Produccin de cido succnico con actinobacillus succinogenes

utilizando melazas de caa como materia prima.

b
Yaritza Quintero-Loaiza
, Miguel Angel Muoz-Zapata
& Daniel Sebastin Snchez-Torresc

a
Facultad de Minas, Universidad Nacional de Colombia, Medelln, Colombia. Estudiante de Ingeniera Qumica
Facultad de Minas, Universidad Nacional de Colombia, Medelln, Colombia. Estudiante de Ingeniera de Petrleos
c
Facultad de Minas, Universidad Nacional de Colombia, Medelln, Colombia. Estudiante de Ingeniera Qumica

Abstract: This paper is a review of the main methods of producing succinic acid via biotechnology reported in the literature to date. The
purpose of this review was to select a process that included a raw material of good availability in Colombia of a low price and that could be
processed by a micro-organism delivering a good performance. The interest in studying these bioprocesses is based on the fact that succinic
acid has a wide application in the pharmaceutical and food industry and in the manufacture of plastics, detergents and other compounds of
industrial interest. After evaluation of different raw materials and microorganisms it was determined that cane molasses and microorganism
actinobacillus

succinogenes are appropriate in the synthesis of the product of interest.

Keywords: succinic acid; actinobacillus

succinogenes; sugar cane molasses; biotechnology.

Resumen: El presente trabajo es una revisin sobre los principales mtodos de produccin de cido succnico por va biotecnolgica
reportados en la literatura hasta la fecha. El propsito de esta revisin fue seleccionar un proceso que incluyera una materia prima de buena
disponibilidad en Colombia de un precio bajo y que pudiera ser procesada por un microorganismo entregando un buen rendimiento. El inters
en estudiar estos bioprocesos se fundamenta en el hecho de que el cido succnico tiene una amplia aplicacin en la industria alimentaria,
farmacutica y en la fabricacin de plsticos, detergentes y otros compuestos de inters industrial. Despus de la evaluacin de las diferentes
materias primas y microorganismos se determin que la melaza de caa y el microorganismo Actinobacillus Succinogenes son apropiados en
la sntesis del producto de inters.
Palabras clave: cido succnico,

actinobacillus succinogenes, melaza de caa, biotecnologa.

1.

Introduccin

El cido succnico o butanodioico es un cido carboxlico

cuya frmula molecular es C4H6O4. Se presenta en forma de
polvo blanco inodoro y soluble en agua. Algunas de sus
propiedades fsicas se encuentran en la tabla 1. Su estructura
se observa en la figura 1.

Punto de ebullicin
Punto de fusin
Presin de vapor
Densidad (20C)
Solubilidad (25C)
Fuente: (1)

235 C
186 C
0.000025 Pa (25C)
1.57 g/cc
83 g/L

En la naturaleza, el cido succnico puede encontrarse en

algunos frutos como las uvas y los albaricoques verdes.
Tambin est presente en el ambar (una resina fsil de pino).
A pesar de esto, las concentraciones son muy bajas como para
considerar un proceso de extraccin a escala industrial, por lo
que se prefiere sintetizarlo (1).

Figura 1: Estructura del cido succnico

Tabla 1: Propiedades fsicas del cido succnico
Estado fsico
Color
Olor
pH

Polvo (slido)
Blanco
Sin olor
2.4-2.8 (1% en agua)

El cido succnico puede obtenerse por va qumica o va

biotecnolgica. En el primer caso, se utilizan petroqumicos y
algunas reacciones como es el caso por ejemplo del anhdrido
malico que puede hidrogenarse para producir cido succnico.
De igual modo, podra obtenerse cido succnico partiendo de
acetileno, monxido de carbono y usando un catalizador. Una

tercera alternativa sinttica del tipo qumico sera la oxidacin

de hidrocarburos parafnicos (1).

crecimiento en la produccin del cido mediante la sntesis

biotecnolgica, mientras que la obtencin por va petroqumica
permanece estable (2).

El segundo enfoque (la va biotecnolgica), se basa en la

utilizacin de una materia prima de origen biolgico y su
posterior fermentacin llevada a cabo por un microorganismo.
En este caso el microorganismo utiliza la glucosa presente en
la materia prima para obtener energa. La glucosa sigue una
ruta metablica que concluye con la produccin de cido
succnico. En la literatura, se reportan rendimientos de 1,71
moles de cido succnico por mol de glucosa (1).

El tamao del mercado mundial de cido succnico se estim

en 137,0 millones de dlares para el ao 2013, con una tasa de
produccin global de entre 30.000 y 50.000 toneladas por ao.
Esta produccin se est utilizando cada vez ms en una
amplia gama de aplicaciones incluyendo la sntesis de
tetrahidrofurano (THF), gamma butirolactona (GBL), y
polibutileno tereftalato (PBT) (3).

La sntesis por la va qumica (usando materia prima

petroqumica) presenta la dificultad de que el precio de los
reactivos se encuentra sometido a las constantes fluctuaciones
del mercado del petrleo. Por lo tanto, un precio del petrleo
elevado encarecera el precio del cido succnico obtenido por
esta va. Asimismo, este tipo de sntesis no es amigable con el
medio ambiente y adems, no es una alternativa factible a
largo plazo debido al carcter no renovable del sustrato (1).

Para el ao 2013, el mercado mundial de cido succnico

obtenido biotecnolgicamente estaba dominado por tres
compaas: Succinity, Bioamber, y Reverdia. Las dos primeras
representando alrededor del 55 % de la cuota mundial (3).

Cuando se usa la va biotecnolgica, se garantiza la

disponibilidad de la materia prima debido a que esta es de
origen renovable (biomasa). Una ventaja adicional es que esta
va posibilita una reduccin de las emisiones de dixido de
carbono, lo cual es un aspecto de gran relevancia en el
contexto actual de conservacin del medio ambiente. A pesar
de lo anterior, existe una dificultad en la obtencin por esta va
y es que el microorganismo no solamente produce cido
succnico sino tambin otros compuestos qumicos tales como
cido frmico, cido lctico, entre otros, que deben ser
separados para obtener los porcentajes de pureza requeridos en
las aplicaciones industriales lo cual, encarece el proceso de
produccin (1).

Para la produccin de cido succnico a nivel industrial se

requiere de materias primas con un alto contenido de
carbohidratos, principalmente glucosas, lactosas y dems, que
potencien la fermentacin del microorganismo Actinobacillus
Succinogenes (Base fundamental para la produccin de dicho
cido por va biotecnolgica); se ha seleccionado ste
microorganismo debido a que
tiene la capacidad de
transformar azucares (glucosa y sacarosa) en el metabolito
deseado, que en este caso es cido succnico (4).

3.

Los amilceos son fuente de polisacridos (principalmente

almidn) baratos, abundantes y renovables. Ejemplos de estos
materiales son: el sorgo, la paja de trigo, el maz, la yuca, el
ame, la papa, el arroz, la cebada entre otros. Los anteriores
amilceos deben ser hidrolizados hasta azcares fermentables
antes del proceso (5).

Este cido es de gran importancia a nivel industrial debido a su

gran cantidad de aplicaciones. La primera de ellas es en la
produccin de detergentes y surfactantes. La segunda
aplicacin es como ion quelante para procesos de prevencin
de la corrosin. Un tercer uso podra ser como regulador de pH
en alimentos y tambin podra usarse en la produccin de
frmacos, antibiticos y vitaminas. Otras aplicaciones incluyen
la sntesis de productos agrcolas, solventes verdes, polmeros
biodegradables y en la fabricacin de compuestos qumicos
importantes a escala industrial (2).
2.

Materia prima

La melaza que es un derivado de la caa de azcar o de la

remolacha azucarera contiene sacarosa (31% p/v), glucosa
(9,5% p/v), fructosa (10%) y nitrgeno (0,95%). Este sustrato
presenta entonces cantidades de azcares fermentables
directamente bastante significativos (5).
En el caso de las melazas, la caa de azcar presenta cinco
variedades de cultivo, los datos que se van a presentar a
continuacin (Tabla 2) corresponde al tipo CC 84-75 que
posee alto rendimiento, resistencia a insectos, plagas y
enfermedades, adems de su alta concentracin de azucares;
esta crece en zonas ente 1.000 a 1.200 m.s.n.m y en
topografas planas y pendientes, lo que brinda una gran
adaptabilidad al suelo y a condiciones ambientales.

Mercado y demanda

La produccin a escala mundial de cido succnico ha

incrementado en los ltimos aos considerablemente: de
15.000 a 35.000 toneladas anuales con un incremento del 10%
anual; aumento que se ha atribuido principalmente al
2

En Antioquia, a pesar de su altos ndices de productividad

(229.8 Ton/ha), toda esta materia prima es destinada para
cubrir las necesidades del sector panelero, por lo cual se
concluye que no habra disponibilidad para su
aprovechamiento en la produccin de cido succnico, por lo
tanto es necesario transportarla ya que la concentracin de
cultivos de caa de azcar se encuentra localizada en el
suroeste de Colombia, en la regin geogrfica del valle del Ro
Cauca. La regin tiene condiciones micro climticas que
favorecen el cultivo todo el ao, a diferencia de otras regiones
donde la cosecha se limita a tan solo a cuatro o seis meses al
ao. El costo de cultivar y moler en Colombia es menos de la
mitad de los costos en otros lugares, lo cual la convierte en una
de las industrias de azcar ms eficientes del mundo (6).

4.2. Dilucin: La altsima concentracin de azucares y

sales presentes en la melaza (base tal cual) pueden
afectar el proceso de obtencin de un producto
especfico, ya que pueden generar cambios en la
presin. Las melazas son materias primas altamente
viscosas y esto ltimo hace difcil su manipulacin;
por estas razones, es necesario diluirlas hasta el punto
que se requiera.
La dilucin previa de las melazas a 45 Brix con agua
caliente, manteniendo por algunas horas una
temperatura de alrededor de 70C; provoca la
sedimentacin de una parte considerable de los
slidos suspendidos.
4.3. Adicin de nutrientes (9): En ocasiones es necesario
aadir algunos elementos adicionales, que
complementen los nutrientes necesarios para la
produccin de cido. Tales como: Extracto de
levadura, NaHCO3, NaCl, MgCl2, K2HPO4 y
NaH2PO4

Tabla 2: Composicin de la materia prima seleccionada y su cultivo

Melazas y Caa de azcar
Nmero de hectreas plantadas de caa en
Antioquia
Produccin de cultivo energtico anual,
Colombia (toneladas/ao)
Produccin anual
Melazas
(toneladas/ao), Colombia
Azucares

229.8
22196,054

5.

260,460

La Actinobacillus Succinogenes es una cepa que puede usar

varias fuentes de carbono en condiciones anaerobias, tales
como: xilosa, glucosa, fructosa, manitol, sorbitol, celobiosa y
sacarosa (10). sta ltima se extrae de la caa de azucar y la
melaza (materia prima a utilizar).

2202,208

Composicin cultivo energtico analizado (% en masa)

Sacarosa
(8-15)%
Bagazo/material solido no
(11-16)%
azucares
Agua
(73-76)%

El microorganismo tiene una muy buena tolerancia a altas

concentraciones de glucosa, lo cual es bastante beneficioso
para la fermentacin (11).

Composicin de las melazas (% en masa)

Sacarosa y otros azcares
51%
Agua
20%
Cenizas
12%
Impurezas orgnicas (no
4,5%
fermentables)
(ceras, esteroides y estreo
fosfolpidos, otros carbohidratos
Otros solidos

La ruta metablica utilizada por el microorganismo no lleva a

cabo un ciclo de Krebs completo y la carboxilacin del
fosfoenolpiruvato est fuertemente regulada por los niveles de
dixido de carbono (11). Tericamente se requiere un mol de
dixido de carbono para producir un mol de cido succinico; y
cuando hay altos niveles de ste gas en el medio, se tiene lugar
a un incremento en la produccin de cido succinico a
expensas de etanol y cido frmico. La adicin de donadores
de electrones adicionales, como por ejemplo hidrgeno,
tambin da lugar un incremento en la concentracin de cido
succinico (1).

12,5%
(otras
sustancias
reductoras,
compuestos nitrogenados y no
nitrogenados)

Fuente: (7)

4.

Microorganismo y su funcionalidad

Pretratamiento general de las Melazas (8)

A partir de numerosos estudios fisiolgicos y genticos

relacionados con la produccin de cido succinico se han
encontrado cinco enzimas responsables de la produccin de
ste, identificadas como PEP carboxinasa (pck), malato
deshidrogenasa (mdh), enzima mlica (sfc), fumarasa (fum), y
fumarato reductasa (frd) (11).

4.1. Esterilizacin:
Las
melazas
pueden tener
microorganismos que sean nocivos tanto para la
salud, o que puedan afectar la produccin, tales como
la bacteria Leuconostocme-senteroides o la
Zymomonasmobilis. La esterilizacin puede lograrse
mediante un aumento controlado de la temperatura.

Una representacin grfica de la ruta metablica que desarrolla

el Actinobacillus succinogenes se detalla en la figura 2.

Regnum:
Phylum:
Classis:
Ordo:
Familia:
Genus:

7.

Bacteria
Proteobacteria
Gamma Proteobacteria
Pasteurellales
Pasteurellales
Actinobacillus

Condiciones de cultivo

En primer lugar, se planea adquirir una de las cepas de

actinobacillus succinogenes de alguno de los laboratorios
especializados en la produccin de este microorganismo.
Una vez se tenga el microorganismo, este debe ser reactivado
para su posterior cultivo y uso en el biorreactor. En el proceso
de reactivacin, se deben usar placas de agar segn lo reportan
algunos de los proveedores del microorganismo. Las
condiciones en esta etapa incluyen: temperatura alrededor de
los 37 C con un tiempo de incubacin entre 1 y 2 das (12).

Figura 2: Ruta metablica de fermentacin de la glucosa en Actinobacillus

Succinogenes.
Pasos: 1: fofoenolpiruvato carboxiquinasa, 2: malato
deshidrogenasa, 3: fumarato reductasa, 4: piruvato quinasa, 5: piruvato
ferredoxin oxidorreductasa, 6: acetato quinasa, 7:alcohol deshidrogenasa,
8:lactato deshidrogenasa. Fuente (1)

6.

Cuando se ha completado el proceso de activacin, un medio

de cultivo recomendable para el actinobacillus succinogenes es
la infusin cerebro-corazn. Dicho medio es muy rico en
nutrientes que posibilitan un adecuado desarrollo microbiano;
los componentes de esta infusin se especifican en la tabla 4
para un litro de agua destilada. La infusin de cerebro, corazn
y la peptona proporcionan la fuente de carbono, nitrgeno y
vitaminas. La glucosa sirve en este caso como el carbohidrato
fermentable, el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico
y el fosfato disdico proporciona una capacidad buffer a la
solucin (12).

Caractersticas del microorganismo

El A. Succinogenes se aisl originalmente del rumen bovino.

Pertenece a la familia Pasteurellaceae basado en el anlisis de
su secuencia 16S rRNA; el anlisis fenotpico mostr que es
un microorganismo de naturaleza anaerobia facultativo, no
mvil, pleomrfico y Gram-negativo (11).
La cepa fue suministrada por Lebniz Institute DSMZ- German
Collection of Microorganisms and Cell Cultures (1), cuyas
caractersticas se indican en la tabla 3.

Tabla 4: Composicin de la infusin cerebro-corazn, (12)

Frmula
Infusin de cerebro de
ternera
Infusin de corazn vacuno
Peptona
Cloruro de sodio
Glucosa
Fosfato disdico

Tabla 3: Caractersticas del Actinobacillus Succinogenes (1),(12)

Nombre
DSM n:
Designaci
n de la
cepa:
Otra
coleccin:
Aislado de:
Historia:
Nmeros
de acceso
Genbank:
Condicione
s de
cultivo:
Grupo de
riesgo:

Actinobacillus Succinogenes
22257, tipo de cepa
130Z

ATCC 55618, CCUG 43843, CIP 106512

8.

Rumen del ganado

<-CCUG<-C. Bizet, CIP<-ATCC<-?
16S rRNA gene: AF024525

Cantidad en gramos por cada

litro
200
250
10
5
2
2.5

Condiciones de operacin del biorreactor

De acuerdo con la informacin reportada en la literatura, las

condiciones de operacin para un biorreactor para la sntesis
de cido succnico utilizando actinobacillus succinogenes se
mueven en los intervalos que se indican en la tabla 5. La
operacin de este tipo de biorreactores se realiza en general
bajo condiciones anaerbicas con burbujeo de CO2 para
incrementar el rendimiento de cido succnico. Aparte de las

Medio 215, 37C o Medio 693, 37C. Tiempo

de incubacin: 1-2 das
1 (clasificacin de acuerdo a German TRBA)

condiciones de operacin mencionadas en la tabla, se debe

contar con la presencia de otros compuestos o materiales con
el fin de que el microorganismo se pueda desarrollar
plenamente, entre ellos se tiene (13),(14):

http://www.nnfcc.co.uk/publications/nnfcc-renewable-chemica
ls-factsheet-succinic-acid
4. Graaf, M. V. D., Vallianpoer, F., Fiey, G., Delattre, L., &
Schulten, E. A. M. (2010). Process for the crystallization of
succinic acid. US Patent App. 13/ , 1(61), 3-8. Retrieved
from http://www.google.com/patents/US20120238722

Extracto de levadura: Es importante ya que es la fuente de

nitrgeno para el microorganismo, este extracto se suele
agregar en concentraciones que varan entre los 10 y los 50
g/L de caldo de cultivo.

5. Garca, C; Arrazola, G; Durango, A. (2010) Produccin de

cido lctico por va biotecnolgica. Consulta del 23 de marzo
de
2014.
Disponible
en:
http://www.unicordoba.edu.co/revistas/rta/documentos/15-2/A
rt%201.%20PRODUCCION%20DE%20ACIDO.pdf

NaHCO3: Se utiliza como regulador de pH. Se suele agregar

entre 10 y 20 g/L.
H2PO4, K2HPO4: Se utilizan como reguladores de pH tambin
y adems aportan fsforo al medio. Estos compuestos se
suelen agregar en cantidades de alrededor de 15 g/L.

6. Cardona, C; Montoya, M; Orozco, J. (2004). Seleccin de

tecnologas apropiadas para la produccin de etanol
carburante. Manizales, Colombia: Universidad Nacional De
Colombia.

Tabla 5: Condiciones de operacin del biorreactor (13), (14).

Condicin de proceso
Temperatura
Agitacin
Concentracin
de azcares
(sustrato)
pH
Presin

Intervalo
36-38 C
150-250 rpm
5-70 g/L

7. Gutirrez, E; Meja, F; Pelayo, C; Gonzlez, V; Corona, R;

Ros, M. Produccin de acido succnico por actinobacillus
succinogenes ZT-130Y providencia con diferentes fuentes de
carbono y desechos agroindustriales. Jalizco, Mxico

6,8-7,2
Alrededor de 1 atm

8. Arteaga, L., Carvajal, G., Bola, O., & Aut, U. (s. f.).
PRODUCCIN DE ETANOL A PARTIR DE MELAZAS.

Con las condiciones de operacin descritas anteriormente se

han logrado producciones de cido succnico de 0,97 gramos
de cido succnico por hora y por litro de solucin o caldo en
el reactor (14).

9. Lpez, E. D. G., Crdenas, F. M., Ortiz, C. P., lvarez, V. G.,

Gonzlez, R. I. C., Gutirrez, M. P. R., Correo, F. (s. f.).
Produccin de cido succnico por Actinobacilus succinogenes.

10. Aguilar, I., Erlai, A., Ospina, J., & Palencia, C. (2014).
Diseo de una planta de produccin biolgica de cido
succnico a partir de Actinobacillus Succinogenes.
Universidad Industrial de Santander.

Referencias

11. Song, H., & Yup, S. (2006). Production of succinic acid by

bacterial
fermentation,
39,
352-361.
http://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2005.11.043

1.Ramos, M. (2015). Valorizacin biotecnolgica de

subproductos/residuos industriales: produccin de cido
succnico y cido lctico. Universidad de Valladolid, Escuela
de Ingenieras Industriales.

12. Leibniz Institute DMSZ-German Collection of

microorganisms and cell cultures. (2016). Actinobacillus
succinogenes. Retrieved September 25, 2016, from
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ml

2. Pinazo, J. (2011). Valorizacin de derivados de la biomasa:

Sntesis cataltica de -butirolactona a partir de cido succnico
y derivados. Espaa: Universidad Politcnica De Valencia.
Disponible
en:
http://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/29848/TrabFinMQ
S_JMPinazo.pdf?sequence=1

13. Carvalho, M., Roca, C., & Reis, M. (2016). Improving

succinic acid production by Actinobacillus succinogenes from
raw industrial carob pods. Bioresource Technology, 218,
491497.

3. Nattrass, L., Aylott, M., & Higson, A. (2013). NNFCC

Renewable Chemicals Factsheet: Succinic Acid. NNFCC,
44(0),
1-2.disponible
en:

14. Pengcheng, C., Shengtao, T., & Pu, Z. (2016). Efficient

and repeated production of succinic acid by turning sugarcane

bagasse into sugar and support. Bioresource Technology, 211,

406413.