ELISA

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ELISA (acrnimo del ingls Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorcin
ligado a enzimas) es una tcnica de inmunoensayo en la cual un antgeno inmovilizado se detecta
mediante un anticuerpoenlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como
cambio de color o algn otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos
encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antgeno y que a su vez es
reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada.
La aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometrael antgeno en
la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular est presente en la
muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un
gran nmero de variables, tales como selecin de reactivo, temperatura, medicin de volumen y
tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la
prueba.
La interaccin antgeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un
paciente tiene una infeccin o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnstica, posee
diversas limitaciones que conviene conocer:
-En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa
necesariamente que el paciente est enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y
que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originara un falso positivo.
-En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que stos
pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sera el caso, por
ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo
ventana de la infeccin en el momento de realizar la prueba, o que estn infectadas por una cepa
extraa.

-En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antgenoanticuerpo.
En estos casos de diagnstico de enfermedad es recomendable la eliminacin (mediante
centrifugacin) de clulas de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un
resultado falso positivo, careciendo aqul de especificidad. Tambin, debemos tener en cuenta que
cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una
determinada poblacin, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha poblacin,
es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro mtodo de diagnostico
independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de
varios anticuerpos, simultneamente, frente a la misma infeccin en una muestra. El resultado del
western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos
diferentes estn presentes en el sujeto frente a esa infeccin. Entonces es cuando se diagnostica
como positivo a dicho paciente.
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es verstil, robusto,
simple en su realizacin, mediante el uso de la fase slida, una separacin fcil entre la fraccin
retenida y la fraccin libre.
Adems se han propuesto y desarrollado diferentes mtodos de amplificacin de la seal
(luminiscentes, cascadas enzimticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA
a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este mtodo ha tenido una enorme aplicacin en todos aquellos campos en los que se precisaba la
cuantificacin de productos mediante anticuerpos: diagnstico clnico, deteccin viral, clasificacin
de anticuerpos en isotipos, bsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
Contenido
[ocultar]

1 Dispositivos empleados en ELISA

2 Fases de un ensayo ELISA
3 Tipos de ensayos ELISA
4 Quimioluminiscencia
5 Marcadores enzimticos ms comnmente utilizados
6 Prueba ELISPOT
7 Enlaces externos

[editar]Dispositivos

empleados en ELISA

Se han ensayado numerosas fases slidas, desde los tubos de cristal de los orgenes a las actuales
microplacas de 96 pocillos de plstico tratado para aumentar su capacidad de absorcin (fenmeno
de superficie) de molculas y con fondos de pocillo pticamente claros para poder realizar las
medidas de densidad ptica en instrumentos especficos, espectrofotmetros de lectura de placas
que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se estn desarrollando dispositivos de
mayor capacidad, por ejemplo con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de 'screening'
masivo de los sistemas robotizados (HTS, 'High-throughput system')

Los lectores ELISA son espectrofotmetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de
los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotmetro convencional, con capacidad de
leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de
ELISA disponen de sistemas de filtros que slo permiten la lectura de una o pocas longitudes de
onda. Son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad ptica de los
cromgenos ms comnmente utilizados.

[editar]Fases

de un ensayo ELISA

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:

1. Conjugacion del anticuerpo o del antgeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa
alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e
indirectos, sandwich, etc. El antgeno marcado se emplea en ensayos de competicin de
antgeno. Dicha unin anticuerpo-enzima o antgeno-enzima ha de producirse durante un
determinado periodo de tiempo en aras de producir una solucin coloreada y que pueda
ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotmetro (normalmente a
una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la
reaccin, no se evidenciar ningn color, interpretndose este resultado como un falso
negativo, disminuyendo la sensibilidad de la tcnica.
2. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unin de anticuerpos o
antgenos se realiza con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen gran
afinidad por protenas. As, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe
realizarse cuidadosamente. Si se usa poco antgeno, se pueden obtener falsos positivos.
Por el contrario, si se usa demasiado antgeno, el exceso dar lugar a una reaccin falsa
negativa.
3. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno unido a la
placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antgeno marcado (ELISA directo) o
empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un secundario anti primario marcado
(ELISA indirecto). Este segundo mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir
uno o ms anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo
unido a la placa se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se ensayan

diferentes relaciones de antgeno fro frente a una cantidad fija de antgeno marcado. Es el
ensayo de competicin del antgeno. En esta etapa es muy importante controlar los
factores tiempo y temperatura de incubacin para evitar la aparicin de falsos negativos.
En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrir la interaccin antgenoanticuerpo y el color no ser evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su
parte, si la temperatura de incubacin es muy baja, la formacin del complejo antgenoanticuerpo tampoco se completar en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta,
las protenas (antgeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto disminuyen su
capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos.
4. Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todos las
molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se aade el sustrato
enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica (D.O.) mediante
espectrofotometra.

[editar]Tipos

de ensayos ELISA

Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificacin de
un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin (por ejemplo en el clonaje de
anticuerpos monoclonales) o la determinacin de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A
continuacin se describen los ms comunes.

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan
recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antgeno.
Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antgeno en la solucin
analizada. Es necesario incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo de las
analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno
buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno
buscado).

ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos

anticuerpos: uno primario contra el antgeno y uno secundario marcado contra el primario. La
deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal debida a la unin
de dos o ms anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo ms popular, como lo es
la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema
enzimtico permite cuantificar una gran variedad de antgenos, por eso es un mtodo ms
polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisin por tener un eslabn ms con respecto
al mtodo directo. La dilucin de la solucin que contiene el anticuerpo primario (por ejemplo:
suero sanguneo) es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparicin de
falsos negativos, ya que si la muestra est muy diluida no saldr positiva si la titulacin de
anticuerpos es muy baja. Es decir, aunque los anticuerpos estn presentes, la prueba no da
positivo porque la concentracin de anticuerpos especficos contra el antgeno que est pegado
en el fondo del pocillo no es suficiente como para dar una seal detectable.
El ELISA indirecto es el mtodo de eleccin para detectar la presencia de anticuerpos
sricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del sndrome
de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Segn esta tcnica, protenas recombinantes de la
envoltura y el ncleo del VIH se absorben como antgenos en fase slida a los pocillos. Las
personas afectadas de VIH producen anticuerpos sricos contra eptopos en estas
protenas vricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos sricos contra
VIH desde las primeras seis semanas de una infeccin.

ELISA sndwich (Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos).

Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer
anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra
problema en la que se encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser
reconocido por el primer anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material
no retenido se aplica una solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As
pues cada molcula de antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y
un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y
sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.

[editar]Quimioluminiscencia

Durante determinadas reacciones qumicas, la luz generada por este fenmeno constituye una
alternativa conveniente y muy sensible para las mediciones de absorbancia en ELISA. Los tipos
de ELISA que recurren a la quimioluminiscencia utilizan un sustrato que genera luz, en lugar del
sustrato cromgeno de las reacciones ELISA ordinarias. Tales son los casos de la oxidacin del
compuesto luminol por perxido de hidrgeno y la enzima peroxidasa de rbano (HRP), que
producen luz.
La luz que se genera en dichas reacciones puede detectarse gracias a su capacidad de
sensibilizar una pelicula fotogrfica. La medicin cuantitativa de la emisin de luz puede
hacerse mediante el uso de un luminmetro. La ventaja de las pruebas de quimioluminiscencia
sobre las cromgenas es la mejora de la sensibilidad. En general, el lmite de deteccin puede
aumentarse al menos diez veces si se cambia un sustrato cromgeno por uno que emita luz, y
ms de doscientas veces cuando se adicionan agentes potenciadores.

[editar]Marcadores

enzimticos ms comnmente utilizados

En la tabla siguiente se recogen los marcadores enzimticos ms comnmente empleados en

ensayos ELISA, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo de prepararlos.
Enzima Sustrato Tampn

HRPO (peroxidasa de rbano) OPD 10 mg/25 mL de tampn citrato sdico 0.15 M pH 5;

aadir microL de 30% perxido de hidrgeno 30%

TMB 2.5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampn citrato sdico 0.1M pH 6; aadir
5 microL de perxido de hidrgeno 30%

ABTS 60 mg/100 mL de tampn citrato sdico 0.1 M pH 6; aadir 35 microL de perxido de

hidrgeno 30%; parar con fluoruro sdico 1.25%; leer a 405 nm

DAB 10 mg/20 mL de tampn Tris 50 mM pH 7.4; filtrar y aadir 20 microL de perxido de

hidrgeno 1%

CNP 6 mg en 1 mL de metanol; aadir 10 mL de tampn Tris 50 mM pH 7.4; filtrar y aadir

40 microL de perxido de hidrgeno 30%

AEC 80 mg en 1 mL de N,N'-dimetilformamida + 200 microL de tampn acetato 0.1

M pH 4.5; filtrar y aadir 50 microL de perxido de hidrgeno 30%

ASA 80 mg/100 mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6.0 con 1 mM NaOH y aadir
10 % por volumen de 0.05% perxido de hidrgeno; parar con 25 microL de NaOH 1 M

AP (Fosfatasa alcalina) PNPP 5 mg/5 mL de tampn dietanolamina-HCl 0.1 M pH 9.8 +1

mM cloruro de magnesio

NAPFB (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de

vidrio, (B) 10 mg de sal Fast Blue BB/ 10 ml de tampn Tris 0.05M pH 9.2 - 2 mM cloruro de
magnesio. Mezclar A + B y filtrar.

NAPR (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio,

(B) 10 mg de sal Red BB/ 10 ml de tampn Tris 0.05M pH 9.2 - 2 mM cloruro de magnesio.
Mezclar A + B y filtrar.

BCIP 1 mg/mL en solucin AMP (2-amino-2-metil-propanol)

beta-G ONPG 2.5 mg/ml en tampn fosfato sdico 0.1 MpH 7.0 + 1 mM cloruro de
magnesio + 0.1 M beta-mercaptoetanol

ureasa BP 8 mg/1.48 ml de 0.01M NaOH; llevarlo a 100 ml con agua desionizada; aadir
100 mg de urea y EDTA a 0.2 mM; ajustar el pH a 4.8 con 1 mM NaOH o HCl; almacenar a
4 C

PG IS Aadir a cada placa de ELISA 25 microL de cada uno de los reactivos siguientes en
secuencia : (A) 1% (peso/vol) gelatina en 0.1 M tampn fosfayo pH 7.0, (B) 1% (peso/vol)
almidn en agua destilada caliente, (C) 3.04 mg/mL de benzil-penicilina en 0.1 M tampn
fosfato pH 7.0 (5000 U/mL), (D) 0.01 N ioduro en 0.1 M KI solucin stock (en una botella
oscura).

[editar]Prueba

ELISPOT

Una variante de la prueba ELISA, llamada ELISPOT, es capaz de detectar cuantitativamente el

nmero de clulas en una poblacin productora de anticuerpos especficos contra un antgeno
determinado o un antgeno contra el que se dispone de un anticuerpo especfico. Aqu, las
placas se recubren con el antgeno reconocido por el anticuerpo de inters o con el anticuerpo
especfico para el antgeno cuya produccin se valora. Seguidamente, se aade a las placas
recubiertas una suspensin de la poblacin celular que se investiga e incuba. Las clulas se
disponen en la superficie de la placa, y las molculas secretadas reactivas a las molculas de
captura son unidas en la cercana de las clulas secretoras, producindose un anillo de
complejos antgeno-anticuerpo alrededor de cada clula que sintetiza la molcula de inters.
Despus, la placa se lava y un anticuerpo unido a enzima especfico para el antgeno
secretado, o para la especie de anticuerpo secretado, se aade y deja que se unan. El posterior
revelado del ensayo mediante adicin de un sustrato cromgeno o emisor de luz adecuado,
indica la posicin de cada clula productora de anticuerpo (o de antgeno) como un punto de
color o luz.
Otras pruebas de laboratorio para confirmar la presencia de anticuerpos del VIH, incluyen la
inmunoelectrotransferencia o examen de Western Blot, la inmunofluorescencia y la
radioinmnoprecipitacin o RIPA.

Exmenes de Laboratorio (Pruebas) para VIH/SIDA

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Qu Son Las Pruebas De Anticuerpos?
La prueba de anticuerpos no es una prueba para el SIDA. No puede indicar si una persona se va a
enfermar con el SIDA. Lo que esta prueba indica es si se han desarrollado o no los anticuerpos
especficos al VIH por la infeccin con el virus.Ventajas Y Desventajas De Tomar La PruebaVentajas

Las personas que saben que tienen el virus pueden comenzar a recibir tratamiento mdico
temprano y monitorear el estado de su sistema inmunolgico.

Los resultados pueden ayudar a una persona a evitar comportamientos de alto riesgo.

La prueba ayuda a mantener un compromiso de mantener buenos hbitos de salud.

Las personas que resultan ser negativas se sienten menos ansiosas.

Las personas que desean un hijo pueden buscarlo sin el temor de la infeccin.

Desventajas

Las personas que resultan ser positivas pueden deprimirse y tener mucha ansiedad.

Cuando la prueba no es annima o totalmente confidencial, existe el riesgo de perder el

trabajo o el seguro mdico.

La decisin de tomar la prueba es una opcin muy personal. No podemos tomar esa decisin en lugar de
nadie. Solamente podemos aconsejar a las personas sobre los efectos que la prueba puede tener en sus
vidas. La decisin es suya.

Periodo De Ventana
"El periodo de ventana" o periodo de espera es el tiempo que una persona infectada tarda en desarrollar
los anticuerpos al virus. Para el 97% aproximadamente de las personas infectadas, el periodo de ventana
es de 3 meses. Despus de 6 meses casi todas las personas que tengan el virus habrn desarrollado
anticuerpos al mismo. Un resultado negativo 6 meses despus del ltimo riesgo es suficiente para
descartar la posibilidad de infeccin.Algunas personas han oido que los anticuerpos son detectables antes
de tres meses. Es cierto que la mitad de las personas infectadas tienen anticuerpos
detectables tres semanas despus de la infeccin, pero se estableci un periodo de espera de tres
meses para que los resultados fueran confiables para casi todo el mundo.
Nota de GeoSalud: el perodo de ventana con las ltimas pruebas ELISA de cuarta generacin
vara de 10 a 14 das. Este periodo puede prolongarse mximo por 6 meses. Actualizado 24 octubre
2009

El periodo de espera de tres meses es vlido para el 97% de la poblacin. Tres meses
despus de haberse expuesto al VIH la mayora de las personas pueden confiar en los
resultados de la prueba.

A veces las personas estn muy angustiados y desean hacerse la prueba poco despus de
la situacin de riesgo. Preguntan cosas como "qu tan confiable es la prueba despus de
seis semanas de ponerme en riesgo?". No lo sabemos con certeza.
Si usted toma una prueba seis semanas despus del riesgo y le sale negativa, se quedara
ms tranquilo/a? Si es as, vaya a hacerse la prueba. Pero recurdale que para tener una
certeza total, debe repetir la prueba otra vez a los seis meses del riesgo.

Algunas personas han oido que el VIH toma aos en detectarse. Los sntomas del
SIDA pueden tomar aos en desarrollarse, pero el VIH es detectable a los tres meses de la
infeccin, y resulta asintomtico para casi todo el mundo.

Interpretacin De Los Resultados

Un resultado positivo significa:

Que la persona es VIH-positiva.

Que es portadora del virus y debe tomar precauciones para no transmitirle el virus a alguien
ms.

Un resultado positivo NO significa:

Que la persona tenga el SIDA.

Que necesariamente vaya a desarrollar el SIDA.

Que sea inmune al SIDA por tener los anticuerpos.

Un resultado negativo significa:

Que no se encontraron anticuerpos al VIH en la muestra de sangre.

Un resultado negativo NO significa:

Que la persona no tenga el HIV

Que la persona sea inmune al VIH o SIDA.

Que tenga resistencia a la infeccin.

Que nunca vaya a desarrollar el SIDA.

Un resultado "indeterminado" de la prueba Western Blot (poco comn) significa:

Que todo el procedimiento de prueba debe repetirse con otra muestra de sangre,
normalmente varias semanas ms tarde.

Los Tres Tipos de Pruebas

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

IFA (Immunofluorescent Assay)

Western Blot

La prueba de ELISA es la primera que se hace porque resulta barata, sencilla y da resultados confiables.
Si la prueba de ELISA sale negativa, no se hacen ms pruebas. Cuando sale positiva, es preciso practicar
la IFA o la Western Blot para confirmar los resultados.
Continuar leyendo aqu: Confiabilidad De Las Pruebas De Anticuerpos

Carga viral
Carga viral es la cuantificacin de la infeccin por virus que se calcula por estimacin de la cantidad
de partculas virales en los fluidos corporales, como por ejemplo ARN viral por milmetros de sangre.
La carga viral se usa para control teraputico de virosis cronicas y control de pacientes
inmunosuprimidos como los que han recibido trasplantes de rganos o de clulas
madrehematopoeticas o de mdula sea.
Las mediciones de carga viral ms frecuentes en la actualidad son para casos de infeccin
por VIH, citomegalovirus y de hepatitis viral C y B.

Contenido
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1 Carga viral de VIH

2 Carga viral en hepatitis B y C
3 Carga viral de citomegalovirus
4 Cuantificacin de carga viral
o

4.1 PCR

4.2 NASBA

4.3 Amplificacin Q

4.4 Amplificacin ADN en rama

4.5 Otros mtodos

5 Referencias
6 Bibliografa

[editar]Carga

viral de VIH

En el diagnstico y tratamiento del sida la carga viral es la cuantificacin de VIH-1 que se encuentra
en el plasma o cuantificacin del RNA vrico que existe en una muestra. El mtodo empleado
consiste en tcnicas de biologa molecular o de diagnstico gentico ,usando la reaccin en cadena
de la polimerasa.
La carga viral resulta un marcador de la actividad del VIH-1 y junto con la determinacin
de CD4 miden la competencia del sistema inmune del paciente.
La determinacin de la carga viral plasmtica (CV) del VIH es el marcador de respuesta al
tratamiento al tratamiento antirretroviral ms sensible, rpido y fiable. La CV se correlaciona
directamente con el pronstico clnico, el riesgo de transmisin viral y el recuento de CD4. Es una
herramienta bsica en el manejo clnico del paciente seropositivo ya que permite:
-Detectar el fracaso teraputico con rapidez.
-Ayuda a modificar el plan teraputico antes de que se desarrollen complicaciones clnica
-Permite sospechar interacciones medicamentosas, alteraciones farmacocinticas o una adhesin
teraputica insuficiente.
La inhibicin de la replicacin viral mediante el tratamiento antirretroviral retrasa la progresin de la
enfermedad, prolonga la esperanza de vida, mejora la calidad de vida y disminuye los efectos
adversos de la medicacin.

[editar]Carga

viral en hepatitis B y C

Junto con genotipificacin viral, la deteccin cuantitativa de RNA est indicada en los casos de
hepatitis por VHB y VHC que sern sometidos a terapia antiviral con el fin de evaluar el pronostico y
respuesta virolgica.
Para el pronostico se considera que a mayor carga viral basal, menor probabilidad de una respuesta
sostenida.
La respuesta al tratamiento antiviral se evala con una carga viral basal (pre-tratamiento) y al menos
una carga viral al trmino de ste y a las 24 semanas post tratamiento. Se considera una buena
respuesta al tratamiento antiviral si se obtiene una carga viral indetectable al trmino del tratamiento
y una carga viral indetectable y/o RNA cualitativo negativo a las 24 semanas (respuesta viral
sostenida). Igualmente se ha determinado que una carga viral temprana (respuesta viral precoz),
con cada de 2 log 10 o ms a las 4 12 semanas intra-tratamiento, permite evaluar precozmente la
probabilidad de obtener una respuesta virolgica sostenida al trmino de la terapia.
En caso del VHB la carga viral permitir adems, detectar la infeccin con mutantes pre-core (hasta
40% en zonas de alta endemia) donde existe ausencia de antgeno e (HBeAg) y por el aumento
significativo de la carga viral detectar la aparicin de mutantes resistentes a los medicamentos
antivirales.
Los mtodos ms utilizados para la carga viral de VHB y VHC son aquellos que utilizan la
amplificacin del RNA (PCR competitiva; PCR en tiempo real) o la amplificacin de seales
(DNA ramificado, bDNA) pero presentan limitaciones importantes pues tienen diferentes rangos de
deteccin y an no poseen un denominador comn de medicin, por lo tanto no son equivalentes ni
comparables. Por tal razn los nmeros absolutos expresados en ellos son referenciales y la
evaluacin de una cada significativa de una carga viral debe ser evaluada siempre en funcin de la
diferencia en logs en base 10.1

[editar]Carga

viral de citomegalovirus

La cuantificacin viral del CMV se recomienda para control y tratamiento de pacientes

inmunodeficientes como los que sufren de Sida o reciben medicamentos inmunosupresores como
parte de su tratamiento con trasplantes y en los cuales el citomegalovirus puede producir serias
complicaciones como afeccin oportunista que ocasiona mayores tasas de morbilidad y mortalidad .
La carga viral se requiere para monitorizacin de la profilaxis y del tratamiento preventivo o curativo
con medicamentos antivirales que se recomienda en los casos de trasplante dado que el CMV es el
agente patgeno ms importante que afectan los casos de trasplante por su correlacin directa con
el rechazo del injerto u rgano trasplantado. Se recomienda su realizacin semanal, al menos
mientras el paciente permanezca ingresado.2 3

Igualmente la carga viral existente en lquido amnitico es un factor predictivo de la transmisin

intrauterina y los nios con infeccin congnita sintomtica excretan mas virus en orina que aquellos
con infeccin asintomtica, aunque todava no se ha podido relacionar la carga viral con el
pronostico en nios infectados de las complicaciones y secuelas de la infeccin por CMV como
la hipoacusia neurosensorial.4
Las tcnicas usadas para carga viral de CMV son la de PCR cuantitativo o Reaccin en cadena de
la polimerasa y las de inmunoensayo.

[editar]Cuantificacin

de carga viral

Existen diferentes tcnicas para poder cuantificar la carga viral. Entre todas ellas podemos destacar
las siguientes: PCR, NASBA, Amplificacin Q y Amplificacin en rama.
Todos estos sistemas (a excepcin de la Amplificacin Q) se encuentran actualmente en el
mercado. Aunque presentan una buena correlacin entre s, es recomendable utilizar el mismo
mtodo para determinar la carga viral a lo largo de la terapia de un paciente, pues puede haber
variaciones en los resultados.
Adems, es muy importante tener en cuanta la existencia de diferentes cepas de un mismo
microorganismo. Esto implica que un sistema puede ser ms sensible a una cepa que otro y, por
tanto, ms recomendable.

[editar]PCR
Esta tcnica se basa en la amplificacin de la diana de manera exponencial mediante replicacin. La
sonda empleada y la seal no son amplificadas (algo que s ocurre en alguna de las tcnicas
descritas ms abajo en este mismo documento). Se requiere adems de equipamiento:
un termociclador que permita el cambio secuencial de temperaturas (95 C, 72 C, 47 C)
caracterstico del proceso de Reaccin en Cadena de la Polimerasa (conocido como PCR).
PCR: conceptos
Partimos de una poblacin de pacientes que han resultado ser seropositivos tras la prueba
diagnstica ELISA. A continuacin procedemos a realizar una PCR a todos estos individuos, de
modo que se obtiene un recuadro parecido al ELISA, solo que en este caso la probabilidad de error
es menor:

FP

VP

VN

VN

HIV-

HIV+

En base a ello, esta tcnica presentar los mismos parmetros que el resto de pruebas
diagnsticas, a saber:
Sensibilidad: mnima cantidad de ADN que se necesita para obtener una gran cantidad de copias.
La tcnica es ms sensible cuanto menor es la cantidad inicial de ADN que hay que suministrar para
obtener una gran amplificacin de la misma en poco tiempo. Se relaciona con los FN, que son los
pacientes que han resultado negativos en la PCR siendo realmente enfermos, dado que cuanto
menor sean los FN resultantes de la prueba, ms sensible ser. Se=VP/(FN+VP)
Especicidad: generacin de un nico producto de amplicacin. No interesa tener mucha cantidad
amplificada, sino obtener pocas copias pero que nos aseguren que esos pacientes no poseen el
HIV, es decir, nos interesa tener una sola banda que asegure que el paciente es negativo,
minimizando la presencia de dobles bandas que originen FP, para ello la temperatura de hibridacin
de los oligos ha de ser adecuada. Cuanto menor falsos positivos resulten de la prueba ms
especfica ser. Sp=VN/(FP+VN)
Ambos parmetros correlacionan, de modo que un incremento de la sensibilidad de una prueba
promueve una disminucin de la especificidad de la misma, y viceversa.
Por otro lado, la PCR tambin presenta una serie de parmetros propios, tales como:
Eciencia: mxima produccin de amplicacin en funcin del nmero de ciclos. Cuanto ms tarda
en llegar a la fase de meseta (o plato de la fase exponencial) ms eficaz es el proceso.
Fidelidad: nmero de errores que comete la ADN polimerasa durante la copia. Cuando lo que
interesa de la PCR es detectar simplemente la presencia del virus en clulas del paciente,
solamente hay que analizar la presencia o ausencia de amplificacin (analizar las bandas de
electroforesis). En este caso por tanto la fidelidad de la PCR es irrelevante, dado que no se va a
realizar un estudio pormenorizado de la secuencia amplificada, lo que indica que la introduccin de
errores en la misma no afecta al experimento. No obstante, si lo que se va a realizar es un estudio
de secuenciacin en el que se estudia la secuencia de cada virus para poder diferenciar diferentes
variantes del mismo, la fidelidad de la tcnica debe ser lo ms alta posible, dado que pequeas
modificaciones en la secuencia amplificada pueden originar graves errores. Una tcnica de PCR
poco fiel puede dar lugar a la presencia de muchos falsos negativos.

De entre los distintos tipos de PCR existentes, los usados para determinar la carga viral son:
PCR competitiva: actualmente en desuso debido a que se trata de una tcnica que requiere
manipulacin del operario para obtener los resultados del proceso. Slo es posible detectar el
producto final, lo que conseguirmos gracias al empleo de quimioluminiscencia.
La sensibilidad obtenida tiene un valor medio, se necesitan ms de 178 moleculas iniciales del virus
para poder llevar a cabo la amplificcin.
PCR cuantitativa: la usada actualmente, ya que el proceso se encuentra facilitado por su
automatizacin. El empleo de sondas Taqman facilita la deteccin de la amplificacin, obtenindose
los resultados durante todo el proceso a tiempo real. La sensibilidad obtenida es elevada, slo son
suficientes 40 molculas vricas para llevar a cabo la amplificacin.

[editar]NASBA
Su denominacin se corresponde con las siglas del nombre de esta tcnica en ingls: Nucleic Acid
Sequence Based Amplification. El proceso se basa en una amplificacin isotrmica de cidos
nucleicos. Dicha amplificacin comienza por seis pasos nicos (1 fase) a partir de los cuales se
forma un bucle de otros seis pasos consecutivos que sern los que realmente amplifiquen la
secuencia diana (2 fase).Con este mtodo se obtiene una amplificacin de nuevo de la diana, pero
en esta ocasin mediante transcripcin (y no por replicacin como ocurre en PCR). Al igual que en
PCR, se consigue una amplificacin exponencial, sin embargo en esta ocasin es mucho ms
rpida que en la PCR (ya que PCR amplifica slo de dos en dos y esta mucho ms). Cuenta
adems con la ventaja de no necesitar un termociclador, pues el proceso es isotrmico y se lleva a
cabo en un bao a una determinada temperatura. La tcnica ha sido diseada especialmente para la
deteccin de virus de ARN, aunque tambin nos sirve para otros microorganismos difciles de
detectar como las Chlamidias mediante la amplificacin de los ARNm. Adicionalmente puede ser
empleada para la deteccin de ADN.
Para la realizacin de NASBA la muestra susceptible de poseer ARN vrico se incuba junto con una
mezcla de tres enzimas (retrotranscriptasa, ARNasaH o II y T7 ARNpolimerasa) y dos cebadores (a+
complementario al extremo 5' y b- complementario al extremo 3', b- adems se encuentra unido a
una secuencia promotora T7).
El tubo que contiene todos estos componentes se ha de introducir en el bao que se encuentra a la
temperatura idnea para la hibricacin de los cebadores y la actuacin de las enzimas.
1 fase

1 paso: el oligo b- (constituido por el cebador y el promotor de T7) se una a su secuencia

complementaria especfica presente en el extremo del ARN (o ADN) del virus que
deseamos estudiar y detectar. (Suponemos obviamente que el virus est presente en la
muestra, ya que en caso contrario no se producira el proceso NASBA de amplificacin).
2 paso: la enzima retrotranscriptasa sintetiza un ADN complementario a la secuencia inicial
de ARN diana mediante la elongacin del cebador b-.
3 paso: la enzima RNAasa degrada la hebra de ARN del heterodplex ADN/ARN,
quedando libre y expuesta la hebra de ADN complementaria.
4 paso: el oligo a+ se une a la hebra de ADN mediante hibridacin.
5 paso: la enzima retrotranscriptasa elonga el oligo, creando otra cadena de ADN. Por
tanto tenemos un ADN de doble cadena unido a un promotor T7P en uno de sus extremos.
6 paso: gracias a la presencia del promotor, T7 ARN polimerasa es capaz de actuar y estar
siempre transcribiendo. Obtenemos de esta forma numerosos ARN complementarios de la
diana original.
2 fase
7 paso: el cebador a+ hibridar con el extremo 3' de ARN complementarios de la diana
sintetizados en el paso anterior.
8 paso: la enzima retrotranscriptasa elonga los cebadores a+, obtenindose unas nuevas
hebras de ADN complementarias a las de ARN que emplean como molde. Tendremos por
tanto heterodplex ADN/ARN.
9 paso: la enzima ARNasa acta de nuevo hidrolizando el ARN de estos heterodplex y
liberando las hebras de ADN, que quedan expuestas en el medio.
10 paso: a estas hebras de ADN se unen los debadores b-.
11 paso: la enzima retrotranscriptasa acta elongando el conjunto formado en el paso 10,
obtenindose ADN de doble cadena unido por uno de sus extremos a un promotor T7P.
12 paso: por ltimo la T7 ARN polimerasa acta sobre su respectivo promotor
producindose de nuevo mlteples copias de ARN complementarios a la cadena diana
original. Volvemos de nuevo al paso 7.
Estos seis ltimos pasos constituyen un
bucle. Este ciclo se repetir ya de forma
continua hasta que detengamos el proceso
(inactivando las enzimas por
desnaturalizacin, sacando el tubo del bao
isotrmico...).

^Para amplificar ADN en lugar de ARN,

re requiere un paso adicional consistente
en una desnaturalizacin que posibilitar
la unin del cebador b- con el promotor
de la T7 ARN polimerasa mediante la
enzima retrotranscriptasa.

El objetivo buscado es detectar la cantidad

inicial de virus, es decir, la carga viral. Con
NASBA podemos seguir dos procedimientos
de cuantificacin:
Electroquimioluminiscencia (ECL): se
emplea el producto final del proceso NASBA
para cuantificar. Para ello junto a la muestra
de partida sobre la que realizamos NASBA,
se aaden tres calibradores internos cuya
secuencia es idntica a la diana objeto de
nuestro estudio salvo en 20 pares de bases
que sern especficos de cada uno de ellos.
Estos calibradores se encontrarn a unas
concentraciones conocidas previamente:
baja, media y alta respectivamente. Tras los
sucesivos pasos de amplificacin, y una vez
terminado el proceso, la mquina que ha
realizado el NASBA automticamente dividir
la muestra en cuatro fracciones: diana,
calibrador a baja concentracin, calibrador a
concentracin media y calibrador a elevada
concentracin. Cada una de estas fracciones
amplificadas hibridar con una sonda
complementaria a los 20 pares de bases
diferentes de cada amplicn. Dichas sondas
contienen adheridas esferas magnticos con
estreptavidina. Las esferas se encuentran
unidas a un electrodo, y a esta mezcla se
aade otras sondas inespecficas con ruterio,
que tambin hibridarn con la secuencia
amplificada. Una descarga elctrica disparar

la reaccin de electroquimioluminiscencia,
desprendindose una luz proporcional al
nmero de copias iniciales de la secuencia
diana. Comparando el resultado de la
secuencia diana con los tres controles cuya
concentracin nos era conocida seremos
capaces de obtener la carga viral inicial.
Balizas moleculares u oligobalizas: este
mtodo permitir cuantificar a tiempo real. A
la mezcla inicial de reaccin se han de aadir
unas sondas especficas denominadas
balizas moleculares (Molecular beacon en
ingls). Se tratan de unas secuencias con
extremos complementarios entre s de unos 5
pares de bases, pero que no son
complementarios a la secuencia diana. Unido
a uno de los extremos presentan un
fluorocromo, mientras que en el extremo
opuesto hay una molcula que inhibe al
fluorocromo cuando est prximo a ste.La
zona situada entre estos dos extremos ser la
complementaria a la diana. Las oligobalizas
cumplen estas mismas caractersticas, pero
adems funcionan como oligos para la
amplificacin.
Por tanto, cuando no exista secuencia diana
con la que puedan hibridar, los extremos
complementarios hibridarn entre s y el
fluorocromo estar inactivo. Pero cada vez
que NASBA pase por el paso 6 o 12 las
balizas moleculares se unirn a las
secuencias complementarias del ARN diana
amplificadas, separndose sus extremos y
quedando liberado el fluorocromo, que emitir
una fluorescencia proporcional al nmero de
hebras de ARN. Esto posibilita la

cuantificando de la carga viral en cada uno de

los ciclos.
El xito de esta tcnica frente a la PCR
tradicional radica en que tras cada ciclo la
secuencia diana no se copia en dos, sino en
unas 1000 gracias a la T7 ARN polimerasa.
Sin embargo, NASBA tambin presenta
limitaciones: pueden aparecer fcilmente
falsos negativos y falsos positivos, haciendo
que no sea tan sensible y especfica como lo
sera la PCR en Transcriptasa inversa (RTPCR). Esto tiene como consecuencia que,
aunque sea adecuada para cuantificar,
NASBA no debe ser empleada para confirmar
o desmentir la presencia de ARNm de un
determinado virus, ya que no es demasiado
fiable. Para esto ltimo sera recomendable
emplear RT-PCR en su lugar.

[editar]Amplificacin Q

Amplificacin Q.

Mediante esta tcnica se amplifica la sonda

especfica que se une a la secuencia de
inters (en este caso, del genoma viral), en
lugar de amplificar tal secuencia, como ocurre
en otros mtodos. Para lograr la amplificacin
de la sonda, se utiliza la enzima Q replicasa,
que es una polimerasa de ARN dependiente
de ARN del bacterifago Q que reconoce
una estructura terciaria de ARN metaestable.
Mediante este mtodo se puede amplificar
tanto ARN como ADN (este ltimo debe ser
previamente desnaturalizado para que sea
ADN de cadena simple).
Se emplean dos tipos de sonda:

Sonda sealizadora: se disea

partiendo de la estructura de ARN
metaestable que reconoce la enzima Q
replicasa. En esta estructura de ARN se
clona una secuencia complementaria a la
diana buscada (se unir una sonda
sealizadora por molcula de genoma
viral).

Sonda de captura: se disea una

secuencia complementaria a la diana,
con un extremo poliG.

La sonda sealizadora y la de captura

hibridan con el cido nucleico diana (sobre
cada molcula de genoma viral van a hibridar
estas dos sondas). La captura de este
complejo que se ha formado (sonda de
captura-diana-sonda sealizadora) se
consigue utilizando una secuencia poliC
(complementaria por lo tanto a la secuencia
de captura poliG) que posee una bola
magntica en un extremo, de modo que al

introducir un imn, queda retenido el

complejo y se puede lavar y eliminar el
exceso de sonda sealizadora no unida a la
secuencia diana. Se suelen hacer una serie
de nuevas hibridaciones con sonda captura y
lavados, con el objetivo de eliminar sonda
sealizadora sin unir y tener as solamente
secuencia metaestable unida a la diana.
Finalmente, se utiliza la enzima Q replicasa
para amplificar la sonda sealizadora. Esta
replicacin es muy eficiente, generndose
106-109 copias por sonda sealizadora
original en menos de 15 minutos. No se
precisa el empleo de un termociclador, lo cual
es una ventaja aadida.
La cuantificacin y deteccin se realiza
por colorimetra o por fluorescencia en tiempo
real.
Es fundamental que la muestra quede
perfectamente lavada. De no ser as, pueden
aparecer falsos positivos, lo que supone una
disminucin de la especificidad de la tcnica.
Sin embargo, la sensibilidad suele ser
elevada, pues es difcil la aparicin de falsos
negativos debido a la gran eficiencia de esta
enzima.

[editar]Amplificacin ADN en rama

Con esta tcnica lo que se va a amplificar es
la seal, no amplificndose ni vindose
alterado el nmero de secuencia diana ni de
sondas, algo que s ocurra en casos
anteriores. La amplificacin es lineal, al
contrario de lo que ocurra en las tcnicas
anteriores donde era exponencial. Presenta la
ventaja de no necesitar termociclador, pero la

desventaja de no ser muy sensible. Sin

embargo, s que resulta muy til para detectar
distintas cepas de un mismo organismo
gracias al empleo de las diferentes sondas
descritas a continuacin.
Para este proceso se van a emplear tres tipos
de sondas diferentes:

Sondas ancla: unen la molcula diana

con una fase slida.

Sonda extensora: especfica para la

molcula diana y la sonda seal.

Sondas amplificadores: se tratan de

sondas especficas para la seal.

El proceso ocurre en varios pasos:

Paso 1: las sondas ancla se unen a la molcula del virus objetivo del estudio y, a su vez, se
unen a la fase slida. Esto puede suceder en uno o en dos pasos, aunque normalmente se
realiza en dos (un oligo fijado a la base reconoce otro oligo que a su vez reconoce la
secuencia vrica y se une a ella. El motivo de esto es puramente econmico, pues de esta
forma se evita el tener que hacer una base diferente en cada caso, por lo que se puede
fabricar a gran escala la base y en cada estudio slo cambio el segundo oligo de unin a la
secuencia vrica.
Paso 2:las sondas extensoras se unen al ARN viral y a las sondas amplificadoras. Se une
una nica sonda amplificadora y da muchas seales. Con una sola molcula dara seal, de
hecho no se amplifica, o se detecta o no. Este segundo paso puede ser tambin
modificado, prueba de ello es bDNA, constituido por una sonda preamplificadora a la que se
unen mltiples sondas amplificadoras y a stas ltimas mltiples sondas etiquetadas que
nos dan la seal, es decir, posee un solo extensor al que se le unen mltiples sondas en
forma de ramas, cada una con su seal.
As se pueden distinguir dos
generaciones en este tipo de
amplificacin de ADN:

1 generacin: cada sonda extensora se une a la sonda amplificadora que tiene mltiples
ramas (normalmente 15) con algn tipo de sealizacin unida a los nucletidos
(normalmente enzima que al transformar sustrato en producto emite una seal detectable,
ya sea lumnica, colorimtrica. Ejemplo: enzima es fosfatasa alcalina, se aade dioxietano
al medio y se mide quimioluminiscencia)
2 generacin: cada sonda extensora se une a una sonda preamplificadora a la que se unen
15 sondas amplificadoras cada una con 15 ramas.

[editar]Otros mtodos
Adems de las tcnicas ya
citadas, exiten otros
mtodos utilizados para la
cuantificacin viral, tales
como:

Ensayos de captura de
hbridos.

Ensayos de captura de
hbridos.

Para esta tcnica, el ADN diana que pueda contener la muestra a analizar es purificado y se
une con una sonda de ARN de cadena sencilla (sera necesario desnaturalizar previamente
el ADN diana). El hbrido ADN-ARN forma una estructura caracterstica que es reconocida
por anticuerpos especficos (dobles cadenas de ADN o cadenas sencillas de ARN no son
reconocidas). Estos anticuerpos estn fijados a pocillos de placas microtituladoras, de
manera que capturan el hbrido ADN-ARN (lo cual tambin facilita los procesos de lavado
durante el ensayo). Los hbridos capturados se detectan aadiendo anticuerpos anti-hbrido

ADN-ARN conjugados con fosfatasa alcalina. Se aade sustrato para la fosfatasa alcalina y
se mide la quimioluminiscencia.
El ensayo de captura de hbridos es por tanto un mtodo de amplificacin de seal, ya que
no se amplifica la cantidad de ADN diana, sino que ste es aislado, unido a una sonda y
finalmente a la seal especfica para este hbrido diana-sonda.

Amplificacin
basada en
digestin.

Esta tcnica permite detectar el cido nucleico de inters mediante el uso de varias sondas
que se unen de forma superpuesta a la diana. Es importante el papel de la enzima
bacteriana Cleavase, que reconoce secuencias de DNA supespuestas y realiza un corte en
la estructura solapante que forman (esta actividad enzimtica in vivo est relacionada con
procesos de reparacin de ADN).
Para iniciar la amplificacin, el cido nucleico diana se mezcla con sonda
sealizadora y sonda invasora. Ambas sondas se unen a la diana, con la peculiaridad de
que el extremo 5' de la sonda sealizadora se superpone con la sonda invasora. La enzima
Cleavase reconoce esta superposicin y corta (digiere) la sonda sealizadora, que puede
entonces actuar como una sonda invasora en el siguiente paso de la reaccin.
En un segundo paso, se aade una sonda FRET que tiene secuencia complementaria a la
sonda sealizadora digerida. En el extremo 5' de la sonda FRET hay una molcula
fluorescente que est situada junto a una molcula quencher, de manera que la sonda
FRET no est emitiendo ninguna seal. La sonda sealizadora digerida (que en este
segundo paso est actuando como invasora) se une a la sonda FRET, generando un sitio
de superposicin que de nuevo es reconocido por Cleavase. Cuando esta enzima corta la
sonda FRET en la regin de superposicin, libera la molcula fluorescente del quencher, y
se produce entonces una seal.
La cantidad de seal puede ser cuantificada y relacionada directamente con la cantidad de
cido nucleico diana paresente en la muestra a analizar.

R
e
a
c
c
i

e
n

c
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R
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t
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o
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)
.
La tcnica de LCR se basa en la amplificacin de sondas-cebadores (en ingls primers)
diseados sintticamente para que sean complementarios al cido nucleico diana. Es
necesario conocer previamente la secuencia diana al completo para poder elaborar estos
oligonucletidos. En tcnicas de PCR, puede existir una distancia de cientos de pares de
bases entre los cebadores, que formar parte de la secuencia amplificada en la reaccin.
En LCR, los cebadores hibridan de forma contigua, separados nicamente por una base.
En lugar de utilizar una ADN polimerasa para sintetizar la secuencias complementarias por
extensin de los cebadores (como ocurre en PCR), una ADN ligasa liga (une) entre s los
cebadores que anillan adyancentes. Una falta de complementariedad con los oligos en la
regin diana (incluso de una sola base) impide la ligacin de los cebadores. Estos
cebadores ligados pueden servir como molde para que otros cebadores anillen sobre ellos.
En LCR es necesario utilizar un termociclador para controlar la temperatura de los
diferentes pasos:
- La muestra se calienta para desnaturalizar el cido nucleico que pueda contener.

- A continuacin se enfra para permitir que los cebadores anillen si la secuencia diana est
presente.
- Una ligasa termoestable une los cebadores adyacentes.
El producto de LCR son por tanto cebadores ligados, por lo que es un mtodo de
amplificacin de sonda y no de diana, ya que el nmero de molculas de cido nucleico
diana no vara. La seal se genera por repeticin de ligaciones entre las sondas-cebadores
que hibridan con la secuencia diana. Un oligo est covalentemente unido a biotina para
poder posteriormente inmovilizarlo y el otro est unido a una molcula seal. Estos dos
oligos sern ligados en el caso de que est presente la secuencia diana e hibriden de forma
complementaria sobre ella, quedanto entonces adyacentes. Los cebadores son capturados
en sustrato slido con estreptavidina y se pueden detectar por la molcula seal. Si no hay
complementariedad total (la secuencia diana no est presente), los cebadores capturados
no producirn seal alguna.

Amplifica
cin por
desplaza
miento
de
hebra (S
DA, en
ingls St
rand
Displace
ment
Amplifica
tion).

La tcnica de SDA consiste en una amplificacin que transcurre isotrmicamente, es decir,

tras la desnaturalizacin inicial, la reaccin tiene lugar a una misma temperatura.
Comprende dos fases:
- Primera fase (generacin de la diana): el cido nucleico de la muestra es desnaturalizado
por calor (95 C). En cada extremo de la secuencia diana, un cebador y una sonda hibridan
muy cerca el uno del otro. Las sondas contienen un sitio para enzima de restriccin. La
extensin del cebador es realizada por una DNA polimerasa deficiente en actividad
exonucleasa derivada de E.coli, que va incorporando adems nucletidos modificados
dATPaS (5'-O-1-trifosfato 2'-deoxiadenosina). A medida que se extienden los cebadores, se
desplazan las sondas, que tambin estn siendo polimerizadas. Una segunda ronda de
cebadores complementarios hibridan con las sondas desplazadas, de forma que la ADN

polimerasa extiende estos segundos cebadores, generando una sondas de doble cadena.
Estas sondas sern el ADN diana en la siguiente fase.
- Segunda fase (amplificacin exponencial de las sondas-diana): Cuando se aade la
enzima de restriccin a la reaccin (que contiene ahora sondas de DNA de doble cadena),
slo una de las cadenas de la sonda ser digerida (cortada) debido a que el sitio que
debera existir en la regin complementaria ha desaparecido por la introduccin de
nucletidos dATPaS durante la polimerizacin. Esto genera una mella (en ingls nick) en el
ADN, desde la cual polimeriza la ADN polimerasa, lo que simultneamente desplaza la
cadena restante. Esta cadena se copia con cebadores que permitirn recuperar el sitio de
restriccin. En esta segunda reaccin de polimerizacin tambin se utilizan nucletidos
dATPaS, por lo que una cadena de cada nuevo producto sintetizado ser resistente al corte
de la enzima, y la generacin y extensin de la mella se puede repetir sin necesidad de
volver a desnaturalizar. Este proceso repetitivo tiene lugar a unos 52 C sin necesidad
de termociclador.
El producto de esta amplificacin son millones de copias de la sonda original. La adicin de
sonda fluorescente produce una seal que se corresponde con la cantidad de diana
amplificada.

Western blot

Resultado del Western blot: una membrana con las protenas separadas en la electroforesis unidas,
de las que slo se disciernen aquellas contra las se ha aadido un anticuerpo.

El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada para detectar protenas especficas en una
muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis
en gel se separan las protenas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad,

Sondas FRET.

Crculo rodante.

etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana
adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la protena de inters
con anticuerpos especficos contra ella.1 2 Finalmente, se detecta la unin antgeno-anticuerpo por actividad
enzimtica, fluorescenciaentre otros mtodos. De esta forma se puede estudiar la presencia de la protena en el
extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras protenas.
Esta tcnica es hoy en da imprescindible en varios campos de la biologa, como la biologa molecular,
la bioqumica, la biotecnologa o la inmunologa. Existe toda una industria especializada en la venta de
anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de miles de protenas diferentes.3 4
El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de Stanford.2 El nombre
(Western, occidental en ingls) le fue dado por W. Neal Burnette,5 y consiste en un juego de palabras con una
tcnica anloga pero que usa DNA, el Southern (sureo) blot, que en este caso debe su nombre a su
descubridor, Edwin Southern. Otras tcnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son el Northern
blot (en el que se separa e identifica RNA), el Eastern blot, el Southwestern blot.

Contenido
[ocultar]

1 Antecedentes
2 Pasos del Western blot
o

2.1 Preparacin de la muestra

2.2 Electroforesis en gel

2.3 Transferencia

2.3.1 Difusin simple

2.3.2 Transferencia al vaco

2.3.3 Electrotransferencia

2.4 Bloqueo

2.5 Deteccin

2.5.1 Mtodo en dos pasos

2.5.1.1 Anticuerpo primario

2.5.1.2 Anticuerpo secundario

2.5.1.2.1 Radiactividad

2.5.1.2.2 Anticuerpo unido a una enzima

2.5.1.2.3 Marcaje fluorescente

2.5.1.2.4 Sistema avidina/estreptavidina

2.5.1.2.5 Deteccin con oro

2.5.2 Mtodo en un paso

2.6 Anlisis

2.6.1 Deteccin colorimtrica

2.6.2 Deteccin quimioluminiscente

2.6.3 Deteccin radiactiva

2.6.4 Deteccin fluorescente

2.7 Exploraciones secundarias
3 Aplicaciones

3.1 Investigacin

3.2 Diagnstico
4 Protocolos
5 Vase tambin
6 Enlaces externos
7 Referencias

[editar]Antecedentes
Antes de la aparicin del Western blot, ya existan diversas tcnicas capaces de detectar un antgeno
determinado en una muestra, como la inmunoelectroforesis, lainmunodifusin doble de Ouchterlony,
la inmunoprecipitacin...
La aparicin del Western no fue posible hasta la aparicin de las membranas. En 1975, Edwin Southern
demostr que la nitrocelulosa era capaz de capturar cidos nucleicosseparados previamente por electroforesis.
De esta forma, se permita el anlisis de una mezcla compleja de molculas de ADN, como un genoma tratado
con enzimas de restriccin.6 Se desarroll as el Southern blot, usando el nombre del descubridor
como epnimo; es por ello que tanto esta tcnica como sus derivadas (Western blot, Northern blot...) se
escriben con mayscula.
Ms tarde, Towbin (1979) y Burnette (1981) demostraron que tambin era capaz de unirse a protenas. Ya en
1986, Millipore desarroll la primera membrana de PVDF diseada para la transferencia de protenas, la
membrana de transferencia ImmobilonTM PVDF. Porteriormente fue llamada membrana de transferencia
Immobilon-PTM para diferenciarse de otras membranas.

[editar]Pasos

del Western blot

[editar]Preparacin

de la muestra

Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:

Una pequea cantidad del tejido se introduce en un buffer de extraccin.

Despus se procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes
volmenes de muestra), con un homogenizador (para muestras pequeas) o
por sonicacin. Por ltimo se centrifuga para obtener las protenas en el
sobrenadante, la fraccin no precipitada.7

Las clulas pueden lisarse por uno de esos mtodos mecnicos. Tambin
pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y
solubilicen las protenas. A veces se
aaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la digestin por las
enzimas celulares de las protenas y de las fosfoprotenas, respectivamente.8

Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 C) para evitar la desnaturalizacin proteica. Para
separar protenas de compartimentos y orgnulos celulares es preciso combinar tcnicas mecnicas - como
filtraciones y centrifugaciones - y bioqumicas.

[editar]Electroforesis

en gel

Artculo principal: Electroforesis en gel.

Las protenas de la muestra sern separadas mediante una electroforesis en gel en funcin de uno o varios
(en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios: punto isoelctrico, peso molecular y carga
elctrica. La naturaleza de la separacin depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.
La electroforesis en gel ms frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de poliacrilamida y
de tampn con dodecilsulfato (SDS). En esta tcnica las protenas sufren un tratamiento por agentes
reductores que provocan la prdida de las estructuras secundaria y terciaria (por ejemplo, reduciendo
los puentes disulfuro (S-S) a grupos tiol (SH + SH)) y mantiene los polipptidos en este
estado desnaturalizado. De este modo, la estructura tridimensional de las protenas no influye en la
electroforesis, y pueden separarse nicamente en funcin del tamao.

[editar]Transferencia
Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos, se las transfiere desde el gel
de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta transferencia puede realizarse
por difusin, por vaco o por accin de un campo elctrico (electrotransferencia).
Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de unir protenas de
forma inespecfica (es decir, se adhieren a todas las protenas con idntica afinidad):

las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la

naturaleza de las interacciones membrana - protena, se sabe con cierta
seguridad que se trata de interacciones no covalentes de naturaleza hidrfba.

en las membranas de PVDF, la unin est basada en interacciones hidrofbicas y

de dipolos entre la membrana y las protenas. Como particularidad, deben ser
humedecidas con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos,
debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.

Las membranas de nitrocelulosa son ms baratas que las de PVDF, aunque son tambin ms frgiles,
tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y no pueden ser sometidas a varias pruebas consecutivas. 9
Tambin pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papel activado. Sin embargo, no
son tan usados como los anteriores.

[editar]Difusin simple
En la transferencia por difusin simple se ponen en contacto las superficies del gel electrofortico y de la
membrana y, sobre sta, se dispone un taco de papeles de filtro. Con el fin de facilitar el proceso, puede
ponerse encima una placa de vidrio y un objeto pesado. Este montaje se coloca sobre un tampn, que
ascender por capilaridad hacia el papel de filtro arrastrando consigo las protenas. Al llegar a la
membrana, quedarn retenidas en ella.
Este protocolo no est muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de protena transferida a la
membrana es muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia. Sin embargo, ha ganado cierta
popularidad por una modificacin que permite obtener mltiples transferencias de un mismo gel,
permitiendo de esta forma realizar varias pruebas sobre geles virtualmente idnticos. Esta modificacin es
viable cuando no es necesaria una transferencia cuantitativa de protena. 10 11

[editar]Transferencia al vaco
En esta tcnica, se aade el poder de succin de una bomba conectada a un sistema de secado de planchas
de gel, el cual lleva las protenas desde el gel hasta la superficie de la membrana de nitrocelulosa. 12 Este
mtodo es vlido tanto para protenas de alto como de bajo peso molecular.11

[editar]Electrotransferencia
Este mtodo se basa en una corriente elctrica y un tampn de transferencia para llevar las protenas desde
el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo
negativo o ctodo al positivo o nodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de
transferencia, gel, membrana, ms papeles de filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado
coloquialmente sandwich, se dispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente elctrica, de
magnitud acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible,... Las protenas del gel se desplazan
hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana. 1

Tras la transferencia, se suele proceder a la tincin del gel con Coomassie Brilliant Blue (un colorante de
protenas) para comprobar que en efecto una parte importante del material proteico ha pasado a la
membrana.
La electrotransferencia es hoy en da la tcnica de transferencia ms usada gracias a la velocidad del
proceso y al elevado porcentaje de protena que se transfiere (especialmente en comparacin con las otras
tcnicas).

[editar]Bloqueo
Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse protenas de forma inespecfica, es preciso
bloquear los lugares de unin que han quedado libres tras la transferencia. En caso contrario, el anticuerpo

(de naturaleza proteica) empleado en la deteccin puede unirse a ellos, dificultando la distincin
del complejo antgeno-antgeno que se forma con la protena que se busca.
En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin de protenas, tpicamente de albmina de suero
bovino o ASB (ms conocida por sus siglas en ingls, BSA), leche en polvoo casena, con una diminuta
fraccin de detergente, como Tween 20 o Tritn X-100. Las protenas en solucin se unirn a todos
aquellos lugares de unin de la membrana que no estn ya ocupados por las transferidas desde el gel. De
este modo, el anticuerpo slo podr unirse a su antgeno especfico, reduciendo as el ruido de fondo y
los falsos positivos.

[editar]Deteccin
En la deteccin se comprueba la presencia en la membrana de una determinada protena. Para ello se
emplea un anticuerpo especfico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice
una reaccin colorimtrica (produce color). De esta forma, se hace patente la unin con el antgeno, la
protena, as como su localizacin.
El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la deteccin en un
nico paso, lo cual es til en ciertos campos.

[editar]Mtodo en dos pasos

Los dos pasos de los que consta este mtodo de deteccin son la unin del anticuerpo primario y la
del anticuerpo secundario.

[editar]Anticuerpo primario

El primer paso es permitir la unin de un anticuerpo primario contra la protena buscada. ste se consigue
inoculando dicha protena o uno de sus eptopos (regiones capaces de desencadenar la respuesta inmune) a
un animal (como un conejo o una cabra) o a un cultivo celular. Adems, como la protena se ha
desnaturalizado durante la electroforesis en gel, es preciso que el anticuerpo reconozca especficamente la
protena desnaturalizada. La presencia del elemento extrao debera desencadenar una respuesta inmune
cuyo resultado incluya la produccin del anticuerpo, primario en este caso, ya que reconoce la protena.
As pues, tras el bloqueo se incuba en agitacin moderada la membrana con una disolucin de anticuerpo
primario (0,5 - 5 g/ml). La disolucin consiste en un tampn salino, concloruro de sodio por lo general,
con un pH cercano a la neutralidad, una pequea fraccin de detergente y, en ocasiones, protenas
disueltas, como ASB o leche en polvo. La membrana junto con la disolucin pueden ser introducidas en
una pequea bolsa de plstico. Esta incubacin puede durar desde 30 minutos a una noche entera. La
temperatura a la que puede tener lugar es igualmente variada; en general, las elevadas temperaturas
favorecen las uniones ms especficas.

[editar]Anticuerpo secundario
Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se expone al anticuerpo
secundario. ste reconoce de forma especfica una regin concreta del anticuerpo primario. Suelen estar
marcados para ser detectables (unin a biotina, a una enzima reporter como laa fosfatasa alcalina o
la peroxidasa del rbano (HRP), etc.). Varios de estos anticuerpos se unirn a cada anticuerpo primario,
amplificando la seal.
Los anticuerpos secundarios proceden de animales o de cultivos de hibridomas de origen animal. Por
ejemplo, un anticuerpo secundario "anti-ratn" es aquel capaz de reconoces casi todos los anticuerpos
primarios obtenidos de ratones. Igualmente hay anticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo"... Su uso presenta
ciertas ventajas: econmicas, por permitir a un laboratorio compartir una nica fuente de anticuerpos
secundarios; y dan resultados mucho ms consistentes.
Tambin pueden emplearse protenas no anticuerpos, como las protenas A y G.

[editar]Radiactividad

Unin del anticuerpo primario a la protena de inters. A este se une la protena A o la protena
G para ser detectada.

Es una alternativa al uso de anticuerpos secundarios que consiste en protenas de unin a anticuerpos
marcadasradiactivamente. Esta protena puede ser, por ejemplo, la protena A de Staphylococcus
aureus13 o la protena G14marcadas con 125I (un istopo radiactivo de yodo). Las protenas mencionadas
tienen la capacidad de unirse a anticuerpos de forma inespecfica, por lo que se unirn al primario.
Este mtodo apenas se usa actualmente, por ser significativamente ms caro, peligroso y lento que los
otros. Sin embargo, presenta ventajas: es muy sensible, da bandas que permiten una precisa cuantificacin;
y la imagen autoradiogrfica puede ser reproducida fcilmente y con gran precisin para su publicacin.11

[editar]Anticuerpo unido a una enzima

Anticuerpo secundario unido a la peroxidasa de rbano, de modo que puede catalizar la

reaccin quimioluminiscente.

Un mecanismo de deteccin simple y rpido consiste en unir al anticuerpo secundario enzimas

que catalicen la transformacin de un sustrato soluble en un producto insoluble. De esta forma, en el
posterior anlisis quedar una mancha all donde est la protena de inters. Enzimas como la peroxidasa
de rbano (HRP) o una fosfatasa alcalina son vlidas para este mecanismo. 11 Por ejemplo, la peroxidasa
puede catalizar la oxidacin del 4-cloronaftol en presencia de un 1% de perxido de hidrgeno. El
resultado es que el primero forma una mancha de precipitado oscura. 15 Otras tcnicas,
como ELISA o ELISPOT, tambin emplean este mtodo de deteccin.
Otro mtodo ms sofisticado consiste en la unin de una enzima que catalice una reaccin
quimioluminiscente. Las anteriormente citadas enzimas tambin son vlidas en este caso, aunque cada una
usa un agente quimioluminiscentediferente. En el caso de la peroxidasa, cataliza la oxidacin del luminol

en presencia de perxido de hidrgeno. La fosfatasa alcalina cataliza la defosforilacin del adamantil-1-2dioxetano fosfato, reaccin que genera luz. Si se coloca unapelcula fotogrfica sobre la membrana, la
exposicin a la luz que se desprende en la reaccin permite detectar la actividad enzimtica.

[editar]Marcaje fluorescente
Otro mtodo basado en el mismo principio emplea anticuerpos unidos a fluorocromos del infrarrojo
cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) - furanona (MDPF) o el rojo Nilo. Estos compuestos
emiten una cantidad de luz constante (estado esttico) cuando se excitan de manera constante, permitiendo
una deteccin muy precisa y una cuantificacin del antgeno ms exacta que la de la quimioluminiscencia,
que se realiza durante un estado dinmico.
El rojo Nilo no es puede usarse para teir bandas en membranas de PVDF; sin embargo es posible realizar
la tincin en el gel SDS - PAGE y luego transferirlo a la membrana de PVDF. Esto ltimo presenta una
ventaja, y es que no es necesario realizar una tincin del gel para comprobar la transferencia proteica. 16

[editar]Sistema avidina/estreptavidina
Otra opcin es emplear un anticuerpo primario unido covelentemente a molculas de biotina. Despus la
deteccin se llevar a cabo con una protena de unin a la misma, como laestreptavidina o la avidina.

[editar]Deteccin con oro

Otra tcnica, conocida como Golden blot, consiste en la deteccin de los anticuerpos primarios
con protena A unida a partculas de oro. El resultado es una membrana con manchas rojas, causadas por
el oro, all donde est la protena.17 La sensibilidad del mtodo puede incrementarse con una tincin
fotoqumica de plata: el oro cataliza la reduccin de los iones plata a plata metlica en presencia de otro
agente reductor, como la hidroquinona; la plata forma de este modo unas manchas visibles bajo
microscopio ptico. Se consigue as una sensibilidad comparable a la de las tcnicas radiactivas. 11 18

[editar]Mtodo en un paso
Histricamente la deteccin se ha realizado en dos pasos por la relativa facilidad que supone producir
anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto ofrece a investigadores y empresas
enormes ventajas en lo que a flexibilidad se refiere, y aade un efecto amplificador al proceso. Sin
embargo, debido a la llegada de los anlisis de protenas de alto rendimiento y los menores lmites de
deteccin ha crecido el inters por desarrollar sistemas de deteccin en un solo paso que aumentaran la
rapidez del proceso al tiempo que reducen los consumibles. Esto requiere un anticuerpo que reconozca al
mismo tiempo la protena de inters y una "etiqueta" detectable. Se incuba de manera similar al anticuerpo
primario del proceso en dos pasos, y, tras una serie de lavados, ya se puede detectar directamente.

[editar]Anlisis
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la deteccin de aquellas que s se han unido
a la protena de inters.

[editar]Deteccin colorimtrica
La deteccin colorimtrica depende de la incubacin del Western blot con un sustrato que reacciona
gracias a la enzima reporter (una peroxidasa, por ejemplo) unida al anticuerpo secundario. Pasa as de ser
un compuesto soluble a una forma insoluble de otro color que precipita cerca de la enzima tiendo as la
membrana. Se procede despus a un lavado en el que se elimina el tinte soluble. La cuantificacin proteica
se evala por densitometra (cuan intensa es la mancha) o por espectrometra.

[editar]Deteccin quimioluminiscente
La deteccin quimioluminiscente requieren la incubacin de la membrana con un sustrato, que emitir
luminiscencia al ser expuesto al reporter que trae unido el anticuerpo secundario. La luz emitida es
captada por una pelcula fotogrfica o, ms recientemente, por cmaras CCD, que toman una imagen
digital del Western blot. Se analiza la imagen por densitometra para evaluar la cantidad relativa de
mancha y cuantifica el resultado en trminos de densidad ptica. Actualmente hay programas que
permiten realizar anlisis ms profundos si se aplican ciertos estndares, como la obtencin del peso
molecular.

[editar]Deteccin radiactiva
Los marcadores radiactivos no requieren sustratos enzimticos; en su lugar se coloca una pelcula
fotogrfica contra el Western blot y la actividad radiactiva del marcador provoca la aparicin en ella de
regiones oscuras. stas se correspondern con las bandas de las protenas de inters. Su alto precio y su
riesgo para la salud y la seguridad han provocado su desuso en los ltimos tiempos.

[editar]Deteccin fluorescente
En la deteccin con marcadores fluorescentes se procede a la excitacin lumnica de stos que les provoca
una excitacin. sta es detectable por un fotosensor, como una cmara CCD equipado con los filtros de
emisin apropiados. Se consigue as una imagen digital del Western blot que puede ser analizado para
obtener el peso molecular o la cuantificacin proteica. La fluorescencia es considerada uno de los mtodos
de anlisis ms sensibles.

[editar]Exploraciones

secundarias

Una caracterstica de las membranas de PVDF, de la que carecen las de nitrocelulosa, es su capacidad de
quitar los anticuerpos y volver a explorar la membrana con otros anticuerpos. Aunque hay protocolos que
permiten hacer lo mismo en membranas de nitrocelulosa, la robustez de las de PVDF facilita la
eliminacin de los anticuerpos, permitiendo ms reusos antes de que el ruido de fondo es tan grande que
impide continuar con los experimentos. Otra diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa, el PVDF
debe ser empapado en etanol, isopropanol o metanol al 95% antes de ser usado. Adems, las membranas
de PVDF tienden a ser ms delgadas y ms resistentes a los daos durante su uso.

[editar]Aplicaciones
[editar]Investigacin
Actualmente, el Western blot es una de las tcnicas ms usadas en el estudio de la biologa molecular.19

[editar]Diagnstico

Prueba de VIH: Aunque el VIH suele detectarse mediante la tcnica ELISA, el

Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado
positivo en un grupo que no es de riesgo o en una poblacin donde la
prevalencia del virus es muy baja. Mediante el Western blot se buscan los
anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Se transfieren a una
membrana las protenas de clulas que, se sabe, estn infectadas por el VIH.
Entonces, se incuba el suero que hay que probar con esta membrana. Este paso
es equivalente a la incubacin con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos
anti-VIH en el suero, sern estos los que realizen el papel de anticuerpo
primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se
vuelve a incubar con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una
enzima-seal. La aparicin de bandas indica la presencia de protenas contra las
cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente
es seropositivo.

Se emplea como prueba definitiva de la encefalopata espongiforme bovina,

comnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".

Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot.

En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la

presencia del FIV en gatos.

[editar]

Qu es el tratamiento antirretroviral?
Este es el principal tratamiento para el VIH y el SIDA. No es una cura, pero permite que las personas
demoren el desarrollo de la enfermedad por muchos aos. El tratamiento consiste en medicamento que
las personas deben tomar cada da por el resto de sus vidas. Para entender ms acerca del tratamiento,
necesita tener algn conocimiento bsico de VIH y SIDA.
El tratamiento antirretroviral para el VIH consiste en medicamentos que combaten la infeccin del VIH
mismo, reduciendo la duplicacin del VIH en el cuerpo. Generalmente estos medicamentos son llamados:

antirretrovirales
medicamentos anti-VIH
antivirales VIH

Qu es la terapia combinada? Qu es TARGA?

Se ha descubierto que, para que el tratamiento antirretroviral sea efectivo por un largo tiempo, es
necesario tomar ms de un medicamento antirretroviral a la vez. Esto se conoce como terapia combinada.
El trmino Tratamiento Antirretroviral de Gran Actividad (TARGA) alude a una combinacin de tres o ms
medicamentos anti-VIH.
Cuando el VIH se duplica (hace nuevas copias de s mismo) a menudo comete errores. Esto significa que
dentro de una persona infectada existen diferentes cepas del virus. Ocasionalmente, se produce una
nueva cepa que resulta ser resistente a los efectos de un medicamento antirretroviral. Si la persona no
est tomando ningn otro tipo de medicacin, la cepa resistente puede duplicarse rpidamente y se
pierden los beneficios del tratamiento.
Tomar dos o ms antirretrovirales al mismo tiempo reduce enormemente el porcentaje de desarrollo de la
resistencia.

Grupos de medicamentos antirretrovirales

Existen cinco grupos de medicamentos anti-VIH. Cada uno de estos grupos ataca al VIH de manera
diferente.

Inhibidores Nuclesidos/Nucletidos de Transcriptasa Inversa

El primer grupo de medicamentos antirretrovirales son los Inhibidores Nuclesidos/Nucletidos de la

Transcriptasa Inversa (INTI o INTR). Constituyeron el primer tipo de medicamento disponible para tratar la
infeccin del VIH en 1987. Los INTI (tambin conocidos como nuclesidos anlogos) interfieren con la
accin de una protena del VIH denominada transcriptasa inversa necesaria para que el virus haga
nuevas copias de s mismo. La mayora de los regimenes contienen al menos dos de estos
medicamentos.

Inhibidores No Nuclesidos de la Transcriptasa Inversa

El segundo grupo de medicamentos antirretrovirales son los Inhibidores No Nuclesidos de la
Transcriptasa Inversa (INNTI o INNTR), que comenzaron a aprobarse en 1997. Al igual que los INTI, los
INNTI (tambin conocidos como no nuclesidos) detienen la duplicacin del VIH dentro de las clulas
inhibiendo la transcriptasa inversa.

Inhibidores de la proteasa

El tercer tipo de antrirretrovirales es el grupo de los inhibidores de la proteasa. El primer inhibidor de la

proteasa fue aprobado en 1995. Los inhibidores de la proteasa, como su nombre lo indica, inhiben la
proteasa, que es otra protena involucrada en el proceso de duplicacin del VIH.

Inhibidores de la Fusin e Inhibidores de la Entrada

El cuarto grupo de antrirretrovirales est compuesto por los inhibidores de la entrada, que incluyen a los
inhibidores de la Fusin. Los inhibidores de la entrada previenen el ingreso del VIH a las clulas
inmunolgicas humanas.
Un inhibidor de la fusin, comnmente denominado T-20, fue autorizado tanto en los Estados Unidos
como en Europa desde 2003, pero solo para ser utilizado por personas que ya han probado otros
tratamientos. El T-20 difiere de los otros antrirretrovirales en que necesita ser inyectado (de lo contrario es
digerido en el estmago).
En agosto de 2007, un nuevo tipo de inhibidor de la entrada conocido como maraviroc fue autorizado en
los Estados Unidos. Este nuevo medicamento se conoce como un inhibidor de CCR5 ya que bloquea al
correceptor CCR5 en las clulas inmunolgicas humanas, previniendo que el VIH se adhiera a la
superficie de las clulas.

Inhibidores de la integrasa
El grupo final de antrirretrovirales consiste en solamente una droga, el raltegravir, que fue aprobado en los
U.E. en octubre de 2007. Raltegravir inhibe una enzima denominada el integrase, que el VIH necesita
para insertar su material gentico en las clulas humanas.

En qu consiste habitualmente la terapia combinada?

El Tratamiento Antirretroviral de Gran Actividad consiste en una combinacin de tres o ms
medicamentos. La combinacin ms comn suministrada a aquellos que comienzan el tratamiento consta
de dos INTI combinados con un INNTI o un inhibidor de la proteasa "reforzado". El ritonavir (en pequeas
dosis) es el medicamento utilizado ms comnmente para reforzar a un inhibidor de la proteasa. Un
ejemplo de una combinacin comn son los dos INTI zidovudina y lamivudina combinados con el INNTI
efavirenza.

Cundo comenzar el tratamiento

Elegir cundo comenzar el tratamiento antirretroviral es una decisin muy importante. Una vez que se ha
comenzado el tratamiento se lo debe continuar, a pesar de los efectos secundarios y de otros desafos.
Se deben tener en cuenta muchos factores al decidir cundo comenzar el tratamiento, inclusive los
resultados de varios exmenes clnicos. Los exmenes ms importantes son el recuento de linfocitos CD4
(que mide la fuerza del sistema inmunolgico) y la prueba de la carga viral (que mide la cantidad de VIH
en la sangre).
Si bien existen diferentes posturas respecto de los beneficios de comenzar antes o despus un
tratamiento de VIH, los lineamientos recomiendan no comenzar un tratamiento antirretroviral hasta
alcanzar los estadios avanzados de infeccin con VIH.

Qu sucede si la HAART no se encuentra disponible?

Aunque en los ltimos aos la cobertura se ha mejorado enormemente, la mayora de las personas que
viven con VIH en los pases en vas de desarrollo an no tienen acceso al tratamiento antirretroviral. En
su lugar, lo ms que pueden aspirar a recibir es un tratamiento de las enfermedades que ocurren como
resultado de un sistema inmunolgico debilitado, las cuales se denominan infecciones oportunistas. Tal
tratamiento slo presenta beneficios a corto plazo debido a que no trata la deficiencia del sistema i

ratamiento del VIH

> VIH/SIDA
Introduccin al VIH

Desde la aparicin del TARGA (terapia antirretroviral de gran

actividad) en 1996, los infectados por el VIH han experimentado

Sntomas del VIH

mejoras en su estado de salud general y en su calidad de vida. De

hecho, dado que ha aumentado la esperanza de vida de los

Causas del VIH

enfermos de SIDA en aquellos pases en los que el uso del TARGA

est extendido, el nmero de personas que viven con el SIDA ha

Diagnstico del VIH

aumentado notablemente. En Amrica del norte y en Europa

occidental y central, el uso del TARGA mantuvo relativamente bajo el

Tratamiento del VIH

nmero de muertes relacionadas con el SIDA (30.000) en 2005.

Objetivos del tratamiento
Tipos de frmacos anti-VIH
Terapia combinada
Evaluacin del tratamiento
Efectos secundarios

Importancia de la
adherencia en el
tratamiento del VIH
Resistencia a los
frmacos para el VIH
Visita al mdico

Objetivos del tratamiento

El tratamiento del VIH tiene cuatro objetivos principales:

Aumentar la esperanza de vida del paciente y su calidad de

vida.

Evitar que el VIH progrese al reducir la carga viral a niveles

indetectables.

Devolver el sistema inmunitario a su estado normal y

mantenerlo as.

Reducir el riesgo de transmisin del VIH a otras personas.

Tipos de frmacos anti-VIH

En la actualidad existen ms de 25 frmacos antirretrovirales para
ayudar a las personas con VIH a desarrollar una vida ms larga y
ms sana. Normalmente se toma una combinacin de frmacos
antirretrovirales para el VIH, lo que se conoce como terapia
antirretroviral de gran actividad (TARGA). Estos frmacos se

Preguntas ms
frecuentes

clasifican en 4 clases:

Inhibidores de la transcriptasa inversa anlogos de

los nuclesidos (ITIN): los ITIN son la clase ms antigua
de frmacos antirretrovirales. Bloquean la capacidad del VIH
de copiar el ADN de una clula que necesita para realizar
copias de s mismo. Tambin se conocen como anlogos de
los nuclesidos, "nuclesidos" o "backbone".

Inhibidores de la transcriptasa inversa no anlogos de

los nuclesidos (ITINN): los ITINN bloquean la misma
protena que los ITIN, aunque su composicin qumica es
diferente. Si no se emplean en combinacin con un ITIN, el
paciente desarrolla resistencia a ellos muy rpidamente.

Inhibidores de la proteasa (IP): los IP bloquean la

proteasa, una enzima que el virus del VIH necesita para
multiplicarse. Como grupo, los IP son muy potentes y se
toleran relativamente bien.

Inhibidores de fusin (IF): los IF, que son la clase ms

novedosa de ARV disponibles, impiden que el VIH se
introduzca en las clulas sanas del cuerpo. El nico frmaco
comercializado de esta clase debe administrarse mediante
inyeccin subcutnea.

Ms informacin sobre clases de frmacos.

Terapia combinada
La terapia para el VIH suele incluir tres o ms medicamentos para el
VIH de los tipos sealados arriba. La combinacin de estos
medicamentos est diseada para evitar que el virus realice copias
de s mismo y minimizar los potenciales efectos secundarios y el
nmero de pastilla . Estas combinaciones se conocen como TARGA,
terapia antirretroviral de gran actividad .
Las recomendaciones de GESIDA (Grupo de estudio de SIDA en
Espaa) actualizadas en enero de 2007 recoge las siguientes
combinaciones de tratamiento antirretroviral. Haga click aqu
Factores como la adherencia, la resistencia, y los efectos
secundarios pueden provocar el fallo de un rgimen TARGA. Si
ocurriera esto, el mdico tomara una decisin para cambiar el
rgimen de medicacin basndose en parte en el historial de
tratamiento, la cantidad de combinaciones probadas y el hecho de
que el paciente haya desarrollado o no resistencia a un frmaco
antirretroviral (ARV).
Haga click aqu para obtener recomendaciones para el cambio de un

rgimen ARV debido al fallo del tratamiento.

Evaluacin del tratamiento

Como alguien que convive con el VIH, probablemente haya odo
hablar mucho sobre el recuento de clulas CD4 y la carga viral. Un
recuento de clulas CD4 es una medicin del nmero de clulas
infectadas por el virus que hay en la sangre. La carga viral es la
cantidad de virus (VIH) en la sangre. Estas dos mediciones son muy
importantes, ya que ayudan al mdico a valorar el estado de salud
as como el buen funcionamiento del tratamiento para el VIH.
Ms informacin acerca de las pruebas para el recuento CD4 y de la
medicin de la carga viral plasmtica.

Efectos secundarios
Los frmacos para el VIH o antirretrovirales (ARV) tienen el
potencial de mejorar la salud y alargar la vida, aunque de vez en
cuando tambin pueden hacer que el paciente no se sienta bien.
ste debe hablar siempre con su mdico sobre cualquier efecto
secundario que aparezca, que empeore o que no desaparezca.
Ms informacin acerca de los posibles efectos secundarios del
tratamient

nmunolgico mismo.