Manual de Prácticas de Laboratorio

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE QUERTARO.
FACULTAD DE QUMICA
MANUAL DE PRCTICAS
LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR.
Dr. Gerardo M. Nava Morales
SEMESTRE 4TO
UNIVERSIDAD AUTNOMA DE QUERTARO.

FACULTAD DE QUMICA
LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR.
Dr. Gerardo Nava
NDICE
MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO.
BIOLOGA CELULAR.
1. PRCTICA NO. 1 RECOMENDACIONES GENERALES DE TRABAJO EN EL

LABORATORIO. SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
MOLECULAR.
2. PRCTICA NO. 2 BIOSEGURIDAD
3. PRCTICA NO. 3 MANEJO Y USO DE MICROSCPIO PTICO B)
MICROSCOPIA ELECTRNICA (TERICA).
4. PRCTICA NO. 4 INICIO DE EXPERIMENTO. CULTIVO BACTERIANO:
PROTOCOLO, MUESTREO Y PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA.
5. PRCTICA NO. 5 ELECTROFORESIS DE PROTENA Y DE CIDOS
NUCLICOS.
6. PRCTICA NO. 6 EXTRACCIN DE ADN GENMICO (CUANTIFICACIN,
PREPARACIN GEL DE ELECTROFORESIS).
7. PRCTICA NO. 7 PCR PUNTO FINAL.
8. PRCTICA NO. 8 PURIFICACIN DE CIDOS NUCLICOS.
9. PRCTICA NO. 9 DIGESTIN ENZIMTICA.
Evaluacin:
Asistencia mnima para aprobar el curso: 80%
Examen final 50%
Bitcora: 50% (tareas, discusin, puntualidad proyecto final y asistencia).
Material Didctico:
Libros
Ttulo: The Cell: A Molecular Approach
Autores: Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman
Edicin: 6
Editorial: Sinauer Associates, Incorporated (2013).
ISBN: 0878939644, 9780878939640
Ttulo: Evolution
Autores: Nicholas H. Barton, Derek E.G. Briggs, Jonathan A. Eisen, David B. Goldstein,
Nipam H. Patel.
Edicin: 1
Editorial: CSH Press (2007).
ISBN: 978-087969684-9
Revistas
Nature Cell Biology
http://www.nature.com/ncb/index.html
Nature Reviews Molecular Cell Biology
http://www.nature.com/nrm/index.html
Nature Reviews Micr obiology
http://www.nature.com/nrmicro/index.html
PRCTICA N1. Recomendaciones generales de trabajo en el laboratorio. Seguridad

en el laboratorio de Microbiologa Molecular.
INTRODUCCIN
Internacionalmente existe un inters por la seguridad, en particular, la seguridad biolgica,
por ello distintas organizaciones gubernamentales y no gubernamentales, extranjeras y
nacionales han desarrollado leyes y normas en este aspecto. En esta clase se indican las
pautas bsicas destinadas a prevenir factores de riesgo laborales procedentes de agentes
biolgicos, fsicos y/o qumicos, relacionadas con el trabajo que en l laboratorio se
realiza. Por lo tanto, el personal involucrado en los procesos que se lleven a cabo, deber
incorporar estas normas en todos los procedimientos que se realicen. Es importante
resaltar que su puntual complimiento no elimina el riesgo de un accidente, sin embargo si
lo previene en gran medida, por lo que tambin es necesario sealar los procedimientos a
seguir en caso de que ocurra.
OBJETIVO
Establecer las pautas para el manejo responsable de los reactivos, equipo y materiales
del laboratorio as como de los procedimientos que competan a este espacio.
FUNDAMENTO DE LA PRCTICA. Definido en clase y desarrollado por el
alumno.
MATERIALES
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE EMERGENCIA.
REGLAMENTO INTERNO (DEPARTAMENTO).
REGLAMENTO INTERNO (LABORATORIO).
MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
PROCEDIMIENTO. Colocar los siguientes lineamientos al inicio de la bitcora

del estudiante.
El alumno deber leer la prctica completa y discutirla con el profesor antes de la
realizacin de la misma.
Los tiles y objetos personales debern ser colocados en el estante designado para
ellos.
El material con el que se trabajar deber estar perfectamente limpio antes y despus
de la prctica.
Antes de preparar las mezclas de reaccin en microtubos o tubos, se debern
etiquetarse apropiadamente cada uno de los tubos con marcador indeleble.
Por ningn motivo debe alterarse el orden de adicin de reactivos en la prctica.
Los reactivos se deben mantener tapados para evitar contaminacin, vaporizacin de
los mismos, o ambos.
Debe utilizarse slo la cantidad requerida de reactivos. No est permitido regresar
excedentes de reactivo al frasco de donde se extrajo el mismo.
8. Revisar los manuales de seguridad de laboratorio. Con el objetivo de conocer el

manejo de reactivos, materiales y sustancias con las que se trabaja.
9. Averiguar las propiedades fsicas y qumicas de todas las sustancias que se van a
utilizar en un protocolo antes de iniciar. Identificar las potencialmente nocivas para la
salud.
10. Conocer los riesgos y el manejo adecuado de sustancias que se utilizarn durante el
desarrollo de las prcticas (consultar manual de seguridad).
11. Evitar el contacto de sustancias con la piel; usar bata y guantes para proteger la ropa
y el cuerpo en todo momento.
12. Si entra en contacto con alguna sustancia peligrosa, contactar inmediatamente con el
encargado de la seguridad en el laboratorio.
13. Informarse y acatar los procedimientos para desechar sustancias qumicas y
biolgicas.
14. Manejar con cuidado los cidos y bases concentrados, utilizar lentes de proteccin y
guantes apropiados, y eventualmente una pantalla para proteger toda la cara, recordar
que siempre se debe adicionar cido al agua y no al revs, para evitar la proyeccin
del lquido.
15. Nunca pipetear soluciones con la boca, siempre utilizar un bulbo o una propipeta.
16. Manejar los solventes dentro de una campana de extraccin.
17. Tomar precauciones al manejar las fuentes de poder y cmaras de electroforesis para
evitar incendios y choques elctricos.
18. Los hornos de microondas y las autoclaves deben ser manejados con cuidado, en
particular, no cerrar completamente las tapas de las botellas.
19. Tener cuidado al manejar herramientas cortantes como escalpelos, agujas, pipetas
Pasteur, etc.
DISCUSIN
CONCLUSIONES
PRINCIPALES FUNDAMENTOS TCNICOS (principios)
1. Qu es la bioseguridad?
2. Indica 3 normas de seguridad e higiene para un laboratorio de microbiologa y
discute la importancia de cada una
3. Realiza un esquema del laboratorio en el que ubiques las zonas de seguridad y
controles maestros de suministro de servicios dentro del laboratorio. Pgalo al inicio
de tu bitcora del laboratorio.
Cuidados personales
4. Enumera el material personal indispensable que debes tener en cada sesin de
laboratorio.
5. Cmo debes tener el cabello y las uas al trabajar en un laboratorio de
microbiologa? Por qu?
Sobre el procedimiento:
6. Enumera las actividades que debes realizar antes y despus de cada sesin de
prctica.
7. Indica los pasos a seguir cuando un cultivo bacteriano se derrama sobre una
superficie.
8. Indica el lugar en que se deben depositar los siguientes materiales para su
desecho:
a) Guantes y cofias
b) Colorantes
c) Objetos de vidrio rotos
d) Cajas de Petri de plstico
9. Definir los siguientes conceptos:
a) Esterilizacin
b) Desinfeccin
10. Describe las caractersticas principales en una bitcora del estudiante.
BIBLIOGRAFA
CASTELLANOS B. CARLOS. 2010. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE

BIOSEGURIDAD. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Mxico DF.
Encontrado en
https://www.biomedicas.unam.mx/_administracion/_unidades_apoyo_inst/manual_
bioseguridad.pdf
OMS 2005. MANUAL DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO. Tercera

edicin. Ginebra. Encontrado en
http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11
SP.pdf
REYES G. JUAN PLABLO.2009. Manejo de residuos biolgico-infeccionsos en el

INMEGEN. Iinstituto Nacional de Medicina Genmica. Mxico DF. Encontrado en
http://www.inmegen.gob.mx/tema/cms_page_media/166/manual_residuos.pdf
RICHMOND JY, MCKINNEY RW. 2002. Bioseguridad en laboratorios de

microbiologa y biomedicina. 4 edicin, versin espaola. Atlanta: Centers for
disease control, national institutes of health.
UNAM 1989. REGLAMENTO DE SEGURIDAD Y COORDINACIN EN MATERIA

DE INVESTIGACIN PARA LA SALUD EN LA UNAM, CAPTULO IV. Universidad
Nacional Autnoma de Mxico. Mxico DF. Encontrado en
http://www.ordenjuridico.gob.mx/Federal/OA/UNAM/Reglamentos/REGLAMENTO
%2013.pdf
PRCTICA NO. 2 BIOSEGURIDAD

INTRODUCCIN.
La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) anima a los pases a reconocer conceptos
en materia de seguridad biolgica y sobre todo en aplicarlos, pudiendo elaborar cdigos
de prcticas relacionadas con la manipulacin sin riesgo de patgenos, adems se
subraya la importancia de la responsabilidad del personal.
OBJETIVO
Definir los conceptos y requisitos de bioseguridad necesarios para el buen funcionamiento
del Laboratorio de microbiologa de los alimentos, facilitando la identificacin de riesgos
relacionados con el manejo de agentes infecciosos, el manejo, transporte y desecho de
muestras parcialmente infecciosas as como la determinacin de los procesos que realiza
el personal involucrado para la prevencin y situaciones de emergencia de dicho espacio.
FUNDAMENTO. Definido en clase y desarrollado por el alumno.
Definiciones de la OMS
o Bioseguridad.
o Riesgo biolgico (grupos).
o Barreras de bioseguridad.
o Niveles de bioseguridad.
o Cuadro de la relacin entre los grupos de riesgo, las prcticas y el equipo.
o Cuadro de los diferentes niveles de bioseguridad. Trabajo que se realiza y
manejo.
DISCUSIN
CONCLUSIONES
PRINCIPALES FUNDAMENTOS TCNICOS (principios).
Bioseguridad en el laboratorio.
BIBLIOGRAFA
CASTELLANOS B. CARLOS. 2010. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE

BIOSEGURIDAD. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Mxico DF.
Encontrado en
https://www.biomedicas.unam.mx/_administracion/_unidades_apoyo_inst/manual_
bioseguridad.pdf
OMS 2005. MANUAL DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO. Tercera

edicin. Ginebra. Encontrado en
http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11
SP.pdf
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 5th edition. U.S.

Deparment of Health un Human Services. Public Health Service. Rervised
December 2009.
PRCTICA N3. Primera Parte. MANEJO Y USO DE MICROSCPIO PTICO.

INTRODUCCIN.
El progreso de la ciencia depende de la formulacin de ideas y del desarrollo de las
herramientas de trabajo. El microscopio ptico ha sido durante muchos aos la principal
herramienta en las reas de la biologa. Muchas de las estructuras y eventos biolgicos
ms interesantes el ojo humano no las puede percibir que tiene una resolucin de cerca
de 100 m. En el siguiente cuadro solamente la clula vegetal est escasamente dentro
de nuestra resolucin.
El microscopio ptico tiene un lmite resolucin de cerca de 200 nm (0.2 m). Este lmite
se debe a la longitud de onda de la luz (0.4 -0.7 m). Las clulas observadas bajo el
microscopio ptico pueden estar vivas o fijadas y teidas.
OBJETIVO.
Familiarizarse con el manejo correcto del microscopio ptico, identificando, en primer
lugar, cada una de las partes del microscopio, aprendiendo a enfocar una preparacin con
las normas adecuadas y precauciones del uso del aparato. En segundo lugar, se
realizarn preparaciones sencillas para observar estructuras biolgicas que permitir la
observacin utilizando distintos aumentos.
Partes de un microscopio ptico.
o Sistema ptico
OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo.
OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta.
CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin.
DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
o Sistema mecnico
SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin.
CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular
REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los
objetivos.
TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que
consigue el enfoque correcto.
MATERIALES
Microscopio ptico
Muestra de tierra con agua.
PROCEDIMIENTO
Manejo del microscopio ptico.
1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina
completamente.
2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas.

3. Para realizar el enfoque:
a. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el
tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a
travs de los oculares, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en
la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos.
b. Proceder a mirar a travs de los oculares, ir separando lentamente el
objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se peuda
observar nitidez en el enfoque de la muestra girar el micromtrico hasta
obtener un enfoque fino.
4. Pasar el siguiente objetivo. La imagen debera de estar ya casi enfocada y suele
ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al
cambiar el objetivo se pierde por completo la imagen, es preferible volver a enfocar
con el objetivo anterior y repetir la operacin. El objetivo 40x enfoca a muy poca
distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances:
a. Incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y
manchar con el aceite de inmersin o contaminar.
Mantenimiento y precauciones
1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en
posicin
2. de observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no sobresale
del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.
3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy
suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de ptica.
4. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico,
micromtrico,platina, revlver y condensador).
5. El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a
la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca
de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est
observando a travs del ocular.
6. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn
lquido, secarlo con un pao. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pao
humedecido en xilol.
RESULTADOS/DISCUSIN.
CONCLUSIONES.
PRINCIPALES FUNDAMENTOS TCNICOS (describir los principios de las
tcnicas discutidas y empleadas en la prctica).
Tincin: Una tincin o coloracin es una tcnica auxiliar para mejorar el contraste en la
imagen vista al microscopio, su objetivo es resaltar estructuras en tejidos, poblaciones
celulares o incluso para resaltar organelas dentro de clulas individuales. Dada la
especificidad del colorante (su grupo activo), este se une de manera selectiva a un
sustrato (ADN, protenas, lpidos, carbohidratos), lo que permite cualificar o cuantificar la

presencia de un compuesto determinado.
Aceite de inmersin: A diferencia del aire, el aceite de inmersin (aceite de cedro, por
ejemplo) tiene un ndice de refraccin similar al del vidrio del cubre objetos (1.5150). Al
colocar aceite de inmersin entre el lente frontal del objetivo (diseado para usarse con
aceite de inmersin) y el cubre objetos, el rango angular de los rayos difractados
capturados por los lentes se incrementan y, en efecto, incrementa la apertura numrica
del objetivo.
BIBLIOGRAFA.
COOPER G. HOUSMAN R. 2004. Coopers: La clula. Editorial Marban. Madrid,

Espaa.
CURTIS H., BARNES., SCHNEV A. 2008. Biologa. Panamericana. 7 edicin.
Buenos Aires.
NAAB O., TORROBA C. Microscopa. 2007. Facultad de Agronoma, UNL. Mxico.
DE ROBERTIS (h.), HIB, PONZIO. 2005. "Biologa Celular y Molecular de
DeRobertis".
ROBINSON et. al. 1987. Methods of preparation for electron microscopy. An
introduction
for
the
biomedical
sciences.
Springer-Verlag.
Berlin.
PRCTICA 3 Segunda parte: TIPOS, MANEJO Y USO DE MICROSCOPIO

ELECTRNICO.
INTRODUCCIN
Los microscopios electrnicos llevan casi 50 aos disponibles comercialmente y existen
en la actualidad en todo el mundo varias decenas de miles, siendo utilizados en muy
diferentes campos. El primer microscopio electrnico fue un microscopio de transmisin,
sin embargo fue el microscopio de barrido el que realmente revolucion la microscopa
electrnica. Actualmente existe toda una familia de microscopios electrnicos surgidos
tras las numerosas investigaciones llevadas a cabo en los ltimos veinte aos. Estos
aparatos combinan la posibilidad de obtener imgenes de gran resolucin con el anlisis
qumico de pequeas reas del material, por ello se ha incrementado notablemente el
campo de aplicacin de esta tcnica. Dado el gran abanico de posibilidades es necesario
conocer las ventajas e inconvenientes de cada uno de los microscopios para as decidir
cul es el ms apropiado para nuestros objetivos (geologa, biologa, medicina,
tecnologa, etc.).
OBJETIVO
Conocer los fundamentos de la microscopa electrnica, los tipos de microscopios
empleados, as como el manejo y uso adecuados. Comprender las ventajas de su
utilizacin para el anlisis y resolucin de problemas histolgicos, citolgicos y
moleculares.
MATERIALES*
PROCEDIMIENTO (De acuerdo al tipo de microscopio. A continuacin se
describir con el microscopio electrnico de barrido).
1. Fijacin del material a observar. La fijacin es la operacin destinada a matar
las clulas lo ms rpidamente posible y conservarlas en el estado ms
parecido al que tenan mientras estaban vivas.
2. Cortes de muestras.
a. Se pueden realizar cortes a mano libre o a mano alzada: Se realizan
con hoja de afeitar o navaja.
b. Cortes con microtrmo de mano: se realiza con una navaja afilada
(microtrmo), realizando un corte de limpieza y luego los definitivos.
3. Preparados.
a. Consiste en colocar entre el portaobjetos y el cubre-objetos un medio
apropiado para la observacin y conservacin del mismo.
b. Preparados de contraste: se utilizan segn el colorante que tie las
distintas partes del objeto creando un gran contraste.
c. Preparados de fase: No reciben coloracin y es necesario observarlas
con el microscopio de contraste de fase.
RESULTADOS/DISCUSIN
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA

Espaa.
CURTIS H., BARNES., SCHNEV A. 2008. Biologa. Panamericana. 7 edicin.
Buenos Aires.
NAAB O., TORROBA C. Microscopa. 2007. Facultad de Agronoma, UNL. Mxico.
DE ROBERTIS (h.), HIB, PONZIO. 2005. "Biologa Celular y Molecular de
DeRobertis".
ROBINSON et. al. 1987. Methods of preparation for electron microscopy. An
introduction for the biomedical sciences. Springer-Verlag. Berlin.
PRCTICA N4. INICIO DE EXPERIMENTO. CULTIVO BACTERIANO (Protocolo,

muestreo y procesamiento de la muestra).
INTRODUCCIN
En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas con
otros tipos de microorganismos. Los cultivos de estas mezclas se llaman por ello cultivos
mixtos. Sin embargo, el conocimiento de los microorganismos se consigue mediante el
estudio de cepas aisladas, cultivadas en el laboratorio en cultivos puros (o axnicos). En
ocasiones el estudio molecular conduce a la caracterizacin de los microorganismos, an
en poblaciones mixtas. No obstante la identificacin bacteriana y la caracterizacin
completa, solo es posible tras el aislamiento de la bacteria y la obtencin de cultivos
puros. Por ello el primer problema es su aislamiento del resto de lis microorganismos
presentes tambin en la muestra. Una vez que se ha logrado el aislamiento, es posible
obtener la bacteria de inters en un cultivo puro.
OBJETIVOS
Conocer las diferentes tcnicas de aislamiento en medios de cultivo slido para la
obtencin de cultivos puros de bacterias.
Preparar medios de cultivos de uso general, diferenciales y selectivos para el cultivo de
diferentes especies bacterianas.
Cuantificar la carga total bacteriana (por cm2) e identificar molecularmente los
microorganismos presentes.
MATERIALES.
1 Mechero
1 Asa bacteriolgica estril.
100ml de solucin salina estril.
2 Hisopos.
4 Tubos de ensayo de 9ml.
4 Cajas Petri
Medio de cultivo (Agar).
Alcohol 70%
Guantes
Lentes
Agar soya tripticasa.
Micropipeta (10-20l)
Puntas (20l)
PROCEDIMIENTO
Preparacin de medios de cultivo.
o Agar soya tripticasa:
Medios de cultivo para identificacin (siembra).
1. Con asa bacteriolgica estril, trabajar siempre a la llama del mechero, tomar una
mnima muestra.
2. Sembrar con cuidado sobre la superficie tersa del medio.
3. Incubar las placas en posicin invertida a 37C en aerobiosis.
Al trmino de 18-24 horas de incubacin, examinar el cultivo.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Muestreo de superficies, alimento o muestras biolgicas.

o Diluciones decuples seriadas.
Realizar el cdigo de identificacin de las muestras a tomar (etiquetar el material a
utilizar).
Colocar el hisopo en la solucin salina, de tal manera que quede sumergido.
Sacar el hisopo de la solucin salina y pasarlo sobre la superficie (alimento)
seleccionada para muestrear.
Colocar el hisopo dentro de un tubo de ensayo con 9ml de solucin salina.
Agitar el tubo para que la solucin sea homogeneizada.
Realizar diluciones a partir de la solucin anterior, quedando de la siguiente manera:
a. Tomar 1ml de la primera solucin (se denominar -1) y pasarlo a otro tubo de
ensayo con 9ml de solucin salina estril (este segundo tubo se denominar 2) quedando al final 10ml de solucin.
b. Homogeneizar.
c. Tomar 1ml de la dilucin -2 y pasarlo al tubo de ensayo para la dilucin -3
(repetir el punto a).
d. Homogeneizar.
e. Tomar 1ml de la dilucin -3 y pasarlo al tubo de ensayo para la dilucin 4.
f. Homogeneizar.
7. Tomar una caja Petri preparada con Agar Soya Tripticasa y dividir la superficie
(tapa) en 4 partes iguales (utilizar un marcador indeleble), de tal manera que cada
cuadrante represente cada una de las diluciones preparadas en el paso nmero 6.
8. Conteo por microdilucin: Tomar una micropipeta y colocar 10l de cada dilucin
sobre la superficie del agar, respetando el cuadrante correspondiente.
9. Esperar la absorcin de las soluciones en el agar para evitar que se mezclen las
distintas diluciones.
10. Repetir el paso 8 por triplicado.
11. Colocar en incubacin a 37C.
12. Observar y anotar lo sucedido a las 18-24 horas de incubacin. (Color, forma,
textura, brillo, niveles)
1. Siembra directa
1. Realizar el cdigo de identificacin de las muestras a tomar (etiquetar el material a
utilizar).
2. Colocar el hisopo en la solucin salina, de tal manera que quede sumergido.
3. Sacar el hisopo de la solucin salina y pasarlo por la superficie seleccionada para
muestrear.
4. En una caja Petri con agar, pasar el hisopo sobre la superficie, de tal manera que
quede sembrada la muestra tomada (en estra).
5. Cerrar la caja de Petri y colocar en incubacin a 37C.
6. Observar y anotar lo sucedido a las 18-24 horas de incubacin. (Color, forma,
textura, brillo, niveles).
RESULTADOS/DISCUSIN
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
COOPER G. HOUSMAN R. 2004. Coopers: La clula. Editorial Marban.

Madrid, Espaa.
MOORE G., GRIFFIN C. 2002. A comparison of Surface sampling methods for
detecting coliforms and food contact Surface. Food microbiology Vol 19.
PRCTICA N 5. ELECTROFORESIS DE PROTENA Y DE CIDOS NUCLICOS.

INTRODUCCIN
El trmino electroforesis se usa para describir la migracin de una partcula cargada bajo
la influencia de un campo elctrico. Muchas molculas importantes biolgicamente
(aminocido, pptidos, protenas, nucletidos, cidos nucleicos... poseen grupos
ionizables y existen en solucin como especies cargadas, bien como cationes, o bien
como aniones. Estas especies cargadas se van a separar en funcin de su carga cuando
se aplica un voltaje a travs de los electrodos.
La electroforesis en gel de agarosa es de las ms utilizadas para analizar y caracterizar
cidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz
molecular y permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. As,
molculas de DNA de diferente tamao van a emigrar de forma distinta en una
electroforesis en gel de agarosa. Adems, si en dicha electroforesis se aplican
marcadores de peso molecular (fragmentos de ADN de tamao conocido) se puede
calcular el tamao aproximado del DNA en estudio.
OBJETIVO
Comprender el fundamento terico de esta tcnica y sus aplicaciones, llevando a cabo la
separacin electrofortica en gel de agarosa de ADN.
MATERIALES
Guantes
Buffer TBE 1X
Reactivo
Tris
cido Brico
EDTA
0.5M,
pH=8
H2O destilada.
1 lt
108g
55g
40ml
10L
1.08 kg
550g
400ml
20 L
2.16 kg
1.1kg
800ml
Cbp 1L
Cbp 10L
Cbp 20L
Matraz Erlenmeyer de 150ml

Micropipeta de 2 l y 20 l
Agua destilada
Alcohol 70%
Agarosa
Puntas (10 l y 20l).
Cmara de electroforesis.
Fuente de poder.
Peine de 14 pozos.
Buffer de carga
Bromuro de etidio.
Transiluminador ultravioleta (MiniBis)
Sanitas.
Marcador indeleble.
PROCEDIMIENTO
2. Preparacin de gel de agarosa.
1. USAR GUANTES
2. Pesar agarosa para preparar geles a 2 condiciones: a) 1 % y b) 2% en 35ml de
buffer TBE.
3. Colocar la agarosa en matraces de 100ml.
4. Adicionar 35ml de buffer TBE a cada matraz.
5. Homogeneizar.
6. Calentar a ebullicin hasta observar una solucin incolora y homognea.
7. Con precaucin retirar el matraz caliente y templar (no enfriar ya que inicia el
proceso de polimerizacin).
8. Agregar 2l de bromuro de etidio.
9. Homogeneizar.
10. Verter sobre la cmara de electroforesis horizontal.
11. Colocar el peine (para formar los micropozos, en dnde irn las muestras).
12. Esperar de 15-30 minutos para la polimerizacin.
13. Con cuidado quitar el peine del gel.
3. Electroforesis de ADN
1. Llenar la cmara de electroforesis hasta el nivel MAX. con buffer TBE de tal
manera que cubra la superficie del gel de agarosa.
2. Diluir las muestras con buffer de carga.
3. Con una micropipeta cargar en el primer pozo el Marcador de Peso Molecular y
posteriormente las muestras y colocarlas en los siguientes pozos.
4. Colocar la tapa de la cmara de electroforesis para que quede correctamente
ensamblada.
5. Conectar a la fuente de poder.
6. Encender la fuente de poder, determinar los parmetros de Voltaje y Tiempo
segn lo establecido por el profesor.
7. Al finalizar, poner STOP a la fuente de poder y apagar.
8. Con cuidado retirar el gel de la cmara de electroforesis
9. Colocar el gel en la placa del transiluminador ultravioleta (MiniBis).
10. Seguir las indicaciones para el anlisis de las bandas presentes en el gel.
11. Una vez obtenida la evidencia del gel, desechar ste correctamente (bolsa roja).
4. Preparacin
de
PROCEDIMIENTO).
Gel separador 10%
Agua destilada (mL)
Tris-HCl 1.5 M pH 8,8(mL)
Acrilamida/Bisacrilamida
gel
4.04
2.5
3.3
de
poliacrilamida
(MATERIALES
Gel concentrador 10%

Agua destilada (mL)
Tris-HCl 0.5 M pH 6,8(mL)
Acrilamida/Bisacrilamida
3.05
1.25
0.65
30%(mL)
SDS 10% (L)
TEMED (L)
Persulfato de amonio 10% (L)
Persulfato de amonio:
100mg
Persulfato de
amonio
1ml
Agua destilada
Mantener en refrigeracin
mximo 3 das.
Buffer de carga SDSPAGE
(solucin
concentrada 2x):
10 ml Tris-HCl 0.5 M pH
6,8(mL)
16 ml Solucin de SDS
10%
50 mg Azul de bromofenol,
12 ml Glicerol
4 ml Agua destilada.
Mantener a temperatura
ambiente
(<2
meses).
Agregar 0.2mL de 1mercaptoetanol a 4.2mL.
TBS 10
2.42 g de Tris-HCl (20 mM)
8 g de NaCl (137 mM)
Ajustar el pH a 7.6
Aforar a 1 litro
100
20
40
30%(mL)
SDS 10% (L)
TEMED (L)
Persulfato de amonio 10% (L)
50
4
40
Solucin de SDS 10%:

1g
Duodecilsulfato de
sodio,
Disolver en 10ml de agua.
Guardar en botella de vidrio
a temperatura ambiente.
Buffer de corrida 10x

30 g Tris Base
14.4 Glicina
10g
SDS
Aforar a 1 litro con agua
desionizada
Solucin Fijadora
Solucin de desteido
500 ml
Metanol
70 ml cido actico glacial
430 ml
Agua
destilada.
200 ml
Metanol
100 ml
Etanol
50 ml cido actico
650 ml agua, guardar a
temperatura ambiente.
TBS-Tween 20 0.05%
1.0 ml Tween 20 en 1000 ml
de TBS.
5. Electroforesis de protena.
Preparacin de muestras.
1. A partir de la extraccin con buffer de lisis RIPA
2. Calcular la cantidad de muestra de acuerdo a la concentracin de protena deseada
previamente cuantificada con RA+S, RB.
3. A la cantidad de muestra requerida se ajusta con RIPA y se agrega la misma
cantidad de Loading Buffer con B.mercapto (950 ul LB + 50ul BM).
4. Dar un spin, calentar las muestras de 80-85 (realmente no hay diferencia) 5 minutos y
dar spin.
5. Cargar cada muestra en su pozo correspondiente del gel (se puede usar la gua para
cargar correctamente en cada pozo y evitar que se salga la muestra, se puede cargar
de 20-30 ul por muestra)
6. Usar marcador de peso molecular de 10-15 ul (se recomienda para los geles de menor
concentracin usar 10ul y aumentar cantidad en geles de mayor concentracin).
Electroforesis
1. Primer tiempo a 100 volts 30 minutos (asegurarse que estn siempre en la misma
polaridad)
2. Segundo tiempo para un gel de 10% 100 volts 2 hrs y 150 v 15 minutos.
6. Fijacin de las protenas
Solucin Fijadora
70ml Metanol
70 ml cido actico glacial
430ml Agua destilada.
1. Retirar el gel de los vidrios y colocarlo en un recipiente hermtico de plstico de un
tamao adecuado (12-15 cm x 12-15 cm).
2. Colocar aproximadamente 15 ml de solucin fijadora, cubriendo completamente el
gel, incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
3. Pasar a la tincin del gel.
7. Tincin de gel (azul de Coommassie)
Solucin de teido
1. En un recipiente hermtico de plstico, limpio, colocar el gel y aadir 50 mL de la
solucin de tincin (azul de comassie)
2. Incubar en agitacin a 22C durante 1 hora.
3. Desechar correctamente la solucin de teido. Tener cuidado de NO tirar el gel.
8. Visualizacin del gel el transiluminador.
9. Desteido del gel.
Solucin de desteido
200 ml Metanol
100 ml Etanol
50 ml cido actico
659ml agua destilada
Guardar a temperatura ambiente.
1. Colocar de 10-15ml de solucin de desteido en agitacin a temperatura ambiente
durante 10 minutos.
2. Repetir el paso uno 5 veces hasta que aparezcan las bandas teidas de azul y el
fondo casi transparente.
RESULTADOS/DISCUSIN
CONCLUSIONES

TBE (ingredientes):
AGAROSA:
TINCIN DE GEL CON BROMURO DE ETIDIO, O SYBR Green (Gold)
BIBLIOGRAFA
COOPER G. HOUSMAN R. 2004. Coopers: La clula. Editorial Marban.
Madrid, Espaa.
GREEN M., SAMBROOK. 2012. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory. 4th edition. New York, USA.
ONDARZA R., Biologa Moderna. 2002. Trillas. 10 edicin. Mxico.
MANIATIS T., FRITSCH, E., SAMBROOK J. 1982. Molecular cloning, a
laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. New York, USA.
WATSON J., BAKER T., BELL S., LEWIS A. 2007. Molegular biology of the
gene. Benjamin Cummings. 6th edition. USA.
PRCTICA N6. EXTRACCIN DE ADN

PREPARACIN, GEL DE ELECTROFORESIS).
GENMICO
(CUANTIFICACIN,
INTRODUCCIN
La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayora
de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN.
En este caso, los mtodos de extraccin permiten obtener cidos nucleicos purificados a
partir de diversas fuentes para despus realizar anlisis especficos de modificaciones
genticas mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza
de los cidos nucleicos son dos de los elementos ms importantes en ese tipo de
anlisis. Si se desea obtener cidos nucleicos muy purificados, que no contengan
contaminantes inhibidores, es preciso aplicar mtodos de extraccin adecuados.
Dada la gran variedad de mtodos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos
existentes, la eleccin de la tcnica ms adecuada suele efectuarse conforme a los
criterios siguientes:
cido nucleico diana;
Organismo fuente;
Material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.);
Resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificacin);
Uso posterior (PCR, clonacin, etiquetado, transferencia, RT-PCR, sntesis de
ADNc, etc.).
OBJETIVO
A partir de la muestra obtenida en la prctica # 4, realizar la extraccin del ADN genmico
con el uso del KIT (QUIAGEN) y del mtodo de FENOL-CLOROFORMO, comprendiendo
los fundamentos que implican el aislamiento y purificacin del ADN genmico de
bacterias. As mismo determinar la calidad y el rendimiento de la extraccin a travs de
una electroforesis en gel de agarosa.
MATERIALES
Guantes
Buffer TBE 1X
Reactivo
Tris
cido Brico
EDTA
0.5M,
pH=8
H2O destilada.
1 lt
108g
55g
40ml
10L
1.08 kg
550g
400ml
20 L
2.16 kg
1.1kg
800ml
Cbp 1L
Cbp 10L
Cbp 20L

Agua destilada
Alcohol 70%
Agarosa
Puntas (200 l y 1000l).

Fuente de poder.
Peine de 14 pozos.
Buffer de carga
Bromuro de etidio.
Transiluminador
(MiniBis)
Sanitas.
Marcador indeleble.
ultravioleta
KIT (QUIAGEN DNeasy Blood &

Tissue Handbook cat. 69506)
Tubos ependorf 1.5mL.
Minicentrifuga
Vrtex.
PROCEDIMIENTO
10. Extraccin y purificacin de ADN genmico (KIT QUIAGEN)
1. Centrifugar 1.5ml de cultivo bacteriano a 8000 rpm durante 8 minutos.
2. Desechar el sobrenadante y agregar 200l de Buffer ASL.
3. Homogeneizar en el vrtex a mxima velocidad hasta disolver el pellet formado.
4. Centrifugar 1000rpm durante 1 minuto.
5. Colocar en el termoblock a 95C durante 10 minutos.
6. Agregar 25 l de proteasa K y agitar con la punta.
7. Agregar :::: l de buffer AL.
8. Homogeneizar en el vrtex.
9. Colocar en el termoblock a 56C durante 15 minutos.
10. Agregar 200 l de etanol y homogeneizar en el vrtex.
11. Vaciar a columnas y centrifugar a 8000 rpm durante 4 minutos.
12. Pasar el sobrenadante a un tubo contenedor.
13. Agregar 500 l de buffer AW1.
14. Centrifugar a 8000rpm durante 1 minuto (si no pasa toda la solucin, repetir).
15. Agregar 500 l de buffer AW2.
16. Centrifugar 13,500rpm durante 3 minutos.
17. Desechar el lquido, secar el tubo contenedor sobre una sanita y volver a colocarlo.
18. Centrifugar a 13,500 rpm durante 1 minuto para secar la columna.
19. Pasar la columnaa un tubo eppendorf.
20. Agregar 200 l de buffer AE.
21. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente.
22. Centrifugar 11,000 rpm durante 2 minutos.
23. Cuantificar el ADN recuperado o guardar a -20C.
24. Realizar electroforesis del ADN recuperado.
25. Limpiar con etanol la centrifuga y el rea de trabajo.
11. Extraccin y purificacin de ADN genmico (Fenol-cloroformo).
1. Iniciar con 100-200l de volumen (de ser necesario, adicionar agua estril).
2. Aadir a la muestra de ADN 1 volumen de fenol:cloroformo (1:1) y mezclar por
inversin 3 veces.
3. Centrifugar a 12,000rpm durante 10 minutos.
4. Tomar la fase superior en un tubo nuevo sin tocar la interfase.
5. Agregar 1 volumentes de etanol fro (-20C) y 1/10 de acetato de sodio 3M.
6. Agitar y colocar a -20C durante 30 minutos.
7. Centrofugar a 12,000 rpm durante 0 minutos y decantar.

8. Lavar pastilla con 300-500l de etanol al 70%.
9. Centrifugar a 12,000 rpm durante 10 minutos y decantar.
10. Lavar pastilla con 100 l de etanol al 100%.
11. Centrifugar a 12,000 rpm durante 10 minutos.
12. Dejar secar la pastilla a 37C durante 10 minutos.
13. Resuspender en agua estril.
12. Electroforesis de ADN genmico
Preparacin de gel de agarosa.
14. USAR GUANTES
15. Pesar agarosa para preparar geles a 2 condiciones: a) 1 % y b) 2% en 35ml de
buffer TBE.
18. Homogeneizar.
21. Agregar 2 de bromuro de etidio.
22. Homogeneizar.
13. Electroforesis de ADN. GEL DE INTEGRIDAD (1%)
ensamblada.
Cuantificacin de ADN genmico. NANODROP.
RESULTADOS/DISCUSIN
CONCLUSIONES
Describir las etapas en la extraccin de ADN (Reactivo utilizado y fundamento).
Lisis de clulas o virus.
Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN.
Purificacin:
o Precipitacin
o Lavado del Pellet.
o Recuperacin
BIBLIOGRAFA
Espaa.
MANIATIS T., FRITSCH, E., SAMBROOK J. 1982. Molecular cloning, a laboratory
manual. Cold Spring Harbor Laboratory. New York, USA.
WATSON J., BAKER T., BELL S., LEWIS A. 2007. Molegular biology of the gene.
Benjamin Cummings. 6th edition. USA.
PRCTICA N7. PCR PUNTO FINAL.

INTRODUCCIN
PCR son las siglas en ingls de Polymerase Chain Reaction o Reaccin en Cadena de la
Polimerasa. La idea bsica de la tcnica es sintetizar muchas veces un pedazo o
fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy
elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas
(79C a 85C), de ah su nombre comercial ms conocido: taq polimerasa. Cuando
hacemos una reaccin de PCR simulamos lo que sucede en una clula cuando se
sintetiza el ADN y en el tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo:
la polimerasa, el ADN del organismo que queremos estudiar donde se encuentra el
fragmento que queremos sintetizar, los oligonucletidos (llamados tambin primers,
iniciadores, cebadores, oligos, etc.) necesarios para que se inicie la transcripcin,
dinucletidos (dNTPs), y las condiciones para que la enzima trabaje adecuadamente
(cierto pH, determinadas cantidades de magnesio en forma de MgCl2, KCl, y pueden
necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo de cada polimerasa). Esta tcnica tan
ingeniosa tiene muchsimas aplicaciones distintas y se ha convertido en una herramienta
muy importante en la biologa molecular; sus aplicaciones van desde la gentica de
poblaciones, evolucin molecular y genmica hasta la medicina forense. Como se
muestra en la siguiente figura en una reaccin de PCR los fragmentos se amplifican en
forma exponencial (tomado de Vierstraete, 2001)
OBJETIVO
Describir y comprender los fundamentos de la PCR convencional o tambin conocida
como punto final, analizando el ADN genmico extrado de un cultivo bacteriano, para
posteriormente interpretar los resultados obtenidos mediante este mtodo cualitativo.
Finalmente conocer las diferencias bsicas entre PCR punto final y PCR tiempo real.
MATERIALES
ADN Extrado de la prctica # 4.
Master Mix.
Microtubos para PCR (200l).
Guantes
Buffer TBE 1X
Reactivo
Tris
cido Brico
EDTA 0.5M, pH=8
H2O destilada.
1 lt
108g
55g
40ml
Cbp 1L

Agua destilada
Alcohol 70%
Agarosa
10L
1.08 kg
550g
400ml
Cbp 10L
20 L
2.16 kg
1.1kg
800ml
Cbp 20L
Fuente de poder.
Peine de 14 pozos.
Buffer de carga
Bromuro de etidio.
Transiluminador ultravioleta (MiniBis)
Sanitas.
Marcador.
PROCEDIMIENTO
14. Amplificacin ADN por PCR.
1. Limpiar todo el material a utilizar (etanol al 70%) antes de colocarlo dentro de la
campana de extraccin.
2. Introducir el material a la campana y organizar para tener mayor control de
manipulacin.
3. Preparar un master-mix dependiendo del nmero de reacciones a realizar. ste
incluye:
a. Amortiguador (Buffer)
b. dNTPs
Master Mix
c. Taq Polimerasa.
d. MgCl2
e. Primers F y R
f. Agua grado molecular.
4. Se seleccionan las muestras
5. Se preparan la cantidad especfica de tubos de PCR 200 l para la PCR y en cada
uno se colocan 15l del Master Mix.
6. Colocar 2l de ADN en el orden indicado.
7. Colocar en 2 tubos extras 15 l de Master-Mix sin ADN (sern los controles
negativos).
8. Homogeneizar por pipeteo.
9. Colocar los tubos en el termociclador bajo las siguientes condiciones:
a. 94C (3 minutos)
b. 94C (1 minuto)
32 ciclos
c. 53C (30 segundos)
d. 72C (1 minuto)
e. 72C (7 minutos)
f. 4 (infinito)
15. Electroforesis de producto de PCR.
1. Pesar agarosa para preparar un gel al 2% en 35ml de buffer TBE.
4. Homogeneizar.
7. Agregar 2l de bromuro de etidio.
8. Homogeneizar.

ensamblada.
RESULTADOS/DISCUSIN
CONCLUSIONES
Definir el propsito de cada uno de los componentes del MasterMix.

Explicar el porqu de las temperaturas en:
o Desnaturalizacin.
o Unin (amplificacin).
o Extensin de la cadena de ADN.
o Desnaturalizacin del ADN molde.
o Anillamiento del cebador.
BIBLIOGRAFA
EGUIARTE L., SOUZA V., AGUIRRE X. 2007. Ecologa Molecular. Instituto
nacional de ecologa. Mxico DF.
TAMAYO DE DIOS L, IBARRA C, VELASQUILLO C. 2013. Fundamentos de la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.
Tecnologa en salud. Vol 2. Nm 2. Pp 70-78.
WATSON J., BAKER T., BELL S., LEWIS A. 2007. Molegular biology of the
gene.
Benjamin
Cummings.
6th
edition.
USA.
PRCTICA N8. PURIFICACIN DE CIDOS NUCLICOS (recuperacin de

los productos de PCR de un gel de agarosa).
INTRODUCCIN
La frecuente necesidad de recuperar y purificar fragmentos de ADN separados sobre
geles de agarosa y poliacrilamida ha llevado al desarrollo de gran variedad de mtodos.
Uno de los mtodos utilizados es la electroforesis empleando agarosa de bajo punto de
fusin (LMPA), que consiste en cortar el fragmento de gel que contiene el ADN que se
desea purificar, fundirlo y, mediante extracciones orgnicas, retirar la agarosa. El ADN
queda en la fase acuosa.
OBJETIVO
Conocer el fundamento y propsitos de la recuperacin de ADN a partir de un gel de
agarosa, su procedimiento y su uso posterior para el anlisis e interpretacin de los
resultados obtenidos a partir de un ADN de alta pureza.
MATERIALES
Guantes
Kit (NOMBRE)
Buffer TBE 1X
Reactivo
Tris
cido Brico
EDTA 0.5M, pH=8
H2O destilada.
1 lt
108g
55g
40ml
Cbp 1L
10L
1.08 kg
550g
400ml
Cbp 10L

Agua destilada
Alcohol 70%
Agarosa
Fuente de poder.
Navaja u hoja de bistur.
20 L
2.16 kg
1.1kg
800ml
Cbp 20L
Peine de 14 pozos.
Buffer de carga
Bromuro de etidio.
Transiluminador
(MiniBis)
Sanitas.
Marcador.
ultravioleta
PROCEDIMIENTO
Extraccin de ADN desde un gel de agarosa.
1. Usar guantes y lentes de proteccin.
2. Visualizar la banda de inters en el gel de agarosa teido con bromuro de etidio,
en un cuarto oscuro en una caja de luz ultravioleta.
3. Con una hoja de bistir cortar alrededor de la banda.
4. Apagar el transiluminador, encender la luz blanca y retirar con cuidado la banda

del gel.
5. Colocar la banda extrada en un tubo eppendorf de 1.5ml.
a. Spin-columns (columna de purificacin de cidos nuclicos).
i. Disolver el gel en 3 volumenes de agente cautrpico a 50C durante
10 minutos.
ii. Aplicar la solucin a una spin-column y centrifugar durante 10
minutos.
iii. Lavar la columna haciendo pasar etanol al 70% a travs de ella.
iv. Eluir el ADN en un volumen pequeo (30l) de agua estril o buffer.
b. Tubo de dilisis.
i. Congelar la pieza de gel a -25C durante 30 minutos.
ii. Cortar 5cm del tubo de dilisis y enjuagar pod dentro y por fuera
con agua destilada.
iii. En juagar con el mismo buffer utilizado para el gel (ej. TBE) y dejar
sumergido en un pequeo vaso.
iv. Sellar con una pinza de dilisis.
v. Insertar la rebanada de gel en el tubo y aadir de 300-400l de
tampn.
vi. Sellar el otro extremo del tubo con un segundo clip de dilisis.
vii. Sumergir el tubo sellado en un tanque de electroforesis de manera
que la banda de ADN es paralela a los electrodos.
viii. Aplicar un campo elctrico de 5v/cm (10-15) minutos.
ix. Retirar el amortiguador del tubo y colocarlo en un tubo eppendorf de
1.5ml.
x. El extracto fenol/cloroformo y etanol precipita el ADN. Redisolver el
sedimento de ADN en un volumen apropiado de agua o tampn TE
(ej. 10l).
c. Mtodo de la tira de papel
i. Usando una hoja de escapelo, cortar la rebanada inmediatamente
frente de la banda a ser extrada. No remover la banda del gel.
ii. Cortar un trozo de papel filtro del tamao para que pueda caber en
la ranura (3mmx10mm).
iii. Colocar la tira de papel en la ranura, devolver el gel a la cmara de
electroforesis (sumergido en buffer).
iv. Encender el interruptor de corriente durante 2-5 minutos.
v. Retirar la tira de papel (que lleva al menos algo de ADN) y colocarlo
en un tubo de microcentrifuga 0.5ml, con la parte del ADN hacia
abajo.
vi. Hacer un pequeo agujero en la parte inferior del tubo con una
aguja.
vii. Colocar el tubo de 0.5ml en un tubo de 1.5ml y centrifugar durante
30 segundos.
viii. El extracto fenol/cloroformo y etanol precipita el ADN. Redisolver el

sedimento de ADN en un volumen apropiado de agua o tampn TE
(ej. 10l).
RESULTADOS/DISCUSIN
CONCLUSIONES
ADN de alta pureza.
Columna de purificacin de cidos nucleicos.
Fenol/cloroformo y etanol.
BIBLIOGRAFA

PRCTICA N9. DIGESTIN ENZIMTICA DE ADN.

INTRODUCCIN
Las enzimas de restriccin, tambin conocidas como endonucleasas, son enzimas que
cortan los enlaces fosfodiester del material gentico a partir de una secuencia que
reconocen. Las mismas permiten cortar ADN de hebra doble, donde reconocen
secuencias palindrmicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).
Son extradas de organismos procariticos (bacterias), donde actan como un mecanismo
de defensa, para degradar material gentico extrao que entre en la clula. Las bacterias
tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extrao y
el DNA propio. Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA metilado, de este modo
solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.
OBJETIVO
MATERIALES
Guantes
Enzima(s) de restriccin.
Termoblock.
ADN extrado y purificado.
Buffer TBE 1X
Reactivo
1 lt
Tris
108g
cido Brico
55g
EDTA 0.5M, pH=8
40ml
H2O destilada.
Cbp 1L
Agua destilada
Alcohol 70%
Agarosa
Fuente de poder.
10L
1.08 kg
550g
400ml
Cbp 10L
20 L
2.16 kg
1.1kg
800ml
Cbp 20L
Peine de 14 pozos.
Buffer de carga
Bromuro de etidio.
Transiluminador
(MiniBis)
Sanitas.
Marcador.
ultravioleta
PROCEDIMIENTO
1. Se emplean enzimas de restriccin que generalmente se encuentran a
10U/l.
2. En promedio se requiere: 3U de enzima/g de DNA a cortar, evitando que
la canridad de enzima en la reaccin sea mayor de 10% del volumen final,
porque contiene glicerol que puede inhibir la reaccin.
3. Para preparar la reaccin se deben colocar los reactivos en un tubo de

500l en el siguiente orden.
1. H2O
2. Buffer (10x)
3. ADN
4. Enzima de restriccin.
4. La reaccin se incuba durante 2 horas en termoblock a 37C.
5. Al final se recomienda correr un gel de agarosa para asegurarnos que la
reaccin ya se halla llevado a cabo completamente, y descartar digestiones
parciales.
RESULTADOS/DISCUSIN
CONCLUSIONES
Enzimas de restriccin (tipos).

Origen del nombre.
Aplicaciones.
Tipos de cortes.
BIBLIOGRAFA


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CASTELLANOS B. CARLOS. 2010. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE

OMS 2005. MANUAL DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO. Tercera

REYES G. JUAN PLABLO.2009. Manejo de residuos biolgico-infeccionsos en el

RICHMOND JY, MCKINNEY RW. 2002. Bioseguridad en laboratorios de

UNAM 1989. REGLAMENTO DE SEGURIDAD Y COORDINACIN EN MATERIA

PRCTICA NO. 2 BIOSEGURIDAD

CASTELLANOS B. CARLOS. 2010. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE

OMS 2005. MANUAL DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO. Tercera

Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 5th edition. U.S.

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2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas.

sustrato (ADN, protenas, lpidos, carbohidratos), lo que permite cualificar o cuantificar la

COOPER G. HOUSMAN R. 2004. Coopers: La clula. Editorial Marban. Madrid,

PRCTICA 3 Segunda parte: TIPOS, MANEJO Y USO DE MICROSCOPIO

COOPER G. HOUSMAN R. 2004. Coopers: La clula. Editorial Marban. Madrid,

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Muestreo de superficies, alimento o muestras biolgicas.

COOPER G. HOUSMAN R. 2004. Coopers: La clula. Editorial Marban.

PRCTICA N 5. ELECTROFORESIS DE PROTENA Y DE CIDOS NUCLICOS.

Matraz Erlenmeyer de 150ml

Gel concentrador 10%

Solucin de SDS 10%:

Buffer de corrida 10x

PRINCIPALES FUNDAMENTOS TCNICOS (describir los principios de las

PRCTICA N6. EXTRACCIN DE ADN

Matraz Erlenmeyer de 150ml

Puntas (200 l y 1000l).

KIT (QUIAGEN DNeasy Blood &

7. Centrofugar a 12,000 rpm durante 0 minutos y decantar.

PRCTICA N7. PCR PUNTO FINAL.

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11. Esperar de 15-30 minutos para la polimerizacin.

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