UNIDAD ACADMICA DE SALUD Y

BIENESTAR
Facultad Odontologa
TEMA:
PCR EN TIEMPO REAL (PCR CUANTITATIVO)

Realizado por:
Gabriela Villacs Andrade
Andrea Torres Vallejo
Jenner Sanchez Aguilar
Curso:
Cuarto Ciclo C
Ctedra:
Microbiologa
Catedrtico:
Dra. Jessica Sarmiento Ordoez

NDICE

OBJETIVOS.................................................................................................................. 3
OBJETIVO GENERAL:.................................................................................................. 3
OBJETIVOS ESPECIFICOS:........................................................................................... 3
INTRODUCCION:......................................................................................................... 4
MARCO TEORICO:....................................................................................................... 6
PROCEDIMIENTO........................................................................................................ 7
Desnaturalizacin......................................................................................................... 7
Hibridacin................................................................................................................. 7
Extensin.................................................................................................................... 7
DISCUSIN.................................................................................................................. 9
CONCLUSIN............................................................................................................ 10
BIBLIOGRAFIA.......................................................................................................... 11

1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL:
-

El objetivo de este estudio es reafirmar la efectividad de dicha tcnica en el diagnstico de

diferentes bacterias periodontales.

1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS:

-

Conocer la aplicacin adecuada de dicha tcnica.

Reconocer la efectividad de esta tcnica para la deteccin de bacterias periodontales.

2. RESUMEN
La identificacin de la expresin gentica y de secuencias especficas de ADN o ARN es un
factor crucial cuando se trabaja con tcnicas de biologa molecular. Para obtener esta informacin
algunas pruebas han sido desarrolladas, siendo la PCR una de las ms usadas. Sin embargo esta
tcnica tiene algunas limitaciones como la dificultad de cuantificar el producto de la PCR y el
riesgo de provocar contaminacin en el laboratorio. Para hacer frente a estas desventajas, la PCR
en tiempo real ha sido desarrollada. Esta tcnica brinda una gran cantidad de datos con una alta
sensibilidad y especificidad usando plataformas modernas que evitan la contaminacin que puede
ser causada en laboratorio por cido nucledos. Por otro lado algunas consideraciones como el
escoger la estrategia de cuantificacin y marcadores fluorescentes, as como la interpretacin de
los datos obtenidos, deben ser tomadas en cuenta cuando se usa la PCR en tiempo real. En esta
revisin bibliogrfica analizamos los conceptos bsicos de la PCR en tiempo real y del manejo de
los datos obtenidos con esta tcnica de laboratorio.

3. INTRODUCCION:
En todos los organismos vivos las clulas regulan sus actividades mediante la activacin o
desactivacin de la expresin de sus genes. La expresin gentica es generalmente proporcional
al nmero de copias de ARN mensajero (ARNm) de un gen determinado. Este es un hecho
crucial cuando se trata de identificar la presencia de productos celulares especficos ya que el
ARNm es traducido en los ribosomas para formar protenas. Por lo tanto es posible obtener datos
relativos a la produccin de elementos biolgicos si la expresin de los genes de una clula es
conocida.1
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es considerada una tcnica biotecnolgica cuya
finalidad es la amplificacin o reproduccin in vitro de un nmero de copias de una regin
especfica de ADN, en este caso bacteriano, para su respectiva evaluacin. La mencionada
tcnica es de gran utilidad en una variedad de campos, incluidas la biologa molecular, la
biotecnologa, la gentica, la epidemiologa, las ciencias forestales, las ciencias forenses, la
microbiologa, el diagnstico de enfermedades infecciosas, entre otras, es decir con mltiples
ventajas que se mencionan a continuacin:
La tcnica de PCR ha demostrado ser muy til en el diagnstico de virus, parsitos y bacterias de
difcil cultivo; porque ofrece un diagnstico confiable, ms rpido y menos laborioso que los
cultivos normales de este tipo de microorganismos. La secuencia especfica de inters no necesita
estar aislada del resto de su genoma, pero una vez completada su reproduccin, esta puede ser
separada del resto del ADN por medio de electroforesis en geles de agarosa. La cantidad de
material que hace falta para el inicio de la reaccin es muy pequea y solo es necesario la
cantidad de ADN contenida en una sola clula, esto le ofrece una alta sensibilidad a la prueba.
La reaccin de PCR es llevada completamente in vitro y requiere para su desarrollo de los
elementos siguientes: 2 oligonucletidos sintticos o cebadores (primers), que deben ser
complementarios a la regin de inters y generalmente nicos para el microorganismo de estudio,
lo que proporciona la alta especificidad; una enzima termoestable, Taq polimerasa, proveniente
de la bacteria Thermus aquaticus y 4 desoxyribonucletidos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).2-1
Este procedimiento, permite obtener una duplicacin exponencial de la secuencia de inters por
medio de 3 pasos fundamentales en un proceso cclico; es decir, cada ciclo consta de un proceso

de desnaturalizacin (95o C) que permite la apertura de las dobles cadenas; luego viene seguido
por un proceso de anillamiento (40-65o C), que consiste en la unin o el apareamiento de los
oligonucletidos o cebadores que se encuentran en la mezcla de reaccin con los extremos 3 de
la secuencia especfica del ADN, formando una unin ayudada por enlaces inicos (primers y
hebra de ADN); en donde la enzima Taq polimerasa se pueda unir y comenzar en presencia de los
4 nucletidos trifosfatos con la tercera etapa que es la fase de sntesis (72o C), la cual se refiere al
copiado del templado que se van uniendo por enlaces inicos dando como resultado una nueva
molcula del fragmento de ADN de inters. En periodoncia clnica es una prctica comn tomar
una muestra de placa subgingival de pacientes con periodontitis y buscar la presencia de
supuestos patgenos periodontales utilizando tcnicas de laboratorio rutinarias como el cultivo,
hibridacin DNA-DNA o PCR en tiempo real.3

4. MARCO TEORICO:
Aunque en la enfermedad periodontal no est demostrada una relacin causa-efecto directa entre
bacterias especficas y enfermedad, es sabido que las bacterias juegan un papel importante en la
iniciacin y perpetuidad del proceso de inflamacin. Es por ello que su identificacin se hace
necesaria para definir la etiologa e instaurar el tratamiento adecuado. La aplicacin de mtodos
moleculares para la identificacin de patgenos periodontales, siempre en estrecha relacin con
otros mtodos empleados para el diagnstico de la enfermedad periodontal, posibilita un mejor
manejo y seguimiento de los pacientes. Ningn tratamiento nico ser eficaz para todos los
individuos, por lo que las pruebas microbiolgicas debern conseguir la eficacia teraputica de
acuerdo al perfil microbiano especfico del paciente. As, los dentistas tratan de lograr una
estabilidad clnica prolongada con tratamientos especficos dirigidos a los microorganismos
directamente involucrados en los procesos infecciosos, sobre todo cuando los agentes patgenos
estn incrustados en las biopelculas. Las tcnicas de biologa molecular se basan en la aplicacin
de mtodos para la deteccin e identificacin de microorganismos de la biopelcula supra y
subgingival. El diagnstico molecular ha demostrado ser seguro, rpido, reproducible y
discriminatorio, siempre que las tcnicas utilizadas hayan sido cuidadosamente estandarizadas y
controladas.2-1
La reaccin en cadena de la polimerasa es una reaccin enzimtica in vitro que amplica
millones de veces una secuencia especca de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la
secuencia blanco es copiada elmente. Para ello, la reaccin aprovecha la actividad de la enzima
ADN polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las clulas. En la
reaccin, si usamos como sustrato ADN genmico, entonces tpicamente hablamos de una PCR,
pero si usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (cido ribonucleico
mensajero) se le conoce como RT-PCR (Reverse Transcripcin-PCR, por sus siglas en ingls).
Esta conversin se logra mediante una reaccin conocida como transcripcin reversa y controlada
por la enzima transcriptasa reversa, capaz de convertir el ARNm en una molcula de ADNc. Este
mtodo fue copiado de los retro virus que usan una transcriptasa reversa para convertir su
genoma de ARN en ADN duplicarse en millones de partculas virales.2 El ADNc se utiliza
cuando analizamos la expresin del ARNm de algn gen de inters.

Al nal de la reaccin, para corroborar si se amplic la secuencia blanco de inters, los

productos de la PCR o tambin llamados ampliaciones son analizados en geles de agarosa para
conrmar si la reaccin fue exitosa. A continuacin se explicarn cada uno de los puntos
mencionados. Gracias a las nuevas tecnologas se a revelado cmo funciona la reaccin del pcr y
que este se lleva a cabo en 3 etapas principales: desnaturalizacin, hibridacin y extensin.5
5. PROCEDIMIENTO
5.1 Desnaturalizacin. En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una
temperatura de 95 C durante 20-30 segundos; el tiempo depende de la secuencia del templado,
es decir, si la cantidad de G-C es alta, ser necesario ms tiempo para romper sus uniones debido
a que el apareamiento de estas bases est formado por tres enlaces, uno ms que las bases de A-T.
Adems, depende de la velocidad en la que el termociclador aumenta la temperatura, esto vara
de acuerdo al modelo del equipo. Al nal de esta etapa tendremos las cadenas separadas que
servirn como templado para el siguiente paso.
5.2 Hibridacin. En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3 del templado previamente
separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el complejo templadoprimers, es importante que la temperatura de hibridacin o temperatura melting (Tm) sea la
ptima; sta generalmente oscila entre 50-60 C. Si el diseo de los primers es el correcto y la
temperatura es la adecuada, la estabilidad y especicidad del complejo ser eciente.
5.3 Extensin. En esta etapa, la Taq polimerasa acta sobre el complejo templado-primers y
empieza su funcin cataltica a una velocidad muy rpida; agrega dNTPs complementarios para
crear las cadenas completas de ADN. La extensin de las cadenas es en direccin de la sntesis
del ADN, es decir, de 5 a 3. La temperatura ptima para la reaccin es de 72 C, ya que a esa
temperatura la enzima es funcional. Al nal del ciclo, se habrn formado las ampliaciones con un
tamao dictado por el nmero total de pares de bases (pb) que deber ser conocido por el
investigador.
El enfoque basado en PCR en tiempo real est teniendo un impacto significativo en la deteccin
de virus, bacterias y paracitos en microbiologa diagnostica. Estos ensayos se han utilizado para
investigar la variedad de enfermedades humanas y el papel de los virus.

5.4 Analizando los resultados No es suciente con detectar la amplicacin en tiempo real y
capturar la fluorescencia de cada muestra, el anlisis de la reaccin es el paso nal para
determinar la cuanticacin gnica. Para ello, los termocicladores estn provedos de una PC con
un software que generalmente son fciles de usar. Este software genera una serie de grcas en
donde se muestran todos los datos necesarios para conocer si la reaccin fue exitosa. Una de estas
grcas es la de amplicacin disociacin o curva melting que muestra informacin sobre la
especicidad de la reaccin. Otro paso importante del anlisis es elegir el tipo de cuanticacin
que se usar para determinar la amplicacin precisa del blanco gnico; este procedimiento
depende de los intereses del investigador. Para ello existen dos tipos de cuanticacin: la absoluta
y la relativa. La primera generalmente se utiliza para conocer el nmero exacto de copias
amplicadas del blanco o la concentracin precisa de cidos nucleicos en una muestra. En la
prctica, este tipo de cuanticacin se usa para medir la carga viral o bacteriana en diferentes
tejidos. La segunda se aplica cuando se desean evaluar los cambios en la expresin de genes en
distintos estados siolgicos. Estos cambios se basan en los niveles del ARNm del gen blanco
comparados con un gen de referencia (gen housekeeping) que no cambia su expresin a pesar de
que los estados psicolgicos se modiquen por diversas causas. Los datos son expresados como
relativos al gen de referencia y generalmente son referidos como el nmero de veces en el que
aumentaron o decrementaron los niveles de ARNm o en su caso, si no hubo cambios. Cualquiera
que sea el tipo de cuanticacin que se elija, casi todos los softwares de los equipos estn
posibilitados para llevar a cabo los anlisis matemticos y estadsticos que se requieren en cada
tipo de cuanticacin. 2
PCR en tiempo real tiene amplias aplicaciones en investigacin cientfica y como herramienta de
diagnstico. Vale la pena resaltar que se han hecho grandes logros en el estudio de virus que
afectan al hombre y a los animales, as como en la investigacin de bacterias y hongos
patognicos, pues esta prueba ofrece una gran sensibilidad y especificidad en menor tiempo y a
un menor costo. Tambin es ampliamente utilizada en identificar mutaciones o polimorfismos
genticos valindose de sondas especficas y sus resultados en el anlisis de los cambios de la
curva de fusin. Asimismo la PCR en tiempo real se utiliza para acceder a datos relevantes a la
biodinmica de los organismos que producen enfermedades. Sin embargo uno de los campos de
mayor aplicacin de esta tcnica es la investigacin de cambios en la expresin gentica de

clulas a travs de la cuantificacin de su ARNm, permitiendo asociar dichos cambios a estados

fisiolgicos celulares, presencia de frmacos, agentes infecciosos, etc.7
Una ventaja adicional de esta tcnica es que para implementarla es suficiente contar con una
cantidad pequea de muestra. Esto la hace ideal cuando se usa conjuntamente con microciruga
laser para hacer biopsias de tejidos o clulas especficas y estudiar, por ejemplo, el
comportamiento de clulas cancerosas. La PCR en tiempo real tambin se est usando en otros
campos como la investigacin forense y la bioseguridad. En estos casos las investigaciones se
basan en la identificacin con una alta sensibilidad y especificidad de organismos patgenos o
saprfitos difundidos en el medio ambiente. La caracterizacin de pequeas cantidades de
material gentico procedente de tales organismos hace posible conocer su procedencia e
identificar su dinmica.6
Otro campo en el que se utiliza la PCR en tiempo real es el de la seguridad alimentaria. Aqu, la
identificacin de organismos genticamente modificados (OGM) en alimentos o aditivos
alimentarios es una necesidad que se puede cubrir utilizando esta tecnologa. Bajo los principios
revisados anteriormente tambin se puede acceder a la cuantificacin de OGM, recurriendo a
genes de referencia para normalizar la cantidad de ADNc ingresado en los ensayos.7

6. DISCUSIN
JOSEP COSTA artculo que tomamos de base con el tema reaccin en cadena de la polimerasa
(pcr) a tiempo real dijo que hoy en da, la reaccin en cadena de la polimerasa (pcr) se utiliza
normalmente en la rutina asistencial de la mayora de nuestros laboratorios, pero su empleo se ha
limitado, con pocas excepciones. por diversas razones, la pcr convencional se ha implementado
poco en el diagnstico de otras muchas enfermedades infecciosas a pesar de aportar indudables
ventajas. la pcr a tiempo real combinada con los nuevos sistemas automticos para la purificacin
de cidos nucleicos, ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de
pruebas moleculares para la identificacin y cuantificacin de los agentes infecciosos de inters
clnico. debido a sus indudables ventajas, como la facilidad de empleo, la mayor rapidez o el
menor riesgo de contaminacin, la pcr a tiempo real, ir reemplazando la pcr convencional y se
extender a un amplio abanico de aplicaciones microbiolgicas. la pcr a tiempo real es una
variante de la pcr convencional que se emplea para la cuantificacin de cidos nucleicos, tanto de
adn como de arn mensajero en una muestra. permite cuantificar proporciones de p. gingivalis, p.
intermedia y a. actinomycetemcomitans, y debido a su gran rapidez y sensibilidad son de gran
utilidad en los estudios epidemiolgicos.6

7. CONCLUSIN
En la actualidad, la investigacin basada en biologa molecular est abriendo un inmenso
espectro de posibilidades para un mejor entendimiento de los fenmenos biolgicos que nos
rodean. Las implicaciones que tiene este nuevo conocimiento abarcan campos tan diversos como
la medicina, la conservacin medio ambiental y la industria. En este contexto las pruebas como la
PCR en tiempo real son una prometedora ayuda para el desarrollo de aplicaciones que permitan
realizar investigacin en biologa molecular obteniendo un gran flujo de datos fiables y precisos
sobre los organismos estudiados. Sin embargo mayor investigacin y desarrollo sern necesarios
para hacer de esta prueba accesible a un gran pblico y sus resultados interpretados de manera
directa y fiable.
Josep Costa menciono que la Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real Como
hemos visto a travs de todo este trabajo, la tcnica de PCR en tiempo real es altamente poderosa
y puede generar resultados reproducibles con significado biolgico. Sin embargo, est ms que
demostrado que hay que tomar muchas precauciones durante la planeacin, la ejecucin del
ensayo y el anlisis e interpretacin de los resultados. En el futuro ser necesario introducir
nuevos estndares y reportar todo el procedimiento para establecer guas confiables que puedan
validar los resultados experimentales y que sean utilizadas por los editores para la revisin
rigurosa de las publicaciones. En resumen, el PCR en tiempo real es una tcnica que debe ser
tratada con respeto.

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