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CATALASA (CAT)

Homogenato
0,2 g tejido + 4,5 mL buffer de homogenizacin relacin 1:20 (p/v)
aproximadamente + 0,225 mL Tritn al 1% en relacin 1:20 v/v.
(Tritn X-100 1%: Preparar 25 mL: 0,25 mL Tritn en 25 mL buffer PBS).
Centrifugar a 2000 rpm 10 min a 4C. El SN se usa para todas las enzimas a
determinar.
Protenas del homogenato determinar por Lowry (o tambin Biuret).
Segn Aebi, H (1984) modificada
Fundamento
La velocidad de descomposicin de H2O2 es directamente proporcional a la actividad de la
enzima.
v = -d (H2O2)/dt = k (CAT) = k (H2O2)
k = constante de velocidad de primer orden
Reactivos
Preparar todo libre de catalasas bacterianas: lavar material como para fosfolpidos, usar
ABD estril.
A- Solucin reguladora de pH para homogenizacin: PBS 30 mM KCl 120 mM pH 7,4
(5mL).
KH2PO4__________0,326 g
K2HP04___________0,627 g
KCl______________ 1,789 g
Llevar a 200 mL con AD pH 7,4
B- Solucin reguladora de pH para reaccin: fosfato de potasio 50 mM pH 7 (2,9mL).
KH2PO4__________0,681 g Llevar a 100 mL con AD
K2HP04___________0,627 g Llevar a 100 mL con AD
Mezclar A y B en proporcin 1:1,5, es decir, 50 mL de A + 75 mL de B en probeta y
verificar el pH.
-

H2O2 dil 1/50: 100 L de H2O2 + 4,9 mL de buffer de reaccin. Preparar en


frasco caramelo. El agua oxigenada no es estable con el almacenamiento,
verificar su ttulo.
Muestra (M) dil 1/250: 8 L de M + 1,92 mL de AD.

Reaccin
Se lleva a cabo en celda de cuarzo a 25C.
Muestra: 500 L M + 40 L de H2O2.
Blanco: 500 L buffer de homogeneizacin + 40 L de H2O2.
Medir la disminucin de absorbancia a 240 nm cada 5 segundos y durante 30 seg. Realizar
por duplicado o triplicado.
Preparar una solucin muy diluida de HNO3 para lavar las celdas, enjuagar muy bien para
que no vare el pH.
La descomposicin del sustrato sigue una cintica de 1 orden para concentraciones
menores de 50 M de H2O2.
Expresar en UI/mg de protenas.
NOTAS
La cantidad de enzima que reacciona corresponde a 1 M de H 2O2/min/mL de mezcla a pH
7 y 25 C.
Clculo de la concentracin de H2O2 desde los datos de la botella
- Val: 97,82% v/v = mL H2O2 en 100 mL de solucin.
29,69% p/v = g H2O2 en 100 mL de solucin.
PM = 34,01 g/mol
34,01 g_____________1L_______________1M
0,034 g = x__________1L_______________0,001M
0,00034 g = x________0,01L_____________0,001M
29,6 g puros___________100 mL solucin
3,4 x 10-4g ____________x = 0,00114 mL
Para preparar 10 mL de una solucin 0,001 M necesito 1,14 L de H2O2.
-

Molaridad terica de la botella

34,01 g_____________1L_______________1M
29,6 g __________100 mL_______________8,7 M
1 mol ___________2 eq
8,7 moles________17,41 g Hago el clculo desde este dato.