguiente, slo debern difundirse
recomendaciones de hervir el agua despus de que la autoridad de salud
pblica y el equipo responsable de la adopcin de medidas en respuesta a
incidentes hayan examinado cuidadosamente toda la informacin y hayan
concluido que existe un riesgo permanente para la salud pblica superior a los
riesgos derivados de la recomendacin de hervir el agua. Por ejemplo, si se
detecta contaminacin microbiana en muestras de agua de consumo, al
evaluar la necesidad de promulgar una recomendacin de hervir el agua
debern considerarse los factores siguientes:
- fiabilidad y exactitud de los resultados;

vulnerabilidad a la contaminacin del agua de origen;


pruebas del deterioro de la calidad del agua de origen;
resultados del monitoreo de la calidad del agua de origen;
resultados del monitoreo de los procesos de tratamiento y desinfeccin;
residuos de desinfectante; e
integridad fsica del sistema de distribucin.
Debe examinarse la informacin disponible para determinar la fuente
probable de la contaminacin y la probabilidad de que sta vuelva a
producirse o persista.
Una vez tomada la decisin de promulgar una recomendacin de hervir el
agua, sta debe ser clara y fcil de entender por las personas a las que se
dirige, ya que de lo contrario podran hacer caso omiso. Las recomendaciones
debern incluir normalmente una descripcin del problema, de los posibles
riesgos para la salud y los correspondientes sntomas, de las actividades a las
que afecta, y de las medidas de investigacin y correctoras que se han
iniciado; debern, asimismo, indicar el tiempo que, segn se prev, se tardar
en resolver el problema. Si la recomendacin est relacionada con una
epidemia, debera proporcionarse informacin especfica sobre la naturaleza
de la epidemia, sobre la enfermedad y sobre la respuesta adoptada en materia
de salud pblica.
Las recomendaciones de hervir el agua deben sealar los usos del agua de
consumo afectados y los no afectados. Por lo general, la recomendacin
indicar que debe evitarse el uso de agua no hervida para beber, elaborar
bebidas fras, hacer hielo, cocinar o lavar alimentos, o lavarse los dientes.
Salvo que la contaminacin sea intensa, el agua no hervida generalmente ser
apta para baarse (siempre que se evite tragar agua) y para lavar la ropa. Una
recomendacin de hervir el agua podra incluir recomendaciones especficas
dirigidas a grupos vulnerables, como mujeres embarazadas y personas que
pudieran padecer inmunodeficiencia.
Deben proporcionarse tambin recomendaciones especficas para diversos
tipos de centros, como clnicas dentales, centros de dilisis, consultas mdicas,
hospitales y otros centros de atencin de salud, guarderas infantiles, escuelas,
proveedores y fabricantes de alimentos, hoteles, restaurantes y operadores de
balnearios y piscinas pblicos.
Mientras estn en vigor recomendaciones temporales de hervir el agua o de
evitar su uso, debe considerarse el suministro de agua de consumo de otras
fuentes, como agua embotellada o a granel. Los protocolos deben sealar otras
fuentes de agua y mecanismos para su distribucin.
Los protocolos deben especificar los criterios que se aplicarn para revocar las
recomendaciones de hervir agua o de evitar su consumo. En funcin del
motivo que impuls la recomendacin, pueden incluirse uno o ms de los
criterios siguientes:

- pruebas de que los parmetros de calidad del agua de origen vuelven a ser
normales;
- arreglo de las averas que afectan a los procesos de tratamiento o a los
sistemas de distribucin;
- correccin de los fallos de los procesos de desinfeccin y restauracin de los
valores normales de concentracin residual de desinfectante;
- en los casos en que la recomendacin se debi a la deteccin de contaminacin
microbiana del agua de consumo, pruebas de la eliminacin o inactivacin de
la contaminacin;
- pruebas de que se han realizado purgas o desplazamientos de agua de las
caeras suficientes para retirar el agua potencialmente contaminada y las
biopelculas; o
- datos epidemiolgicos indicativos de que la epidemia ha finalizado.
Cuando se anulan las recomendaciones de hervir el agua o evitar su consumo,
debe notificarse la anulacin, por canales similares, a los mismos grupos de
poblacin a quienes se inform de la recomendacin. Adems, debe
informarse a los administradores, gestores u ocupantes de grandes edificios y
de edificios que cuentan con depsitos de almacenamiento de agua de la
necesidad de asegurarse de haber purgado concienzudamente los depsitos y
el conjunto de los sistemas de distribucin internos antes de recuperar los
usos normales del agua.
Las recomendaciones de evitar el consumo de agua, que tienen muchas
caractersticas comunes con las recomendaciones de hervir el agua pero son
menos frecuentes, se aplican cuando el agua contiene contaminantes
peligrosos, principalmente contaminantes qumicos, que no puede eliminarse
hirvindola.
1.6.2 Medidas tras un incidente
Es importante investigar adecuadamente cualquier incidente y promover
medidas correctoras que eviten que vuelva a producirse. El PSA deber
actualizarse para incorporar la experiencia adquirida. Los resultados de la
investigacin pueden tambin ser tiles para disear medidas aplicables a en
otros sistemas de abastecimiento de agua, para impedir que se produzca un
incidente similar en otro lugar. En caso pertinente, las investigaciones
epidemiolgicas de la autoridad de salud tambin contribuirn al diseo de
medidas futuras.

2. BIOLOGA MOLECULAR EN MEDICINA


Introduccin
Las clulas son las unidades funcionales de cualquier organismo vivo. Las
instrucciones necesarias para dirigir sus actividades estn contenidas en los
cromosomas del ncleo celular y son conocidas en su conjunto como
informacin gentica. La informacin gentica se encuentra almacenada en el
cido desoxirribonucleico (DNA) en forma de un cdigo, denominado cdigo
gentico. Un segmento de DNA de localizacin cromosmica precisa que
contiene el cdigo para un producto (protena o RNA) de funcin definida se
denomina gen. La informacin del gen es transferida a los diferentes
compartimentos celulares a travs del cido ribonucleico (RNA) y es
transmitida de una clula madre a las hijas por duplicacin del material
gentico (DNA) [1].
Los procesos celulares involucrados en la transferencia y transmisin de la
informacin gentica en la clula constituyen la materia de estudio de la
biologa molecular. La biologa molecular puede ser definida como una
disciplina que se ocupa del estudio de la vida a nivel molecular. Se
fundamenta en un dogma central (Figura 1), que establece el flujo de la
informacin gentica en la clula (DNA RNA Protena) [1].
Para el estudio de la transferencia y la transmisin de la informacin gentica,
los bilogos moleculares han desarrollado tcnicas que permiten la
manipulacin de los cidosnucleicos (DNA y RNA), denominadas tcnicas del
DNA recombinante; con este mismo fin han propuesto y perfeccionado
procedimientos para el estudio de los productos de la expresin de los genes
(RNA y protenas) [1,2].
La medicina molecular es la ciencia biomdica que utiliza las tcnicas de la
biologa molecular en el estudio de las enfermedades humanas.
El impacto de la biologa molecular en las ciencias mdicas se vio potenciado
por el Proyecto Genoma Humano, investigacin multinacional que
estableci la secuencia de bases del DNA contenido en los cromosomas
humanos. El Proyecto del Genoma Humano ha logrado determinar el orden
preciso de los cerca de 3,200 millones de nucletidos del genoma y elaborar un
mapa que ubica a sus 30 a 40 mil genes. [3,4]. Para la medicina, el
conocimiento de la secuencia completa del DNA humano constituye una
poderosa herramienta para la investigacin en biomedicina que ha permitido
el avance en el conocimiento de la patogenia, el desarrollo de nuevas terapias
y la implementacin de mtodos diagnsticos precisos (Figura 2).

Figura 2. Impacto de la biologa molecular en la medicina. El conocimiento y


las tcnicas generadas por la biologa molecular influyen en el diagnstico y el
tratamiento de las enfermedades humanas. La incorporacin de la biologa
molecular a la medicina ha sido impulsada por el avance tecnolgico y la
comprensin de la informacin gentica producidos por el Proyecto Genoma
Humano.

Medicina genmica
Las diferencias morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas y moleculares entre
individuos de la misma especie (diferencias fenotpicas), son producto de las
variaciones en la secuencia del DNA (variaciones genotpicas). Los cambios en
la secuencia del DNA que se presentan con una incidencia superior al 1%
reciben el nombre de polimorfismos, si la incidencia es menor son llamadas
mutaciones. En el genoma se identifican diferentes tipos de polimorfismos;

VNTRs (de Variable Number Tandem Repeats) y SNPs (de single nucleotide
polymorphism). Los SNPs (variaciones heredadas en una sola base) explican
alrededor del 90% de la diversidad fenotpica en el humano [5,6].
El estudio de los polimorfismos y su asociacin con las enfermedades
humanas es el rea de investigacin de la llamada medicina genmica, la cual
se define como el uso de anlisis genotpicos rutinarios para mejorar los
cuidados de la salud del individuo [7]. De la relacin entre los polimorfismos
y las enfermedades humanas que se derivan de las investigaciones en
medicina genmica surge el trmino de susceptibilidad gentica, es decir,
un polimorfismo o conjunto de estos que confieren propensin gentica al
desarrollo de ciertas enfermedades o bien a complicaciones de estas. La
capacidad de predecir con cierta exactitud los riegos de padecer enfermedades
donde los genes jueguen un papel fundamental hace posible la aplicacin de
medidas preventivas que limiten o incluso eviten los padecimientos y sus
complicaciones. La variabilidad gentica no slo es capaz de identificar la
susceptibilidad a los padecimientos, puede predecir adems la evolucin de
estos y su respuesta a las terapias farmacolgicas; claro ejemplo de ello son los
polimorfismos encontrados en pacientes con DM que se asocian a nefropata
diabtica severa [8].
Farmacogenica
La evaluacin de las reacciones txicas y adversas de los frmacos es un
requisito indispensable para su uso teraputico. Idiosincrasia es el trmino
acuado por la farmacologa para definir las reacciones individuales (tanto
teraputicas como toxicas) que puede experimentar un individuo tras la
administracin de una terapia farmacolgica; en definitiva, la respuesta
individual a las drogas es determinada por el genotipo [9,10].
De los estudios de variabilidad gentica se deriv la farmacogenmica,
disciplina que evala la influencia de los polimorfismos genticos en la
respuesta a los frmacos. Las evaluaciones farmacogenmicas de los nuevos
activos e incluso de los ya existentes permitirn incrementar la eficiencia y
bioseguridad de los tratamientos farmacolgicos para generar un tratamiento
justo a la medida del genotipo, en otras palabras, frmacos hechos a la medida
[10].
Medicina molecular y patogenia
Es clara la implicacin de la biologa molecular en el estudio, diagnstico y
tratamiento de padecimientos genticos hereditarios ocasionados por
mutaciones; sin embargo, todas las enfermedades humanas poseen un
componente gentico bien hereditario o como resultado de la respuesta del
organismo a los estmulos del medio, como las toxinas o los virus.
La exploracin de las funciones de cada gen humano y de sus implicaciones

en la enfermedad revela cmo el genotipo se relaciona con la gnesis y


evolucin de los padecimientos. Con el conocimiento de las bases moleculares
de las enfermedades es posible identificar marcadores para el diagnstico
temprano y nuevos blancos teraputicos, as como desarrollar estrategias
teraputicas novedosas y efectivas que en su conjunto permitan mejorar la
atencin a la salud.
Por ejemplo, actualmente est bien documentada la estrecha asociacin entre
la gnesis del cncer de mama y las mutaciones de los genes BRCA. Los genes
BRCA 1 y 2 funcionan como supresores tumorales [11,12]; mutaciones en estos
genes producen la prdida de su funcin y por lo tanto conducen a
proliferacin celular descontrolada. La deteccin de portadores de mutaciones
en BRCA1 y BRCA2 tiene un gran impacto sobre la prctica mdica, permite
implementar estrategias de prevencin y diagnstico temprano en miembros
de familias con individuos afectados, adems de permitir predecir la
evolucin (agresividad) del cncer de mama para en ltima instancia
determinar el manejo ms adecuado [13].
Diagnstico molecular
La biologa molecular ha venido a revolucionar los estudios diagnsticos de
enfermedades hereditarias y adquiridas. Las tcnicas moleculares aplicadas al
diagnstico ofrecen mayor sensibilidad, especificidad y rapidez con
requerimientos mnimos de muestra en comparacin con las pruebas
convencionales. Esto permite el inicio temprano del mejor esquema
teraputico, disminuyendo de esta manera la probabilidad de complicaciones
(Figura 3) [14-16].
Las tcnicas moleculares aplicadas al diagnstico de enfermedades infecciosas
en ocasiones superan las limitaciones que imponen los organismos para su
aislamiento. Los cidos nucleicos microbianos extrados de una muestra
clnica pueden ser analizados para buscar la presencia de secuencias de DNA
especficas de los organismos sin importar los requerimientos fisiolgicos para
la viabilidad de los organismos [16]. El anlisis y la clonacin del genoma del
virus de la hepatitis C (HCV) ha permitido conseguir antgenos virales
necesarios para el desarrollo de pruebas serolgicas. Actualmente, las tcnicas
de biologa molecular permiten la identificacin, cuantificacin y el anlisis de
la secuencia del genoma de HCV en individuos infectados.

Figura 3. Diagnstico Molecular. Las tcnicas generadas por la Biologa Molecular ofrecen ventajas
sobre las tcnicas convencionales en el diagnstico de enfermedades hereditarias y adquiridas.

Terapia gnica
La terapia gnica se define como la transferencia o introduccin de material
gentico para modificar el repertorio gentico de clulas, destinada a curar
enfermedades de origen tanto hereditario como adquirido. Las enfermedades
posibles de tratar con esta estrategia teraputica incluyen desde las
monognicas hereditarias hasta las polignicas e infecciosas; dada esta
diversidad, cada enfermedad requiere un abordaje particular. Las opciones en
la manipulacin gentica son variadas e incluyen la adicin o supresin de
genes. La adicin de genes (insertar un gen funcional que exprese la protena
teraputica en el tejido indicado), incluye la correccin de genes defectuosos,
insertar genes para inducir funciones nuevas o incrementar la expresin de un
gen de inters. Por otro lado, la supresin gnica se realiza a travs de RNA de
interferencia, oligonucletidos anti-sentido o bien ribozimas para disminuir o
anular la expresin de genes.
Segn el procedimiento que se aplique a las clulas para introducir el gen, la
terapia gnica se divide en terapia gnica ex vivo e in vivo (Figura 4). En la
terapia ex vivo las clulas a transfectar son cultivadas para posteriormente
introducirles el material gentico; una vez que estas clulas expresan el gen
teraputico son introducidas nuevamente al paciente. Por otro lado; la terapia
in vivo consiste en la introduccin directa del gen teraputico al torrente
sanguneo o en la administracin directa en el rgano o tejido diana. Cuando
la terapia gnica se aplica en clulas germinales se origina un cambio
permanente de todo el organismo y en generaciones posteriores. Por el
contrario, la aplicacin en clulas somticas implica que solo tejidos u rganos

sean transfectados mediante administracin sistmica, inyeccin directa o


previa extirpacin del tejido. Este tipo de terapia gnica se aplica a
prcticamente cualquiera de las clulas del organismo y es la ms aplicada en
la clnica.

Figura 4. Modalidades de la Terapia Gnica.

Para transferir los genes teraputicos, la terapia gnica utiliza vehculos de


origen viral o no viral llamados vectores. La transferencia de genes y cambios
fenotpicos provocados por un vector viral se denomina transduccin; en
cambio, la transferencia de genes por un sistema no viral se denomina
transfeccin (Figura 5).
Los vectores no virales muestran una baja toxicidad y en general son de bajo
costo; sin embargo, la transferencia de genes es generalmente ineficiente y
transitoria. La transfeccin por vectores no virales se divide a su vez en
mtodos fsicos (electroporacin, bombardeo de partculas, inyeccin directa
de DNA, etc.) y qumicos (precipitacin con fosfato de calcio, liposomas, etc.).
Electroporacin; consiste en el uso de una corriente elctrica para
generarorificios en la membrana celular a travs de los cuales el material
gentico se introduce, generalmente por precipitacin de complejos DNAsales. Usada para cultivos celulares.
Bombardeo de partculas; consiste en el uso de un aparato de balstica que
dispara micropartculas de oro rodeadas de DNA plasmidico; estas partculas
atraviesan la pared celular depositando el material gentico en el citoplasma.
Es el mtodo de eleccin para la transfeccin de clulas vegetales.
Inyeccin directa del DNA; consiste en la introduccin directa de DNA en el

ncleo celular mediante una especie de jeringa y un microscopio. Se utiliza


principalmente para la produccin de animales transgnicos.
Precipitacin con fosfato de calcio; consiste en formar un precipitado insoluble
entre el cloruro de calcio y el DNA que forma microagregados que se
depositan sobre la membrana celular y posteriormente son endocitados. Es la
tcnica de eleccin para experimentos in vitro.
Liposomas; se basa en polmeros de poliamidoaminas y lipopoliaminas con
cargas positivas que se unen a las cargas negativas del DNA formando
vesculas multilaminales que interactan con los lpidos de la membrana
celular, facilitando la transferencia de los cidos nucleicos al interior de las
clulas.

Figura 5. Vectores tiles en la Terapia Gnica

Por otro lado, los vectores virales presentan una mayor eficiencia de
transduccin comparados con los sistemas no virales, por lo que son los
vectores de eleccin en los modelos in vivo y en protocolos clnicos de terapia
gnica. Hasta el momento se usan retrovirus, adenovirus, adenoasociados,
herpesvirus y baculovirus. Para su uso como vectores, los virus son
modificados genticamente para que sean deficientes en replicacin; en
algunas ocasiones adems, su cpside es modificada con la finalidad de dirigir
o re-direccionar su clula blanco. Cada uno de estos vectores posee ventajas y
limitaciones respecto a los otros dependiendo del transgen, el tipo celular y la
va de administracin. En general, un vector ideal debe producirse de manera
fcil y eficiente, no ser txico o inducir reacciones inmunolgicas, ser capaz de
infectar a clulas tanto en reposo como en replicacin y transducir tipos
celulares de manera especfica.
Con base en la naturaleza de su genoma los vectores virales pueden ser
divididos en vectores de RNA y DNA; dada su capacidad de integrar o no su

genoma viral dentro del DNA cromosmico de la clula husped pueden ser
clasificados como vectores integrativos o nointegrativos. Los vectores
integrativos se basan en retrovirus; los no integrativos incluyen a los vectores
adenovirales (Ad), virus adeno-asociados (AAV) y los virus de herpes simple
tipo 1 (HSV-1).
Medicina de RNA
La medicina de RNA utiliza diversas estrategias basadas en el uso de
molculas de RNA con fines teraputicos. De estas estrategias, la primera en
ser desarrollada fue la terapia antisentido; es decir, aquella basada en el
empleo de oligonucletidos antisentido expresamente diseados para
bloquear la accin de determinados genes. Esta idea inicio promisoriamente
hacia 1992 en la Universidad de Harvard, donde se propuso inicialmente que
la terapia antisentido podra resultar eficaz para tratar enfermedades
vinculadas con una actividad gentica anormal y donde se inici la
elaboracin comercial de oligonucletidos antisentido.
Esta terapia se basa en la sntesis de un oligonucleotido antisentido a un
mRNA para el que se desea bloquear su traduccin, evitando as la
produccin de una protena nociva. En un abordaje alterno, el oligonucletido
puede ir dirigido a unirse a un DNA de doble cadena que contiene una
mutacin causante de una patologa; de esta manera, la triple cadena formada
no ser transcrita, impidiendo la expresin del gen defectuoso.
Las desventajas presentadas por esta estrategia estriban en la gran cantidad de
oligonucletidos que se requieren administrar para sistemas in vivo y en la
facilidad de degradacin de estos RNA de cadena sencilla (a veces aun antes
de alcanzar su objetivo); adems, dada la conformacin espacial tanto del
DNA como del RNA, aun con un diseo terico correcto no es posible
asegurar la hibridacin del oligonucletido. Esta estrategia ha probado ser til
para bloquear la expresin del oncogn kRAS, los efectos fibrticos del TGF-
y para inhibir la expresin vrica del VHC.
El sistema de inhibicin conocido como RNA de interferencia (RNAi) se
descubri al observarse que algunas molculas de RNA de longitud pequea
podan anular la expresin de genes en clulas de plantas y animales al
hibridar con las cadenas de RNA mensajero, con lo que la sntesis proteica se
vea inhibida [17,18]. Este proceso de inhibicin con RNA de doble cadena se
da en las clulas naturalmente, por ejemplo, las plantas lo utilizan como
defensa contra infecciones virales; otros procesos dentro de la clula utilizan
mecanismos similares.
El siguiente aporte en esta historia, despus del descubrimiento de los RNA
pequeos, ocurri a mediados del 2002 cuando se identific una enzima con
actividad de ribonucleasa llamada Dicer. Esta enzima es la encargada de
producir en la clula las molculas de RNA pequeo a partir de molculas de

RNA grandes. Los segmentos cortados pueden ser, segn el gen que los
produjo, microRNAs y RNAs interferentes cortos (siRNAs).
Los siRNAs se originan por el procesamiento de un RNA largo de doble
cadena (dsRNA) por la enzima Dicer que genera fragmentos de 20-25
nucleotidos de longitud. Este siRNA se incorpora a un complejo denominado
Complejo Silenciador Inducido por RNA (RISC) que contiene proteasas. Al
constituirse el RISC, las hebras complementarias (sentido y antisentido) del
siRNA son desapareadas. El siRNA desapareado antisentido se asocia,
mediante hibridacin, con el RNA blanco y gua al complejo RISC hacia su
secuencia blanco (mRNA sentido) al cual es complementario. La actividad de
endorribonucleasa corta el RNA blanco en la porcin media de la regin
pareada y algunas exonucleasas completan la degradacin. Esta estrategia se
ha utilizado como herramienta para silenciamiento de genes especficos en
clulas de mamfero. Otras estrategias que se han implementado para inducir
la expresin de estas molculas son la inyeccin de dsRNA (sintetizado
qumicamente o transcrito in vitro), el bombardeo de partculas recubiertas del
RNAi o la transfeccin con vectores que portan secuencias para la expresin
endgena del RNAi (transitoria o estable).
Las posibilidades y aplicaciones del RNA pequeo han cambiado la manera
de entender la produccin de protenas, la cual ya no se puede explicar sin la
participacin de estos RNA que pueden inactivar genes completos. Como
estrategia teraputica, su poderosa accin de inhibicin y la posibilidad de
propagarse de una clula a otra podr generar nuevas terapias genticas
altamente eficaces. Por su tamao pequeo, su participacin en la expresin o
inexpresin de protenas y sus funciones todava desconocidas, los RNA
pequeos se han convertido en molculas clave que repercutirn en la forma
en que nos acercamos a los mecanismos de la vida.
Los microRNAs (miRNA) son RNA de cadena sencilla de 21-23 nucletidos de
longitud que regulan la expresin gnica. Fueron descritos por primera vez
por el grupo de Victor Ambros en 1993 como small RNAs, aunque el termino
micro RNA se acuo hasta el 2001 por Ruvkun [19,20]. Los miRNA son
codificados por genes que son transcritos mas no traducidos; estos transcritos
son procesados a un forma llamada pri-miRNA que originan las estructuras
premiRNA que contienen una pequea horquilla; finalmente se originan los
miRNA maduros. Los genes que los originan son transcritos primariamente a
pri-miRNA con una CAP y una cola de poli A que es procesado en el ncleo
de la clula a un segmento corto de 70 nucletidos con estructura de pasador
llamado pri-miRNA. Este procesamiento lo realiza un complejo llamado
Microprocessor complex, que incluye una nucleasa llamada Drosha y una
protena de unin a RNA de doble cadena denominada Pasha.
Posteriormente, en el citoplasma, el pre-miRNA es procesado a su forma
madura por la nucleasa Dicer que inicia la formacin del complejo RISC
(complejo inductor del silenciamiento de RNA). El corte por Dicer origina dos
molculas pequeas complementarias de RNA, de las cuales solo una,

conocida como hebra gua, es seleccionada por la protena Argonauta


(RNAasa del complejo RISC) para integrar el complejo RISC mientras que la
cadena sobrante es degradada. El miRNA generado complementara a su
secuencia blanco la cual ser degrada por el complejo RISC.

Figura 5. Va del miRNA

En plantas, la funcin de estas molculas parece ser similar a la del RNAi


(facilitar el corte del mRNA); en el caso de los animales, se cree funciona
previniendo la traduccin proteica sin degradar el mRNA. Los miRNA
parecen tambin regular la metilacin de secuencias.
La actividad de un miRNA puede ser bloqueada por un locked nucleic acid
(LNA), que es un oligonucletido modificado (2'-O-methyl RNA oligo), o por
un oligonucletido bloqueador estrico [21]. Los miRNA [22,23] han sido
vinculados a patologas como cirrosis, cncer, dao muscular, etc; y su
bloqueo est siendo explorado como una estrategia teraputica para el
tratamiento de varios padecimientos [21].

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3. MANEJO DE MUESTRAS PARA LA DETECCIN DE


CIDOS NUCLEICOS FNGICOS
Como en otros procedimientos de diagnstico microbiolgico, es necesario
obtener las muestras de forma apropiada, siguiendo las normas generales de
asepsia y transporte rpido al laboratorio.
Cuando se plantea aplicar tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos es
especialmente importante ser muy cuidadoso con la asepsia. La mayora de
estos mtodos tienen una alta sensibilidad y son capaces de detectar
cantidades muy pequeas de ADN fngico, por lo que una dosis
contaminante, aunque sea muy baja, puede ofrecer un resultado positivo
claro. Este aspecto es de importancia extrema cuando se llevan a cabo
mtodos basados en la amplificacin de secuencias universales para hongos.
De forma general, se recomienda no manipular las muestras en el mismo
laboratorio en el que se trabaja con cultivos fngicos. Adems, si es posible, el
termociclador (aparato que realiza la amplificacin) debe estar situado en una
habitacin o cubculo independiente del resto del laboratorio y sin sistema de
ventilacin que genere corrientes de aire.
Para el diagnstico de las infecciones fngicas, se puede utilizar prcticamente
cualquier tipo de muestra clnica, desde lquidos orgnicos a tejidos. Las
muestras que han sido ms ensayadas, hasta el momento, son la sangre y el
suero; aunque se dispone de interesantes resultados con casi cualquier fluido
primariamente estril, como lquido cefalorraqudeo, humor acuoso y vtreo,
lquidos de derrames, lavado broncoalveolar y diversos tejidos [1-6].
Las posibilidades de los mtodos son en principio muy amplias pero sin duda,
el diagnstico precoz de IFI es el objetivo de mayor inters y en el que se han
puesto ms expectativas en la aplicacin de estas tcnicas. En estos casos la
muestra ms estudiada ha sido la sangre total y los patgenos de mayor
inters Candida y Aspergillus [7,8].
PECULIARIDADES EN EL MANEJO DE DETERMINADAS MUESTRAS
Suero. Aunque la sangre en principio es mejor muestra que el suero o plasma,
los primeros protocolos aplicados para la extraccin de ADN de estas
muestras ofrecan un bajo rendimiento, en gran medida debido a la dificultad
para romper las clulas fngicas y extraer con xito suficiente cantidad de
molcula diana, adems la presencia de hemoglobina puede inhibir la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). As pues, se consider que la
utilizacin de suero como sustrato, ofrecera mejor rendimiento ya que en el
mismo se podran detectar fragmentos libres de molculas de cidos
nucleicos. Algunos estudios han ofrecido resultados positivos en este sentido
[9,10] pero actualmente, los problemas planteados con la sangre total se van

solucionando y es minoritario el empleo de suero como sustrato de estudio


para deteccin de cidos nucleicos. De hecho este mtodo tiene un bajo
rendimiento ya que el cido nucleico libre se degrada rpidamente y la
concentracin de estas molculas es siempre ms baja que en sangre total.
Sangre. En ella se pueden encontrar estructuras celulares fngicas completas
en las que el hongo se conserva con su genoma intacto. La presencia de los
envoltorios celulares propios de los hongos gener, al comienzo, muchos
problemas para conseguir la extraccin del ADN, pero estas limitaciones se
han ido resolviendo y, actualmente, el problema que genera la sangre total
depende sobre todo de los componentes que interfieren con la PCR. Por tanto,
es conveniente tratar la sangre (lisando los hemates) antes de procesarl a para
extraccin de cidos nucleicos.
Otros fluidos estriles. Los fluidos primariamente estriles como lquido
cefalorraqudeo, lquido sinovial, lquido pleural, lquido asctico, humor
acuoso, humor vtreo y otros, no suelen precisar tratamiento antes de la
extraccin de cidos nucleicos. En caso de que sean lquidos hemorrgicos hay
que hacer una lisis previa de hemates. Las clulas de la serie blanca, muy
abundantes en lquidos purulentos, pueden contener elementos fngicos en su
interior y son muy tiles por conservar la molcula diana. Estas clulas se
lisarn durante el proceso de extraccin del ADN.
Muestras oculares. Las muestras de endoftalmitis y queratitis deben ser
tomadas en condiciones estriles y preferiblemente por el oftalmlogo. En
endoftalmitis, el medio extracelular debe esterilizarse con solucin iodada de
povidona 5% antes de la extraccin de la muestra. Siempre es preferible dejar
el fluido extrado (vtreo o acuoso) en la jeringuilla, transportarla al
laboratorio a 4C y procesarla inmediatamente en un ambiente estril. En las
queratitis se realiza un raspado con esptula de Kimura, despus de instilar
anestsico tpico, y las clulas se depositan en agua destilada estril que se
trabajar como muestra [3].
Muestras tisulares. Las biopsias tienen una buena rentabilidad, aunque para
conseguirlas deben realizarse tcnicas invasoras no indicadas en todos los
enfermos. Es importante manejarlas como muestras de diagnstico molecular
desde el momento en que se extraen del paciente, ya que el tratamiento
habitual de las mismas con fijadores como el formol, las invalida como
material de trabajo para las principales tcnicas de diagnstico molecular.
Lavado broncoalveolar. Las muestras respiratorias tienen una especificidad
menor, debido a los falsos positivos que genera la presencia de Aspergillus, y
otras especies fngicas, que colonizan el tracto respiratorio. En el caso de
utilizar lavados broncoalveolares, muestras presuntamente estriles, la
sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivo y negativo son
superiores a los de otras muestras, segn han demostrado algunos estudios.
[11,12].

Tcnicas de extraccin
La preparacin de la muestra puede tener un impacto mu y significativo en la
sensibilidad y reproducibilidad del mtodo diagnstico. En general, el mtodo
de preparacin de la muestra debe liberar el ADN intracelular, rompiendo la
pared de la clula fngica, la membrana celular y la membrana nuclear.
Adems, debe concentrar las molculas blanco del ADN que puedan estar
presentes en pequeas cantidades y debe eliminar los restos de protenas,
contaminantes, posibles inhibidores y otros materiales extraos, sin que se
degrade el cido nucleico.
Existe una gran diversidad de protocolos individualizados y tcnicas caseras
de extraccin. Las divergencias entre ellos se centran fundamentalmente en el
mtodo de ruptura de envoltorios . Todos los hongos no presentan las mismas
necesidades en este sentido, de forma que algunos se lisan de manera sencilla
con un choque osmtico y detergentes, mientras que otros precisan de la
combinacin de varias estrategias para poder exponer el genoma. En general,
los mecanismos de ruptura y lisis de pared y membranas pueden ser de tres
tipos: mecnico, osmtico y enzimtico o bioqumico, pudindose combinar
entre ellos.
A pesar de tanta variedad, existen protocolos ya estandarizados de uso muy
frecuente para un amplio nmero de especies fngicas. Entre los protocolos de
extraccin comercializados, Microbial DNA Isolatio n Kit (Mo Bio
Laboratorios, CA, EE.UU.) y QIAmp DNA Mini Kit (QIAGEN, CA, EE.UU.)
son fiables pero su precio es elevado; entre los protocolos de extraccin
caseros, el publicado por White y col. es uno de los que presenta mayores
garantas [14].
En caso de no disponer de un protocolo estandarizado, algunos detalles
prcticos pueden ayudar a elegir entre los disponibles. Un aspecto importante
es el tipo de muestra (con o sin inhibidores) y la cantidad de que se dispone de
la misma. En general los mtodos de biologa molecular no precisan de
grandes cantidades de muestra, de hecho es otra de las ventajas de estas
tcnicas, pero en ocasiones hay que tenerlo en cuenta (muestras oculares) para
elegir mtodos con alto rendimiento [3]. Por otra parte, es muy importante
valorar la presencia de la diana que se va a tratar de detectar. Algunos
mtodos de extraccin suponen una gran prdida del ADN, o una dilucin
sustancial de este, durante el procesado de la muestra. Cuando la tcnica
elegida incluye la amplificacin de la diana, el problema es menor que si se
han elegido tcnicas de hibridacin u otras que no multiplican la secuencia a
detectar. Las dianas que estn presentes en un alto nmero de copias a lo
largo del genoma del hongo originan menos problemas en este sentido. Si
adems se utilizan tcnicas de amplificacin de las mismas, el efecto de
prdida de ADN asociado a la extraccin es menor. Por ltimo, y muy
importante, es imprescindible tener en cuenta las peculiaridades del hongo a
detectar, especialmente la posible presencia de envoltorios u otras estructuras

celulares que limiten la efectividad de la extraccin (como la presencia de una


gruesa cpsula). Muchos de los primeros fracasos en la aplicacin de estos
mtodos en micologa, se debieron a la dificultad que presentan la mayora de
los hongos para la ruptura de sus envoltorios. Algunos protocolos de
extraccin precisan combinar ms de un mtodo de lisis celular, para
garantizar esta ruptura. Adems, con una determinada muestra es posible que
un protocolo permita extraer ADN de una levadura como Candida pero no de
otra como Cr yptococcus. El protocolo a seguir se puede perfilar muy bien
cuando existe una clara sospecha diagnstica, pero cuando se quiere extraer
ADN de cualquier hongo que pueda estar parasitando un determinado tejido
el problema es ms complejo.
Por lo tanto, la eficacia diagnstica de los distintos mtodos moleculares
depender en gran medida de la tcnica de extraccin utilizada. En trminos
generales, los mtodos de extraccin deben seguir protocolos universales y, si
es posible, deben estar comercializados. Adems, se debe intentar mejorar su
capacidad de concentracin y purificacin de los cidos nucleicos mediante
procesos de automatizacin o mediante tratamientos especficos (sonicacin,
congelacin, etc.).
As pues, cuando no existe un protocolo estandarizado es necesario valorar una
serie de requisitos:

Tipo de muestra: con o sin posibles inhibidores de la polimerasa.


Cantidad de muestra: en general se precisan cantidades bajas.
Diana a detectar: De bajo o alto nmero de copias en el genoma.
Envoltorios celulares: Presencia de cpsula u otros.
Habitualmente, la ruptura de los envoltorios celulares fngicos se realiza
mediante diferentes mtodos:

Mecnicos: sonicacin, congelacin, agitacin con perlas de vidrio o tips.


Qumicos: detergentes o agentes qumicos (urea, SDS).
Enzimticos: proteinasa K, novozima, zimolasa.
Adems de la ruptura de la pared y otras estructuras, todos los protocolos
deben incluir agentes que precipiten y limpien de restos celulares la muestra.
Para ello lo ms frecuente, es aplicar la denominada extraccin fenlica que,
despus del sistema que corresponda de ruptura de envoltorios, permite
obtener una muestra de cido nucleico limpia y en cantidad suficiente.

En la Tabla 20.1 se exponen los resultados de un estudio recientemente


publicado [15] que analiza algunos de los mtodos utilizados en la extraccin
de ADN a partir de Candida (proteinasa K-fenolcloroformo PKFC-; Lisis por
calor y tiocianato de guanidinio LCTG-; QIAmp DNA; HighPure PCR
template y DNAzol). Estos resultados muestran una amplia variacin en los
lmites de deteccin, el tiempo de procesamiento y el coste, en funcin del
protocolo de extraccin utilizado.
Seleccin de la molcula diana
Las molculas utilizadas como blanco de deteccin en las pruebas desarrolladas
para el diagnstico de las micosis incluyen tanto genes mitocondriales como
nucleares, de una o mltiples copias (Tablas 20.2, 20.3, 20.4 y 20.5) [13]. En
general, los mtodos diagnstico moleculares que utilizan genes multicopia
ofrecen mejores resultados que aquellos que emplean genes con una sola copia.
La diana multicopia ms utilizada son los genes ribosmicos. De un modo
prctico, pueden considerarse las dianas ribosmicas y las no ribosmicas como
dos categoras diferenciadas para valorar los distintos mtodos de deteccin de
hongos.
Dianas no ribosmicas
Entre las dianas no ribosmicas se incluyen las secuencias que codifican a)
protenas de tipo funcional, como el citocromo P450 de Candida [16],
implicadas en funciones vitales para el gnero o la especie o en funciones
caractersticas del grupo y b) protenas de tipo estructural (gen de la actina o
protenas del ribosoma) [17]. Tambin se han utilizado como dianas secuencias
que amplifican telmeros de genes mitocondriales [18] y secuencias no
especficas y arbitrarias que se utilizan para hibridacin y amplificacin al azar
por PCR (AP-PCR) [19].

Dianas ribosmicas
La regin genmica ms frecuentemente utilizada para detectar ADN fngico e
identificar especies, es la que incluye el complejo ribosomal (genes 18S, 5.8S y
28S). Estos genes contienen secuencias conservadas comunes a todos los hongos
y tambin, dominios variables y regiones espaciadoras internas (ITS), altamente
variables. Las secuencias conservadas se pueden utilizar para detectar la
infeccin fngica, mientras que las variables se pueden emplear para la
identificacin de las especies implicadas. Esta regin adems, se encuentra en el
genoma en un alto nmero de copias. En levaduras concretamente, se estiman
unas 150 repeticiones en tandem de los genes ribosmicos [20] lo que garantiza
la sensibilidad del mtodo de deteccin. De hecho, se han obtenido magnficos
resultados en este sentido con dichas secuencias ribosmicas [3,21,22]. La
organizacin de este complejo en los hongos, representada en la Figura 20.1,
permite disear sondas y cebadores que hibriden y detecten tanto secuencias
muy conservadas e inespecficas, como variables y muy especficas,
dependiendo del objetivo del mtodo.

Gen de la subunidad 18S. Los primeros estudios que utilizaron el complejo


ribosomal como diana, se concentraron en el gen 18S del ADN. La comparacin
de las secuencias nucleotdicas dentro de esta regin ha sido un mtodo muy
til para taxonoma de base filogentica. Sin embargo, su uso en

identificacin tiene limitaciones. Por una parte, la gran homologa de secuencia


dentro de los hongos no permite en muchos casos diferenciar especies y por
otra, la gran longitud del gen exige comparar largas secuencias nucleotdicas.
No obstante, pueden encontrarse diversas tcnicas moleculares de diagnstico
que analizan esta regin mediante amplificacin por PCR y/o hibridacin. De
hecho existen sondas especficas y cebadores para detectar Candida [23],
Aspergillus [24,25,27], Trichophyton, Microsporum, Saccharomyces, Cryptococcus ,
Malassezia, Histoplasma y Penicillium [7,26].

Figura 20.1. Estructura del ADN ribosmico, con los fragmentos ITS (Internal Transcriber Spacers). La
amplificacin de estas zonas de ADNr utilizando los iniciadores ITS-1 e ITS-4 y posterior secuenciacin de los
fragmentos amplificados, permite diferenciar entre la mayora de las especies fngicas. La tcnica de PCR en
tiempo real permite automatizar el proceso y cuantificar la deteccin.

Gen de la subunidad 28S. Ha sido utilizado principalmente para estudios


filogenticos. Presenta regiones variables pero su tamao es superior al del gen
18S. Resulta una regin vlida para diferenciacin en niveles taxonmicos altos

(por encima de especie). Existen trabajos que utilizan esta regin para detectar
infeccin fngica por amplificacin PCR, pero centrndose en las regiones
variables [2].
Regin de los espaciadores. Esta regin incluye los espaciadores intergnicos
ITS1 e ITS2 y el gen de la subunidad 5.8S. Actualmente, este es el fragmento
ms utilizado como diana para la deteccin e identificacin de hongos. El
fragmento completo tiene una longitud aproximada de 600 pares de bases (su
tamao vara segn la especie). El gen 5.8S no es vlido para filogenia ni
identificacin, pero es una excelente diana para unin de cebadores universales
puesto que la secuencia est muy conservada y es de pequeo tamao. Las
regiones espaciadoras tienen secuencias con variabilidad interespecie (con
algunas excepciones). En conjunto ofrecen una magnfica diana puesto que las
regiones conservadas facilitan el diseo de cebadores que se unen en todos los
hongos; adems, el fragmento que flanquean posee secuencias variables para
las diferentes especies de un gnero. Por otra parte, el pequeo tamao del
segmento facilita el estudio y comparacin de la secuencia. La mayora de las
tcnicas moleculares se centran en el estudio de esta regin [3,28,29].
El hallazgo de zonas variables, como los fragmentos ITS 1 y 2 del ADN
ribosmico (ADNr) o las zonas D1/D2 del 28S de ADNr, estn desplazando las
pruebas basadas en la deteccin del 18S. Para seleccionar la diana ms
adecuada en cada caso primero hay que preguntarse qu se busca?
Obviamente, se busca ADN fngico pero es importante definir una de las dos
estrategias posibles:
1. Inespecfica (mtodos no orientados): Detecta cualquier hongo que se
encuentre en la muestra.
2. Especfica (mtodos orientados): Detecta hongos de una especie
determinada, por ejemplo Candida albicans, o de un gnero concreto
(Candida, Aspergillus, etc.).
Para cada uno de los planteamientos se combinar una diana determinada y un
mtodo de deteccin. Se pueden detectar dianas diferentes aunque se trabaje en
la misma regin del genoma (ADN ribosmico) y, dependiendo de la
metodologa utilizada, desarrollar una estrategia de tipo especfico o
inespecfico.
Mtodos de amplificacin y deteccin
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR Polymerase Chain Reaction) ha
sobrepasado a otras tcnicas de diagnstico basadas en los cidos nucleicos,
como el Southern Blot, debido a su simplicidad, sensibilidad, rapidez y
especificidad. La PCR permite la amplificacin de la regin del genoma
seleccionada para anlisis, en un tiempo mnimo (aproximadamente 31/2 h).
No obstante, los mtodos de hibridacin siguen teniendo cierto lugar en
diagnstico, por lo que se comentan brevemente.

Figura 20.2. Representacin del proceso de amplificacin de fragmentos de cido nucleico medinte la tcnica de la
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR). Los tres pasos que se repiten representan un ciclo completo, con las fases
de desnaturalizacin (separacin de cadenas), unin de los cebadores a cada hebra y sntesis de la copia del fragmento
diana. El proceso se repite tantos ciclos como se programe, obtenindose un elevado nmero de copias idnticas de la
diana.

Tcnicas de hibridacin
Emplean sondas de ADN para detectar la presencia de un organismo
determinado. La sonda es una cadena nica de ADN que se ha sintetizado para
que sea complementaria a la secuencia que se quiere detectar y que va marcada
para poder identificarla despus de la hibridacin. Las tcnicas ms extendidas
dentro de este grupo son las que detectan AD N ribosmico de Histoplasma
capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Penicillium marneffei y
Cryptococcus neoformans. Algunas de estas tcnicas se han llegado a
comercializar empleand o quimioluminiscenci a como sistema de revelado (
AccuProbe: Gen-Probe, San Diego, EE.UU.). Se parte de una pequea porcin
de la colonia a identificar, se extrae el RNA y luego se permite que hibride con
sondas marcadas con steres de acridina, captndose la luz emitida por medio
de un luminmetro [7].
Las pruebas de hibridacin in situ se han empleado para localizar cidos
nucleicos de los microorganismos en tejidos. Esta tcnica ha sido usada para la
identificacin de Candida spp. y Aspergillus spp. Aunque el proceso es rpido y
sencillo de realizar, la sensibilidad de la prueba es frecuentemente ms baja que
las pruebas de amplificacin de cidos nucleicos. La hibridacin in situ y
revelado mediante la observacin microscpica de fluorescencia, se ha aplicado
tambin para la identificacin de Candida spp. y algunos hongos filamentosos
directamente en muestras clnicas. Habitualmente, la diana empleada es el
fragmento 18S del RNA ribosmico, que tiene una especificidad limitada, con
abundantes falsos positivos.

Tcnicas de amplificacin
Adems de la PCR convencional ltimamente ya estn apareciendo trabajos
para la deteccin de ADN fngico mediante PCR a tiempo real. La PCR consiste
bsicamente en la localizacin de secuencias especficas por complementariedad
de bases, como en la hibridacin; pero una vez halladas, la PCR las copia
mltiples veces amplificando su presencia y por tanto su seal mientras que la
hibridacin simplemente las marca. En la hibridacin suelen utilizarse
compuestos que emiten una seal fluorescente para marcar las secuencias
diana. El producto (amplicn) generado en la PCR clsica se suele detectar
mediante electroforesis en gel de agarosa, teido con bromuro de etidio.

Figura 20.3. Obtencin de fragmentos especficos de cido nucleico mediante la tcnica de la PCR anidada. Se
parte del producto de la primera PCR (Figura 20.1) y se somete a una nueva amplificacin que puede ser: con
cebadores nuevos que hibriden en regiones comprendidas en la primera diana (PCR Anidada o Nested PCR); o
con un cebador igual a la primera amplificacin junto con uno nuevo que hibrida dentro de la regin amplificada
(PCR Semianidada o Seminested PCR).

Combinaciones de ambas tcnicas


Existen otras tcnicas en las que bsicamente se utiliza la PCR para obtener una
gran cantidad de fragmento diana y, posteriormente, la hibridacin como
mtodo para detectar la presencia de dicha secuencia. Estas tcnicas pueden
combinarse con mtodos moleculares inmunolgicos que generalmente aportan
el sistema de marcado de secuencias especficas. De esta forma, puede
plantearse la hibridaci n con una sond a complementaria del amplicn y la
deteccin mediante inmunoanlisis (EIA), que proporciona una lectura
colorimtrica o fluorescente automatizada.

Principales tcnicas de deteccin e identificacin de ADN fngico basadas en la


PCR
La PCR amplifica una regin especfica del genoma mediante unos cebadores
(Figura 20.2). Diferencindose entre las que usan cebado re s especficos
(bsqueda orientada) y aquellas que usan cebadores universales para detectar
cualquier tipo de ADN fngico en la muestra. En el primer caso, un resultado
positivo en la PCR ya indica el gnero o especie fngica; en el segundo, solo
indica la presencia de un hongo en la muestra pero sin conocer su especie.
Posteriormente, para identificar la especie se puede elegir entre una amplia
gama de tcnicas moleculares, cada una de ellas con sus ventajas e
inconvenientes.
Identificacin orientada: bsqueda especfica
Estas tcnicas permiten la identificacin de hongos en el mbito del gnero o de
la especie, en base a la utilizacin de sondas o cebadores diseados
especficamente para detectar una secuencia conocida de un hongo concreto.
PCR simple. Amplificacin mediante una pareja de cebadores especficos de
gnero o especie, dependiendo del objetivo planteado (Figura 20.2).
PCR anidada. Se incorpora una segunda pareja de cebadores para una segunda
amplificacin en la que se utiliza como diana el producto amplificado en la
primera PCR. Esta tcnica tiene tambin una modificacin llamada PCRsemianidada (snPCR) en la que la segunda PCR mantiene uno de los cebadores
de la primera y aade uno nuevo que acorta la regin amplificada y detecta
fragmentos ms especficos, generalmente especie-especficos. Se ha
comprobado una alta efectividad en la deteccin de especies patgenas de
Candida (C. albicans, C . tropicalis , C. glabrata y C. parapsilosis) (Figura 20.3).PCR
mltiple. Varias parejas de cebadores se utilizan en una misma PCR. Este
mtodo ha sido ensayado en identificacin de hongos filamentosos [30] y
diferentes especies de Candida [1,31].
PCR con posterior hibridacin con sondas especficas. PCR con cebadores
universales seguida de hibridacin con sondas oligonucleotdicas especficas de
especie. Este mtodo ha sido utilizado en la identificacin de muchas levaduras
y hongos filamentosos patgenos [32]. Los trabajos desarrollados para detectar
candidemias o aspergilosis con PCR-EIA han demostrado una elevada
efectividad, adems de aumentar el nmero de muestras analizables y realizar
la semi-cuantificacin de las mismas.
Identificacin no orientada: bsqueda inespecfica
PCR y polimorfismos de tamao. Es te mtodo consiste en diferenciar
individuos en funcin del tamao de una diana determinada, tras su
amplificacin por PCR y separacin en gel de agarosa. Dependiendo de la

variabilidad de tamao de la regin amplificada se podr aplicar a la


identificacin en diferentes niveles taxonmicos. Hay trabajos en los que se ha
aplicado este mtodo a la identificacin de levaduras ( Candida y no Candida ),
de hongos filamentosos, como Aspergillus, y de ciertos dermatofitos. Algunos
de estos estudios comparan el tamao de la regin ITS2 tras su amplificacin
por PCR [28,33].
PCR-RFLP. PCR y polimorfismo de tamao de fragmentos de restriccin
(RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism). Este mtodo amplifica la
diana seleccionada y analiza la secuencia del fragmento obtenido a travs del
resultado que ofrece la digestin del mismo con diferentes enzimas de
restriccin. Cada enzima de restriccin tiene una secuencia especfica que es su
seal para cortar el ADN. El resultado de la digestin de un fragmento con una
determinada enzima, depende directamente de la secuencia de nucletidos de
ese fragmento. Cuanto ms se asemejen en secuencia dos fragmentos, ms
similar ser el patrn de restriccin obtenido. La tcnica se ha utilizado en
numerosas experiencias para identificacin de levaduras mediante digestin de
la regin del gen 5.8S y sus espaciadores [34].
PCR-SSCP. PCR y polimorfismo de conformacin de hebra simple (S SCP:
Single Strand Conformational Polymorphism). Adems de la identificacin basada
en el tamao del fragmento amplificado, esta tcnica tiene en cuenta la
composicin nucleotdica para identificar especies. Para hebras del mismo
tamao, la migracin ser diferente segn su composicin en nucletidos;
posteriormente, se analiza la migracin que hacen las hebras simples de ADN del
fragmento amplificado por PCR. Las diferencias en el desplazamiento en el gel
permiten su identificacin [24]. Esta tcnica no valora el orden en que aparecen
los nucletidos en el fragmento.
PCR y secuenciacin del ADN. Este mtodo aporta la mxima informacin
puesto que valora el tamao, la composicin nucleotdica y el orden de las bases
en el fragmento de ADN en estudio. Las secuencias de las zonas ITS y de las
D1/D2 se emplean en la identificacin de la mayo ra de especies fngicas. Las
secuencias se introducen en programas informticos, que comparan la cepa
problema con las secuencias de cepas control, conocidas por bases de datos de
referencia, como el Gen Bank (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov / genbank/
index.html) o el EMBL (http: //www.ebi.ac.uk/). Las comparaciones deben
realizarse con cepas cuya identificacin no ofrezca dudas y que provengan de
centros de referencia acreditados.
Este planteamiento ofrece nuevas posibilidades a la microbiologa asistencial,
pues pueden identificarse y distinguirse la prctica totalidad de las especies
fngicas. De esta forma, si la secuenciacin de los fragmentos antes sealados
no permite distinguir entre especies, pueden emplearse otras dianas como
factores de elongacin, la betatubulina, etc.

PCR a tiempo real (Real Time PCR). Con esta tcnica, la recoleccin y el
anlisis de datos se producen al mismo tiempo que la reaccin de amplificacin
de dianas. Para ello, al mismo tubo de reaccin se aaden marcadores de ADN
o sondas fluorescentes; de esta forma, durante la amplificacin se mide la
aparicin de ciertos componentes y as es posible recoger y analizar los datos al
mismo tiempo (Figura 20.4). Por lo tanto, con esta tcnica no hay transferencia
de muestras, no se aaden nuevos reactivos ni tampoco se utiliza el gel de
agarosa para ver los resultados. Con todo ello se consigue minimizar el
problema de la contaminacin denominada carry over que proviene de los
mismos amplicones obtenidos en PCRs anteriores. La cantidad de ADN diana
inicial determina el incremento de fluorescencia que se va obteniendo en cada
ciclo.
El sistema ms utilizado en los laboratorios asistenciales es el LightCycler
(Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Esta tecnologa combina la
amplificacin rpida en capilares mediante aire caliente, junto a la deteccin
simultnea del amplicn, mediante un sistema de marcado con fluorocromos. El
sistema de deteccin se basa en la transferencia por resonancia de energa
fluorescente con dos sondas especficas distintas. La primera sonda de
hibridacin marcada con fluorescena y una segunda sonda de hibridacin
marcada con el fluorforo LightCycler Red 640. Ambas sondas hibridan con el
amplicn en posicin cabeza-cola, es decir que el marcador fluorescente y el
fluorforo quedan muy prximos. En esa posicin se produce una transferencia
de energa entre ambos, lo que determina la emisin de fluorescencia que es
medida por el sistema, siendo proporcional a la cantidad de ADN generado
durante el proceso de PCR. A da de hoy, la fluorescencia con SYBR Green I es
el indicador de eleccin para la PCR a tiempo real, pero existen variantes
dependiendo del marcador y la tcnica utilizada [5,15,35].

Figura 20.4. Representacin del sistema de amplificacin y lectura de PCR a tiempo real (real time PCR). La unin
de SYBR Green I a la doble cadena de ADN durante su sntesis va acompaada de la emisin de una seal que
permite detectar en cada momento la presencia del fragmento diana y extrapolar la cantidad de la misma en la
muestra inicial.

Esta tecnologa presenta ventajas evidentes: la amplificacin y deteccin se


realizan en los mismos tubos cerrados o capilares (lo que minimiza la
contaminacin), es un proceso rpido (< 2 h), automatizable y, adems, permite
la comparacin de resultados entre laboratorios.
Hasta la fecha, se han publicado varios estudios sobre la utilidad de la PCR-tr
en el diagnstico directo de las infecciones fngicas. Sobre todo, en la deteccin
de Aspergillus en enfermos de alto riesgo. Aunque se han empleado diferentes
tcnicas y amplificado diversas dianas, el ADN ribosmico y el ADN
mitocondrial han sido los ms utilizados, especialmente secuencias de la zona
18S 28S del ADN ribosmico. Para la amplificacin de estas zonas se han
utilizado sondas marcadas del tipo Taqman, FRET (Fluorescence Resonance
Energy Transfer) o iniciadores especficos y fluorocromos del tipo SYBRGreen.
Los resultados de estos trabajos han sido variables, dependiendo del grupo de
pacientes, de las muestras utilizadas y de las comparaciones utilizadas. En
trminos generales, las tcnicas de PCR-tr detectan con eficacia Aspergillus spp.
en muestras respiratorias , mostrando una rentabilidad superior a la de los
cultivos tradicionales. Sin embargo, la rentabilidad desciende en muestras
sanguneas. En algunos centros con gran cantidad de pacientes
oncohematolgicos, la PCR-tr se utiliza como prueba complementaria de la
deteccin de galactomanano y de la tomografa axial computarizada de alta
resolucin.
Mtodos de tipado intraespecie
Las tcnicas de tipado de las especies fngicas se desarrollaron a partir de las
utilizadas para la clasificacin de las bacterias. En los ltimos aos, se estn
aplicando varias tcnicas que han demostrado su capacidad para el tipado
aunque la utilidad de las mismas depende de la especie en cuestin. Adems,
no todos los mtodos tienen las mismas aplicaciones, ya que algunos ayudan a
tipificar brotes de infeccin, con cepas relacionadas temporal y espacialmente, y
otros sirven para realizar estudios de gentica de poblaciones.
En la tabla 20.6 se incluyen las tcnicas utilizadas en la tipificacin de las
especies fngicas. Histricamente, el primer mtodo empleado en micologa fue
el anlisis con enzimas de restriccin o RFLP de genoma total, pero su escaso
poder de discriminacin hizo que fuera reemplazado por otros mtodos [36]. De
esta forma, una de las posibilidades es complementar el anlisis de enzimas de
restriccin con mtodos de ADN fingerprinting, procedimiento que sirve para
simplificar el patrn de bandas a analizar tras la electroforesis. Esta tcnica se ha
convertido en la tcnica de referencia para tipificar muchas levaduras, como C.
albicans. Para tipar cepas de esta especie se emplean sondas del tipo 27A y Ca3,
con mltiples copias, o repeated DNA sequences (RDS), algunas de las cuales han
sido incluidas en sistemas semi-comerciales. Tambin se ha utilizado el mtodo
de fingerprinting con pequeos fragmentos u oligonucletidos, generalmente
con los llamados mini y microsatlites.

Otra de las tcnicas desarrolladas en los ltimos aos es la electroforesis en


campo pulsante, mtodo empleado para separar cromosomas o fragmentos
grandes de ADN. Es un mtodo tedioso, caro y, adems, su capacidad de
diferenciacin no es muy elevada para la mayora de las especies.
Tambin se han utilizado tcnicas que no utilizan el ADN como diana, este es el
caso de las isoenzimas o electroforesis de enzimas multilocus. Este mtodo
detecta sustituciones de aminocidos y se ha utilizado para realizar gentica de
poblaciones.

Como en el caso de la micologa diagnstica, las tcnicas de tipado intraespecie


se han ido adaptando a los mtodos basados en la amplificacin de fragmento s
mediante PCR. Este es el caso del RAPD (Randomly Amplified Polymorphic
DNA), del SSDP (Sequence-Specific DNA Primers), del PMM (Polymorphic
Microsatellite Markers) y del MLST (Multilocus Sequencing Typing) [37]. Hasta
la fecha, los resultados ms abundantes se deben a la tcnica de RAPD, con
algunos cebadores como el R108 y el R151 que sirven para tipar cepas de
Aspergillus; pero existen problemas de interpretacin y de reproducibilidad
debido a las condiciones que suelen emplearse para realizar la PCR (bajas
temperaturas de anneling y cebadores demasiado cortos). Por eso, la mayora
de los expertos recomiendan utilizar dos tcnicas de tipificacin o dos
cebadores diferentes a la hora de tipar cepas relacionadas. Entre otras, se
proponen el uso de secuencias microsatlites como el fago M13 y minisatlites
como l (GACA)4, para clasificar varias especies fngicas; as como, la PCRRFLP del gen URA5, especialmente til en el tipado intraespecie del complejo
Cryptococcus neoformans [38,39]. En cuanto al MLST, se han desarrollado varios
protocolos para C. albicans y parece la tcnica de futuro para realizar gentica de
poblaciones.

Las tcnicas moleculares diagnsticas se incluyen dentro de los mtodos


alternativos al cultivo, desarrollados en los ltimos aos, con la intencin de
mejorar la rentabilidad de las pruebas microbiolgicas. Estas tcnicas se aplican,
generalmente, en el diagnstico de infecciones oportunistas en pacientes
inmunodeprimidos, para los que el diagnstico tradicional es poco sensible y,
adems, tardo.
En micologa mdica, las tcnicas alternativas al cultivo se han desarrollado
como mtodos de diagnstico precoz de las micosis invasoras en enfermos
inmunodeprimidos. La rentabilidad actual de estas tcnicas no es muy elevada,
aunque en algunas instituciones sanitarias, la deteccin de componentes
fngicos, como el galactomanano y el beta-glucano, se incluye rutinariamente
entre las pruebas diagnsticas que se realizan en enfermos oncohematolgicos
con alto riesgo de micosis invasoras, particularmente de aspergilosis y de
candidiasis.
Hasta ahora, los mtodos moleculares basados en la deteccin de cidos
nucleicos de las especies fngicas, apenas se han implantado en los laboratorios
asistenciales. Esto se debe, principalmente, a que no se han desarrollado
mtodos comerciales reproducibles, por lo que slo aquellos laboratorios que
cuentan con el personal y los equipos necesarios han desarrollado y adaptado
tcnicas caseras, que precisan de consolidacin y estandarizacin para su
aplicacin en otros centros.
En la literatura cientfica sobre este asunto pueden encontrarse todo tipo de
tcnicas de deteccin de especies, como ya se ha explicado en los apartados
anteriores. No obstante, la amplificacin de cidos nucleicos mediante la PCR es
el mtodo ms extendido para el diagnstico directo en muestras clnicas [13].
Las contaminaciones y los falsos positivos son frecuentes, particularmente con
especies fngicas que causan infecciones oportunistas y que son contaminante s
habituales de laboratorio, como Aspergillus, Fusarium o Acremonium. Por ello, las
tcnicas de amplificacin cuantitativas, como la PCR en tiempo real (PCR-tr),
estn desplazando a los mtodos basados en la PCR convencional. La PCR-tr
presenta varias ventajas entre las que destacan, la posibilidad de introducir
puntos de corte a la hora de interpretar los resultados, aumentando la
especificidad de la tcnica, as como la automatizacin de la amplificacin,
visualizacin e interpretacin de los resultados.
Conclusiones
La aparicin de mtodos basados en la PCR, as como la difusin de las tcnicas
de cuantificacin de cidos nucleicos, como la PCR en tiempo real, pueden
ayudar a la implantacin del diagnstico molecular en la prctica
microbiolgica asistencial. Estas tcnicas estn automatizadas, parcial o
totalmente, y aportan sistemas comercial es de extraccin, purificacin,
amplificacin y deteccin de cidos nucleicos, por lo que existe la posibilidad de

elaborar protocolos estandarizados, aplicables a los laboratorios clnicos, con


fiabilidad metodolgica y, quiz, rentabilidad diagnstica.
Actualmente, algunos centros con experiencia, como algunos hospitales
terciarios y centros de referencia, utilizan mtodos basados en la biologa
molecular, como complemento de las tcnicas clsicas en el diagnstico de las
IFI. Estas micosis no son frecuentes en muchos de los centros de nuestro
Sistema Nacional de Salud, ya que atienden a pocos enfermos con riesgo de este
tipo de infeccin. Por ello, ante una sospecha de IFI se recomienda contactar con
alguno de los centros con experiencia y valorar la posibilidad de emplear un
mtodo de diagnstico molecular.
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