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Curso de microbiologa de alimentos

MODULO I
Lic. Jeanett Daga Quisbert

Objetivos
Adquirir prctica en el manejo de aparatos de
laboratorio y en el empleo de tcnicas
microbiolgicas.
- Conocer las normas que regulan la calidad
microbiolgica de un alimento

Importancia de la microbiologa de
alimentos

Aplicacin en industrias alimenticias


Lcteos
Crnicos (embutidoras)
Aceite (FINO)
Cereales
Aguas embotelladas
Gaseosas, etc
agropecuaria

Fuentes de contaminacin
1.Salud de los
animales.

2.Ambiente.

3.Transporte.

4.Utensilios.

6.Ser humano.

5.Procesado.

Identifique 6 fuentes de contaminacin

Objetivo del anlisis microbiolgico


Materia prima cumpla con las especificaciones microbiolgicas
Asegurar que el producto cumpla con las normas
microbiolgicas establecidas.
Control del proceso en la fabricacin con los anlisis
microbiolgicos se pueden determinar:
nmero total de microorganismos indicadores, alterantes,
patgenos especficos, metablicos de los microorganismos
ejemplo sus toxinas.

Factores intrnsecos
pH
4 6 mohos
2- 9 levaduras
4,5 9 bacterias optimo 6,5 7,5
Menor a 0,7
0,91 mohos , bacterias y levaduras

Potencial Redox y el oxigeno


Aerobios
Anaerobios facultativos
Anaerobios
microaerofilos

Constituyentes naturales
antimicrobianos
lisozima

Factores extrnsecos
Temperatura
Psicrofilos
Mesofilos
Termofilos

Humedad relativa

Atmosfera gaseosa
0,61 0,85 mohos
0,95 0,99 bacterias
Menor a 0,7
0,91 mohos , bacterias y levaduras

METODOS DE CONSERVACION DE
ALIMENTOS
TRATAMIENTO TERMICO
Pasteurizacin
congelacin

Desecacin
Solar
Desecadores mecnicos
Liofilizacin
Durante el ahumado

aditivos
cidos orgnicos y sus sales
Propionatos de sodio y
calcio fungisttico
(panadera)
Benzoatos eficaces a Ph
cidos
Sorbatos (acido sorbico)
antimicrobiano menos
efectivo para bacterias
Acetatos, acido actico

Nitritos y nitratos,
Nitritos reaccionan con
aminas produciendo
nitrosamidas
(cancergenos ) accin
sobre clostridium
botulinium

Dixido de azufre y
sulfitos, producen acido
sulfuroso antimicrobiano

Oxido de etileno y oxido


de propileno (gases
esterilizantes)

Especias y dems
condimentos

Sal y azcar
Alcohol
formaldehido

PRESENCIA Y CONCENTRACION DE
GASES.
Almacenaje en atmosferas controladas CO2 (10%) .
El CO2 retarda la podredumbre fngica.
El efecto inhibidor de CO2 aumenta conforme disminuye la temperatura.
Los hongos y levaduras son mas resistentes a este mtodo que las
bacterias.
Las bacterias gramnegativas (pseudomonas) son mas sensibles al CO2
que las grampositivas ( bacterias acido lcticas).

Radiacion

Radiacion ultravioleta 260 nm 200nm (ozono)


Raduacion ionizante
- rayos X

MICROONDAS

Microorganismos indicadores
Advierten oportunamente de un manejo inadecuado
o contaminacin que incrementan el riesgo de
presencia de patgenos en alimentos.
Ventaja
Su deteccin puede resultar adecuada desde un
enfoque de prevencin de riesgos, indicando un
manejo inadecuado o presencia de contaminacin
Deteccin sencilla, rpida y econmica.

Microorganismos indicadores
Indicadores de
condiciones de manejo
o de eficiencia de
proceso que incluyen

Indicadores de
contaminacin fecal

Mesfilos aerobios
(RTBAM)
Hongos y levaduras
Coliformes totales
Coliformes fecales
E. coli
Enterococos
Cl. perfringens

Bacterias aerobias mesfilas


Bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30C, pero
pueden hacerlo en rangos bien amplios de temperaturas inferiores y
mayores a los 30C.
Todas las bacterias patognicas de origen alimenticio son mesfilas

Grado de contaminacin de una muestra y las condiciones


que han favorecido o reducido la carga microbiana
Indica la calidad sanitaria del alimento y se utiliza para
monitorear la implementacin de Buenas Prcticas de
Manufactura

Bacterias aerobias mesfilas


no se aplica a alimentos fermentados
puede dar escasa informacin sobre el
manejo del alimento cuando ste es poco
favorable para el desarrollo microbiano por
su pH aw

indicador importante en alimentos frescos,


refrigerados y congelados, en lcteos y
alimentos listos para consumir
incubar en condiciones de aerobiosis, a 35 C
durante 24 a 48 horas.

Resultado
Se estima la microflora total sin especificar tipo
de microorganismos
Excesiva
contaminacin de
la materia prima

Recuentos
Elevados
Deficiente manipulacin
durante el proceso de
elaboracin

La posibilidad de que
existan patgenos,
pues estos son
mesfilas

La inmediata
alteracin del
producto

Hongos y levaduras
Ph

AW

temp

antibacte
rianos

Sales
/carbohidratos

Mohos

cidos 1- 11

baja

baja

Si

si

Levaduras

Acidos 2 -9

Si

si

Disminuyen la vida til del producto


Se les asocia con materia prima contaminada o ambiente
contaminado
Son tiles para evidenciar grado general de contaminacin en
alimentos con estas caractersticas o cuando los mesfilos
aerobios no son tiles, como en alimentos fermentados.

Su presencia es indicativo
Grado general de contaminacin

frutas frescas
Vegetales
Cereales
jugo de frutas
Quesos
alimentos congelados

Desarrollo de hongos toxignicos

frutos secos
Especias
Cereales
otros granos, y sus
derivados.

Las especies toxicognicas de mayor


importancia
Aspergillus
Penicillium
Fusarium

LOS COLIFORMES EN ALIMENTOS


Los microorganismos indicadores de la calidad microbiana se
utiliza para evaluar la calidad del alimento o para predecir la
durabilidad del mismo.
los indicadores de inocuidad deben tener antecedentes de
asociacin con el patgeno cuya presencia tienen que indicar
y estar presentes cada vez que aquel lo haga.
ampliamente distribuidos en el agua, el suelo y los vegetales,
y forman parte de la flora intestinal de los seres humanos y de
los animales de sangre caliente y fra.

Coliformes totales
Se transmiten por malos hbitos de manipulacin en los
alimentos.
Indican contaminacin post proceso trmico
Actualmente se consideran un excelente indicador de la eficiencia
de los procesos de sanitizacin y desinfeccin, as como de
calidad sanitaria en agua, vegetales y diversos productos
procesados.
bacilos cortos, Gram (-), anaerobios
facultativos, no esporulados, que fermentan la
lactosa a 35 C, en menos de 48 h, con
produccin de cido y gas.
gneros: Escherichia, Enterobacter, Proteus,
Klebsiella y Citrobacter.

COLIFORMES FECALES
Los coliformes fecales son termotolerantes, La principal
bacteria de este grupo es la Escherichia coli cuya presencia
en los alimentos indica una posible contaminacin fecal por
lo cual el consumidor en caso de ingerir ese alimento podra
estar expuesto a bacterias entricas .
Los coliformes pueden proliferar en gran cantidad de
alimentos, en agua y productos lcteos.
Pueden ser fcilmente destruidos por el calor.
En productos lcteos y otros - no indica contaminacin
fecal sino que refleja la higiene general de la planta industrial.

Coliformes fecales
De vida libre y se transmiten por malos hbitos de manipulacin en los
alimentos.
Incluye el 90% de las colonias de
E. coli
Algunas cepas de
Enterobacter
Citrobacter
Proteus.
En Enterobacter estn dos grupos importantes
Salmonella
Shigella.
Su presencia en el alimento brinda informacin sobre las condiciones
higinicas del producto y la eventual presencia de patgenos

e. coli
Se considera indicador de contaminacin fecal
reciente, humana o animal en productos como agua
embotellada, leche y jugos, alimentos infantiles, y
alimentos procesados, en general.
(fermenta lactosa a 44.5C) , produce indol a partir de
triptofano y produce glucuronidasa

coliformes fecales
bacilos Gram negativos aerbios y anaerbios
facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa
formando cido y gas dentro de 24 hrs. a 45,5 0,2C
para anlisis de alimentos.

Proceso productivo
La presencia de bacterias coliformes en los alimentos no
significa necesariamente que hubo una contaminacin fecal o
que hay patgenos entricos presentes.
Algunos coliformes (E.coli) son comunes en: Heces del
hombre y otros animales
En alimentos sometidos al calor sugiere una contaminacin
posterior al tratamiento trmico o que ste ha sido deficiente

Cl. Perfringens o sulfito reductores


bacteria Gram (+), esporulada, anerobia, reductora de sulfitos
es habitante usual del tracto intestinal de muchos animales.
Las esporas son muy resistentes a los desinfectantes, (100 C)
estn presentes en aguas negras pero no se multiplican en el
sedimento y se le considera un buen indicador cuando se
sospecha de contaminacin con protozoarios o virus, que
generalmente no tienen relacin con el hallazgo de coliformes o
enterococos.
tambin se considera un indicador til en aguas tropicales,
donde la supervivencia de otros como E. coli y Enterococcus
puede disminuir.

Cl. perfringens
Son buenos indicadores en trabajos de seguimiento o
para relacionar los con contaminacin fecal
No especficos de heces humanas
Altos recuentos de C.perfringens en el alimento previo a
su consumo, puede llevar a la produccin de la toxina in
vivo en el consumidor.

Preparacin de medios de cultivo

PLATE COUNT

MAC CONKEY AGAR


Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram
negativos de fcil desarrollo, aerobios y anaerobios
facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no,
lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el
mismo.

En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para


el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la
mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que
inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.
Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto
produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en
las colonias, y la precipitacin de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias
incoloras.

EMB

Es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram


negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias
nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de
la familia Enterobacteriaceae.

el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de


bacilos Gram negativos.
Es nutritivo por la presencia de peptona que favorece el
desarrollo microbiano. La diferenciacin entre organismos
capaces de utilizar
la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de
hacerlo, est dada por los indicadores eosina y azul de
metileno; stos ejercen un efecto inhibitorio sobre una amplia
variedad de bacterias Gram positivas.
Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan
un caracterstico brillo metlico. Las cepas que utilizan la
lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada,
mientras que las
que no lo hacen son incoloras.
Tambin, pueden crecer especies de Candida y se observan
como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en
profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C.
albicans. Enterococcus spp.
crece en este medio como colonias puntiformes y
transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras
bacterias oxidativas se observan como colonias de color azul
lavanda; esto puede ocurrir
aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de
lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporacin de azul de
metileno a sus membranas. En este medio se obtiene adems,
un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.

agar XLD
Xilosa, Lisina, Desoxicolato
es un medio selectivo diferencial, utilizado para el
aislamiento y diferenciacin de patgenos entricos
Gram negativos, especialmente del gnero Shigella

La degradacin de los carbohidratos presentes en el medio (xilosa, lactosa y


sacarosa) genera la produccin de cido haciendo virar el indicador (rojo
fenol) de rojo a amarillo. En este medio se incorpora la xilosa porque es
prcticamente fermentada por todas las enterobacterias con excepcin de
los microorganismos pertenecientes al gnero Shigella. La lisina se incluye
para aumentar la diferenciacin de los microorganismos pertenecientes al
gnero Salmonella, ya que sin la lisina estos microorganismos rpidamente
fermentan la xilosa produciendo la acidificacin del medio y no se pueden
diferenciar de otras especies no patgenas. Como la cantidad de este
carbohidrato es limitada, una vez que estos microorganismos lo consumen,
comienzan a utilizar la lisina lo cual produce la alcalinizacin del medio; este

PDA agar
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento y recuento de
hongos y levaduras en muestras clnicas, alimentos,
cosmticos y otros materiales.
Fundamento
Tanto la glucosa presente como la infusin de papa
favorecen el desarrollo exuberante de hongos y levaduras,
mientras que el desarrollo bacteriano es inhibido con el
agregado de cido tartrico luego de la esterilizacin hasta
alcanzar un pH: 3.5 0.2. Una vez agregado el cido no se
puede recalentar ya que el agar se hidroliza.

INFECCION
Enfermedad producida por la
ingesta de alimentos
contaminados con la bacteria
que produce la enfermedad
ejm: Salmonelosis

Diluciones para siembra en profundidad


Pesar 25 o 10 g de muestra

Colocar la muestra en 225


ml de agua peptonada

Realizar diluciones decimales en


tubos de 9 ml de agua peptonada

Sembrar en cada placa estril


1 ml de muestra diluida

10

10 -2

-1

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

10-3
1 ml

10 -4
1 ml

Adicionar agar fundido a 45


C en cada placa estril
Que contiene 1 ml de
muestra diluida
Homogenizar la muestra haciendo
movimientos en forma de 8 sobre el
mesn antes que solidifique el agar
Dejar solidificar y luego
incubar a 36C por 24 horas
en posicin invertida

Contar el numero de colonias y


reportar el resultado como UFC/g o ml
de muestra

Diluciones para siembra en superficie


Pesar 25 o 10 g de muestra

Colocar la muestra en 225


ml de agua peptonada

Realizar diluciones decimales en


tubos de 9 ml de agua peptonada

Sembrar en cada placa estril


1 ml de muestra diluida

10

-1

1 ml

1 ml

1 ml

10 -2
0,1 ml

10-3
0,1 ml

10 -4

0,1 ml

Adicionar agar fundido a 45


C en cada placa estril
Que contiene 0,1 ml de
muestra diluida
Homogenizar la muestra en la placa
con la ayuda de una esptula de
Drigalsky
Dejar solidificar y luego
incubar a 36C por 24 horas
en posicin invertida

Contar aquellas placas que contengan


entre 30 a 300 colonias y reportar el
resultado como UFC/g o ml de muestra

Bacterias Aerobias Mesfilas


CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE
Aplicar este procedimiento a alimentos congelados, enfriados,
precocidos o preparados con excepcin de los productos
fermentados o madurados tales como queso, ciertos tipos de
embutidos, yogurt, etc.
FUNDAMENTO
Este en un mtodo de recuento en placa y siembra en profundidad.
Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfeccin.
Determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas.
Determinar el origen de la contaminacin durante los procesos de elaboracin
de los alimentos.
Verificar condiciones ptimas de almacenamiento y transporte.
Obtener informacin acerca de la vida til de los alimentos.
Indicar alteracin incipiente en ciertos alimentos.

Metodologa
N=

C
[ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d

donde :
N = nmero de colonias por ml o g de producto
C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas
n1 = nmero de placas contadas de la menor dilucin.
n2 = nmero de placas contadas de la dilucin consecutiva.
d = dilucin de la cul fu obtenido el primer recuento

Tubos mltiples para aguas

Confirmacin de coliformes totales y


fecales

Tubos con 10 ml de caldo


lauril triptona simple
concentracin x + 10 ml de
muestra
37 C x 24 a 48 h

Tubos con 10 ml de caldo lauril


triptona doble concentracin
2x + 20 ml de muestra

Siembra con asa bacteriolgica


de los tubos positivos (turbiedad
y produccin de gas) el caldo
lactosa verde brillante bilis 2 % y
caldo EC

Tubos con 10 ml de caldo lactosa


verde brillante bilis 2 %

Lectura de tubos positivos en


tablas NMP de coliformes totales/
100 ml de muestra

tubos con 10 ml de
caldo EC o EC- MUG

Lectura de tubos positivos en


tablas NMP de coliformes fecales/
100 ml de muestra

Enterococos
Es un indicador de contaminacin fecal, debido a su
abundancia en el tracto digestivo de animales
y humanos; aunque se encuentran en cantidades
menores en comparacin con E. coli,
algunas de sus ventajas es su mayor supervivencia. Se
consideran indicadores en alimentos procesados,
como lcteos y crnicos, en los cuales E. coli puede no
sobrevivir.