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I n f o r m a c i n de n

Resumen

Palabras Clave:
Vscera de trucha
Fraccionamiento de tejidos
Anlisis proximal
Identificacin de protena
Identificacin de lpidos
Identificacin de carbohidratos

El procedimiento tiene como objetivo conocer la distribucin de las molculas biolgicas en una muestra animal, se toma una
muestra de tejido de viscera de trucha arcoris para la prctica y se realiza el fraccionamiento, se cuantific la distribucin de
diferentes tipos de biomolculas utilizando centrifugacin para la separacin de los componentes. El componente mayoritario
de la vscera de trucha segn el estudio es protena con un 28.46% en peso hmedo, tambin se obtuvo carbohidratos en un
8.22%, cidos nucleicos en 2.69% y lpidos en un 2.64% (todos valores calculados en % de peso hmedo). Adicionalmente se
obtuvo el % en peso de glucgeno y monosacridos-oligoscridos. Se realizaron pruebas cualitativas para la identificacin de
cada fraccin obteniendo resultados satisfactorios.
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Historia del artculo:

Fecha de entrega: 10 de Septiembre 2015

1. Introduccin
El estudio de un tejido animal se hace para obtener informacin de su
composicin y as asignarle o n un valor nutricional dentro de la dieta
humana. Los compuestos biolgicos estn hechos a partir de los mismos
elementos que se encuentran en otras molculas, en la mayora de ocasiones
predominan elementos tales como el carbono, hidrgeno, nitrgeno,
oxgeno, fsforo, y azufre. Mediante reacciones qumicas que se efectan en
la clula, se forman y rompen enlaces de acuerdo a mecanismos estudiados
por la bioqumica enzimtica, estas reacciones al ser catalizadas se llevan a
cabo a velocidades muy rpidas. En estas reacciones se forman una serie de
biomolculas que son importantes para el organismo, cmo protenas, que
son biopolmeros grandes formados por aminocidos que entre sus mltiples
funciones tienen las de tipo estructural y la funcin cataltica, los
carbohidratos son un grupo de biomolculas abundantes, que van desde los
azcares sencillos como glucosa, hasta sus polmeros como el almidn, la
celulosa o el glucgeno, en cuanto a los lpidos, son componentes
importantes de las membranas biolgicas, los ms sencillos son los cidos
grasos y glicridos, luego estn algunas molculas ms grandes como los
fosfolpidos y algunas molculas ms complejas como lipoprotenas de alta

densidad (HDL), los cidos nucleicos como ADN y ARN, son biopolmeros
conformados por los nucletidos, los cuales a su vez estn formados por un
azcar ribosa, una base nitrogenada como la citosina y al menos un grupo
fosfato. Se quiso estudiar la distribucin de cada grupo de biomolculas
utilizando la solubilidad diferencial y la centrifugacin en el tejido de trucha
arcoris para el fraccionamiento en sus principales constituyentes.

2. Materiales y Procedimiento
2.1 Toma de la muestra
Las vsceras de trucha no son de inters comercial por tal razn son difciles
de conseguir y fue necesario pescarlas por nuestra propia cuenta, la trucha fue
pescada en un centro de piscicultura de trucha arcoris ubicada en el municipio
de Jambal, Cauca. El pescado fue almacenado por 1 semana en congelador y
descongelado horas antes de la prctica para la obtencin de sus vsceras, estas
se lavaron para limpiarlas de materia fecal y tierra que podran ser fuente de
error para el anlisis. En el laboratorio se pes 14.0045 g de vsceras para iniciar
el proceso.

2.2. Fraccionamiento

El precipitado de protena se almacena para su caracterizacin, el

sobrenadante se utiliza para continuar el procedimiento.

2.2.1Triturado
La muestra de vsceras, como cualquier tejido biolgico, est conformado
de 3 componentes clulas, matriz extracelular y lquida tisular. Como el
objetivo es fraccionar todo el tejido es necesario macerar o licuar para
romper las membranas celulares y que sus constituyentes entren en contacto
con los solventes y reactivos utilizados. La totalidad de muestra pesada se
licua con cido tricloroactico a 4C y al licuado se le adiciona 1g de arena
que servir para separar los conglomerados y romper las membranas
celulares en el proceso de centrifugacin.

2.2.6. Aislamiento de cidos nucleicos:

En la fraccin de sobrenadante se encuentran cidos nucleicos disueltos en

solucin salina, se adicionan 40 mL de etanol en fro y se deja reposar la
solucin por 10 minutos, pasado este tiempo se centrifuga la solucin por 10
minutos para obtener los cidos nucleicos que precipitan este proceso se debe
a una accin combinada del cloruro de sodio el el etanol, el alcohol etlico
disminuye la constante dielctrica de la solucin lo que hace posible el cido
nucleico precipite con ayuda de la sal.

2.2.2. Aislamiento de carbohidratos:

2.3 Identificacin
A la muestra que se licu con 21 mL de cido tricloroactico (ATA) se le
adicion 1g de arena y se centrifug por 10 minutos. El proceso de
centrifugacin se utiliza para separar lquidos de slidos en este caso el
lquido es el ATA y todo componente del tejido que sea soluble en l,
qumicamente las nica molculas presentes que, a este pH, temperatura y
con ese tipo se solvente se disuelven son los carbohidratos, as protenas,
lpidos y cidos nucleicos precipitaran junto con la arena.

2.2.3. Separacin de polisacridos - oligosacridos:

Se toma el lquido de los tubos de centrfuga y se pone en un vaso en bao

de hielo, todo el proceso con ATA se hace a 4C o lo ms frio posible debido
a que los polisacridos sufren hidrlisis cida y la velocidad de la reaccin
aumenta con la temperatura, se agregan 40 mL de etanol fro, en este proceso
el glucgeno precipita ya que es menos soluble en etanol acuoso que los
monosacridos, se somete a centrifugacin por 10 minutos para acelerar el
proceso, en el sobrenadante quedan los mono y oligosacridos solubles en
etanol y el precipitado es en su mayora glucgeno. Se almacena cada
fraccin para su posterior identificacin.

2.2.4. Aislamiento de lpidos:

El sedimento de la extraccin de carbohidratos se saca sobre una caja de Petri

y se pesa, despus se trata con con 12 mL de una mezcla de
etanol:ter:cloroformo en proporciones 2:2:1, la polaridad de esta mezcla
solubiliza los lpidos de una polaridad media a una apolar mientras que la
protena, cidos nucleicos y arena permanecen como slido. Se lleva a
centrifuga por 5 minutos para garantizar la solubilidad de las grasas y la
sedimentacin del resto de componentes. Se separa la fraccin lipdica que
es el sobrenadante y se contina la separacin con la fase slida obtenida.

2.2.5. Aislamiento de protenas:

El precipitado obtenido al aislar los lpidos es solubilizado en 20 mL de

cloruro de sodio al 10% y se coloca en un bao de agua hirviendo por 40
minutos, despus de este proceso se centrifuga la solucin por 10 min y lo
que ocurre es que la protena desnaturalizada precipita mientras que los
cidos nucleicos que no sufren cambio en su estructura quedan en solucin.

2.3.1. Carbohidratos:

Se realiz tanto para glucgeno como para oligosacridos la reaccin general

de identificacin de carbohidratos (Ensayo de molisch). Esta reaccin sirve
para el reconocimiento de todo tipo de azcares. Se basa en el principio de
que los azcares, en medio cido fuerte se deshidratan formando furfurales,
tambin se realiz una prueba sometiendo a calentamiento una solucin de
oligosacridos en un crisol tapado con un papel filtro que se impregn con
|p-toluidina al 10%. Estos furfurales al reaccionar con el -naftol originan
complejos coloreados. La prueba es positiva para ambas muestras. Para
identificacin del glucgeno se agreg reactivo de lugol, que contiene yodo
y produce color al introducirse en la estructura del polisacrido. Tambin se
realiz prueba de Barfoed para oligosacridos en el que utilizo acetato de
cobre en bao mara para que este al reducirse a Cu 2O en poco tiempo
indicara la presencia de monosacridos.

2.3.2. Lpidos.

Se realiza una saponificacin de toda la fraccin lipdica con NaOH

concentrado en exceso, se utiliza como patrn una muestra de manteca
animal, el producto de la saponificacin se separa en 2 tubos, en 1 se hace
prueba para materia insaponificable mediante la adicin de gotitas de agua
ya que la presencia de esta provoca turbidez, en el segundo se agita la
solucin para promover la formacin de espuma que es evidencia de la
formacin de jabn de los steres de cidos grasos.

2.3.3. Protena

Se realiz la prueba de biuret para la identificacin en la cual al agregarse

una solucin a la muestra se produce un color azul oscuro por formacin del
complejo con el cobre.

2.3.4 cidos nucleicos

Se realiz una hidrlisis cida de la muestra para producir desoxirribosa e

identificarla por medio de reacciones de identificacin de los aldehdos, se
hizo por la reaccin con la 2,4-DFH.

4. Resultados y discusin

Componente

Peso (g)

Porcentaje en
peso hmedo
Glucgeno
0.2030
1.45
Oligosacridos
0.9481
6.77
Lpidos
0.3701
2.64
Protena
3.9860
28.46
cidos nuclicos
0.3764
2.69
Tabla 1 Distribucin de componente en vscera de trucha.
La diferencia de solubilidades entre los diferentes grupos de macromolculas
nos permiti medir la cantidad presente de cada uno en la muestra obteniendo
que los 2 compontes mayoritarios son protenas seguido de carbohidratos, la
suma de los pesos de las sustancias obtenidas representan un 42% del peso total
en la muestra hmeda, es decir que hay un 58% de muestra que corresponde
mayoritariamente a Agua pero tambin a minerales aunque estos se encuentran
muy pequeas proporciones.

La prueba de yodo se basa en la capacidad del yodo de

formar un complejo con la hlice formada por la amilosa,
la coloracin con almidn es muy notoria sin embargo la
estructura molecular del glucgeno no forma una hlice
sino que es ms ramificada en varias direcciones as la
interaccin con el yodo es menor y el color observado es
ms dbil en nuestro caso no se observ la reaccin.

Los lpidos se dividen en 2 grandes grupos, los saponificables y los no

saponificables, por esta razn al realizar la saponificacin como prueba de
identificacin la misma solucin servia para identficar cualitativamente la
presencia de los 2 tipos de lpido, los cidos grasos libre, triglicrido
fosfolpidos y dems grasa saponificable reaccina de la siguiente forma.

Las pruebas cualitativas de caracterizacin son especficas para cada sustrato y

evidencian que en realidad lo que se pes corresponde a lo que se planeaba
aislar con el procedimiento. Para las 2 fracciones que correspondan a
carbohidratos se realiz 2 pruebas generales de identificacin del furfural que
se forma por la deshidratacin de los azcares:
Ensayo de molisch: La prueba identifica el furfural que se produce por la
descomposicin del carbohidrato formando un complejo color prpura, la
reaccin es la siguiente.

Los estearatos de sodio formados tienen la propiedad de formar miscelas

adems disminuyen la tensin superficial del agua por esta razn forman
espuma cuando se agitan, esta prueba fue positiva para los lpidos aislados
como se esperaba ya que la fraccin saponificable constituye al menos un 97%
de la grasa total de un alimento.
Por otra parte la grasa insaponificable lo es porque carece de un ester o cido
graso en su estructura que le permita realizar la reaccin as se observa turbidez
al agregar gotas de agua pura al recipiente.
Para la protena se realiz la prueba de biuret, en esta una solucin de sulfato
de cobre en hidrxido de sodio forma un complejo de cobre con los enlaces
peptdicos la intensidad del color va a depender de la concentracin de protena
en la solucin, esta prueba se compar con un patrn de albmina y los
resultados fueron satisfactorios.

El ensayo con p-toloudina: esta prueba se hace por una descomposicin rpida
del carbohidrato con cido sulfrico y calor en un crisol, el vapor del
carbohidrato contiene furfural que reacciona con la p-toloidina produciendo un
color que va desde rosado a rojizo dependiendo de la concentracin de
carbohidratos, la reaccin que ocurre es:
Para cidos nucleicos el procedimiento que se realiz fue una hidrlisis cida
que rompe el enlace glucosdico entre la desoxirribosa y la base prica de esta
forma se puede realizar cualquier prueba de identificacin de aldehdos o para
ribosas y se evidenciara la presencia de cidos nucleicos indirectamente, esta
no es una prueba especfica para cidos nucleicos sin embargo como sabemos

que a la solucin se le ha tratado por centrifugacin con solventes para extraer

las dems fracciones si es una prueba suficiente para deducir que lo que est en
solucin son cidos nucleicos.

5. Conclusin
Las muestras biolgicas son matrices complejas debido al gran nmero de
molculas presentes y que pueden actuar como interferentes para una reaccin,
la aplicacin de la centrifugacin utilizando el principio de la solubilidad
diferencial permite que los principales constituyentes sean separados y que de
esta forma se puedan estudiar por separado.
El anlisis de los componentes de la vscera de trucha revel que es una buena
fuente de protena ya que esta representa un 28.46% del peso del alimento
comparado con un 20% que contiene un filete de pescado, tambin es un tejido
ms magro que la carne ya que slo contiene un 2.64 % de grasa.
Con excepcin del glucgeno aislado las dems fracciones reaccionaron como
se esperaba en las pruebas cualitativas lo que permite decir que el
procedimiento fue adecuado.

6. Referencias.
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