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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS


DEPARTAMENTO ACADMICO DE ALIMENTOS

PRACTICA 8 : DETERMINACION DEL NUMERO DE BACTERIAS


VARIABLES EN UNA MUESTRA
DOCENTE

: Blg. ALCEDO ROMERO, Margarita

CURSO

: MICROBIOLOGIA I

INTEGRANTES

PRINCIPE QUISPE MIRIAM


QUIROZ CASTILLO FLOR
VARGAS TINEO FRANKLIN

CICLO

: 2016 0

TINGO MARA PER

I.

INTRODUCCION

La determinacin del nmero de bacterias variables en una muestra, trata de


conocer el nmero total de microorganismos presentes en el alimento. Este
nmero no guarda relacin con el de microorganismos patgenos por lo que no
puede usarse como ndice de su presencia y slo debe considerarse un
indicador de las caractersticas higinicas generales del alimento.
Esta tcnica se basa en la presuncin de que las bacterias se hallan
normalmente distribuidas en un medio lquido, esto es, que las muestras
repetidas del mismo tamao de un mismo producto, debe esperarse contengan
el mismo nmero de grmenes como promedio, naturalmente algunas de las
muestras pueden contener algunos grmenes ms o menos. La cifra media es
el nmero ms probable. Si el nmero de grmenes es grande, la diferencia
entre las muestras sern pequeas; todos los resultados individuales estarn
prximos a la media. Si el nmero de grmenes es pequeo, las diferencias,
hablando relativamente sern mayores.

Es posible calcular el nmero ms probable de grmenes/100ml. con cualquier


combinacin de resultados obtenidos de tales muestras. Se han hecho tablas
para muestras de 10 ml, 1 ml y 0,1 ml, utilizando cinco o tres tubos para cada
tamao de la muestra y, para determinaciones en agua, utilizando una muestra
de 50 ml.

La presencia de coliformes fecales y Escherichia coli se usa para indicar una


contaminacin potencialmente peligrosa por el hecho de que el habitad natural
de estos microorganismos son las heces humanas y de animales de sangre
caliente.
II.
OBJETIVOS
Proporcionar conocimientos sobre la determinacin del nmero de
microorganismos de una muestra problema (alimento) y as determinar
su calidad microbiolgica.

III.
3.1.

MARCO TEORICO.
Principales mtodos de recuento del nmero bacterias en una

muestra
El nmero de bacterias puede determinarse directamente por recuento del
nmero total de clulas o indirectamente por la estimacin del nmero ms
probable, por filtracin o por el recuento de clulas viables en placa (clulas
capaces de dividirse en un medio de cultivo slido, tambin se refieren como
unidades formadoras de colonias, UFCs).
3.1.1. Recuento directo de bacterias al microscopio
Es una tcnica para determinar el nmero total de organismos de una muestra:
Se utilizan cmaras de recuento (cmara de Petroff-Hauser) y visualizacin al
microscopio. Es un mtodo rpido del nmero total de clulas de una muestra
pero no distingue entre viables o no viables.
3.1.2. Recuento directo con contadores electrnicos
Se utiliza el contador Coulter recuenta el nmero de clulas suspendidas en un
lquido, a su paso por un orificio por donde fluye la corriente elctrica. Se puede
determinar a su vez el tamao de las clulas pero tampoco distingue entre
viables, muertas o partculas.
3.1.3. Recuento en filtros de membrana
En este mtodo el recuento se realiza por filtracin de un volumen de la
muestra a travs de un filtro de membrana de tamao adecuado para retener a
las bacterias (0.22-0.45 m). Una vez filtrada la muestra, el filtro se coloca
sobre un medio de cultivo slido y se incuba. El recuento del nmero de
colonias formadas sobre el filtro determina el nmero total de bacterias en la
muestra filtrada. Es un mtodo til cuando el nmero de bacterias presentes en
la muestra es muy bajo. Se utiliza con frecuencia para determinar el nmero de
bacterias en agua.

3.2. Mtodos de recuento de bacterias viables en placa


Estos mtodos ofrecen la ventaja de cuantificar solo a las bacterias viables
presentes en una muestra. Implican la dilucin seriada de la muestra en agua,
caldo o solucin salina, la inoculacin de la dilucin en medio de cultivo slido y
la incubacin durante 24-48 horas a la temperatura apropiada y en placa son
mtodos de estimacin de bacterias viables en trmino de unidades
formadoras de colonias (UFCs). El nmero de unidades formadoras de colonias
de una suspensin bacteriana puede determinarse mediante dos tcnicas:
3.2.1. Recuento en placa por siembra en profundidad.
Consiste en aadir medio de cultivo fundido y enfriado a 50C sobre placa de
Petri que contiene una cantidad determinada de la muestra diluida. Se tapa la
placa y se rota para mezclar la muestra en el agar. Cuando el agar solidifica se
incuban las placas. Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en
la superficie. Es un mtodo generalmente utilizado para el recuento de
microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos.
3.2.2. Recuento en placa por siembra en superficie
Consiste en la siembra de un volumen conocido de la dilucin de la muestra
sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri. En este mtodo todas
las colonias crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta
tcnica para el recuento de bacterias aerobias.
3.3. Fases del crecimiento de un cultivo
3.3.1. Fase lag:
Es

un

perodo

de

adaptacin,

cuando

un

cultivo

de

microorganismos es llevado de un ambiente a otro. Los microorganismos


sufren una reorganizacin tanto en su velocidad de crecimiento como en
sus constituyentes macromoleculares. Durante esta etapa la masa
celular puede cambiar sin cambiar el nmero de clulas.

3.3.2. Fase exponencial:


Es un perodo de balance o de estado estacionario en el
crecimiento, durante el cual la velocidad especfica de crecimiento es
constante.
La composicin qumica del medio de cultivo est cambiando
debido a que los nutrientes se estn consumiendo y productos
metablicos son producidos.
3.3.3. Fase de desaceleracin:
La velocidad de crecimiento disminuye y los microorganismos
dejan de reproducirse empezando a entrar a la fase estacionaria.
3.3.4. Fase estacionaria:
Los nutrientes se agotan y los productos txicos se acumulan. La
masa total puede permanecer constante pero el nmero de clulas
puede descender. La tasa de crecimiento es igual a la tasa de muerte.
3.3.5. Fase de declinacin o muerte:

La tasa de muerte es mayor que la tasa decrecimiento. Los nutrientes se


agotan y se acumulan productos txicos.

3.4. Medida del crecimiento microbiano


Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes parmetros
algunos de los cuales presentar a continuacin. No debemos olvidar que en
condiciones de crecimiento equilibrado todos los parmetros del cultivo
evolucionan de forma proporcional y, por consiguiente, midiendo uno de ellos
(el de medida ms fcil) podemos medir el resto.
Entre los mtodos principales de recuento de microorganismos podemos
destacar:
3.4.1. Recuento celular microscpico directo
Se basa en colocar un volumen determinado de clulas sin fijar y
realizar el conteo utilizando microscopa de fase. Para ello se utiliza la
cmara de recuento de Petrof f- Hauser o de Newbauer consistente en un
portaobjetos con una excavacin de 0.02 mm de profundidad en un rea
de 1 milmetro cuadrado, con una rejilla dividida en 25 cuadrados grandes
los cuales a su vez se subdividen en 16 cuadrados de 4X4 o sea que la
muestra se distribuye en 400 celdillas.
3.5. Prueba de la reductasa
Esta prueba se aplica nicamente para leche fresca, puesto que su
enzima ayuda a la reduccin de sus componentes orgnicos y su anlisis con
el azul de metileno sirve de ayuda para evidenciar la velocidad del TRAM en
cada tipo de leche, y, de esta manera establecer la calidad de cada tipo de
leche, asimismo permite ver el desarrollo bacteriano de forma aproximada, no
precisa.
De manera general, esta prueba permite determinar el grado de
conservacin de los diferentes productos lcteos, prevalecientes en nuestro
medio, y as, por lo tanto, juzgar su calidad como leche de consumo. Por este

motivo la prueba de la reductasa es el factor principal que se debe tomar en


cuenta por el pago de las diferentes leches dentro de nuestro medio.

De esta manera una leche de buena calidad, segura para consumo


humano, es el resultado de reconocidas prcticas sanitarias observadas a lo
largo de las etapas de cada uno de sus procesos, desde la extraccin
pertinente de la misma, hasta llegar a su envasado.
El nmero de bacterias presentes en el producto final refleja las
condiciones sanitarias bajo las cuales la leche ha sido procesada y permite
determinar el periodo de preservacin de sta o de sus componentes
derivados. Las principales fuentes de contaminacin en la leche cruda por
presencia de microorganismos estn constituidas por superficies en el medio
ambiente.
Figura 1: Cmara de Newbauer.

3.4.2. Recuento en placa por siembra en profundidad.


Consiste en aadir medio de cultivo fundido y enfriado a 50C sobre placa
de Petri que contiene una cantidad determinada de la muestra diluida. Se
tapa la placa y se rota para mezclar la muestra en el agar. Cuando el agar
solidifica se incuban las placas. Las colonias se desarrollan tanto dentro
del agar como en la superficie. Es un mtodo generalmente utilizado para
el recuento de microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos.

3.4.3. Recuento de colonias o recuento estndar en placa


Se basa en contar las colonias de microorganismos que se desarrollan
despus de inocular en un medio de cultivo adecuado e incubar a una
temperatura y tiempo determinados un volumen determinado de muestra.
Se

utiliza

para

determinar

el

nmero

de

clulas

aisladas

microorganismos unicelulares viables como bacterias, levaduras, tambin


se utiliza para el conteo de esporas fngicas presentes en la muestra.
Figura 2: Recuento en placa dilucin de la muestra.

3.4.4. Recuento en filtros de membrana


En este mtodo el recuento se realiza por filtracin de un volumen
de la muestra a travs de un filtro de membrana de tamao adecuado
para retener a las bacterias (0.22-0.45 m). Una vez filtrada la muestra, el
filtro se coloca sobre un medio de cultivo slido y se incuba. El recuento
del nmero de colonias formadas sobre el filtro determina el nmero total
de bacterias en la muestra filtrada. Es un mtodo til cuando el nmero de
bacterias presentes en la muestra es muy bajo. Se utiliza con frecuencia
para determinar el nmero de bacterias en agua.
3.4.5. Recuento directo con contadores electrnicos
Se utiliza el contador Coulter recuenta el nmero de clulas suspendidas
en un lquido, a su paso por un orificio por donde fluye la corriente
elctrica. Se puede determinar a su vez el tamao de las clulas pero
tampoco distingue entre viables, muertas o partculas.

IV.

MATERIALES Y METODOS

4.1. Recuento estndar en placa


A. Materiales:
Placas de Petri estriles.
Tubos de ensayo son diluyente (9mL).
Frascos de dilucin con diluyente (90mL).
Pipetas estriles de 2 y de 5 mL.
Gradillas/plumones.
Mechero bunsen.
Incubadora a 35 / 24 h .

Cuentacolonias.
Agar plate count.
Diluyente: agua peptonada al 0.1%
Muestra de alimentos (QUESO).

B. Procedimiento:
i. Preparacin de las diluciones:
Si la muestra es

lquida, previamente homogenizar (agitar varias

veces) y luego tomar con una pipeta serolgica 1mL de la solucin


(muestra original) y colocar en un tubo de ensayo conteniendo 9mL de
diluyente.
Si la muestra es slida, pesar 10g y colocarlo en los frasco de
diluciones con 90mL de diluyente, proceder a homogenizar la muestra
con el diluyente (en caso de que la muestra sea dura proceder a
triturado o licuado segn requiera el caso).
Cambiar la pipeta y pipetear 10 veces el contenido del tubo para
homogenizar la muestra. Este correspondera a la dilucin

10

para

ambos casos.
Tomar 1mL del primer tubo o frasco de dilucin e introducirlo en un
segundo tubo de ensayo conteniendo 9mL de diluyente y proceder
igual a los descritos anteriormente. Este tubo corresponde a la dilucin
102 .
Para las dems diluciones repetir lo descrito anteriormente. Realizar
tantas diluciones como corresponde de acuerdo el estado de
contaminacin de la muestra.
ii. Recuento estndar en placas:
Tomar 1mL de las tres ltimas diluciones y colocarlas en placas de
petri vacas identificadas, hacerlo por duplicado (de acuerdo al grfico).
Realizar de igual modo con las otras diluciones.
Adicionar a cada placa petri con el inoculo, 15mL de medio de cultivo
fundido y temperado a

4045 , entre la preparacin de la dilucin y

de la adicin del agar no debe transcurrir ms de 10min.


Mezclar inmediatamente el inoculo con el agar,

mediante

movimientos de va y ven y rotacin. Espera que solidifique el medio


de cultivo. Y adicionar una capa delgada de agar (5mL) sobre el medio
solidificado y dejar secar.
Invertir las placas e incubar 35 2 / 24- 28 h.

Despus del tiempo transcurrido realizar la lectura correspondiente


con la ayuda de un cuentacolonias.
4.2. Prueba de la reductasa
A. Materiales:

Tubos de ensayo estriles.


Pipetas de 10mL estriles/gradillas.
Bao mara a 36 con tapa o estufa de 36 -37 .
Muestra de alimento: Leche cruda.
Reactivo: azul de metileno.

B. Procedimiento:
Colocar 1mL de solucin de azul de metileno en un tubo de ensayo
esterilizado.
Agregar 10mL de leche cruda.
Colocar los tubos con la muestra en bao mara a 36 - 37
asegurando que el agua cubra toda la muestra.
Cronometrar el inicio del periodo de la prueba de reduccin del azul
de metileno e invertir los tubos a cada 30min para redistribuir las
bacterias y la grasa.
Hacer la siguiente lectura 1h despus y as sucesivamente hasta que
la leche presente decoloracin.
Despus de cada observacin invierta, lentamente en su posicin
inicial.

V.

RESULTADOS Y DISCUSIN

5.1. Recuento estndar en placa

En el conteo de colonias se utiliz la maquina cuenta colonias


Figura 3: Maquina cuenta colonias

Figura 4: Conteo de colonias

La regla a utilizar es el siguiente.


Si:
b
> 2; se toma la menor dilucion .
a
b
< 2; se toma la media aritmetica .
a
Utilizaremos los dos por que las dems colonias sobrepasan la cantidad de;
300> x >30 ; en los dems grupos.
La frmula a utilizar es:
N=

XFd
(1)
inoculo

Donde el factor de dilucin es:


Fd=

1
(2)
dilucion

Eje:
4
Dilucin = 10

Fd=

1
=104
4
10

Cuadro 1: Conteo de colonias y su promedio.

Numero de microorganismos
Dilucione
s

Promedio en base

placa
1

placa
2

Promedio

10

328

315

321.5

321.5* 10

104

252

245

248.5

248.5* 10

105

157

165

161

161* 10

106
6

Media
Aritmtica

335.75 10

El inoculo que se utilizo fue de 1 mL.


Entonces Si:
b 161105
=
>2 se toma la menor dilucion .
a 248.510 4
4

248.510 colonia
N=
1 mL

N=248.5104

Unidades Formadoras de colonia


(mL)

5.2. Prueba de la reductasa


Tiempo de cambio de color

Clase de leche

1 a 3 Horas

Regular

Figura 3: resultado despus de 1 hora

VI.

CONCLUSIONES

Se aprendi correctamente el conteo de colonias y tambin el mtodo con


las reglas para obtener los resultados de UFC.
Existen diversos mtodos para contar colonias, el que se utiliza ms es el
Pour Plate; sirva para hacer el anlisis cuantitativo como el cualitativo.
Con la cmara de Newbauer se cuenta en cinco partes ce toda los cuadro
que tiene la cmara y se cuenta en el microscopio.
En la prueba de la reductasa, se pudo observar que la leche esta en
condiciones regulares.

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/recuento-de-

bacterias-viables/recuento-text
http://www.buenastareas.com/ensayos/Recuento-De-

Colonias/6099513.html
http://www.unad.edu.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/3

_4_3recuento.htm
http://es.scribd.com/doc/38138496/Recuento-y-Cuantificacion-de-

Microorganismos#download
http://www.unavarra.es/genmic/micind-2-3.htm.
http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/12-

metodos%20de%20recuento.htm
http://www.buenastareas.com/ensayos/An%C3%A1lisis-De-La-LechePrueba-De/3517332.html