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INTRODUCCIÓN
En toda aproximación a la era de la Genómica es necesario considerar el cami-
no transitado hasta el presente. Los principales logros de la genética y la
genómica, comenzando por el descubrimiento por Mendel de las leyes de la
heredabilidad1 , el reconocimiento del ADN como el material hereditario [2], la
determinación de su estructura [3], la elucidación del código genético [4], el
desarrollo de las tecnologías de ADN recombinante [5,6] y el establecimiento
de métodos automáticos de secuenciación de ADN [7,8,9] sentaron las bases
para el desarrollo del Proyecto del Genoma Humano, cuyos principales objeti-
vos [10] se alcanzaron recientemente y han revolucionado las ciencias biológi-
cas. Estos estaban dirigidos a desarrollar tecnologías de análisis, obtener el
mapa físico, genético y secuencias de genomas de organismos modelos y final-
mente del genoma humano.
Estos monumentales resultados han estado acompañados de un progreso igual-
mente grandioso en las investigaciones biomédicas y en las ciencias de la com-
putación. Los investigadores en las esferas biológicas están ahora bien
posicionados para realizar análisis globales de mutaciones genéticas
poblacionales, expresiones de genes, identidad y función de proteínas
(Proteómica) y de estructura tridimensionales de proteínas (Genómica estruc-
tural). La información resultante de estas investigaciones podría acelerar el
desarrollo de nuevas terapias dirigidas especialmente según el perfil genético
de cada individuo (Farmacogenómica). Por otra parte el enorme volumen de
información experimental ha requerido el desarrollo de bases de datos y soft-
ware que permitan el acceso a mega datos, así como su transferencia y mani-
pulación. De todo este desarrollo se han desprendido una serie de ramas de
estudio que como se ha visto comprende de manera general, la Genómica, la
Proteómica, la Farmacogenómica y la Bioinformática, formando una gran red
de interrelaciones y manteniendo objetivos particulares.
Durante este tiempo se han desarrollado nuevas estrategias para el diseño de
medicamentos, dentro de las cuales han estado la Genómica, la Química
324 CAPÍTULO 18
GENÓMICA
El estudio de la estructura, función e interacción de los genes y sus complemen-
tos en las células vivas, se denomina Genómica. El estudio de las proteínas y
sus complementos en una célula se denomina Proteómica. Finalmente, el alma-
cenamiento a gran escala, la organización, estructuración y extracción de infor-
mación a partir de los datos obtenidos en los estudios biológicos se denomina
Bioinformática.
La nueva visión de la genómica esta formulada en tres temas fundamentales:
genómica para la biología, genómica para la salud, y la genómica para la socie-
dad [11]. Cada uno de estos temas requiere de grandes esfuerzos y se plantea
ambiciosos objetivos. En este capítulo nos referiremos a algunos aspectos de la
Genómica para la biología, que se centra en la elucidación de la estructura y la
función de los genes y comprende los siguientes elementos:
UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA 325
(RT)-PCR
Existen diversos métodos para la detección y cuantificación de ARNm a partir
de muestras biológicas, entre los que se incluye Northern blotting, ensayos de
protección de nucleasa y PCR por trascripción inversa (RT)-PCR. Todos estos
métodos comienzan con la adquisición de la muestra biológica fresca (sangre,
médula ósea, material de biopsia, líneas celulares, etc.) que permite la extrac-
ción del ARN total, o el ARNm purificado [19].
En el (RT)-PCR, la reacción en cadena de la polimerasa tradicional se combina
con la trascripción inversa para amplificar el ARNm. En esta última reacción el
ARNm de la muestra es convertido a cADN de simple cadena en una reacción
mediada por la enzima reverso transcriptasa. Este cADN sintetizado represen-
ta sólo los exones del correspondiente ADN genómico. El subsiguiente método
de amplificación es llamado (RT)-PCR para distinguirlo del PCR estándar usa-
do para amplificar ADN genómico. Esta reacción es una herramienta extrema-
damente potente y sensible para detectar y cuantificar ARNm a partir de
pequeñas cantidades de muestras y en los estudios de genómica tiene su uso
mayoritariamente en los ensayos de expresión y cuantificación de genes así
como en el diagnóstico genético. Entre las aplicaciones recientes del (RT)-PCR
se incluyen la detección de micrometastasis de nódulos linfáticos en cáncer de
próstata [20], de contaminación de la médula ósea con tumores de mamas y
monitoreo de residuos mínimos de enfermedad en la leucemia aguda [21].
328 CAPÍTULO 18
ELECTROFORESIS Y BLOTTING
El ADN, el ARN o las proteínas pueden ser separados por su peso molecular
mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. El ADN y ARN
están uniformemente cargados negativamente y su separación en geles de
agarosa se realiza en función de su peso molecular y su conformación.
En el caso del ADN y ARN las técnicas de blotting más usadas se basan en
la transferencia a un soporte sólido, como nitrocelulosa, y la posterior hibrida-
ción empleando sondas de ácidos nucleicos específicas según el caso y puede
ir precedidos de reacciones en cadena de la polimerasa como veremos en
algunos ejemplos más adelante. Estos métodos de hibridación se han extendi-
do ampliamente en el campo de la genómica y cada compañía desarrolla una
metodología propia empleando diferentes sondas o marcadores que definen
las particularidades de cada método particular. Estos métodos de hibridación,
juntos a los de secuenciación conforman las tecnologías más comunes en los
estudios de genómica.
UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA 329
BIBLIOTECAS
El ADN cromosómico aislado directamente de la células es llamado ADN
genómico, mientras que el obtenido mediante trascripción inversa es llamado
ADN complementario (cADN). Por otra parte, un grupo de clones obtenidos
a partir de ADN de una fuente particular es conocido como biblioteca de
ADN, esta puede ser de ADN genómico, o de cADN en dependencia de la
fuente. Para preparar una biblioteca de ADN humana, el ADN genómico, es
primeramente digerido con enzimas de restricción y los fragmentos de res-
tricción son recombinados con un vector similarmente digerido. Esta pobla-
ción de moléculas ADN recombinantes con diferentes insertos de ADN
humano es entonces clonada en un hospedero bacteriano siendo esta colec-
ción de vectores con insertos de ADN humano lo que representa una bibliote-
ca de ADN humano.
Las bibliotecas de ADN complementario tienen la ventaja de portar sólo los
exones (regiones codificantes de los genes para proteínas) y pueden ser mo-
dificadas flanqueando los extremos con fragmentos de señales de trascripción
y traslación conformando así vectores de expresión que permiten el pesquisaje
de las proteínas codificadas. Los clones de ADN complementario de genes
conocidos o no, pueden ser parcialmente secuenciados para generar colas de
secuencias expresadas (ESTs). Estas secuencias permiten, aunque de mane-
ra incompleta, disponer de una representación de las secuencias expresadas
en la célula de interés y determinar la localización del gen dentro de la se-
cuencia de ADN genómico.
330 CAPÍTULO 18
SECUENCIACIÓN
Este método consiste en la lectura de la cadena de nucleótidos de una región de
ADN de interés. Se realiza a partir de suficiente cantidad de la región de ADN
blanco proveniente de fragmentos clonados en bacteria o amplificados por PCR.
Este método emplea un pequeño oligonucleótido cebador de ADN para sintetizar
la cadena complementaria del ADN molde que será secuenciado, y análogos
químicos específicos de los nucleótidos (dideoxinucleótidos) que son capaces de
terminar la extensión de la cadena en la base específica que analogan. Como
resultado se obtienen fragmentos de longitud variable que difieren en un nucleótido.
Este grupo de fragmentos que están marcados radiactivamente o con fluoróforos,
pueden ser separados por electroforesis en gel y se obtiene como resultado un
patrón que permite la determinación del nucleótido específico presente al final de
cada fragmento. Actualmente se usan métodos de detección automática
computadorizada mediante sistemas de láser que agilizan la obtención de la infor-
mación. La mayoría de los métodos de detección de polimorfismos genéticos
emplean métodos que combinan diferentes variantes de PCR con variantes de
secuenciación, ejemplos de los cuales serán mostrados más adelante
MAPEO DE GENES
El mapeo genético humano comprende:
• La localización o mapeo de los genes de cada uno de los 23 pares de
cromosomas.
• La determinación del orden y espacio entre genes en el cromosoma particu-
lar [33].
El mapeo de genes puede ser realizado en dos sentidos:
Mapeo físico: que se basa en estimar la distancia física entre genes medidos
en pares de base (pb).
Mapeo de ligamiento genético: que se basa en la frecuencia de entrecruza-
miento meiótico observado entre dos loci de un cromosoma. La distancia de
ligamiento se mide en centiMorgans (cM)
El mapeo físico de genes puede realizarse por diferentes métodos con diversos
niveles de resolución que varían desde el cromosoma entero hasta un simple
par de bases. Los métodos de baja resolución incluyen: cariotipaje, hibridación
con fluorescencia in situ (FISH) y la hibridación de células somáticas.
Los cromosomas humanos pueden ser identificados por talla y por distintos
patrones de bandas observados bajo el microscopio y teñidos con colorantes
UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA 331
cromosoma [43]. Mientras más cerca estén uno del otro mayor posibilidad ha-
brá de que ocurra el evento de recombinación y viceversa.
El ligamiento genético se define como la tendencia de los genes del mismo
cromosoma de mantenerse juntos durante la meiosis. La fortaleza de este ligamiento
es usada como unidad de medida (Morgan) de la distancia entre 2 genes unidos
[44]. Un centiMorgan denota un evento de recombinación del 1 % (lo que signi-
fica que los genes en cuestión se mantienen unidos el 99 % del tiempo durante la
meiosis). Una distancia genética de 1 cM se refiere a dos genes que están relati-
vamente cerca uno del otro. De acuerdo a lo anterior un mapa de ligamiento
genético puede ser percibido como un mapa de un cromosoma con genes o mar-
cadores de ADN que están alineados según distancias que reflejan la frecuencia
de recombinación entre los genes adyacentes o marcadores [38]. La distancia
total del genoma humano esta estimada a 3000 cM, por tanto 1 cM corresponde
aproximadamente a 1 millón de pb, aunque hay que tener en cuenta que esa es
una unidad de medida relativa, no es constante en el genoma.
Debe tenerse en cuenta que las regiones cromosómicas que se evalúan para los
análisis de ligamiento pueden no estar asociadas necesariamente con caracte-
res fenotípicos aparentes. Por ejemplo: el color del pelo es un carácter fenotípico
aparente, y la variación de la secuencia de ADN responsable del color del pelo
se refleja en una variación en el color del pelo. En contraste, una variación
genética en la secuencia de ADN de un marcador genético fenotipicamente
silente es revelada mediante técnicas moleculares que explotan la presencia o
ausencia de sitios específicos de corte de enzimas de restricción (RFLPs) y
variaciones en el número de VNTRs en regiones cromosomales especificas
que son los llamados marcadores genéticos [45]. Independientemente de si los
marcadores del estudio sean fenotipicamente aparentes o no, los estudios de
ligamiento requieren que exista heterocigosidad en los loci de los genes y de los
marcadores genéticos [46].
Teniendo en cuenta que uno de los objetivos fundamentales de la genómica es
la búsqueda de los genes asociados a enfermedades, el mapeo genético consti-
tuye uno de los pasos imprescindibles en este proceso, debido a que la localiza-
ción de estos genes dentro del genoma humano es el primer paso que permite el
posterior clonaje del gen especifico.
POLIMORFISMO
El genoma humano es grandemente afectado por las variaciones de su secuen-
cia [48]. Si tomamos dos individuos al azar y comparamos sus secuencias de
ADN genómico podremos comprobar que el 99,9 % de sus secuencias son
idénticas. En el 0,1 % restante se encuentran las diferencias que determinan la
suceptibilidad a enfermedades, la respuesta diversa al ambiente, el metabolis-
mo diferencial ante drogas o medicamentos, así como un número importante de
diferencias entre individuos
Cuando el grado de variación en un punto específico del ADN da como resulta-
do una variante que está presente en más del 1 % de la población estamos en
presencia de un polimorfismo. Si la incidencia de esta variante es menor del 1%
entonces lo llamamos mutación. Sin embargo algunas definiciones son impreci-
sas debido a que en algunas poblaciones lo que llamamos mutación en otra la
encontramos como polimorfismo.
Los polimorfismos genéticos pueden ser revelados mediante digestión con
enzimas de restricción lo que da como resultado fragmentos de restricción de
tallas variables, este es el fenómeno visto anteriormente y conocido como RFLP.
Estos RFLPs generalmente no tienen efecto fenotípico ya que usualmente ocu-
rren en las regiones intergénicas. Algunas regiones del ADN son altamente
polimórficas debido a la presencia de pequeñas secuencias repetitivas en tandem
de número variable (VNTRs). Las variaciones en el número y la talla de estas
secuencias en los individuos pueden ser determinadas mediante RFLPs inducidos
por enzimas de restriccion que cortan en los límites de las secuencias repetitivas.
334 CAPÍTULO 18
En octubre del año 2002 comenzó un nuevo proyecto similar al Proyecto del
Genoma Humano, al cual se le denominó Proyecto Internacional HapMap en el
que participan 9 grupos de investigación de los 5 continentes [52]. Su objetivo
fundamental es la determinación del haplotipo a partir de los patrones genéticos
que se identifiquen en muestras de sangre de 200-400 personas de diferente
origen étnico. Este proyecto, que culmina en tres años, se espera que tenga un
costo de 100 millones de dólares y será patrocinado por organizaciones públicas
y privadas. Cuando sean completados los haplotipos podrán ser accesibles en
bases de datos públicas.
En una definición más general, un haplotipo es simplemente el genotipo de un
cromosoma simple o de un grupo haploide de cromosomas. Actualmente el
haplotipo comienza a ser la nueva unidad funcional de la genómica, y en este
sentido se reconoce como un arreglo lineal de alelos en una cadena simple de
ADN. Se conoce que mas de 10 000 nucleótidos se heredan en bloque, y debido
a la cantidad de SNP que se conoce que hay en el genoma humano, pues deben
haber en este bloque muchos SNPs. Estos SNPs que están presentes en un
haplotipo pueden encontrarse en la secuencia de un gen o en la de múltiples
genes pero lo que si esta claro es que el haplotipo permite determinar el contex-
to en el cual actúan los genes. Un estimado reciente sugiere que entre el 65-85 %
del genoma humano puede estar contenido en los bloques de haplotipos [52].
La principal implicación que ha tenido el tema de los haplotipos es la reducción
del número potencial de diferentes genotipos. Además existe ahora la posibili-
dad de identificar lo rasgos heredables que comprenden múltiples variantes de
SNP, detectando sólo un SNP. Esto reduce el trabajo necesario para descubrir
las relaciones entre una enfermedad y uno o más polimorfismos. Este trabajo se
hace típicamente mediante estudios de ligamientos, donde son genotipados los
grupos de pacientes con una enfermedad (ya sea agrupados en familia, o pobla-
ción no relacionada entre si) y un grupo adecuado de control y en el grupo de
datos obtenidos buscan correlaciones entre el genotipo y el diagnóstico. Cuan-
do no se conoce el gen asociado, esta aproximación requiere de un volumen
grande de estudios de genotipaje. Sin embargo, si un SNP está siempre presen-
te en el contexto de un haplotipo especifico, la secuencia completa de ADN
puede ser inferida con un esfuerzo mínimo.
El haplotipo podría comenzar también a ser una herramienta de gran valor en
la medicina evolutiva. Mediante análisis de variaciones específicas y patro-
nes de herencia como los efectos de la heterocigosidad y el desequilibrio de
ligamiento (una secuencia genética que es heredada como un bloque y que no
puede ser disuelta mediante los eventos de recombinación natural, lo que indi-
ca una formación relativamente reciente de ese alelo) los antropólogos,
336 CAPÍTULO 18
PYROSECUENCING
Es un método muy exacto de análisis de un gran número de secuencias ADN
de tamaño medio o pequeño.
UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA 337
Paso 1
Hibridar un oligonucleótido cebador a una secuencia de ADN molde simple
cadena amplificada por PCR e incubar con las enzimas ADN polimerasa, ATP
sulforilasa, luciferasa y apirasa, y los sustratos, adenosina 5’ fosfosulfato (APS)
y luciferina.
Paso 2
Añadir el primer dNTP a la reacción. La ADN polimerasa cataliza la incorpora-
ción del dNTP a la cadena de ADN, si es complementaria con la base presente
en la cadena molde. Cada evento de incorporación es acompañado de la libera-
ción de pirofosfato (PPi) en una cantidad equimolar con la cantidad de nucleótido
incorporado (ver Figura 18.1).
Figura 18.1.
338 CAPÍTULO 18
Paso 3
La ATP sulforilasa convierte cuantitativamente PPi a ATP en presencia de
adenosina 5’fosfosulfato. Este ATP conduce la conversión de luciferina a
oxiluciferina mediada por la luciferasa, lo cual genera luz visible en una canti-
dad que es proporcional a la cantidad de ATP. La luz producida en esta reacción
es detectada por una cámara acoplada y se observa un pico en el pyrodiagrama.
La altura de este pico es proporcional al número de nucleótidos incorporados
(ver Figura 18.1).
Paso 4
La apirasa es una enzima que degrada nucleótidos por lo que degrada
contínuamente el ATP y los dNTPs que no son incorporados. Esto elimina la
señal de luz y regenera la solución de reacción. Entonces se adiciona el próxi-
mo dNTP (ver Figura 18.1).
Paso 5
La adición de dNTPs es de uno en uno. Este proceso continúa igual que el
anterior y de esta forma, al final se obtiene la secuencia de nucleótidos a partir
del diagrama de picos obtenidos (ver Figura 18.1).
Figura 18.2.
Una misma sonda es empleada para detectar ambos alelos de cada SNP.
El genotipaje se realiza empleando una serie de enzimas que funcionan como se
explica a continuación:
Paso 1
Se desnaturaliza y se lleva a la temperatura de hibridación a una mezcla del
ADN genómico, más de 10 000 sondas, la ligasa y la polimerasa termoestables.
Las dos secuencias localizadas en los extremos de las sondas hibridan con sus
respectivos sitios complementarios en el genoma, formando un lazo circular con
un espacio vacío entre los extremos de la sonda (ver Figura 18.3a).
Paso 2
Se adicionan los dNTP, uno a cada tubo de reacción (4 tubos por ensayo). La
polimerasa adiciona el nucleótido en la reacción donde el nucleótido adicionado
es complementario a la base que está siendo estudiada (ver Figura 18.3b).
Paso 3
La ADN ligasa cierra el espacio vacío para formar una molécula circular
covalentemente cerrada que encierra la cadena genómica a la cual fue hibridizada
(ver Figura 18.3c).
340 CAPÍTULO 18
Paso 4
Se adicionan las exonucleasas que digieren las sondas lineales que se forman
donde el nucleótido añadido no fue complementario con la base a completar en
la sonda. Posteriomente las reacciones son calentadas para inactivar las
exonucleasas. (ver Figura 18.3d).
Paso 5
Las sondas son cortadas para liberarlas del ADN genómico (ver Figura 18.3e).
Paso 6
Las sondas son entonces amplificadas y marcadas usando los oligonucleótidos
cebadores comunes para todas las sondas (ver Figura 18.3f).
Paso 7
Se hibridizan las 4 reacciones a un arreglo de oligonucleótidos universales.
Paso 8
La incorporación de la base es medida mediante una señal fluorescente usando
el sitio complementario en el arreglo de ADN.
Se generan 4 valores para cada sonda: Los dos valores de las bases alelos
esperados se comparan para determinar si el individuo es homocigótico o
heterocigótico para el SNP en cuestión, las dos bases no alelos se comparan
con las bases alelos para señalar el fondo de la medición como un procedimien-
to de control de calidad.
CONCLUSIONES
El conocimiento del genoma humano se seguirá ampliando en los próximos años
con la identificación y clasificación de todos los genes humanos y la mejoría y
342 CAPÍTULO 18
REFERENCIAS
1
Mendel G. Versuche über Pflanzen-Hybriden. Verhandlunfen des naturforschenden Vereines,
Abhandhungen, Brüm 4,3-47 (1866).
2
Avery,O.T..MacLeod,C.M-&MaCarty M.Studies of the chemical nature of the substance
inducing transformation of pneumococcal Types. Induction of transformation by a
desoxyribonucleic acid fraction isolated from Pneumococcus Type III. J. Exp. Med.79, 137-
158(1944).
3
Watson, J.D.&Crick, E. H.C. MoIecular structure of nucleic acids: A structure for deoxyribose
nucleic acid. Nature 171, 737 (1953).
4
Nirenberg, M.W. The genetic code II. Sci. Amer 208, 80-94 (1963).
5
Jackson, D.A., Symons, R.H., Berg, P. Biochemical Method for inserting new genetic
information into DNA of Simian Virus 40: circular SV-40 DNA molecules containing lambda
phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2904-
09 (1972).
6
Cohen, S.N., Chang, A.C., Boyer,H.W., Helling,R.B. Construction of biologically functional
bacterial plasmids in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 3240-44 (1973).
7
The International Human Genome Sequence Consortium. Initial sequencing and analysis of
the human genome. Nature 409, 860-961 (2001).
8
Sanger, E., Coulson, A.R. A rapid method for determining sequences in DNA by printed
synthesis with DNA polymerase, J. Mol. Biol. 94, 441-48 (1975).
9
Maxam, A.M., Gilbert, W. A new method for sequencing DNA Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,
560-64 (1977).
UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA 343
10
Collins,F. and Galas, D. A new five-year plan for the US Human Genome Project. Science,
262,43-46 (1993).
11
Collins FS, Green ED, Guttmacher AE, Guyer MS. A vision for the future of Genomics
research. Nature. 2003,422:1-13.
12
The Internacional Human Genome Sequencing Consortium. Inicial sequencing and análisis of
the human genome. Nature 409,860-921 (2001).
13
The Chipping Forecast II. Nature Genet. 2002,32:461-552.
14
Morgan TH. Sex limited inheritance in Drosophila. Science.1910;32:120-22.
15
Aurelius E, Johansson B, Skoldenberg B, Staland A, Forsgren M. Rapid diagnostic of herpes
simplex encephalitis by nested polymerase chain reaction assay of cerebrospinal fluid. Lancet.
1991;337:320-323.
16
Bustin SA, Dorudi S, Molecular assessment of tumour stage and disease recurrence using
PCR-based assays. Mol Med Today. 1998;4:389-96.
17
Biondi A, Rambaldi A. PCR approach for the evaluation of minimal residual disease in acute
leukemia. Stem Cell. 1994;12:394-401.
18
Raj GV, Moreno JG, Gomella LG. Utilization of PCR technology in the detection of solid
tumors. Cancer. 1998;82;1419-1442.
19
Chomczynski P,Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by guanidium thiocyanate-
phenol-chloroform extraction. Anal Biochem.1987;162:156-59.
20
Deguchi T, Yang M, Kawada Y. Micrometastasis of prostate cancer to lymph nodes: detection by
means of reverse transcription-polymerase chain reaction. J Natl Cancer Inst.1997;89:1471-73.
21
Diverio D, Pandolfi PP, Rossi V, Biondi A, Pelicci PG, Lo Coco F. Monitoring of treatment
outcome in acute promyelocytic leukemia by RT-PCR. Leukemia.1994;8(suppl2):S63-S65.
22
Giulietti A, Overbergh L,Valckx D, Decallonne B, Bouillon R, Mathieu C. An overview of real
time quantitative PCR;applications to quatify cytokine gene expression. Methods.
2001,25:386-401.
23
Whitcombe D, Theaker J, Guy SP, Brown T, Little S. Detection of PCR product using self-
probing amplicons and fluorescence. Nat Biotechnol. 1999;17:804-807.
24
Aldape K, Ginzinger DG, Godfrey TE, Real time quantitative PCR: a potential tool for
genetic analysis in neuropathology. Brain Pathol. 2002;12:54-66.
25
Satou J, Funato T, Satoh N, et al. Quantitative PCR determination of human cytomegalovirus
in blood cells. J Clin Lab Anal. 2001;15:122-126.
26
Kaiser K, Rabodonirina M, Picot S. Real time quantitative PCR and RT-PCR for analysis of
Pneumocystis carinii hominis. J Microbiol Methods. 2001;45:113-118.
27
Lovatt A.Applications of quatitative PCR in the biosafety and genetic stability assessment
of biotechnology products. J Biotechnol. 2002;82:279-300.
28
Blakely WF, Prasanna PG, Grace MB, Miller AC. Radiation exposure assessment using
cytological and molecular biomarkers. Radiat Prot Dosimetry. 2001;97;17-23.
29
Lyon E, Mutation detection usuing fluorescent hybridization probes and melting curve analysis.
Expert Rev Mol Diagn. 2001;1:92-101.
30
Tung CH, Mahmood U, Bredow S, Weissleder R. In vivo imaging of proteolitic enzyme
activity using a novel molecular reporter. Cancer Res. 2000;60:4953-58.
344 CAPÍTULO 18
31
Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel
electrophoresis. J Mol Biol. 1975; 98:503-17.
32
Fernyhough P. Quantification of mRNA levels using Northern blotting. Methods MOL Biol.
2001;168:53-63.
33
Smith MJ, Goodfellow PN, Gene mapping and genetic diseases. Curr Opin Cell Biol.
1989;1:460-65.
34
Korenberg JR, Rykowski MC. Human genome organization; Alu, lines,and the molecular
structure of metaphase chromosome bands. Cell.1998;53:391-400.
35
Dewald GW, Wyatt WA, Juneau AL, et al Highly sensitive fluorescence in situ hybridization
method to detect doubleBCR/ABL fusion and monitor response to therapy in chronic
myeloid leukemia. Blood.1998;91:3357-65.
36
Ruddle FH, Bootsma D, Stefani M, et al. Workshop on mapping by somatic cell hybridization.
Prog Clin Biol Res. 1982;103(ptA):145-153.
37
Tischfield JA, Ruddle FH. Assignment of the gene for adenine phosphoribosyltransferase to
human chromosome 16 by mouse human somatic cell hybridization. Prc Natl Acad Sci USA.
1974;71:45-49.
38
Sturtevant AH. The linear arrangement of six-linked factors in Drosophila, as shown by their
mode of association. J Exp Biol. 1913;14;43-59.
39
Putrament A. Recombination and chromosome structure in eukariotes. Gent Res.1971;18:85-95.
40
Bowcock AM, Hebert JM, Wijsman E, Gadi I, Cavlli-Sforza LL, Boyd CD. High recombination
between two physically close human basement membrane collagen genes at the distal end of
Chromosome 13q. Proc Natl Acad USA.1988;85:2701-05.
41
Smith KN, Nicolas A. A recombination al work for meiosis. Curr Opin Genet Dev.1998;8;200-11.
42
Tease C. Cytological detection of crossing-over in BUdR substituted meiotic chromosomes
using the fluorescent plus Giemsa technique. Nature.1978;272:823-24
43
Morton NE. Sequential test for the detection of linkage. Hum Genet. 1995;7:277-318.
44
Robson EB. The human gene map. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 1988;319:229-37.
45
Pulst SM. Genetic linkage analysis. Arch Neurol. 1999;56:667-72.
46
White R, Lalouel JM, Leppert M, Lathrop M, Nakamura Y, O’Connell P. Linkage maps of
human chromosomes. Genome.1989;31:1066-72.
47
Spoerel NA, Kafatos FC. Isolation of Full-length genes: walking the chromosome. Methods
Enzymol. 1987;152:598-603.
48
Venter JC, Adams MD, Myers EW. Et al. The sequence of the human genome. Science.
2001;291:1304-51.
49
Jeffrey AJ, Wilson V, Wong Z et al. Highly variable minisatellites and DNA fingerprints.
Biochem Soc Symp. 1987;53:165-80.
50
Collins FS. Variation on a theme: Cataloging human DNA sequence variation”
Science.1997;278:1580-81.
UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA 345
51
Goldstein DB, and Weale ME. Population genomic: Linkage disequilibrium holds the key.
Curr. Biol. 2001;11:576-79.
52
Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, Moore JM, Roy J, Blumenstiel B, Higgins J, DeFelice
M, Lochner A . The structure of Haplotype Bloks in the Human Genome. Science. 2002;
296(5576):2225-29
53
Daly MJ, Rioux JD, Schaffner SF, Hudson TJ, and Lander ES. High-resolution haplotype
structure in the human genome. Nat Genet. 2001;29:229-32.