MicrobiologaGeneralMicro

biologaGeneralMicrobiolog
aGeneralMicrobiologaGen
eralMicrobiologaGeneralMi
UNIVERSIDAD NACIONAL DE
TRUJILLO
crobiologaGeneralMicrobio
logaGeneralMicrobiologa
COLORACIONES
GeneralMicrobiologaGener
alMicrobiologaGeneralMicr
obiologaGeneralMicrobiolo
gaGeneralMicrobiologaGe
neralMicrobiologaGeneral
MicrobiologaGeneralMicro
Ciudad Universitaria, Guadalupe 15
de Octubre de 2016.
biologaGeneralMicrobiolog
aGeneralMicrobiologaGen
eralMicrobiologaGeneralMi
crobiologaGeneralMicrobio
Ingeniera Agroindustrial

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

CURSO:

Microbiologa General.

DOCENTE:

Manuela Lujn Velsquez.

INTEGRANTE:
GUEVARA CASTRO, Jhonatan.
CICLO:

IV

Prof. Manuela Lujn Velsquez

Alumno: GUEVARA CASTRO, Jhonatan.

Ingeniera Agroindustrial

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

COLORACIONES
I.

INTRODUCCCIN:

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles

de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el
contraste entre la clula y el medio que la rodea es la utilizacin de colorantes.
Estos pueden emplearse tambin para localizar estructuras especficas en la
clula o para distinguir entre tipos diferentes de clulas.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de
teirlas, proceso llamado fijacin. Para las bacterias la fijacin por el calos es lo
ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como
formaldehdo, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin se realiza
habitualmente en clulas que han sido secadas sobre un portaobjetos, tratando
despus ste con el agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de
tincin. La fijacin produce generalmente el encogimiento de las clulas, la
tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que
son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas
o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.
En microbiologa el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que
proporciona importante informacin para la identifi cacin temprana y defi
nitiva de los microorganismos. En la valoracin de las muestras, es
trascendente el poder de resolucin del microscopio, el cual se defi ne como la
capacidad que posee un objetivo para distinguir la distancia mnima entre dos
puntos del objeto para que se puedan visualizar como dos puntos separados. El
poder de resolucin de un objetivo es el responsable de la calidad, claridad,
nitidez y fi neza detallada de la imagen, y depende de la longitud de onda del
haz de luz utilizado y de la apertura numrica del objetivo empleado.
Para aprovechar la ventaja de los microscopios, se han desarrollado tcnicas
tintoriales que destacan las caractersticas morfolgicas de los
microorganismos.

Prof. Manuela Lujn Velsquez

Alumno: GUEVARA CASTRO, Jhonatan.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

II.

Ingeniera Agroindustrial

OBJETIVOS:

Conocer las coloraciones para aplicfarlas adecuadamente a la muestra dada.

Poner en prctica los pasos correctos para las diferentes coloraciones
explicadas en clases.
Brindar herramientas bsicas en la confeccin y el manejo de extendidos y la
tincin de los mismos de acuerdo a la observacin que se desee realizar.

III.

FUNDAMENTO TERICO:

COLORACIN:
Es un proceso por el cual las molculas de un colorante se absorben a una
superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las clulas de los
microorganismos y poder realizar la observacin en microscopio ptico. Dado
que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el
cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algn
tratamiento previo.
Los colorantes ms utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son
catinicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados
negativamente, como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos (las
envueltas externas de los microorganismos estn por lo general cargadas
negativamente).
Pasos para toda coloracin:
Extensin de la muestra.
Fijacin de la muestra.
Agregar el colorante.
Lavar.
Secar.
Observar a 10X = 100.
Si bien es cierto existen varios tipos de coloraciones, pero slo en esta
prctica, solo se relizaron algunas y son:
COLORACIN GRAM:

Prof. Manuela Lujn Velsquez

Alumno: GUEVARA CASTRO, Jhonatan.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Ingeniera Agroindustrial

Fue desarrollada por el cientfi co dans Hans Christian Gram en 1884; hoy en
da, sigue siendo una de las tinciones ms utilizadas universalmente debido a
lo econmico, sencillo y efi caz que resulta. En microbiologa clnica resulta de
gran utilidad, ya que a partir de muestras clnicas directas provenientes de
sitios estriles se puede saber de manera rpida las caractersticas de la
muestra y hacer una diferencia de los potenciales microorganismos causantes
de una infeccin.
De gran importancia en Microbiologa porque permite diferenciar dos grandes
grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), segn se comporten ante esta tincin.
El fundamento radica en la diferencia estructura de la pared celular de ambos
grupos: las basterias Gram+ tienen una gruesa cada de peptidoglicano en su
pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de petidoglicano ms
fina y una capa lipopolisacrida externa. Tras la coloracin con el primer
colorante (critsal violeta) se efecta un lavado con etanol que arrastrar al
colorante slo en las Gram-, mientras que en las Gram+ el colorante queda
retenido y las clulas permancern azules. Las clulas Gram- se teirn
despus con un colorante de contraste para que puedan observarse.
De esta coloracin tiene como objetos el de la ultilizacin de tcnicas sencillas
para la observacin de microoganismios, conocer el manejo del microscopio
ptico para la observacin de bacterias, conocer y manejar las unidades de
medida de las clulas y establecer comparaciones entre tamaos de
procariotas y de eucariotas, reconocer los distintos modelos de pared
bacteriana.
COLORACIN DE ESPORAS:
Se utiliza para teir las estructuras de resistencia llamadas endosporas
bacterianas. Sobre el portaobjetos con la preparacin se echa verde malaquita
que tie las clulas de verde. Luego se lava con agua destilada con lo que las
clulas se quedan incoloras y las endosporas permanecen verde. Finalmente se
usa la safranina para obtener bacterias de color rosa mientras que las
endosporas continan con su color verde del verde malaquita.
Tincin de esporas (wirtz-conklin)
Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus,
producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se
producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento
de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos,
etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso
de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior.
Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva
forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de

Prof. Manuela Lujn Velsquez

Alumno: GUEVARA CASTRO, Jhonatan.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Ingeniera Agroindustrial

las bacterias productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo

que su estudio y observacin son de enorme inters.
COLORACIN DE CPSULAS:
La cpsula es una sustancia viscosa producida por algunas especies que la
sintetizan a partir de polipptidos, polmeros de glucosa u otros aminoazcares
que contienen nitrgeno, que despus de combinarse con el agua es
segregada por todo el contorno de la pared celular como un moco gelatinoso.
Cuando la cpsula ha sido producida puede observarse en los frotis coloreado
por el mtodo de Gram como un halo incoloro alrededor de la bacteria. Cuando
se requiere ver la cpsula con ms detalle o inducir su produccin se recurre a
coloraciones especiales.

IV.

MATERIALES Y MTODOS:

Materiales:
MATERIALES PARA LA COLORACIN GRAM
Mechero Bunsen o de Alcohol.
Asa de Siembra o aguja enmangada.
Pinzas.
Portaobjetos.
Muestras bacterianas de origen natural: yogurt, sarro dental, suelo, etc.
Palillos.
Microscopio.
Zafranina (rojo).
Aceite de inmersin.
Soporte de Tinciones.
Goteros.
Alcohol acetona.
Agua destilada.
Colorantes para tincin: Solucin violeta de genciano o cristal violeta.
MATERIALES PARA LA COLORACIN DE ESPORAS Mtodo de Wirtz Coklin

Prof. Manuela Lujn Velsquez

Alumno: GUEVARA CASTRO, Jhonatan.

Ingeniera Agroindustrial

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Portaobjetos.
Agua destilada.
Zafranina (rojo).
Verde de malaquita.
Microscopio.
MATERIALES PARA LA COLORACIN DE CPSULAS Mtodo de Maneval
Microscopio.
Maneval A Rojo de Congo.
Maneval B Fuxcia bsica.
Agua destilada.
Portaobjetos.
Mtodos:
MTODOS PARA LA COLORACIN GRAM
Se extendi la muestra.
Se suspendi bacteriana. Ej: Straphilococus.
Se dej secar a temperatura durante 20minutos.
Se agreg violeta de genciano o cristal violeta, que cubra toda la muestra por
2minutos.
Luego se lav y se agreg lugol.
Se decolor con alcohol acetona y se lav.
Se agreg zafranina (rojo) por 2minutos.
Se lav, sec y se observ al microscopio.
MTODOS PARA LA COLORACIN DE ESPORAS Mtodo Wirtz Coklin
Se extendi la muestra de Bacilos sp.
Se fij la muestra a temperatura ambiente.
Se agreg verde de malaquita.
Se extendi hasta disponer vapor por 3veces.

Prof. Manuela Lujn Velsquez

Alumno: GUEVARA CASTRO, Jhonatan.

Ingeniera Agroindustrial

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Luego se lav.
Se agreg zafranina (rojo) por 2veces.
Se lav, sec y observ en el miscroscopio.
MTODOS PARA LA COLORACIN DE CPSULA Mtodo de Maneval
Se coloc una gota de Maneval A.
Se suspendi la bacteria y se extendi.
Se fij y se dej secar.
Se agreg Maneval B.
Se lav, sec y se observ al microscopio

V.

RESULTADOS:

RESULTADOS DE LA COLORACION GRAM

Se observ cocos Gram+
Se observ Estafilococus.
RESULTADOS DE LA COLORACIN DE ESPORAS Mtodo de Wirtz Coklin
Bacilos.
Se observ Esporas (color verde).
RESULTADOS DE LA COLORACIN DE CPSULA Mtodo de Maneval
Se observ Cpsulas.
Se observ bacilos.
VI.

DISCUSIONES:

Pudimos observar con la tincin de gram que la bacteria staphylococcus

aureus es una bacteria gran positiva esto se debe a que esta bacteria posee
una gruesa capa de peptidoglucano adems pose cidos teicoicos . El cristal
violeta penetro, en esta clula, el lugol hizo que el cristal violeta se fijara
intensamente en la pared bacteria de la clula y se formara un complejo entre
los dos. El alcohol acetona nos sirvi para realizar la decoloracin pero como
esta es una bacteria positiva esta no se descoloro a diferencia de la otra
muestra de la bacteria enterobacter que se pudo observar que es una
bacteria gram negativa en este procedimiento con el alcohol acetona estas se

Prof. Manuela Lujn Velsquez

Alumno: GUEVARA CASTRO, Jhonatan.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Ingeniera Agroindustrial

decoloran y por eso la se usa la safranina que es un colorante de contraste y

podemos observar su color rojo. Esta clase de bacteria pose una capa de
peptidoglucano delgada.
La diferencia que se observo en la resistencia a la decoloracin, se debe a que
la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos,
como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano
que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de
cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se
escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram
positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin
de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino
que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda
escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azulviolcea.
VII.

CONCLUSIONES:

Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiologa permiten el

diagnstico oportuno y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan
un papel importante en la decisin del tratamiento inicial de las enfermedades
infecciosas. Se debe practicar la tincin adecuada de acuerdo con el agente
infeccioso en sospecha y el tipo de muestra clnica. Las tinciones son
herramientas elementales, vigentes y de uso universal que coadyuvan al
diagnstico microbiolgico.
Aunque las bacterias no aparecen en diferentes medio que las rodea, difieren
mucho qumicamente esta diferencia qumica es los que permite distinguir las
bacterias por Tincin, pues generalmente, el colorante reacciona con la clula
bacteriana, pero no reacciona con su medio exterior.

VIII.

BIBLIOGRAFA:

Decr D, Barbut F, Petit JC. Role of the microbiology laboratory in the diagnosis
of nosocomial diarrhea. Pathol Biol (Pars). 2000; 48: 733-744.
Keller PJ. Imaging morphogenesis: technological advances and biological
insights. Science. 2013; 340: 123-168.
Guarner J, Brandt ME. Histopathologic diagnosis of fungal infections in the 21st
century. Clin Microbiol Rev.2011; 24: 247-280.
Beveridge TJ. Use of the Gram stain in microbiology. Biotechnic &
Histochemistry. 2001; 76: 111-118.

Prof. Manuela Lujn Velsquez

Alumno: GUEVARA CASTRO, Jhonatan.

Ingeniera Agroindustrial

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Seely. H; Van Demark, P. 1962. Microbios en accin. Manual de Laboratorio para

Microbiologa. Editorial Blume. Madrid-Espaa.
Murray P. Manual of clinical microbiology. 9th ed. USA: American Society for
Microbiology; 2007.

IX.

ANEXOS:
COLORACIN GRAM

Prof. Manuela Lujn Velsquez

Alumno: GUEVARA CASTRO, Jhonatan.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Ingeniera Agroindustrial

COLORACIN DE ESPORAS

COLORACIN DE CPSULA

Prof. Manuela Lujn Velsquez

Alumno: GUEVARA CASTRO, Jhonatan.