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Oncognesis Viral

Como pueden los virus inducir oncognesis?

Modificando la seal de transduccin (activando los activadores)


Bloqueando los reguladores negativos del ciclo celular (genes supresores
de tumores)

Modifi cando la seal de transduccin


Retrovirus oncognicos
No todos los retro, si no algunos. El mecanismo que utilizan para inducir la
oncognesis es variado: algunos la inducen a nivel de un mecanismo de
traduccin, retrovirus transductores; y otros que utilizan un mecanismo de
Insercin o de latencia extendida, se llaman retrovirus no transductores.
Tienen un virus ARN, de polaridad positiva, primero convertan el ARN en ADN a
travs de la transcriptasa reversa (nezima viral). Integran luego su genoma al
genoma celular (integrasa). Una vez integrado, puede utilizar la maquinaria
celular para expresar sus protenas.
Gen GAG: codifica para la protena de capside
Gen POL: Codifica para la transcriptasa reversa
Gen ENV: Codifica para la protena de Envoltura
LTR: Tanto en el 3 como en el 5, regin reguladora que acta como enhancer.
Retrovirus transductores: Se llaman asi a los Retrovirus que portan un
oncogen, y este es capaz de regular el ciclo celular.
Un Oncogen, es un protoncogen modificado el cual es parte del ADN de la
celula. Difreneciar protoncogen o c oncogen que es un gen que est en la
clula, del v- oncogen que es un gen que est en el virus.
Los transductores portan un v oncogen, e sun gen viral, su origen fue celular,
por esa capacidad que tienen de integrarse al genoma celular, en algn
momento se llevo genes celulares y a la evz en la clula quedan genes
celulares. El v oncogen NO es idntico al c oncogen, hay diferencias. La
diferencia es que el v oncogen es muy similar pero tiene alguna mutacion que
hace que ese gen NO pueda ser regulado por la clula. En cambio el c oncogen
es regulado por la celula, es decir que se puede expresar y desespresar. El v
oncogen es muy similar pero tiene alguna mutacin que hace que no pueda
regularlo

Cuando ingresa el Retrovirus y este tiene este gen, integra el genoma inserta el
gen viral. El celular tambin se expresa, pero el viral tiene un promotor y
enhancer fuertes, la expresin del viral es mas potente. Las protenas que son
producto de esos genes, son reguladoras del ciclo celular.
Sin regulacin se expresa constantemente.
La diferencia no es solo que uno esta en el virus y el otro en la clula, si no
tambin que esta modificado y no puede ser regulado por la clula.
Son altamente carcinognicos en animales y transforman clulas en cultivo
rpidamente.
Muchos son defectivos en su replicacin y necesitan un virus helper para
replicar. En condiciones de laboratorio. Que son defectivos significa que le falta
algo de gag, pol y env. Esto se fue perdiendo evolutivamente en las sucesivas
interacciones con la clula, por lo tanto no replican, ahora si pueden hacerlo
cuando tiene un helper, por ejemplo, por complementacin o recombinndose.
Que no puedan replicar no significa que no puedan producir oncognesis, son
dos eventos bien diferenciados. Ya que solo necesitan expresar el v- oncogen.
Ejemplo: Activaciones de la seales celulares, tienen que ver con
fosforilaciones, las enzimas encargadas de esto son las quinasas.
El gen src codifica para una tyrosina kinasa (que es una enzima que agrega
grupos fosfatos alos residuos de tirosina de protenas). La diferencia entre el v
oncogen del virus del sarcoma de Rous con respecto al c oncogen celular de un
pollo, es que el primero tiene menos aminocidos en el extremo craboxiterminal. Tiene una delecion. Para que pase a su forma activa, la quinasa debe
ser fosforilada en la tirosina 416 (lo tienen tanto el celular como el viral). Para
volver a su forma inactiva, esta protena debe ser fosforilada en el residuo que
es el 527, el v oncogen llega hasta el 526. No tengo el residuo para inactivarlo,
haciendo que este mediador citoplasmtico este todo el tiempo activo, perdi
la capacidad de ser regulado. El celular se sigue regulando perfectamente.

Retrovirus no transductores
A diferencia de los anteriores NO portan ningn oncogen. Se integran al
genoma celular, pero deben hacerlo en las proximidades de un c- oncogen. Se
integra en cualquier lado, pero si lo hace cerca de un c- oncogen lo puede
activar.

Alteran la expresin de la protena celular, ya que est gobernada o bien por el


promotor o bien enhancer del virus, que son mucho ms potentes que los
celulares. Va estar aumentada la expresin de esa protena celular.
El mecanismo se denomina activacin por insercin de promotor o de
enhancer.
En el caso de que sea por promotor, este es el que estimula la sntesis del
oncogen. Si gobierna el LTR del virus se tendra un mensajero mixto, con un
pedazo de clula y un pedazo de virus quimera
Si gobierna el LTR de la derecha (celular) se produce mensajero celular. En
general es este el que gobierna y se deleciona el de la izquierda, no se sabe
bien por que.
En el caso que se d por enhancer, que tiene posibilidad de actuar en ambas
direcciones y a distancia. La integracin no altera el protoncogen pero la
proximidad del enhancer viral estimula la transcripcin.
Retrovirus de latencia extendida
El nico que virus que se conoce es el virus de la leucemia de clula T humana.
El gen tax es un factor de transcripcin que acta activando varios promotores
de protoncogen, transactivar promotores. Esta propiedad le da la latencia. No
porta oncogenes ni se inserta cerca de los mismos.
Y generalmente se asocia con algunas enfermedades neurodegenerativas.
Infecta clulas T (CD4). Causa principalmente Leucemia T linfocitica en adultos
en el 1% de los infectados, el resto es asintomtico. Lleva unos 20 aos en
producir la enfermedad.
Resumen

Bloqueando los reguladores negativos del ciclo celular (genes


supresores de tumores)
Es utilizado por Adenoma, Polioma y Papilomavirus. Son virus con genoma
ADN, pequeos, necesita para poder replicarse la polimerasa celular. Necesitan
llevar a la clula a la fase S y esto lo logran modulando el freno, o sea a p53 y
a prb.
En el ciclo celular hay distintos puntos de control en G1 y G2 donde se controla
que la clula cuente con todo lo necesario y tenga el tamao requerido. Si esta
todo ok, pasa a la etapa S o sale de ella. Esto se da por la clclinas y las
quinasas dependientes de ciclinas. Las ciclinas son protenas que varian sus
niveles a lo largo del ciclo, las quinasas no. Cuando aumentan la ciclinas,
aumenta la probabilidad de que se forme el complejo ciclina-quinasa y va a
tener la capacidad de activar a otras protenas a travs de la fosforilacion.
En la transicin de G1 a S hay diferentes complejos ciclina-quinasa, estos
fosforilan por ejemplo a Prb, cuando esta fosforilada, lo que ocurre es que hay
transicin de las protenas que estn involucradas en la replicacin del ADN
(muchas de ellas enzimas). Hay replicacin celular.
La transicin de S a G2 esta regulado por otro complejo, E2F, y cuando este
esta fosforilado no se trancriben estas protenas y por lo tanto no ocurre la
duplicacin del ADN.

Prb y E2F estn vinculados. E2F actan como factor de transcripcin de ciertas
protenas relacionadas con la duplicacin del adn y prb esa unido a E2F, y asi
no puede actuar como factor de transcripcin, estando esta bloqueado. Cuando
se forma el complejo ciclina quinasa y se fosforila prb, el hecho de que este en
estado hace que libere a E2F y ah puede actuar como factor de transcripcin y
por lo tanto va a actuar como factor de transcripcin. Los virus de alguna
manera tienen que interferir el efecto de la forsforilacion del complejo ciclinaquinasa. Esto va a ser por unin.
Por otro lado en la etapa S hay otros puntos de control, los cuales estn
regulados por la protena P53. Ante un dao leve del ADN se detiene el ciclo
celular para permitir la reparacin de ese dao, ahora si es un dao
irreversible, p53 puede inducir la apoptosis. Si se anula su funcin podemos
desregular el ciclo.
En condiciones normales los niveles de P53 son bajos, ante daos leves en el
ADN se activa P53 por fosforilacion y aumenta sus niveles. Y P53 acta como
factor de transcripcin de P21, el cual se une al complejo ciclina quinada e
inhibe su actividad; este era el que fosforilaba a Prb, y este no esta fosforilado
y por lo tanto queda unido a E2F y por lo tanto no hay replicacion del ADN. De
esta manera de detiene el ciclo.
En caso de que el dao sea grave directamente va a apoptosis, P53 acta
como factor de transcripcin de otras protenas como BAX que al estar
aumentadas inician la apoptosis.
Si Prb se encuentra fosforilado (inactivo) y P53 bloqueado, la divisin celular va
a estar estimulada y se produce oncognesis, divisin celular estimulada.
Si Prb se encuentra no fosforilado (activo) y P53 activo, se detiene el ciclo
celular y esto puede producir apoptosis.
Proteinas virales que estimulan divisin celular
E1B de Adenovirus, LT de SV40 y E6 de Papilomavirus; se unen a P53 y
bloquean su actividad. Lo bloquean solo por unirse, son protenas virales
E1A de Adenovirus, LT de SV40 y E7 de Papilomavirus; se unen a Prb y lo
inactivan. Producen el mismo efecto de la fosforilacion.
Adenovirus no es muy oncognico, pueden hacerlo solo en algunos huspedes.

Modulacin de la apoptosis

Tengo una clula infectada, y tengo por un lado la estrategia de la celula y por
otro lado la del virus.
Que la clula entre en apoptosis tambin depende de sus mecanismos para
impedirlo.
Se define Apoptosis como un proceso genticamente programado mediante el
cual las clulas de organismos pluricelulares llevan a cabo su autodestruccin
en respuesta a una amplia variedad de estmulos (internos o externos). Es un
proceso fisiolgico, que se da tambin para mantener la homeostasis de los
tejidos, a diferencia de la necrosis.
Cuando comienza la apoptosis comienza a disminuir su volumen
citoplasmtico. Tambin se compacta el ncleo. Y esto finalmente va a terminar
con la fragmentacin de la celula (citoplasma y nucleo) y se van a generar
cuerpos apototicos que adentro tienen restos de ADN, ribosomas, etc. Las
membranas de las organelas quedan intactas. No genera respuesta
inflamatoria. Los cuerpos apoptoticos pueden ser fagocitados por los
macrfagos.
En cultivo celular como no hay fagos (en gral) puede ver la condensacin del
nucleo que esta fragmentado. En un cultivo sano las clulas son aplanadas y
estiradas, cuando empieza la apoptosis se comprimen y se levantan, el cuerpo
se redondea, se retraen.
Caractersticas de las clulas apoptoticas

Reduccin del volumen celular. Se observa por el redondamiento celular


y la compresin
Condensacin de la cromatina. Esto se puede observar con un colorante
que se unen al ADN y con un microscopio de fluorescencia cuando esta
condensada la luz se ve como mas blanca, las normales se ven azules y
con el ncleo redondo. Cuando entra en apoptosis el ncleo primero se
ve como una medialuna y ms blanco. A veces es difcil saber si esta
condensacin se debe a apoptosis.
Degradacin internucleosomal del ADN. La degradacin del ADN es
ENTRE los nucleosomas, entonces quedan liberados fragmentos de
doscientos pares de bases o aproximadamente de ese tamao. Si yo
extraigo el ADN de un cultivo celular que qiero determinar aopoptosis,
hago una corrida electrofortica y coloco un marcador de peso molecular
y me fijo si observo fragmentos de cada doscientos pares de bases, esto
se denomina escalera o Ladder.
Traslocacion de fosfatidilserinas a cara externa de la membrana
plasmtica. Es un evento bastante temprano en la apoptosis. Cuando
ocurre, se sabe que la fosfatidilserina trasloca de la cara citoplasmtica
a la cara externa, si yo utilizo una molecula que puede unirse a la

fosfatidilserina, y a su vez a esta molecula le acoplo un fluorocromo, yo


puedo ver con un microscopio de fluorescencia si hay marca en la
superficie celular, esto me indicara que la fosfatidilserina esta fuera de
la clula (se hace con clulas vivas). A veces tambin se usa citometria
de flujo, la molcula que se une a la fosfatidilserina es la Anexina V.
Fragmentacin de la clula en cuerpos apoptoticos. A veces se pueden
observar por microscopia.

Se va de lo general y cada vez a lo mas particular: Un Ladder me indica un


nivel morfolgico general de la clula podra estar en aopotosis, un tnel me lo
indica un poco mas porque me dice que hay fragmentacin de ADN, entonces
puedo hacer una Anexina que me indica que adems hay una traslocacion de
fosfatidilserina, y ya me esta confirmando que hay un apoptosis. En general
cuando quiero confirmar aopoptosis se usan varias tcnicas.
Cmo se activa la apoptosis?
Puede ser por estmulos externos y se activa la va extrnseca; o por estmulos
intracelulares por la va intrnseca o mitocondrial. Tanto una como la otra
concluyen en la activacin de caspasas efectoras (enzimas que van a degradar
componentes celulares, del citoesqueleto, de la membrana nuclear, van a
terminar con la muerte de la celula).
Los virus modulan estas vas para poder inducir o frenar la aopoptosis. La
pueden querer frenar, ya que la celula puede entrar en apoptosis cuando esta
infectado, y no tiene tiempo de replicar.

Via extrnseca:

La unin del ligando al receptor hace que este se trimerice. Como ejemplos de
ligando estn Fas L, TNFalfa, etc, Como ejemplo de receptores tenemos
Fas,TNFR1, etc. Una vez que este se trimerizo, se colocan protenas
adaptadoras como FADD o TRADD (depende de que ligando que protena), y
esto recluta a la procaspada 8 (caspasa iniciadora) que se dimeriza; y esta
tiene capacidad de autoclivarse convirtindose en caspasa 8 activa, que cliva a
otras caspas, las ejecutoras que atacan distintos componentes celulares (3, 6 y
7).
Via intrnseca

Estmulos intracelulares que aumenta la expresin de protenas proapoptoticas


(miembros de la familia bcl-2): Bax, Bik, etc. Estas protenas que estn en el
citosol van a migrar a la mitocondria, donde forman homodimeros (de dos
protenas iguales); que van a formar poros, por donde va a salir el citocromo C,
este a su vez se une con la protena BAX1 y con la procasasa 9, formando el
apoptosoma. Cuando la procaspasa 9 forma parte del apoptosoma, se autocliva
y se convierte en caspasa 9 activa; caspasa iniciadora y cliva a la caspasa 3 (u
otra ejecutora).
Hay otras protenas que son antiapoptoticas como bcl-x, largo y corto. El corto
es apoptotico y el largo es antiapoptotico. Tambien bcl-2. Estas pueden formar
heterodimeros con la propapooticas, cuando se forma el heterodimero no se
puede formar el poro en la membrana de la mitocondria. No permiten que las
antiapoptoticas migren a la mitocondria.

Las c-flip son protenas que lo que hacen es competir con la procaspasa 8 para
unirse a la protena adaptadora. La apoptosis esta inducida, pero por este flip
se frena, porque nunca se activa la caspasa 8.
Todas las vas confluyen en la caspasa 3, si la mido se que hay apoptosis, pero
no a qu nivel. Indicador bioqumico.
La protena Vir, hay veces que se activa la via extrnseca y la caspasa 8 cliva a
Vir, y Vir truncado lo que hace es favorecer la formacin de los canales para
que salga el Citocromo C. Se activa indirectamente la via intrnseca.
Las IAP son protenas que inhiben a la caspasa 3, puede estar todo activado,
pero esta protena regula a esta caspasa.
Hay otras protenas que bloquen a la IAP, es proapototica.

Qu protenas virales pueden actuar y a qu nivel?


Inhibiendo bcl-2, serian proapoptoticas.
Otros virus tienen protenas similares a las IAP (que inhiban a las caspasas).
Puede haber protenas virales que estimulen la transcripcin de bcl-2.
Hay muchos virus codifican protenas virales que son homologas a bcl-2 y
pueden formar heterodimeros con las celulares (bax y todas las
proapoptoticas).
Hay protenas virales que se colocan como si fueran el receptor que no
necesitan ligando, se comportan como si estuviese el ligando todo el tiempo
unido.
Hay virus que tienen protenas (V flip) que desplazan a la procaspasa 8 y no
dejan que la caspasa 8 se active. La celula ya inicio su apoptosis.
Por Western puedo medir si Bax o Bcl-2 estn elevados. Eso no alcanza, porque
si uno clula esta en apoptosis o no, va a depender del equilibrio que haya en
un conjunto de protenas, por ejemplo puedo tener Bax aumentado pero
tambin Bcl-2 aumentado por lo tanto se compensan. En un trabajo serio se
tienen que medir varias protenas, por ejemplo varias proapototicas
aumentadas y las antiapopototicas no.
Cmo se estudia la modulacin que ejercen los virus sobre la
apoptosis?
Por ejemplo La protena NS3 de el Virus de la Diarrea Viral Bovina cuando se
expresa solo en clulas mamferas induce apoptosis correlacionada con con la
activacin de caspasa 8 y caspasa 9.
Es un virus RNA +. Codifica para una poliproteina. Hay dos cepas la citopatica y
no citopatica segn el efecto en cultivos celulares. Se observa que cuando esa
protena esta sin clivar (NS2 y NS3 juntas), no hay efecto citopatico. Mientras
que cuando se clivan, se libera NS3, se expresa solo en citopaticas e induce
apoptosis.
En el trabajo, quieren saber si induce apoptosis y por que via. Caspasa 3 me da
informacin ms certera de que hay apoptosis pero no por que via.
Primero tengo que clonar el gen, primero lo paso a ARN con una transcriptasa
reversa. Tambien le sacaron a la protena los primero 50 aminoacidos (para ver
si la porcin amino terminal, la primera, tena que ver o no con la induccin de
la apoptosis). El ADN se corta con enzimas de restriccin, o si conozco toda la
secuencia del genoma, genero ese fragmento por PCR. Se clona en un vector
de Adenovirus, para infectar clulas. Le colocan el inserto (NS3 o NS3

modificado)y tambin le colocan GFP para saber si estas clulas tienen o no


adentro el vector y tetraciclina para regular la expresin poniendo tetraciclina
en el medio de cultivo. Infecto clulas, y tengo que corroborar que entro, si
emiten algo verde. Se confirma la expresin de NS3 y NS3 con los aminocidos
deleteados, por Western Blot. Ingreso a la clula y adems se expresan las
protenas.
Determinar apoptosis: Observo al microscopio la morfologa, hay que ver si las
clulas verdes estn diferentes de las otras; si estn redondeadas y
levantadas, con compactacin, disminucin del volumen citoplasmtico. Hay
que ver si hay efecto citopatico. Ambas cosas tanto NS3 y el deleteado.
Tambin se hace Tunel. El nucleo esta compactado y coloreado.
Por citometria de flujo se mide el contenido de ADN sudiploide (G0/G1). Se
indica ADN degradado, de menor longitud. Fragmentacin de ADN.
Tambin se hace Ladder : NS3 y la mutada, iguales que el control positivo
Western blot de Citocromo C: A distintas horas, se diferencia el citocromo que
esta en citosol y el que esta en mitocondria. Calle 1, es control. 2, 3, y 4, clula
infectada a diferentes horas. A las 48hs aparece una banda en el citosol,
observan que est saliendo de la mitocondria. Esto no solo habla de apoptosis,
si no de la va intrnseca.
Se hace Western blot del clivaje de las procaspasas 8, 9 y 3. A las 48 hs se ve
el clivaje de caspasas 8, 9 y 3. Da otra informacin, confirma que esta activa la
via intrnseca por caspasa 9, y a la vez tengo la 8 clivada; tengo ambas activas.
Tambin miden actividad de las caspasas 8, 9 y 3. Les da estn activas. Se
coloca un sustrato colorimtrica, si esta la caspasa activa va a clivar, si el
sustrato se cliva da color.
Las caspasas pueden activarse de manera inespecfica, se utiliza un inhibidor;
esta activa y cuando le pongo el inhibidor deja de estarlo. Se indica porcentaje
de inhibicin, si esta alto, hubo inhibicin, y si la hay es porque estuvo activa
(invlcurada en va). Hacen infeccin con NS3 mutada y no mutada; y otra
infeccin con FAS-L, Fas-L es activador de la va extrnseca, se usa como
control positivo. Le pongan un inhibidor de caspasa 3 y observan inhibicin,
esta activa.
Luego tambin se utilizan inhibidores conocidos de las vas. Se usan para
confirmar los anteriores.
Concluyen que NS3 y NS3 50 inducen apoptosis en cultivos celulares a travs
de la va extrnseca (cas 8), que indirectamente activa la va intrnseca (cas 9),

confluyendo ambas en la activacin de la cas 3. NO demostraron esta


conclusin.
Estrategias
Adenovirus tiene homologas a bcl-2 frena apoptosis, tambin inductoras; se
cree que primero la frena y luego la induce. El virus de la anemia del pollo
induce apoptosis, ya que el se disemina en cuerpos apoptoticos.

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