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IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS HIDROCARBONOCLASTAS PARA

BIORREMEDIACIN DE SUELOS COLOMBIANOS CONTAMINADOS CON


PETRLEO
Andrs Felipe Arias Arellano, Christian Giovanni Ballesteros Beltrn, Elia Patricia
Garduo Cortez
RESUMEN
La contaminacin por parte de hidrocarburos provenientes del petrleo afecta en gran
medida ecosistemas del suelo colombiano debido a los derrames ocasionados por
ataques de grupos terroristas contra los oleoductos del pas, es por esto que resulta de
gran inters la implementacin de estrategias para remediar el dao, como el uso de
microorganismos biorremediadores hidrocarbonoclastas. Se propone un mecanismo
para la caracterizacin filogentica de microorganismos capaces de sobrevivir a medios
contaminados por petrleo mediante el uso de dos metodologas distintas de obtencin
de su material gentico. La primera metodologa consiste en el uso de cultivos
selectivos en el que la nica fuente de carbono es la proporcionada por el petrleo, as
se identifican morfolgicamente las colonias bacterianas formadas en el medio y se les
realiza un protocolo de extraccin de ADN cromosmico. La segunda consiste en el
tratamiento de la muestra de suelo con dicho contaminante y la exclusin del material
gentico de clulas no viables en el medio mediante la tcnica de cross-linking
fotoinducido de EMA para una posterior caracterizacin de nicamente las clulas
viables. Una vez realizada la extraccin, amplificacin mediante PCR y secuenciacin
del gen 16S rDNA se procede comparar con las bases de datos para la caracterizacin
filogentica. Se espera que en caso de hallar microorganismos viables, debido a los
amplios estudios ya realizados, stos sean en gran medida Pseudomonas sp,
Agrobacterium sp, y hongos tales como Trichoderma sp, Mucor sp, Aspergillus sp, ya
que resultan ser los ms eficientes en degradar compuestos derivados del petrleo en
el suelo(Hernndez et al 2003).
INTRODUCCIN
En la actualidad el petrleo es la principal fuente de energa, razn por la cual la
demanda de extraccin es verdaderamente alta. Se habla de desarrollo cuando el
consumo de recursos naturales se eleva y el consumo del petrleo y sus derivados
participan en ello (Serrano- Guzmn M.F et al, 2013). No obstante, el mal manejo en la
ejecucin de esta actividad, repercute negativamente sobre los ecosistemas, en este
sentido, la contaminacin por petrleo puede ser causada por derrames accidentales, o
bien, intencionales sobre el ambiente, lo cual desencadena efectos adversos sobre el
medio y consecuentemente en el hombre. Los derrames pueden suscitarse durante la
explotacin o bien, durante el transporte de los hidrocarburos. El resultado del mal
manejo tiene secuelas directas sobre el suelo, agua, aire, flora y la fauna. A nivel
mundial, los derrames de hidrocarburos son muy comunes y las afectaciones pueden
presentarse hasta las capas subterrneas. Entre otras cosas, estos derrames pueden
afectar suelos y agua y dejar secuelas en procesos ecolgicos, as pues, el deterioro la
calidad del ambiente se ve comprometida principalmente sobre las propiedades del

suelo y agua alterando la estabilidad qumica presente por naturaleza y, asimismo,


repercutiendo sobre la diversidad microbial (Serrano- Guzmn M.F et al, 2013).
El petrleo es una sustancia compuesta bsicamente de hidrocarburos, y, en menor
proporcin de elementos no hidrocarbonados. El petrleo crudo se compone
principalmente de hidrocarburos que se clasifican en: parafinas, naftenos y aromticos.
A partir del petrleo como materia prima, es posible extraer diversos productos entre los
cuales se encuentran: aceites lubricantes, butano, gasolina, butano.
Entre los efectos por derrames petroleros que se tienen registrados, se encuentra por
ejemplo que los suelos arenosos pierden la friccin, asimismo la permeabilidad y
compactacin se ven afectadas como resultado de la saturacin de hidrocarburos en el
medio (Alsanad et al., 1995; Alsanad et al., 1997) (citado por Serrano- Guzmn M.F et
al, 2013).
La presencia de hidrocarburos en el suelo, repercute en el intercambio gaseoso con la
atmsfera, ocasionando evaporacin y penetracin de la sustancia; la toxicidad del
desastre tambin depende de las condiciones en que el derrame fue efectuado, como el
tipo de hidrocarburo, temperatura, humedad, textura del suelo y la cantidad vertida
(Serrano- Guzmn M.F et al, 2013). Hay estudios en los que los resultados indican que
la presencia de hidrocarburos en el suelo tiene alcances sobre la germinacin y el
crecimiento vegetativo de varios tipos de pastos (Serrano- Guzmn M.F et al, 2013).
Asimismo se tiene registro de la evaluacin de los hidrocarburos poliaromticos en
bosques, y los resultados obtenidos indican necrosis foliar en los individuos afectados.
Por lo anterior, se sabe que los alcances que se tienen por derrames petroleros, causan
deterioro progresivo en la calidad del ambiente generando una amenaza a la salud
pblica y comprometiendo la presencia de especies animales y vegetales. De ah la
importancia de implementar herramientas que permitan la degradacin de este tipo de
sustancias que comprometen el estado de los ecosistemas y ponen en riesgo la
supervivencia de ciertas especies.
En la naturaleza, la presencia de estas sustancias en el suelo, son eliminadas mediante
procesos de biodegradacin, volatilizacin, percolacin y drenaje superficial; ahora
bien, con el aprovechamiento de hechos efectuados naturalmente, se desarrollan
tcnicas que aminoran las secuelas de los derrames de petrleo (Trujillo- Toro M.A. &
Ramrez- Quirama J. F, 2012). La biorremediacin es una alternativa eficiente y
saludable. Consiste en el aprovechamiento de ciertos organismos como hongos,
plantas o bacterias que son capaces de metabolizar dichos compuestos y
transformarlos en sustancias menos txicas para el ambiente (Serrano- Guzmn M.F et
al, 2013); estas degradaciones se presentan usualmente en la naturaleza, sin embargo
la manipulacin adecuada de los sistemas que lo permiten pueden aumentar la
velocidad en que se efecta el proceso de degradacin (Trujillo- Toro M.A. & RamrezQuirama J. F, 2012). Para el proceso se pueden usar plantas en una tcnica llamada
fitorremediacin. Asimismo algunos animales tienen la capacidad de desarrollarse en
ambientes contaminados por estos compuestos, como es el caso de las lombrices de
tierra que absorben los contaminantes a travs de los tejidos y los acumulan en las vas
digestivas (Serrano- Guzmn M.F et al, 2013). No obstante, las bacterias son los
organismos ms empleados en procesos de biorremediacin a pesar de que los
hongos, algas, Cianobacterias y Actinomicetes tambin son muy eficientes en la
degradacin de compuestos txicos presentes en los suelos.
J. Benavides, G. Quintero et al (2006) mencionan que en Colombia, los hechos indican

que en los ltimos 18 aos (hasta entonces), el transporte de crudo se ha visto afectado
debido a la permanente actividad terrorista efectuada contra los oleoductos e
instalaciones petroleras; basta con indagar en el pasado para saber que en 1998,
dentro del pas se presentaron 920 ataques contra la infraestructura petrolera causando
repercusiones en la zona alta de la cuenca del ro Catatumbo, en la llanura del valle
medio y medio bajo del ro Magdalena. Durante los aos posteriores, los ataques
disminuyeron considerablemente, aun as los impactos ambientales permanecen en los
diferentes ecosistemas que fueron afectados.
La explotacin de recursos como el petrleo y los derrames derivados de ello, a nivel
mundial generan consecuencias de diversas ndoles sobre los ecosistemas de los que
se extraen, mismos que requieren la aplicacin de estrategias que garanticen la
remediacin de los factores perjudicados sin generar efectos negativos en el proceso.
La implementacin de tecnologas nuevas que se efecten en favor de la remediacin
de catstrofes naturales y de origen antrpico, aumentan en importancia en tanto los
ecosistemas se encuentran amenazados. En este sentido, el aislamiento de organismos
capaces de desarrollarse en presencia de hidrocarburos para su posterior identificacin
a nivel molecular, es una herramienta que permitir hacer optimizar su uso para la
remediacin de zonas perjudicadas.
PREGUNTA DE INVESTIGACIN
A partir de muestras de suelo colombiano, es posible el aislamiento de
microorganismos capaces de sobrevivir en medios contaminados con petrleo para
realizar procesos de extraccin de material gentico con el fin de una posterior
identificacin filogentica?
OBJETIVOS
Objetivo general:
Aislar microorganismos capaces de degradar hidrocarburos provenientes de petrleo
crudo, presentes en muestras de suelo colombiano, para su posterior identificacin y
prospeccin como posibles herramientas de biorremediacin de suelos contaminados.
Objetivos especficos:
Realizar extracciones de ADN comunitario en suelos previamente tratados con petrleo
crudo para la identificacin de microorganismos capaces de usar como sustrato los
hidrocarburos del petrleo y que no son posibles de cultivar, teniendo en cuenta que
slo del 1 al 10% de los microorganismos presentes en el suelo pueden ser cultivados
(Muyzer et al 1993)
Extraer ADN de cada colonia identificada morfolgicamente como distinta a partir de las
diluciones en placa realizadas en laboratorio
Identificar microorganismos hidrocarbonoclastas a nivel molecular a partir de las
regiones variables (V1-V9) del gen que codifica a rRNA 16S.

MARCO TERICO
Biorremediacin
Las tcnicas de biorremediacin implican el uso de plantas, hongos, microorganismos o
derivados como enzimas para la desintoxicacin de algn medio mediante la
transformacin del contaminante en sustancias menos txicas o inocuas para el
ambiente y la salud humana (J. Benavides G Quintero et al, 2006).
Segn la EPA (Agencia de Proteccin Ambiental, por sus siglas en ingls)
biorremediacin es la manipulacin de sistemas biolgicos para efectuar cambios en el
ambiente (EPA, s.f). Se trata de una estrategia usada para la detoxificacin de
contaminantes sobre los ecosistemas. Con su aplicacin, se minimizan los daos
causados al ambiente (Vargas- Gallego P. A. 2004).
En ambientes naturales se efectan procesos enzimticos en donde ocurren
transformaciones bioqumicas producidas por organismos. El metabolismo
microbiolgico que permite la degradacin de petrleo, es el agente responsable de la
biorremediacin de ambientes contaminados por derrames de hidrocarburos, sin
embargo la velocidad a la que ocurre en baja; en este sentido, la manipulacin
adecuada de estos sistemas biolgicos puede ser una estrategia que permita la
remediacin acelerada de los sitios en donde los hidrocarburos abundan (AguirreGarrido J. F., 2005). Dicha aceleracin puede llevarse a cabo por la adicin nutrientes
(nitrgeno y fsforo) as como la modificacin de variables (humedad, pH, oxgeno e
inoculacin con microbiota); con ello se puede modificar la actividad de los
microorganismos all presentes y en consecuencia, acelerar los procesos metablicos
(Ercolly & Glvez, 2001; Infante, 2001) (citado por Trujillo- Toro M.A. & RamrezQuirama J. F, 2012). La aceleracin de la degradacin de los contaminantes por parte
de los microorganismos, es el principio en que se basa la biorremediacin.
La biorremediacin se divide en dos tipos: in situ y ex situ. Con respecto a la estrategia
in situ, consiste en aplicaciones en las que el suelo contaminado es tratado o los
contaminantes presentes son removidos sin la necesidad de excavar el sitio. Por el
contrario, en la biorremediacin ex situ es necesaria la excavacin, dragado o la
remocin del suelo contaminado para su tratamiento (INECC, 2007).
Las tcnicas de biorremediacin se trata de estrategias que en comparacin con
alternativas ms costosas y la incineracin de residuos, es ms eficiente , econmica y
amigable al ambiente (Trujillo- Toro M.A. & Ramrez- Quirama J. F, 2012). Si se
implementa de manera adecuada, el proceso no tiene repercusiones negativas sobre
los suelos y en cambio ofrece soluciones ms simples, completas y econmicas que las
tecnologas mecnicas (Vargas- Gallego P. A. 2004.). Empero, entre las dificultades de
la tcnica radican en que para muchos tipos de vertidos su efectividad no ha sido
determinada, los resultados suelen ser mediano y largo plazo, y adems su aplicacin
en el mar en complicada. Es decir, para la obtencin de resultados favorables, es
necesario el estudio de cada sitio en el que se aplica, su aplicacin es especfica para
cada zona tratada y se requiere informacin del sitio contaminado (Corona e Iturbide,
2004) (citado por Trujillo- Toro M.A. & Ramrez- Quirama J. F, 2012)

Regiones 16S rRNA


El ARN bacteriano de la subunidad 30S del ribosoma (rRNA 16S) es la macromolcula
ms ampliamente utilizada para estudios de filogenia y taxonoma bacterianas (M
Rosario, M Carmen, 2004). Fueron los estudios de Carl Woese a principios de la
dcada de 1970 los que permitieron que el anlisis de esta molcula se aplicara como
cronmetro molecular.
Esta tcnica resulta de gran ayuda cuando no es posible caracterizar el microorganismo
mediante sus caractersticas fenotpicas y permite la creacin de libreras en las que se
reporten las secuencias de nucletidos correspondientes a cada microorganismo y as
se pueda disponer de ellas para la comparacin de la secuencia obtenida en el
laboratorio mediante programas informticos y de esta forma conocer de qu
microorganismo se trata en caso de estar reportado.
El rARN 16S es un polirribonucletido con un tamao aproximado de 1500 nt y es
codificado por el gen del ADN ribosomal 16S el cual se encuentra muy conservado,
presentando regiones comunes en todos los microorganismos y algunas otras variables
como se muestra en la figura 1.
Son las regiones variables (V1-V9) las que resultan de gran importancia para
caracterizacin filogentica ya que son caractersticas de cada microorganismo y son
las regiones conservadas en las que se pueden basar el diseo de los primers para la
amplificacin de la secuencia.
Se ha demostrado que para la identificacin de una bacteria a nivel de especie no es
necesario la amplificacin del gen completo que codifica a rRNA 16S y que la mayor
variabilidad se halla en los primeros 500 pb del extremo 5, por lo tanto, resulta ms til
crear primers que sirvan para amplificar las regiones variables de inters en lugar de
todo el gen.

Figura 1 Estructura secundaria del ARNr 16S (tomada de Neefs et al). Las hlices comunes a todos los seres vivos,
denominadas hlices universales, se numeran de la 1 a la 48, en orden de aparicin a partir del extremo 5. Las
hlices especficas de procariotas se indican con Pa-b, donde a es el nmero de la hlice universal precedente y b el
nmero de serie. Las regiones relativamente conservadas se presentan en negrilla. Las regiones variables, en lneas

finas, se designan V1-V9, teniendo en cuenta que V4 es exclusiva de eucariotas. Las regiones que se muestran en
lneas discontinuas slo estn presentes en un nmero limitado de estructuras (M Rosario, M Carmen, 2004).

PCR para amplificacin de la regin 16S


La tcnica de PCR provee de un mecanismo relativamente sencillo para la obtencin de
un gran nmero de copias de un fragmento de ADN de inters incrementando en gran
medida las posibilidades de deteccin de microorganismos mediante el uso de otras
tcnicas que requieran una cantidad considerable de material gentico, en este
proyecto se hace uso de una PCR tradicional ya que no se hace necesario la
cuantificacin del nmero de copias del transcrito ni una hebra molde de ARN ya que el
objetivo son los genes ubicados en el ADN que codifican ARN para la subunidad
ribosomal menor en bacterias.
La enzima encargada de la replicacin de la cadena es la ADN polimerasa en principio
extrada del extremfilo Thermos aquaticus con el fin de soportar las altas temperaturas
requeridas para la denaturacin del ADN. La PCR cuenta con 3 etapas principales: la
denaturacin del ADN debido a las altas temperaturas (alrededor de 95C), la
hibridacin de lo primers en los sitios especficos por complementariedad de bases
(alrededor de 55C) y la posterior sntesis o elongacin de la cadena por la enzima
polimerasa (alrededor de 75C).
Una vez se ha extrado el ADN de los cultivos selectivos o mediante una extraccin de
ADN comunitario es posible generar amplificaciones de los marcadores biolgicos
(rRNA 16S) para una futura identificacin de microorganismos mediante el uso de la
reaccin en cadena dela polimerasa y el uso de un par de primers especficos
universales los cuales son muy tiles debido a que reconocen regiones muy
conservadas del gen de rRNA 16S comunes para la gran mayora de microorganismo y
permiten amplificar la regin deseada en funcin de la seccin variable del gen que
codifica a la regin 16S (V1- V9) que queramos amplificar.
Descarte selectivo de ADN proveniente de clulas no viables en mezclas de
comunidades bacterianas mediante bromuro de etidio monocido
Uno de los principales retos en el anlisis de diversidad de microorganismos, los cuales
no son cultivables, en mezclas de comunidades bacterianas, es la diferenciacin entre
las clulas viables (clulas vivas) y clulas no viables (clulas muertas), ya que stas
ltimas a pesar no contar con caractersticas funcionales, si no han pasado por un
proceso de lisis celular, su material gentico se mantendr intacto por largos periodos
de tiempo, interfiriendo con un proceso de identificacin de microorganismos capaces
de sobrevivir en el medio si se emplea un mtodo de extraccin y amplificacin de ADN
comunitario, llegando a arrojar falsos positivos sobre los resultados. El mtodo
propuesto por A. Nocker y A. Camper (2006) plantea una alternativa relativamente fcil
de usar que utiliza el colorante de intercalacin de ADN bromuro de etidio monocido
(EMA). Se sabe que este producto qumico slo penetra en clulas no viables con
comprometida integridad de la membrana celular adems se hace provecho del hecho
de que la reticulacin posterior fotoinducida inhibe la amplificacin por PCR del ADN de

clulas muertas, lo que implica una amplificacin de la regin de inters nicamente


sobre las clulas viables, demostraron adems que la mayor parte del ADN de las
clulas muertas en realidad se pierde durante el procedimiento de extraccin de ADN,
probablemente junto con desechos celulares que entran en la fraccin de pellets.
Esta tcnica resulta ser un mtodo extremadamente til en estudios ecolgicos al limitar
el anlisis de las comunidades bacterianas mediante su ADN a la fraccin viable.
Primers universales
Los primers universales de PCR son oligonucletidos que se unen a una secuencia
presente en muchos vectores de clonacin de plsmidos o secuencias conservadas en
genomas de microorganismos como las regiones que codifican para rRNA 16S, la
mayora de los cuales se derivan de vectores pUC (que a su vez provienen de
pBR322). Estas secuencias se identificaron como sitios ptimos de PCR y
secuenciacin a medida que flanqueaban el sitio de clonacin mltiple en el que se
introducira una secuencia de ADN exgena (Ls LABS, s.f).
A continuacin se presentan algunos de los primers universales para la amplificacin de
la regin del rDNA 16S:

Tabla 1. Ejemplos de primers universales para la amplificacin del gen rDNA 16S (B. Sameer A. 2011; B. Hodkinson
et al 2009, lutzonilab, disponible en lnea: http://lutzonilab.org/16s-ribosomal-dna/)

Los primers universales son de gran importancia dentro de la identificacin filogentica


ya que permiten la amplificacin de las las regiones que codifican para rRNA 16S
mediante la hibridacin en lugares altamente conservados entre todos los
microorganismos, una ejemplo de esto es el uso del par primers 27F y 1492R que
permiten la amplificacin completa de dicho gen (alrededor de 1500 pb) (W Weisburg et
al, 1991) aunque en ocasiones no resulta conveniente amplificar todo el el gen sino
regiones en las que se encuentre la variabilidad (V1-V9) de inters y se usan
igualmente primers universales que hibridicen dentro del gen en las regiones
conservadas.

El Petrleo y la contaminacin debido a ste.


El petrleo crudo es una mezcla de hidrocarburos en su mayora parafinas, naftenos y
aromticos. son compuestos de hidrgeno y carbono que forman distintas enlaces entre
ellos lo cual indica un tipo de clasificacin como alcanos, alquenos, alquinos y
aromticos. Dentro de la industria del petrleo se hace una diferenciacin entre el
petrleo debido a su densidad lo que permite clasificarlo como crudos ligeros, medios,
pesados y extrapesados, aunque su principal composicin siempre radica de
hidrocarburos; a continuacin se presenta se presenta una tabla con la composicin de
hidrocarburos presente en el petrleo crudo.

Tabla 2. Contenido aproximado de hidrocarburos en el petrleo crudo (PEMEX, 2001)

Inclusive por los mtodos tradicionales, la extraccin de crudo resulta bastante


contaminante para los ecosistemas cercanos, y con la implementacin de mtodos
como el fracking la contaminacin no slo por petrleo sino por los compuestos
utilizados en la fractura hidrulica e incluso la contaminacin de aguas subterrneas
con hidrocarburos y gases inflamables resulta an ms txico para los ecosistemas.
Un gran problema con la contaminacin por petrleo, a parte del inminente dao al
ecosistema, es el gran costo econmico y dificultad que supone la remediacin de los
cuerpos acuferos, suelos y atmsfera contaminados (Schmidt W, 2000).
Tcnica DGGE (Electroforesis en gel con agente desnaturalizante)
Una vez se cuenta con el amplificado de las regiones de inters del gen que codifica
para rRNA 16S de una amplia variedad de microorganismos resulta de gran importancia
la diferenciacin de dichos amplificados para la caracterizacin al menos numrica de la
variedad de microorganismos presentes pero separar fragmentos tan semejantes en
nmero de pares de bases resultara improductivo mediante una electroforesis
tradicional, es por eso que se emplea la tcnica de DGGE (Denaturing Gradient gel
electrophoresis) la cual permite separar los fragmentos previamente amplificados por
PCR con diferencias mnimas o nulas de tamao.
La tcnica resulta muy semejante a la electroforesis convencional a excepcin del
agregado de agentes desnaturalizantes como la Urea o formamida en un gradiente de
concentracin, lo que permite hacer un anlisis diferencial de fragmentos de ADN que
tengan el mismo tamao.
La tcnica se fundamenta en el hecho de que cuando un fragmento de ADN de un
determinado tamao y secuencia se encuentra en las condiciones que producen su
desnaturalizacin, la migracin de dichas cadenas en una electroforesis en gel se

detiene o es considerablemente ms lenta. Esta desnaturalizacin diferencial en base a


los contenidos de Citosina y Guanina permite diferenciar amplificados de igual tamao
por su composicin.
Como ya se demostr con la aplicacin de la PCR, existen diferente mtodos para la
denaturacin de la doble cadena de ADN, los cuales pueden ser fsicos (como la alta
temperatura en la PCR) o qumicos (principalmente el uso de urea).
Esta tcnica es realmente til para la diferenciacin de fragmentos amplificados que
posean el mismo tamao pero regiones variables en su composicin por lo que se
emplea para detectar polimorfismos en las secuencias amplificadas.
En estudios de biorremediacin de suelos se han reportado cambios en las bandas de
DGGE asociadas a diferentes microorganismos con respecto a cambios en las
concentraciones de los hidrocarburos, decreciendo en nmero a medida que los
contaminantes aumentan (Duarte et al, 2000).
MATERIALES Y MTODOS
Muestreo de suelos
Se realizan muestreos de suelos Colombianos que resultan de gran inters debido a su
historial, como suelos cercanos a costas (debido a los derrames petrolferos cercanos a
stas) o suelos contaminados con hidrocarburos por causa del conflicto armado y
ataques terroristas constantes a los oleoductos que producen derrames que afectan
gran parte del ecosistema adyacente. Tambin resulta til realizar muestreos de suelos
los cuales no han sido contaminados con petrleo y que contengan una gran variedad
de materia orgnica con el fin de presenciar mayor biodiversidad de microorganismos y
as poder implementar cultivos en medios selectivos que tengan una mayor probabilidad
de xito o un tratamiento con contaminacin por petrleo en medios apropiados para el
crecimiento de microorganismos y una siguiente extraccin de ADN comunitario para
anlisis de biodiversidad de organismos con la capacidad de sobrevivir al medio.
La cantidad de muestreo se realiza tambin en funcin de las caractersticas del suelo,
las cuales pueden ser determinadas mediante mtodos como la espectrofotometra y
as sea posible determinar qu condiciones sern las ms apropiadas para el proceso
de adecuacin del suelo para el crecimiento de microorganismos el cual se puede
realizar en un biorreactor, por ejemplo si el suelo es oligotrfico (con baja cantidad de
nutrientes) la cantidad de muestreo aumenta en gran magnitud respecto a un suelo
orgnico y las condiciones en un biorreactor se modificarn en gran medida.
-Aislamiento de microorganismos (diluciones y cultivo)
Con el mtodo de diluciones en placa cualquier clula viable que se encuentre en la
muestra, puede ser inoculada en un medio de cultivo que cuente con caractersticas
que se lo permitan. Se prepara una serie de diluciones con muestras de suelo. Gracias
a esto se pueden generar colonias separadas, que pueden ser de una sola clula o una
agrupacin, y sern contadas como una bacteria (Ramrez et al., 1992).
De acuerdo al protocolo seguido por Aguirre G. (2004) para el aislamiento de bacterias
hidrocarbonoclastas, el mtodo consiste en tomar 1g de muestra de suelo y mezclar en
un tubo con 9 mL de solucin isotnica. Despus de agitar la mezcla en vrtex, tomar
una alcuota de 1mL que se coloca en el siguiente tubo con 9 mL de solucin isotnica.

El proceso de diluciones seriadas se repite hasta obtener una dilucin de 10 -7 (Aguirre


G. 2004).
Con las diluciones listas, se procede a la inoculacin de las mismas, por triplicado. Con
la ayuda de esptulas Drigalki, se dispersa la alcuota sobre las cajas petri con medio
basal (el cual carece de fuentes de carbono). Sobre la tapa de las cajas se coloca un
papel filtro impregnado con con petrleo, el cual ser el nico aporte de carbono para
los organismos, por lo tanto los que se desarrollen, indicarn su capacidad
hidrocarbonoclasta. A continuacin incubar las cajas Petri en forma invertida, y en
ausencia de luz, a una temperatura de 37 C y observar cada 12 horas tener un control
en el crecimiento de las colonias (Aguirre G. 2004)
Reactivos:
Solucin salina isotnica (NaCl al 0.85%), esterilizar a 15 PSI durante 15 min
Medio Mineral para bacterias hidrocarbonoclastas (composicin g/L): Agar noble (1.5
% p/v); 0.4 g de KH2PO4; 1.6 g de K2HPO4; 1.5 g de NH4Cl; 0.17 g de MgCl2.6H20;
0.609 g de Na2SO4; 0.045 g de CaCl2.2H2O; 1 mL de Solucin mineral*
Solucin mineral (composicin g/L): 5.1 g de MgCl2.6H20; 0.66 g de MnCl2.2H20; 1 g
de NaCl; 1 g de FeCl3.6H2O; 0.1 g de CaCl2.2H2O; 0.01g de CuCl2; 0.06 g de ZnCl2;
0.05g de AlCl3; 0.01 de H3BO3; 0.04 g de NaMoO4.2H20

-Extraccin de ADN de las colonias identificadas morfolgicamente como


distintas
Para la extraccin de ADN de colonias las cuales crecieron en un medio en el que slo
se provey hidrocarburos provenientes del petrleo como nica fuente de carbono, se
emplea los mtodos tradicionales de extraccin de ADN cromosmico a partir de
bacterias como el protocolo de extraccin mediante solventes orgnicos obteniendo las
comunidades bacterianas de los cultivos realizados.
-Diferenciacin de clulas viables mediante la tcnica de EMA
Para los suelos tratados con petrleo crudo a los cuales se le quiere realizar una
identificacin filogentica de los microorganismos sobrevivientes que no son cultivables
Se emplea una adaptacin del protocolo propuesto por A. Nocker y A. Camper (2006):
se disuelve el EMA en agua a una concentracin stock de 5 mg/ml y es almacenado a
-20C en la oscuridad. Se agrega el EMA a las muestras de suelo sometidas a
diluciones a una concentracin final de 100g/ml, se encuba durante 5 minutos en la
oscuridad y luego se exponen a la luz durante 1 min usando una lmpara halgena a
650 W puesta a 20 cm de la muestra, luego la muestra es colocada en hielo para evitar
un exceso de calentamiento. Luego del crosslinking fotoinducido las clulas son
puestas en la centrifuga a 5000 xg durante 5 min para la preparacin de la extraccin
de ADN.
- Extraccin de ADN del suelo
Para microorganismos no cultivables del (99-90%) se realiza la tcnica de extraccin de
ADN comunitario de suelo tratado con crudo y mantenido en condiciones especiales
mediante el uso de biorreactores. Para la extraccin de ADN de muestras de suelo A.
Nocker y A. Camper (2006) utilizaron el kit de extraccin de ADN de suelos de
Qbiogene (Carlsbad, CA) y hallaron que el mtodo de exclusin de material gentico de

clulas no viables de clulas viables mediante EMA no era alterado, por lo que si se
requiere verificar las clulas que sobreviven en el medio mediante la extraccin de ADN
comunitario puede resultar adecuado el uso del Kit anteriormente mencionado mediante
el siguiente protocolo suministrado por el fabricante:
Para la preparacin de la muestra se agrega a 500mg de suelo dentro de Lysing Matrix
E Tube, luego para el proceso de lisis se agrega 978l del buffer de fosfatos sdico y
122l de buffer MT, se aseguran los tubos en FastPrep Instrument y se procesa por 30
segundos a velocidad de 5.5, se centrifuga Lysing Matrix E Tubes a 14000 xg por 30
segundos y se transfiere el sobrenadante a un tubo limpio, se agrega 250l del reactivo
PPS y se mezcla agitando el tubo a mano 10 veces, luego se centrifuga a 14000 xg por
5 minutos para obtener el pellet precipitado, se transfiere el sobrenadante a un tubo
limpio de 15 ml (se resuspende Binding Matrix Suspensin antes de usar) y se agrega
1ml de Binding Matrix Suspensin a el sobrenadante, luego se invierte a mano durante
2 minutos, se remueve 500l del sobrenadante siendo cuidadoso de evadir la Binding
Matrix, se descarta el sobrenadante y se transfiere aproximadamente 600l de la
mezcla el SPINTM Filter y se centrifuga a 14000 xg por 2 minutos para secar la matriz de
la solucin de lavado SEWS-M, se remueve del SPINTM Filter y se coloca en el Catch
Tube, finalmente se agrega 50l de DES (DNasa/ Pyrogen Free Water) y se remueve
suavemente la membrana y se centrifuga a 14000 xg por 1 minuto y se transfiere a un
Catch Tube.
-Amplificacin por PCR de las regiones 16S
Una vez se cuenta con el ADN puro extrado de las colonias formadas en los cultivos
selectivos o el ADN comunitario extrado del suelo despus de haber sido sometido a
procesos de contaminacin es posible hacer una identificacin filogentica mediante la
amplificacin de las regiones del ADN que codifican para rRNA 16S con el uso de la
tcnica de PCR convencional y primers especficos universales que amplifiquen la
regin de variabilidad de inters dentro del gen para todos los microorganismos
presentes en la muestra ya que los primers se unen a las regiones conservadas dentro
del gen comn.
Ya que estudios revelan que la mayor variabilidad dentro de este marcador biolgico se
encuentra en los primeros 500 pb del extremo 5 (M Rosario, M Carmen, 2004) y es
posible identificar bacterias a nivel de especie mediante estos primeros 500 pb se
determin que una buena opcin de primers corresponden al 27F y 785R para una
amplificacin de las regiones variables del gen V1-V4 y un tamao del amplicn de
aproximadamente 750 pares de bases, lo que facilita la secuenciacin y la posterior
separacin mediante el mtodo de DGGE.
Primer

Secuencia

Tm C

27 F (forward)

5 AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3

53.2

785 R (reverse)

5 CCVGGGTATCTAATCC 3

46.8

tabla 3. primers empleados para la amplificacin de las regiones V1-V4 (P. Izquierdo, 2015)

De acuerdo a las temperaturas de melting de los primers se emplea una temperatura de

alineamiento ptima de 50C y en base a lo reportado por P. Izquierdo (2015) se ajusta


el tiempo de extensin a unos 45 segundos teniendo en cuenta la longitud de los
fragmentos a amplificar, luego se verifica la especificidad de los primers mediante un
anlisis electrofortico convencional en un gel de agarosa al 1%.
Tcnica DGGE
Es una tcnica til y econmica para detectar mutaciones sin necesidad de recurrir a
secuenciamiento. Consiste en separacin de fragmentos de ADN obtenidos por PCR
corriendolos en un gel con un gradiente de un agente desnaturalizante.
Esta tcnica se basa en la energa necesaria para denaturar dos hebras de ADN. Esta
energa puede provenir de temperatura y se puede determinar con la siguiente frmula
en el caso de oligonucletidos de 20 pares de bases o menos (Cortzar et all 2004);
Tm = 2C (A + T) + 4C (G + C)
Sin embargo los puentes de hidrgeno que mantienen unidas las cadenas de ADN se
pueden separar aadiendo sustancias denaturante que compiten por unirse con los
puentes de hidrgeno formados entre las bases nitrogenadas; pero el principio es el
mismo, se requiere una mayor concentracin por cada C o G en la secuencia. En vista
de que los productos de PCR que se analizan en estos casos tienen la misma longitud,
las secuencias de ADN con ms contenido de C o G logran migrar una distancia ms
larga antes de detenerse tras ser separadas (Fernndez et all).

Figura 2. Ejemplo de identificacin por mtodo DGGE. A la izquierda se muestran fragmentos de la


misma longitud con distintas concentraciones de C y G, las cadenas que contienen ms C o G se
mantienen estables por ms tiempo; a medida que se van separando por causa del agente su migracin
se ve interrumpida. Al lado derecho se muestra una corrida de una mezcla de las distintas secuencias en
los carriles del gel.(imagen tomada del manual Herramientas moleculares aplicadas en ecologa)

-secuenciacin de las regiones amplificadas e identificacin de los


microorganismos
Las muestras para secuenciamiento pueden ser obtenidas de los amplicones
generados a partir de la PCR mediante la extraccin cuidadosa de las bandas desde los
geles de electroforesis, des esta forma se remite a un laboratorio que practique las
prcticas de secuenciamiento actuales y que proporcionen alta fiabilidad ya que la

secuencia obtenida se utilizar para comparacin en bases de datos mediante


herramientas informticas entre ellas el BLAST para nucletidos en la pgina web del
NCBI para la base de datos especfica 16S ribosomal RNA sequences (bacteria and
Archaea)
RESULTADOS ESPERADOS
Dadas las pruebas efectuadas por Hernndez et al, evaluando la actividad de
organismos con capacidad de Hidrocarbonoclastas de organismos obtenidos de la
rizosfera de plantas de frijol y maz cultivadas en suelos contaminados con petrleo se
encontraron bacterias pertenecientes a Pseudomonas sp, Agrobacterium sp, y hongos
tales como Trichoderma sp, Mucor sp, Aspergillus sp, fueron los ms eficientes en
degradar compuestos derivados del petrleo en el suelo(Hernndez et all 2003). al
realizar un ensayo de esta naturaleza y empleando los mtodos de identificacin
citados, en especial la tcnica DGGE, en en ensayo de identificacin de
microorganismos que sobreviven en un suelo contaminado, ser necesario implementar
diferentes primers para identificar organismos presentes, ya que no todos son bacterias.
En bacterias el el marcador molecular ms empleado es el opern que codifica para el
ADN ribosomal; en especial la secuencias 16s; esta secuencia pertenece a una zona
muy conservada y que presenta muy pocos cambios. En general, presentan diferencias
entre especies lugares muy especficos; que se pueden considerar como la firma de un
grupo filogentico. Sin embargo, hay que tener en cuenta que en proceso de
amplificacin del ADN obtenido de la muestra del suelo no slo se deben emplear
primer para la subunidad 16s, ya que en eucariotes se tiene la subunidad 18s como
homlogo de esta (Mendoza et all 2016).
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