Qumica General e Inorgnica I 1er Cuatrimestre 2014 anexo unidad 3

Autores: Rolando M. Caraballo (rcaraballo@qi.fcen.uba.ar), Cecilia Spedalieri (cspedalieri@qi.fcen.uba.ar)

Introduccin al programa ImageJ

aplicacin para la determinacin de tamaos de objetos en una imagen

El ImageJ (web:http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html) es una programa de dominio

pblico, multiplataforma (existen versiones para Linux, Windows y MacOS), muy til y de
gran versatilidad para el procesado de imgenes, siendo utilizado incluso en distintos
proyectos de investigacin.
El programa permite realizar operaciones muy sencillas sobre imgenes (como
ajustar el contraste, o transformar una imagen color en una imagen blanco y negro), as
como efectuar operaciones ms sofisticadas sobre las imgenes (como por ejemplo
resaltar algunos detalles y ocultar otros, descomponer un video en imgenes y viceversa).
En ste curso introduciremos algunas nociones bsicas para el manejo del
programa con un fin especfico (anlisis colorimtrico de un indicador cido-base a
distintos pHs), pero tengan en mente que el programa tiene muchos ms usos (desde
contar nanopartculas hasta analizar fotos de tejidos), y que la Web est llena de recursos
al respecto.

Instalacin en Windows
Para ver cmo desinstalar e instalar software en general, leer el Tutorial Inicial.
Para el caso particular del ImageJ, descargar y ejecutar el archivo correspondiente a
su versin de Windows desde la pgina http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html.
En la siguiente figura se muestra dicha pgina con las opciones de descargas
dependiendo de los sistemas operativos.

Figura 1: Pgina de descarga del ImageJ.

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Extra! - Plugins y macros
Los plugins son mdulos de software adicional que sirven para realizar tareas ms
especficas, extendiendo la utilidad del programa.
Por otro lado los macros son lneas de comando que pueden programarse para realizar
acciones repetitivas (por ejemplo, medir en la misma posicin para una serie de imgenes,
etc.), automatizando diversas tareas.
En este curso utilizaremos las funciones por defecto del programa, pero... es bueno saber
que hay mucho material para explorar!

El entorno ImageJ
Mostraremos ahora cmo utilizar el ImageJ una vez instalado. Daremos las
explicaciones utilizando la versin instalada en una computadora en el sistema operativo
Windows, donde el idioma elegido es el ingls. En cualquier otra plataforma el programa
puede usarse de un modo similar.
Para abrir el programa buscamos el mismo haciendo click en la tecla de Inicio (logo
de Windows en el extremo inferior izquierdo de la pantalla), y eligiendo Todos los
programas, aparece en el men como ImageJ.
Cuando abrimos el ImageJ vemos una Barra de trabajo. La barra de trabajo de ImageJ
se compone de varios mens (File, Edit, Image, etc.), algunos botones de herramientas
(seleccin de rea rectangular, oval, etc.), y adems muestra informacin (dependiendo de la
herramienta seleccionada) en forma de texto en la parte inferior.

Figura 2: Barra de trabajo del ImageJ.

Como en este curso vamos a hacer un uso restringido del programa nos
concentraremos en describir solamente las herramientas que vamos a utilizar.

Cmo abrir imgenes

Para abrir una imagen en ImageJ hay al menos 2 caminos.
a) desde el men File como en la mayora de los programas:

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Figura 3: Abrir un archivo desde el men File.

Desde el men File seleccionamos Open y en el cuadro de dilogo elegimos la imagen

que deseamos abrir.
b) Si tenemos abierto un explorador de archivos (Explorador de Windows) podemos hacer
click con el botn izquierdo del mouse sobre el archivo y, mientras mantenemos apretado dicho
botn, arrastrar la imagen y soltarla sobre la barra del ImageJ (donde dice <<Drag and Drop>>):

Figura 4: Abrir un archivo por Drag and Drop.

Seleccin de un rea de inters

(no es imprescindible usarla)
La mayora de los comandos en el ImageJ funcionar sobre una regin de la imagen
que es preciso seleccionar o separar de alguna manera. Por ejemplo, para seleccionar toda la
imagen se puede ir al men Edit-->Selection-->Select All.
Tambin se puede definir un rea especfica de inters dentro de la imagen,
usando cualquiera de las herramientas de seleccin en la barra de trabajo: rectangular, oval,
poligonal y mano alzada (los primeros cuatro conos de la barra de trabajo, en orden).

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Figura 5: Herramientas para seleccionar un rea de

inters.

Rectngulo: cuando se usa la herramienta de seleccin rectangular se puede modificar el

tamao de la seleccin arrastrando las esquinas de la seleccin. Si se mantiene apretada la
tecla Shift al hacer la seleccin se fuerza a que la seleccin sea cuadrada.
Oval: De manera similar a la herramienta de seleccin rectangular, la herramienta de seleccin
oval, al mantener apretada la tecla Shift, fuerza a que la seleccin sea circular.
Utilizando las flechas del teclado se puede mover la seleccin, y si lo hacemos
manteniendo la tecla Alt presionada se puede agrandar la seleccin de a un pixel.
Cuando se crea o modifica el tamao de una seleccin su posicin, ancho y altura
se pueden observar en la barra de trabajo del ImageJ. A continuacin se observa una figura
donde se selecciona un rea circular de la imagen de prueba (centro del tubo).

Figura 6: Seleccin de un rea circular en una imagen.

Al aplicar entonces una funcin de anlisis (como haremos a continuacin) la misma

se lleva a cabo slo sobre el rea seleccionada.

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Medicin de tamao de objetos
Existen, en principio, diversas formas de medir tamao de objetos utilizando el ImageJ. La
utilizacin de cada mtodo depende de la calidad de la imagen (si el fondo tiene color parecido al
objeto, si hay luces y sombras generadas por la iluminacin, etc) y de la calidad de los objetos (si
estn separados o agregados, si tienen un grado de transparencia, etc).
Sea cual sea el mtodo a utilizar, el primer paso y ms importante de todos es determinar
la escala en la imagen. Es decir, traducir las medidas en pixeles del ImageJ en unidades con las
que resulte ms cmodo trabajar. Para ello, es muy importante tener dentro de la imagen un
fragmento del cual se conozca exactamente la longitud.
Como primer paso, tras abrir la imagen deseada, tenemos que determinar la escala.
Siempre es ms cmodo realizar primero un zoom a la zona con la distancia conocida utilizando la
lupa en la barra de herramientas. Una vez seleccionada la lupa, el zoom in se realiza con el botn
izquierdo del mouse y el zoom out con el derecho. Tras acercarnos lo necesario, seleccionamos
ahora la herramienta para dibujar lneas, y medimos la distancia conocida en la imagen.

Figura 7: medicin de la longitud conocida.

Una vez determinada la longitud conocida, vamos al men AnalyzeSet Scale, donde
podremos configurar la equivalencia entre pixeles y la unidad que deseemos.

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Figura 8: Men AnalyzeSet Scale y ventana de dilogo correspondiente

En la ventana abierta de Set Scale, debemos completar cunto mide la lnea que
marcamos en la imagen en la opcin Known distance (al estar el programa en ingls, recordar
que la separacin de decimales se realiza con puntos, y no con comas), y la unidad en que
deseamos representarla en la opcin Unit of length. Por ejemplo, en el caso de la imagen
estamos utilizando una hoja milimetrada, donde cada cuadrado mide 1cm de lado. Entonces, si
queremos que los resultados se presenten en centmetros, escribimos 1 en Known distance y cm
en Unit of length. Si queremos que se presenten en milmetros, escribimos 10 en Known
distance y mm en Unit of length. De esta manera, mientras sigamos trabajando con esta imagen
sin cerrarla, todas las mediciones que se realicen estarn en las unidades que configuramos en
este paso.
Podemos considerar ahora las formas de determinar los tamaos de objetos. Tres modos muy
tiles son los siguientes:

Determinacin automtica: Este mtodo es el adecuado cuando los objetos no estn

agregados (encimados), y existe un gran contraste entre el fondo y el objeto. Tras realizar
algunas pocas configuraciones, el programa mide automticamente los objetos.
Determinacin semi-automtica: Si se observan agregados de objetos, o si existe algn
ruido de fondo (problemas de iluminacin, bordes difusos, etc), este mtodo resulta
bastante til. Se realizan algunos pasos de configuracin similares a los de la
determinacin automtica, pero tras la medicin del ImageJ se seleccionan manualmente
los artefactos, es decir, lo que el programa seleccion como objeto de inters pero que no
lo son.
Determinacin manual: Si bien este mtodo es el ms tedioso en cuanto al tiempo que
lleva, resulta sumamente adecuado an cuando los objetos tienen color similar al fondo,
poseen cierta transparencia o brillo, o estn muy agregados.

Considerando el caso en estudio (medicin de cpsulas de alginato de calcio y de protn),

utilizaremos este ltimo mtodo, que nos brinda un gran control sobre la medicin, minimizando
muchos errores que generara la utilizacin de los otros mtodos descriptos.

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Determinacin manual de tamao de objetos

Primero seleccionaremos los parmetros que deseamos medir. Para ello, abrimos la
ventana de dilogo del men AnalyzeSet Measurements.

Figura 9: Men AnalyzeSet Measurements y ventana de dilogo correspondiente

En la ventana abierta de Set Measurements, hay muchas opciones que pueden seleccionarse.
Algunas de ellas resultan bastante claras por su nombre, como Area o Perimeter. Para la
determinacin del tamao de las cpsulas, marcaremos las siguientes opciones:

Shape descriptions: da informacin acerca de la circularidad del objeto (cuan cerca est de
ser un crculo perfecto, Circ.), la relacin de aspecto (relacin entre largo y ancho, AR),
y otros parmetros extra relacionados con la forma (Round, Solidity).
Fit ellpise: si el objeto resulta de forma elipsoidal, brinda los parmetros de dimetro en
relaciones perpendiculares (parmetros a y b de una elipse, Major y Minor).
Display label: permite agregar una columna con el nombre de la imagen que se est
utilizando.
Add to overlay: marca el objeto una vez que se realiz la medicin. De esta manera, nos
aseguramos de contar cada objeto slo una vez.
Una vez que marcamos todas las opciones, clickeamos OK y, a partir de ahora, todas las
mediciones que se realicen mientras el programa est abierto brindaran la informacin
seleccionada.
Ahora slo queda comenzar a medir las cpsulas. Dependiendo de la forma que tengan las
mismas, utilizaremos distintas selecciones de forma. Se pueden elegir crculos, cuadrados, elipses,
ovalos, hasta incluso otras formas como tringulos, rectngulos, estrellas, etc. Para el caso de
estudio, podremos usar dos tipos de seleccin de forma: elipses y pincel a mano.

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Para seleccionar la elipse, hacemos click derecho en el recuadro de formas circulares, y
seleccionamos la opcin Elliptical selections.

Figura 10: Seleccin Elliptical selections, e imagen con seleccin elptica

La delimitacin de las cpsulas con una elipse se controla a travs de los puntos marcados
por las flechas. Los puntos marcados con flechas rojas son los puntos de anclaje. El superior es
el punto origen de la elipse (a partir del cual la formamos), y all se puede cambiar el ngulo de
orientacin de la elipse. El punto inferior permite cambiar el tamao de la elipse. Los puntos
marcados con flechas verdes son puntos de ajuste, los cuales permiten ajustar el ancho de la
elipse. Una vez marcado el permetro de la elipse, apretando Ctrl + M o utilizando el men
AnalyzeMeasure obtenemos la informacin deseada en una ventana de dilogo aparte.

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Figura 11: Medidas obtenidas

Este proceso debe repetirse para todos los objetos en una misma imagen, y para todas las
imgenes que se tengan de las mismas condiciones experimentales (NO OLVIDAR que hay que
configurar la escala CADA VEZ que se abre una nueva imagen).
Otro mtodo para delimitar las cpsulas, particularmente til para objetos que no tengan
una forma definida, es la opcin Selection Brush Tool en el recuadro de formas circulares.

Figura 12: Seleccin Selection Brush Tool y cuadro de dilogo para el espesor

Una vez seleccionada la opcin, haciendo doble click en el recuadro de formas circulares
abrimos la ventana de dilogo que nos permite seleccionar el espesor del pincel con el que
delimitaremos el objeto. En esta opcin pueden probar el tamao que ms les convenga, aunque
un tamao de 5 pixeles es suficiente. Tras esta seleccin, todo lo que hay que hacer es mantener
el botn izquierdo apretado y delimitar el borde de la partcula que se desee. Hay que tener en
cuenta que utilizar esta opcin generar prdida de informacin respecto a la utilizacin del otro
mtodo. Por ejemplo, al utilizar el pincel y delimitar una cpsula, la circularidad ser muy baja,
dado que el reborde tendr pequeas ondas a causa del propio pulso del mouse. Esta tcnica
debe ser utilizada slo cuando ninguna de las otras disponibles en el programa se ajuste a la forma
de las partculas obtenidas.
Los resultados obtenidos en la ventana de dilogo pueden copiarse a un archivo Excel sin
problemas, seleccionando todos los datos juntos (Ctrl + A o EditSelect All), copindolos (Ctrl + C
o EditCopy) y pegndolos en un archivo nuevo de Excel. Esta forma de importar los datos no
genera los ttulos de cada columna, por lo tanto es importante no cerrar la ventana de dilogo del
ImageJ hasta no haber completado los ttulos correspondientes en la planilla de Excel.
Mas informacin sobre el anlisis en http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html