LABORATORIO N 2 DE BROMATOLOGA

1) Dibujo estructural del HPLC

2) Mtodos para cuantificar una vitamina hidrosoluble y liposoluble

VITAMINAS HIDROSOLUBLES
VITAMINA B1 (Tiamina)
El mtodo del tiocromo es el ms ampliamente utilizado para la determinacin
de la vitamina B1, incluye una hidrlisis cida (utilizando cido sulfrico 0,1 M
durante 15 min a 121C; el pH de la mezcla enfriada se ajusta a 4,5 a travs de
la adicin de buffer acetato) seguida por una defosforilacin enzimtica de los
steres (500 mg de Takadiastasa y se incuba al menos por 20 minutos a 45C)
y la cuantificacin de la tiamina liberada. La medicin de la vitamina B1 en el
extracto final se realiza mediante fluorometra despus oxidar al tiocromo que
es un compuesto fluorescente.
El extracto puede ser purificado si es necesario a travs de una columna de
intercambio inico, como Amberlite CG 50 (100-200 mesh). La tiamina es
retenida en el intercambio inico y luego es eluda con cido clorhdrico 0,15 M.
El eluido se ajusta a un volumen definido con cido clorhdrico (0,15 M).
Alcuotas de esta solucin se mezclan con isobutanol, una solucin de hidrxido
de sodio (50%), una solucin de hexa-cianoferrato de potasio (5%) y se agita
vigorosamente durante 60 segundos. En una serie paralela con los mismos
reactivos, se prepara un blanco bloqueando la reaccin a travs de la adicin
de cloruro de benceno-sulfonilo. Se agrega cloruro de sodio despus de la
oxidacin para optimizar la extraccin. Despus de la centrifugacin se toman
10 ml del extracto de isobutanol, se mezcla con 0,5 ml de etanol y se mide la
fluorescencia en contra del blanco.

Ms recientemente, se han publicado procedimientos por HPLC que se utilizan

para cuantifcar, el propio tiocromo o a travs de una derivatizacin
postcolumna.

VITAMINA B2 (Rivoflavina)
La riboflavina puede determinarse fluoromtricamente; sin embargo, todava existen
distintos componentes en los alimentos que interfieren, lo cual complica el
anlisis.Adems, es muy importante proteger la muestra y los extractos de la luz. Toda la
manipulacin de la muestra deber realizarse en frascos de vidrio mbar y las soluciones
mantenerse en la oscuridad.
Por otro lado, el mtodo de cuantificacin con HPLC permite una preparacin ms simple
de la muestra que el mtodo del lumicromo.

VITAMINA B6 (Piridoxina)
Debido a la mltiple presencia de la vitamina B6 en los alimentos es imposible determinar
su actividad midiendo un slo componente. Por lo tanto, en este momento se recomienda
un mtodo microbiolgico para la determinacin de la actividad de la vitamina B6.
La vitamina B6 es extrada de la muestra por hidrlisis cida. Las condiciones
recomendadas son HC1 0,44 M durante 2 h a 121C para productos de plantas y HC1
0,055 M durante 5 h a 121C para productos animales. Debe mencionarse que la
hidrlisis cida puede liberar vitmeros-B6 a partir de glucsidos y por lo tanto llevar a una
sobrestimacin del contenido. Despus de la hidrlisis, las soluciones son neutralizadas a
un pH 5,0 con una solucin de hidrxido de sodio. La dilucin del extracto se realiza con
agua para obtener concentraciones de aproximadamente 100 ng/ml.
El microorganismo de ensayo, Saccharomyces carisbergensis (ATCC 9080) es mantenido
en un agar-APT. El subcultivo es preparado por incubacin hasta 24 h a 30C en el medio
de fermentacin que contiene B6. El medio de cultivo no. 0951-15-2 se utiliza para el
ensayo (Laboratorios Difco, Detroit USA). Los tubos se llenan con el medio (10 ml), y se
agregan 25, 50 y 100 del extracto o de una solucin estndar. Seis tubos para blanco no
contienen ningn aditivo. Los tubos son sometidos a un bao de vapor durante 10 minutos
a 100C. Despus de enfriarse, todos los tubos con excepcin de 2 blancos son cada uno
inoculados con 1 gota de inculo y luego incubados durante 16-18h 30C. La turbidez de
la suspensin celular se mide a 580 mn despus de mezclar bien.

VITAMINA B12 (Cobalamina)

El nivel presente en los alimentos es muy bajo y el mtodo microbiolgico es la nica
manera de estimar la vitamina B12 en forma satisfactoria.
La vitamina B12 es extraida de la muestra con agua o buffer a una temperatura de
aproximadamente 100C durante 10-30 minutos con la adicin de cianuro de potasio. El
pH del extracto se ajusta a 6 ya sea con hidrxido de potasio o cido clorhdrico. La

dilucin del extracto se

aproximadamente 2 mg/ml.

realiza

con

agua

para

obtener

concentraciones

de

El microorganismo de ensayo, Lactobacillus leichmanii (ATCC 7830) es mantenido en un

agar de cultivo de Micro-Ensayo (Laboratorios Difco, Detroit USA; no. 031902). El
subcultivo es preparado por incubacin hasta 16-18 h a 37C en el medio de fermentacin
que contiene B12 (caldo de micro inoculacin (Difco no. 0320-02. Los tubos se llenan con
el medio (10 ml), y se agrega 25, 50 y 100 l del extracto o solucin estndar. Seis tubos
para blanco no contienen ningn aditivo. Los tubos son sometidos a un bao de vapor
durante 10 minutos a 100C o autoclavados durante 5 min a 121C. Despus de enfriarse,
todos los tubos con excepcin de 2 blancos son cada uno inoculados con 1 gota de
inculo y luego incubados durante 16-18 h a 37C. La turbidez de la suspensin celular se
mide a 580 nm despus de mezclar bien.

VITAMINA C
El cido ascrbico (AA) es fcilmente oxidado a cido dehidroascrbico (ADA). Las
soluciones de extraccin ms comnmente utilizadas son las de los cidos metafosfrico,
oxlico y actico y mezclas de ellos. Se puede agregar EDTA en ciertos procedimientos
para complejar los iones de los metales as como tambin agentes reductores como
ditiotreitol (DTT).
Bsicamente existen dos enfoques diferentes para la determinacin del cido ascrbico:
- La determinacin del cido ascrbico presente en la muestra o en el extracto
de muestra ignorando alguna presencia posible de ADA.
- La determinacin del cido ascrbico "total" que incluye la suma de AA y ADA
utilizando un mtodo que transforma ya sea AA a ADA o ADA a AA con la
consiguiente cuantifcacin de ADAoAA.
Todos los mtodos que utilizan las propiedades reductoras de la molcula de cido
ascrbico pertenecen a la primera categora. Se pueden utilizar muchos reactivos y de
todos ellos, el 2,6-diclorofenolindofenol (DCFI) es ciertamente el ms utilizado debido a
que su uso es simple y los resultados son en general confiables. El DCFI es de color azul
profundo pero incoloro cuando es reducido por AA. Por lo tanto, es fcil titular volmenes
fijos del extracto de la muestra hasta que permanezca un color rosado y comparar el
volumen de reactivo utilizado con aquellos de una solucin estndar de concentracin
conocida de AA.
Uno de los mtodos ms especficos que pertenecen a la segunda categora fue
desarrollado por Deutsch y Weeks y se basa en la medicin de ADA despus de la
oxidacin de todo el AA utilizando ya sea oxgeno unido a carbn u otro oxidante tal como
iodo. El ADA formado es luego derivatizado con o-fenilendiamina para formar un derivado
fuertemente fluorescente, el que puede cuantificarse fcilmente por la comparacin con
soluciones estndares.

En aos recientes, diversos investigadores han publicado procedimientos que utilizan

HPLC para separar y cuantificar AA y/o ADA.

VITAMINAS LIPOSOLUBLES
VITAMINA A
Antiguamente, se determinaba la vitamina A mediante una reaccin colorimtrica de
retinol con tricloruro de antimonio (reaccin de Carr-Price). El retinol obtenido despus de
saponificar (2-10 g de la muestra se saponifican preferentemente bajo nitrgeno utilizando
una mezcla de hidrxido de potasio acuoso, etanol o metanol, agua y con la adicin de un
antioxidante como cido ascrbico, pirogalol o BHT) y extraer los componentes no
saponificables tena que ser purificado utilizando cromatografa de columna abierta con el
fin de eliminar los componentes interferentes.
La HPLC se ha convertido en la actualidad en el mtodo de eleccin dado que esta
tcnica acorta considerablemente el procedimiento del anlisis y aumenta la
reproducibilidad y exactitud.

VITAMINA E
Antiguamente la determinacin de la vitamina E en los alimentos se realizaba con una
reaccin de cloruro frrico que se reduca a iones ferrosos, los que forman un complejo de
color rojo con batofenantrolina (4,7-difenil-1,10-fenantrolina). Se realizaba la reaccin
denominada Emmerie-Engel en extractos purificados cromatogrficamente despus de
saponificar las muestras y que era interferida por muchos componentes
Se utiliz la cromatografa de gas por algn tiempo, pero muy pronto se reconocieron las
ventajas de HPLC, tambin considerando la posibilidad de separar simultneamente a, ,
y, y 5-tocoferol con esta tcnica.

VITAMINA D
La HPLC ofrece actualmente el mtodo de anlisis ms adecuado para la determinacin
de vitamina D en un amplio rango de alimentos incluso a bajos niveles de concentraciones
naturales.
La determinacin de vitamina D2 y D3 en una solucin apropiada del extracto de la
muestra se realiza mediante HPLC de fase normal semipreparativa seguida por HPLC de
fase reversa analtica. La cromatografa se monitorea por UV y se logra la identificacin
de los picos de acuerdo a los tiempos de retencin y la cuantificacin se realiza por el
mtodo de estndar interno utilizando las reas o las alturas de los picos.

3) Datos de sierra exportadora respecto a los productos que tienen

vitamina en macro
ARNDANOS (Vitamina C, E)

AGUAYMANTO

PALTA (VITAMINA E)

4) Adems del HPLC, qu otros mtodos existen para cuantificar las

vitaminas liposolubles o vitaminas hidrosolubles
METODOS DE YODOMETRIA PARA CUANTIFICACIN DE VITAMINA C
En esta titulacin interviene el yodo como agente oxidante. Dado que la
reaccin entre el yodo y el cido ascrbico presenta una estequiometria de 1:1,
en el punto final de la titulacin el nmero de moles de yodo reducido ser
equivalente a los moles de cido ascrbico oxidado. Es importante sealar que
con este mtodo determina la capacidad reductora total de la disolucin, por
ello, si la disolucin a titular contiene otras sustancias reductoras adems del
cido ascrbico, el contenido de cido ascrbico sobrestimado. Adems, hay
que tener en cuenta que la vitamina C es oxidada fcilmente por el aire, por
tanto, las disoluciones que contienen vitamina C deben ser preparadas
inmediatamente antes de ser tituladas, con el fin de obtener resultados fiables.
El almidn se utiliza como indicador para el yodo, debido a que forma un
complejo de color azul intenso con el mismo. Cuando ya no quede vitamina C
reducida el yodo no desaparecer, se unir al almidn y aparecer el color azul
indicando el fin de la titulacin.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Moron C, Zacarias I, De Pablo S. Produccin y manejo de datos de composicin
qumica de alimentos en nutricin, capitulo 17. Editorial FAO, Direccin de
alimentos y nutricin, 1997. Disponible en:
http://www.fao.org/docrep/010/ah833s/ah833s19.htm
Ciancaglini P et al. Using a classical method of vitamin C quantification as a
tool for discussion of its role in the body. Biochem. Mol. Biol. Edu. 29: 110-114,
2001. Harris DC. Anlisis qumico cuantitativo. Editorial Revert, 2001.