PRACTICA N 9

ANLISIS MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS

Introduccin
Los alimentos son fcilmente colonizados (contaminados), ya sea de
forma natural, en origen o durante el procesamiento y la manipulacin. La
multiplicacin de los microorganismos en el alimento puede implicar
desde una alteracin inapreciable hasta su deterioro completo y puede
ser, en cualquier caso, una va de transmisin de enfermedades.
Generalmente, cuando hablamos de calidad de un alimento debemos
considerar el aspecto microbiolgico que resulta fundamental porque
influye en la conservacin y la vida til del producto, pero adems, porque
los microorganismos pueden ser causantes de enfermedades conocidas
como enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAs). De tal
manera que, para garantizar inocuidad del alimento, se requiere la
determinacin de criterios para los microorganismos patgenos y/o
toxinas y en algunos casos la utilizacin de microorganismos indicadores
(relacionados con la presencia de un patgeno). Se entiende por criterios
microbiolgicos al valor o gama de valores microbiolgicos establecidos
mediante el empleo de procedimientos definidos, para determinar la
aceptacin o rechazo de un alimento muestreado. Los microorganismos
con respecto a las clases de criterios microbiolgicos, se agrupan como:
Microorganismos de carcter o criterio imperativo, Microorganismos
indicadores de higiene y Microorganismos de alerta.
Los microorganismos de carcter o criterio imperativo, son
aquellos que no deben estar presentes en el alimento o bebida ya que su
presencia representa un dao a la salud o la vida de los consumidores. Su
presencia determinar la eliminacin del alimento de acuerdo a la Norma
que para tal efecto dicte el Ministerio de Salud. Son microorganismos de
carcter o criterio imperativo:
a) Salmonella sp.
b) Clostridium botulinum
c) Listeria monocytogenes
d) Escherichia coli enterohemorrgico O157:H7
e) Brucella melitensis
f) Vibrio cholerae
g) Hongos toxignicos
h) Anaerobios mesfilos/termfilos (conservas)
Los microorganismos indicadores de higiene, son aquellos que no
deben estar presentes en el alimento o bebida en lmites superiores a los
especificados en la NORMA SANITARIA DE CALIDAD SANITARIA E

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INOCUIDAD PARA LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO HUMANO. El

exceso de estos microorganismos indica que las condiciones de higiene
en el procesamiento de los alimentos o bebidas son deficientes; estos
productos deben ser rechazados, debiendo establecerse las medidas
sanitarias que el caso amerite. Son microorganismos indicadores de
higiene:
a) Escherichia coli
b) Staphylococcus aureus coagulasa +
c) Bacillus cereus
d) Clostridium perfringens
Los microorganismos de alerta, son aquellos que al exceder los lmites
especificados requerirn la aplicacin de medidas correctivas para tener
el proceso bajo control. Son microorganismos de alerta los siguientes:
a) Coliformes termotolerantes (fecales)
b) Hongos (Mohos y Levaduras)
c) Aerobios mesfilos/psicrfilos/termfilos
d) Anaerobios mesfilos/termfilos
As tambin, la NORMA SANITARIA establece 17 grupos de alimentos y
bebidas segn su origen y/o tecnologa aplicada en su procesamiento o
elaboracin. Son:
a) Leche y productos lcteos
b) Helados y mezclas para helados
c) Productos grasos
d) Caldos, sopas, cremas, y mezclas deshidratadas
e) Productos elaborados a partir de cereales
f) Azcares y miel
g) Productos de confitera
h) Productos de panadera y pastelera
i) Alimentos de uso infantil
j) Carnes y productos crnicos
k) Productos hidrobiolgicos
l) Huevos y oviproductos
m) Salsas, aderezos, especias y condimentos
n) Frutas y verduras
o) Comidas y platos preparados
p) Bebidas
q) Estimulantes y fruitivos
En esta prctica nos centraremos en algunas bacterias que sirven como
microorganismos indicadores de higiene, as tambin, de aquellas
clasificadas como microorganismos de alerta. En los microorganismos
indicadores de higiene se estudiar a E. coli, como indicador de

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contaminacin fecal, cuya deteccin tiene la ventaja, desde un enfoque

de prevencin de riesgos, de indicar un manejo inadecuado o presencia
de contaminacin. Tambin, su deteccin puede resultar ms sencilla,
rpida y econmica, pudiendo brindar informacin de manera oportuna.
As tambin, se estudiar a los microorganismos de alerta, Coliformes
fecales y aerobios mesfilos, cuya presencia nos dan idea de la calidad
de la materia prima y del proceso de elaboracin del producto, cifras altas
en este recuento pueden indicar un proceso de alteracin del alimento,
aunque no necesariamente hay que relacionarlo con la presencia de
grmenes patgenos.
OBJETIVO

I.

II.

Adiestrar al alumno en la identificacin de microorganismos

relacionados con la contaminacin y deterioro de alimentos.
Adiestrar al alumno en la cuantificacin de la presencia de
microorganismos causantes de contaminacin a travs del NMP y
UFC

MATERIALES
1 alimento de venta pblica no cocinado (hamburguesa, cremas,
verduras, etc.)
Tubos de ensayo con 9 ml con solucin salina al 0.85%
Agar Plate count lquido.
Caldo EC
Caldo Brilla
Placas Petri.
Pipetas de 1 y 10 mL
Tubos con 9 mL de solucin salina estril
Gradillas
Plumn indeleble.
Mechero de alcohol
Encendedor

PROCEDIMIENTO

1. Tomar 10 mL 10 g de la muestra problema segn sea lquida o

slida y transferir a un matraz con 90 mL de solucin salina al 0.85%,
sta constituir la dilucin 10-1.
2. Realizar diluciones seriadas 10 -2, 10-3 y 10-4 en los tubos con
solucin salina estril.
3. Proceder al aislamiento por los mtodos descritos abajo.
A) RECUENTO DE AEROBIOS MESFILOS POR EL METODO DE
DIFUSIN EN PLACA:

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1. Tomar 1 mL de la ltima dilucin (10-4) de la muestra en condiciones

estriles.
2. Destapar con la mano izquierda la placa Petri lo necesario y
depositar el inculo.
3. Colocar la cubierta de la placa Petri.
4. Incorporar 10 a 15 mL del Agar Plate Count mantenidos a 35C,
tapar y realizar movimientos rotatorios a fin de distribuir
homogneamente el inculo.
5. Repetir el mismo procedimiento con la penltima dilucin (10-3).
6. Rotular e incubar a 28 C.
7. Contar el nmero de colonias que aparecen al final de la incubacin.
8. Realizar los clculos UFC para cada dilucin.
9. Realizar la discusin de los resultados obtenidos.

B) RECUENTO
DE
Escherichia
COLIFORMES TOTALES POR EL
PROBABLE ( NMP)

coli Y MICROORGANISMOS
METODO DEL NUMERO MAS

Escherichia coli
1. Tomar 3 cubos con caldo EC e inocular 1 mL de la ltima dilucin a
cada uno, repetir el procedimiento con las otras 2 ltimas diluciones
tomando siempre 3 tubos para cada dilucin, empezando siempre
con la menor dilucin.
2. Rotular los datos en los tubos e incubar a 28 C por 48 horas.
3. Calcular el valor del NMP (Tabla I).
MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES
1. Tomar 3 cubos con caldo BRILLA e inocular 1 mL de la ltima dilucin a
cada uno, repetir el procedimiento con las otras 2 ltimas diluciones
tomando siempre 3 tubos para cada dilucin, empezando siempre
con la menor dilucin.
2. Rotular los datos en los tubos e incubar a 28 C por 48 horas.
3. Verificar este resultado en la tabla I para determinar el nmero
ms probable.
4. Calcular el valor del NMP (Tabla I).
Se considerar como resultado positivo aquellos tubos que presenten
formacin de gas dentro de los tubos durham acompaando el
crecimiento microbiano (turbiedad)
III.

PRESENTACIN DEL INFORME

Realizar la discusin de los resultados del clculo del NMP para el

recuento de E. coli y microorganismos coliformes totales en relacin a los

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Lmites Mximos Permisibles de acuerdo a la clasificacin del alimento

(http://www.digesa.sld.pe/norma_consulta/Proy_RM615-2003.pdf).
IV.

CUESTIONARIO
1. Qu caractersticas presentan los microorganismos del grupo de
coliformes fecales y aerobios mesfilos.
2. Explique en qu consiste el deterioro de los alimentos causado por
Escherichia coli.
3. Mencione las posibles fuentes de contaminacin de los alimentos por
coliformes fecales y aerobios mesfilos antes y despus del proceso
de produccin.
4. Menciones las medidas preventivas necesarias para evitar la
contaminacin microbiana de los alimentos en el proceso de
produccin.

TABLA I
Tabla 1. ndice del NMP para varias combinaciones de resultados
positivos y negativos para 1g de muestra cuando se usan 3 tubos

con alcuotas de 0.1; 0.01 y 0.001g.

Referencia: Official Methods of Analysis of AOAC International, 18 ed. 2005. Chapter 17.3, pag.

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PRACTICA N 10
ANLISIS MICROBIOLGICO DE AGUAS
Introduccin
En el anlisis microbiolgico de aguas se ha sealado la existencia de tres
tipos de bacterias: bacterias autctonas, microorganismos procedentes
del suelo y bacterias que habitan el intestino del ser humano y de otros
animales. La mayora de las bacterias autctonas del agua son bacterias
acuticas gram negativas de los gneros Pseudomonas, Flavobacterium,
etc.
El recuento de grmenes viables que se espera depende de la naturaleza
de la muestra de agua. Comparativamente, los ros sin polucin muestran
recuentos ms bajos. Los recuentos de las aguas abajo de las ciudades
son mucho ms elevados a causa de las descargas de aguas residuales y
de efluentes industriales hacia los ros. Aunque estos recuentos altos de
grmenes viables hacen pensar en la contaminacin del agua y en la
presencia de bacterias diferentes de las acuticas, pero no indican
necesariamente contaminacin por heces, aguas residuales no tratadas,
etc., ya que estas bacterias pueden ser saprofitos del suelo, si bien no son
deseables, pues pueden contribuir a incrementar problemas de alteracin
de los alimentos. La contaminacin fecal del agua se origina por la
presencia de bacterias derivadas del intestino: Escherichia coli,
Streptococcus faecalis y Clostridium perfrigens y, posiblemente,
patgenos intestinales como Salmonella y Vibrio cholerae. Con el objetivo
de determinar la potabilidad de un suministro de agua, es necesario
determinar que no est contaminada por las bacterias patgenas
mencionadas.
OBJETIVO

V.

Adiestrar al alumno en la identificacin de microorganismos

relacionados con la contaminacin del agua potable.
Adiestrar al alumno en la cuantificacin de la presencia de
microorganismos causantes de contaminacin a travs del NMP y
UFC

MATERIALES
Muestras de agua potable y/o riego procedentes de diferentes distritos
Tubos de ensayo con 9 ml de agua peptonada al 0.1%
Agar Plate Count lquido.
Caldo EC
Placas Petri.

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Pipetas de 1 y 10 mL
Gradillas
Plumn indeleble.
Mechero de alcohol
Encendedor

VI.

PROCEDIMIENTO

Gua de Prcticas de Biologa General

4. Tomar 1 mL de la muestra problema y realizar diluciones seriadas 10 1

, 10-2, 10-3 y 10-4 en los tubos con agua peptonada estril.
5. Proceder al aislamiento por los mtodos descritos abajo.
C) RECUENTO DE AEROBIOS MESFILOS POR EL METODO DE
DIFUSIN EN PLACA:
10. Tomar
1 mL
de la ltima dilucin (10 -4) de la muestra en
condiciones estriles.
11. Destapar con la mano izquierda la placa Petri lo necesario y
depositar el inculo.
12. Colocar la cubierta de la placa Petri.
13. Incorporar 10 a 15 mL del Agar Plate Count mantenidos a 35C,
tapar y realizar movimientos rotatorios a fin de distribuir
homogneamente el inculo.
14. Repetir el mismo procedimiento con la penltima dilucin (10-3).
15. Rotular e incubar a 28 C.
16. Contar el nmero de colonias que aparecen al final de la incubacin.
17. Realizar los clculos UFC para cada dilucin.
18. Realizar la discusin de los resultados obtenidos.

D) RECUENTO DE Escherichia coli POR EL METODO DEL NUMERO

MAS PROBABLE ( NMP)
Escherichia coli
4. Tomar 3 cubos con caldo EC e inocular 1 mL de la ltima dilucin a
cada uno, repetir el procedimiento con las otras 2 ltimas diluciones
tomando siempre 3 tubos para cada dilucin, empezando siempre
con la menor dilucin.
5. Rotular los datos en los tubos e incubar a 28 C por 48 horas.
6. Calcular el valor del NMP (Tabla I).

Cuestionario

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Mencione los diferentes tratamientos utilizados en la potabilizacin del

agua.
Qu consecuencias tendra utilizar agua contaminada en la
elaboracin de los alimentos?