Aislamiento de Artemisinina (Qinghaosu) de Artemisia

Annua Cultivada en los Estados Unidos

Daniel l. Klayman,* Aij. Lin. Nancy Acton, John P. Scovill, James m.
Hoch, Wilbur k. Milhous, Anthony D. Theoharide
Division of Experimental Therapeutics , Walter Reed Army Institute of Research
and Arthur S. Dobek
Department of Clinical Investigation. Walter Reed Army Medical Center,
Warhingron, DC 20307
La hierba, Artemisia annua L., un miembro de la familia Compositae, se ha
utilizado durante muchos siglos en la medicina tradicional china. Ge Hong en el
ao 340 y Li Shizhen en 1596 recomendaron la toma de una infusin acuosa de
la planta para aliviar los escalofros y la fiebre de la malaria. En 1967, se inici
una bsqueda en China de nuevos medicamentos antimalricos que pudieran
obtenerse a partir de los remedios tradicionales. Segn estudios preliminares,
el uso de las extracciones de A. annua con H2O caliente o EtOH, no confirmaron
las propiedades curativas de la planta. Despus, sin embargo, la extraccin con
Et2O proporcion una fraccin neutra que posea una buena actividad
antimalrica en ratones infectados con Plasmodium berghei y en monos
infectados con Plasmodium cynomolgi. En 1972, el constituyente activo
cristalino se aisl de las partes areas de la planta con un rendimiento de 0,01
a ,5% en un procedimiento an no publicado. En 1979, se inform de su
estructura (1), y al compuesto se le dio varios nombres por los investigadores
chinos, "artemisinina", "qinghaosu" (es decir, el principio activo de qinghao), y
"arteannuin".
Esta lactona sesquiterpeno tiene una funcin perxido, la
destruccin de lo cual elimina las propiedades antimalaricas del compuesto. La
artemisinina se ha utilizado para curar a ms de 2000 pacientes de malaria
infectados con Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum y se dice que es
eficaz contra el resistente a la cloroquina P. falciparumal igual que la malaria
cerebral. Muchos derivados de 1 han sido preparados, algunos de los cuales
superan los precursores en potencia antimalrica. La sntesis de la artemisinina
ha sido descrita recientemente.

1
Existe cierta confusin en cuanto al nombre chino correcto para A. annua. La
mayor parte de la literatura china actual se refiere a la planta como qinghao
(hierba verde); Sin embargo, Read y Ju-ch'iang denominaron a la A. annua,
huang hua hao (hierba de flor amarilla), mientras a la Artemisia apiacea se le
denomina chin hao. Zhang, en 1981, expres su conformidad con los ltimos
nombres y declar que es engaoso llamar a la A. annua, "qinghao". Otra

fuente se refiere a la Artemisia dracunculus como ch'ing hao. Como la

artemisinina tiene una estructura totalmente diferente de los antimalricos
existentes, estbamos solicitando determinar hasta qu punto la A. annua que
se encuentra en los Estados Unidos contiene este constituyente. Por lo tanto, la
planta, que crece cerca como una mala hierba, se recogi y se sec con aire.
Varios disolventes de bajo punto de ebullicin (por ejemplo, CH 2C12, CHCI3,
Et2O, Me2CO) extrajeron 1 fcilmente; Sin embargo, el ter de petrleo (30-60
) fue ms selectivo y, por tanto, fue considerado como el disolvente de
eleccin. El tratamiento con CH 3CN del extracto de ter de petrleo elimin
gran parte de las ceras adjuntas, y adems el fraccionamiento del extracto en
gel de slice dio 1. En tanto que los hojas y/o flores secas cedieron 0,06% de
artemisinina, los tallos de la planta resultaron estar desprovistos del
compuesto. Los chinos informaron que un estudio de otras 30 especies de
Artemisia (no identificado) no pudo descubrir ninguna con propiedades
antimalricas. Examinamos diez especies que crecen en los Estados Unidos por
el procedimiento de extraccin descrito anteriormente y de manera similar no
se encontr que ninguna contenga 1. A la vista de los informes anteriores de
falta de deteccin de actividad antimalrica en extractos de A. annua en EtOH,
se analiz la estabilidad de 1 hervida en este disolvente durante 48 horas. Se
estima por tlc que aprox 20% de la muestra fue destruida por dicho
tratamiento, como se indica por la aparicin de una nueva mancha en el
origen. Adems, hubo un ensanchamiento del pico de carbonilo a 1745 cm -1. El
tratamiento de 1 con isoPrOH a temperatura de reflujo durante 48 horas, sin
embargo, condujo a la recuperacin de material de partida sin cambios. La
artemisinina se ensay en un sistema in vitro para actividad antimalrica
contra cepas de P. falciparum susceptibles a la cloroquina y resistentes a la
cloroquina y mostraron una potente actividad inhibidora comparable a la de
metanol quinolina, mefloquina. En una pantalla antibacterial, la artemisinina no
ninguna actividad inhibidora hacia alguno de los organismos Gram-positivos o
Gram-negativos.
PARTE EXPERIMENTAL
GENERALIDADES DE LOS PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Los puntos de fusin se determinaron en un aparato de punto de fusin
Thomas Hoover y estn sin corregir. Los espectros IR se ejecutan en un
espectrofotmetro Perkin-Elmer Modelo 283 con pastillas de KBr. Los espectros
pmr y cmr se ejecutan en CDCI, en un espectrmetro JEOL FX90Q. La rotacin
ptica se determin en un polarmetro Perkin-Elmer Modelo 241MC. Los
espectros de masas se obtuvieron en un Finnigan Modelo 3 Lood GC / MS
funcionando en modo CI (CH4) utilizando la sonda slida.
MATERIAL DE LA PLANTA
Las partes sobre el suelo de A. annua utilizados en este estudio se obtuvieron
en Virginia, Maryland y el Distrito de Columbia durante los meses de agosto y
septiembre de 1983, y fueron identificados por el Prof. Ted Bradley, George
Mason University , Fairfax, Virginia. El material adicional fue donado por la Sra
Holly Shimizu del National Herb Garden, US National Arboretum, Washington,
DC. Las hojas y tallos fueron secadas con aire y se extrajeron por separado. Las
muestras de las especie Artemisia, es decir, A. pontica, A. abrotanum, A.

pychnocephala, A. versicolor, A. schmidtiana, A. absinthium, y A. ludoviciana

tambin fueron proporcionados por el US National Arboretum. A. tridentata var.
tridentata, A. tridentata var. vaseyana, y A. arbuscula fueron suministradas por
el Sr. Robert Fuller, Bureau of Indian Affairs, Fort Duchesne, Utah. Las muestras
de A. vulgaric se obtuvieron en Maryland en septiembre de 1983, y A.
dracunculus fue comprada localmente.
EXTRACCIN Y FRACCIONAMIENTO
Hojas secadas al aire de A. annua (200g) recogidas a principios de agosto de
1983, se extrajeron con ter de petrleo hirviendo (punto de ebullicin 30-60)
durante 48 horas. La eliminacin al vaco del disolvente dio un jarabe de color
marrn oscuro que se disolvi en 20 ml de CHCl 3 y a esta solucin se le aadi
180 ml de CH3CN. Se retir el material insoluble, y el filtrado se evapor a
presin reducida dando 4,5 g de residuo gomoso.
SEPARACIN CROMATOGRFICA
El residuo se someti a cromatografa sobre 200 g de gel de slice de malla 70230 usando 7,5% de EtOAc en CHCl3 como eluyente. El fraccionamiento se
inici tras el paso de 200 ml de eluyente y las las alcuotas fueron controladas
por TLC (placas de gel de slice; 7,5% de EtOAc en CHCl3; deteccin de 1 por
vapor de I2; Rf = 0,66). La artemisinina apareci despus de la recoleccin de
aproximadamente 300 ml de eluyente y se obtuvo (0,12 g, rendimiento 0,06%)
como cristales blancos finos, p.f 153-154 [p.f lit. 156-157], despus de la
recristalizacin en ciclohexano. La identidad de 1 fue confirmada por p.f
comparativo, espectro IR superponible, con una muestra autntica de
artemisinina. los espectros PMR y CMR, y {}D eran idnticos a los reportados.
Espectro de masas m/z 283 (M+1); Calculado (C 15H22O5) 282. Una mezcla de
hojas y flores de A. annua recogidos a principios de septiembre 1983 secadas
al aire, cuando se trataron de la manera descrita anteriormente, tambin
arrojaron 0,06% de 1.
La actividad antimalrica intrnseca de la artemisinina se evalu
cuantitativamente in vitro utilizando la tcnica de microdilucin
semiautomatizado esencialmente la de Desjardins y col. En base a la
concentracin inhibitoria calculada del 50% (IC 50), el compuesto 1 se encontr
que era igualmente eficaz (media IC 50<3,4 ng/ml) contra aislados de P.
falciparum susceptibles a la cloroquina (Camp) y resistentes a la cloroquina
(Smith).
Tenga en cuenta que la mefloquina presenta un IC 50 medio de 3,5 ng/ml en la
primera cepa y 2,5 ng/ml en la segundo, mientras que la cloroquina, un IC 50 de
7,6 ng / ml contra las cepas Camp y un IC 50 de 60 ng/ml frente a cepas Smith.
La actividad antibacteriana de 1 contra organismos clnicamente relevantes se
evalu usando placas de microtitulacin con un procedimiento de microdilucin
en caldo Mueller-Hinton. En el tamiz fueron incluidos los siguientes organismos
Gram-positivos [nmero de cepas]: Staphylococcus aureus[5], Streptococcus
faecalis[5]; y los siguientes organismos Gram-negativos: Klebsiella
Enterobacter[7], Shigella dysenteriae[4], Escherichia coli[5], Serratia
marcescens[8] y Proteus spp[8]. La concentracin mnima inhibitoria (MIC) en
cada caso fue > 32g/ml. En el ensayo de Neisseria meningitidis[5], otro

gnero Gram-negativo, el MIC fue > 1 g/ml. N. gonorrhoeae[25], probado con

un procedimiento de dilucin en agar GC suplementado, tambin tena una CIM
>1 g/ml. La artemisinina parece fomentar el crecimiento de N. gonorrhoeae.