Los plsmidos son molculas de ADN extracromosmico circular que se

replican y transmiten independientes del ADNcromosmico. Estn

presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en
organismos eucariotas como laslevaduras. Su tamao vara desde 3 a
10 kb. El nmero de plsmidos puede variar, dependiendo de su tipo,
desde una sola copia hasta algunos cientos por clula. Los vectores
plasmdicos permiten clonar ligandos de DNA exgeno de hasta 4 kb ya
que un tamao mayor a ste dificulta la clonacin en estos vectores. El
trmino plsmido fue presentado por primera vez por el bilogo molecular
norteamericano Joshua Lederberg en 1952.1
Las molculas de ADN plasmdico, adoptan una conformacin tipo doble
hlice al igual que el ADN de los cromosomas, aunque, por definicin, se
encuentran fuera de los mismos. Se han encontrado plsmidos en casi
todas las bacterias. A diferencia del ADN cromosomal, los plsmidos no
tienen protenas asociadas.
En general, no contienen informacin esencial, sino que confieren
ventajas al hospedador en condiciones de crecimiento determinadas. El
ejemplo ms comn es el de los plsmidos que contienen genes de
resistencia a un determinado antibitico, de manera que el plsmido
nicamente supondr una ventaja en presencia de ese antibitico.
Hay algunos plsmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de
insertarse en el cromosoma bacteriano. Estos rompen
momentneamente el cromosoma y se sitan en su interior, con lo cual,
automticamente la maquinaria celular tambin reproduce el plsmido.
Cuando ese plsmido se ha insertado se les da el nombre de episoma.
Los plsmidos se utilizan como vectores de clonacin en ingeniera
gentica por su capacidad de reproducirse de manera independiente del
ADN cromosomal as como tambin porque es relativamente fcil
manipularlos e insertar nuevas secuencias genticas.
Los plsmidos usados en Ingeniera Gentica suelen contener uno o
dos genes que les confieren resistencia a antibiticos y permiten

seleccionar clones recombinantes. Hay otros mtodos de seleccin

adems de la resistencia a antibiticos, como los basados en
fluorescencia o en protenas que destruyen las clulas sin uso de
antibiticos. Estos nuevos mtodos de seleccin de plsmidos son de
uso frecuente en agrobiotecnologa, debido a la fuerte crtica de grupos
ecologistas contra la posibilidad de presencia de antibiticos en los
organismos modificados genticamente.

Resistencia a los antibiticos[editar]

Los plsmidos a menudo contienen genes o paquetes de genes que les
confieren una ventaja selectiva, lo que les da la habilidad de hacer a la
bacteria resistente a los antibiticos.
Cada plsmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como
un origen de replicacin u ORI (un punto inicial para la replicacin del
ADN), lo cual habilita al ADN para ser duplicado independientemente del
ADN cromosomal. Los plsmidos de la mayora de las bacterias son
circulares, pero tambin se conocen algunos lineales, los cuales
reensamblan superficialmente los cromosomas de la mayora
de eucariotas.

Epsomas[editar]
Un epsoma es un plsmido que puede integrarse por s mismo
al ADN cromosomal del organismo husped. Por esta razn, puede
mantenerse en contacto por un largo tiempo, ser duplicado en cada
divisin celular del husped y volverse parte bsica de su mapa gentico.
Este trmino no se usa ms en plsmidos, debido a que ahora est claro
que una regin homologa con el cromosoma elabora un plsmido dentro
de un epsoma.
Los plsmidos usados en ingeniera gentica son llamados vectores.
Estos son usados para transferir genes desde un organismo a otro y
tpicamente contienen un marcador gentico confiriendo un fenotipo el
cual puede ser seleccionado a favor o en contra. La mayora tambin
contienen un polivinculador o sitio de clonado mltiple (MCS), el cual es

una pequea regin que contiene los sitios de restriccin ms

comnmente usados, permitiendo una fcil insercin de fragmentos de
ADN en ese lugar.

Tipos[editar]
Una forma de agrupar plsmidos es por su habilidad de transferirse a
otra bacteria. Los plsmidos conjugativos contienen tra-genes, los
cuales ejecutan complejos procesos de conjugacin, como la
transferencia sexual de plsmidos a otra bacteria. Los plsmidos noconjugativos, son incapaces de iniciar una conjugacin, de all que ellos
pueden transferirse nicamente con la asistencia de los plsmidos
conjugativos y lo hacen por accidente. Una clase intermedia de
plsmidos son los movilizables los cuales llevan solo un subtipo de
genes requeridos para la transferencia. Ellos pueden parasitar un
plsmido conjugativo, transfirindose a una alta frecuencia solo en su
presencia.
Es posible para plsmidos de diferentes tipos el coexistir en una clula
simple.
Siete tipos diferentes de plsmidos han sido encontrados en la E.Coli.
Pero normalmente plsmidos relacionados son incompatibles, en el
sentido de que solo uno de ellos sobrevive en la lnea celular, debido a la
regulacin de las funciones vitales de los plsmidos. Por lo tanto, los
plsmidos pueden ser diferenciados de acuerdo a grupos de
compatibilidad.
Otra forma de clasificar plsmidos es por funcin. Hay 5 clases
principales:

Plsmidos de fertilidad: los cuales contienen tra-genes, son

capaces de conjugarse.

Plsmidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden

constituir resistencia contra antibiticos o venenos. Histricamente

conocidos como Factores R, antes de que se entendiera la naturaleza

de los plsmidos.

Col-plsmidos: los cuales contienen genes que codifican

(determinan la produccin de) colinas y protenas que pueden matar a
otra bacteria.

Plsmidos degradativos: los cuales habilitan la digestin de

sustancias inusuales como tolueno o cido saliclico.

Plsmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un

patgeno.

Los plsmidos pueden pertenecer a ms de uno de estos grupos

funcionales.
Los plsmidos solo pueden coexistir como una o ms copias en cada
bacteria, debido a la divisin celular pueden perderse en una de las
bacterias segregadas.
Algunos plsmidos incluyen un sistema de adicin o Sistema de Muerte
Postsegregacional (PSK: Postsegregational Killing System). Ellos
producen en conjunto un veneno de larga vida y un antdoto de vida
corta. Las clulas hija que retienen una copia del plsmido sobreviven,
mientras que una clula hija que falla al integrar el plsmido muere o
sufre una reducida tasa de crecimiento debido al veneno que obtuvo de
la clula padre. Este es un ejemplo de plsmidos como el ADN
replicante.

Aplicaciones[editar]
Los plsmidos sirven como una importante herramienta en laboratorios
de gentica e ingeniera bioqumica, donde son comnmente usados
para multiplicar (hacer muchas copias de) o como genes particulares
expresos. Muchos plsmidos estn disponibles comercialmente para
dichos usos.

El gen a ser replicado se inserta en copias de un plsmido el cual

contiene genes que hacen clulas resistentes a un antibitico en
particular. En el paso siguiente el plsmido es insertado en la bacteria por
medio de un proceso llamado transformacin. Luego, la bacteria es
expuesta a un antibitico particular. Solo la bacteria que toma copias del
plsmido sobrevive al antibitico debido a que el plsmido lo hace
resistente. En particular, los genes protectores son expresados (usados
para hacer protena) y la protena expresada evita la accin del
antibitico. De esta forma, los antibiticos actan como un filtro que
seleccionan nicamente la bacteria modificada. Ahora, estas bacterias
pueden ser cultivadas en largas cantidades, cosechadas y el plsmido de
inters puede ser aislado.
Otro uso importante de los plsmidos es fabricar grandes cantidades de
protenas. En este se deja crecer la bacteria que contiene el plsmido
que encierra al gen de inters. Solo como la bacteria produce la protena
que le confiere si resistencia a los antibiticos, este tambin puede ser
usado para producir protenas en grandes cantidades desde el gen
insertado. Esta es una forma barata y fcil de producir genes o protenas
que este codifica de forma masiva, como por ejemplo insulina, o inclusive
antibiticos.

Extraccin del ADN plasmdico[editar]

En el maxiprep se cultivan volmenes mucho ms grandes de bacterias
en suspensin. Esencialmente, este es un escalado de la preparacin
mini-prep, el cual es seguido por una purificacin adicional. Esto resulta
en una cantidad relativamente grande (0,5 -1 mg) de ADN plsmido muy
puro.
En los ltimos tiempos muchos kits comerciales han sido creados para
realizar la extraccin plasmdica a varias escalas, purezas y niveles de
automatizacin.

Conformaciones[editar]

El ADN plsmido puede aparecer en uno de cinco conformaciones, las

cuales (para un tamao dado) corren a diferentes velocidades en un gel
durante electroforesis. Las conformaciones se muestran abajo en orden
de movilidad electrofortica (velocidad para un voltaje dado), del ms
lento al ms rpido:

Mellado abierto circular: el ADN tiene un solo corte filamentario.

Lineal: ADN tiene terminales libres, ya sea porque los filamentos

fueron cortados o porque el ADN era linear in vivo. Usted puede
modelar este como un cordn que no se ha conectado as mismo.

circular relajado: ADN que interacta completamente con ambos

filamentos sin cortar, pero que ha sido enzimticamente relajado.
Usted puede modelar este dejando un cordn relajado y luego
conectndolo a s mismo.

superespiral desnaturalizado: ADN como el ADN superespiral o

superenrollado (ver ms abajo), pero que tiene regiones sin unir que
lo hacen ligeramente menos compacto; esto resulta de una excesiva
alcalinidad durante la preparacin del plsmido.

ADN superespiral: Es un ADN totalmente intacto con los filamentos

sin cortar, y con forma de remolino, resultando en una forma
compacta.

La tasa de migracin de pequeos fragmentos lineales es directamente

proporcional al voltaje aplicado (en el caso de voltajes bajos). En el caso
de altos voltajes, grandes fragmentos migran continuamente a diferentes
tasas. Por lo tanto, la resolucin del gel decrece con el incremento del
voltaje.
A un bajo voltaje determinado, la migracin de un pequeo fragmento
lineal de ADN est en funcin de su longitud. Fragmentos lineales largos
(de 20kb) migran a cierta tasa sin importar la longitud. Esto es debido a

que las molculas reptan desde el centro de la molcula siguiendo el

sentido de la matriz de gel.
La digestin restrictiva se usa frecuentemente para analizar fragmentos
purificados de plsmidos. Estas enzimas rompen especficamente el ADN
en ciertas secuencias cortas

Csmido
Los csmidos son vectores de clonacin, que han sido ampliamente usados en la
elaboracin de genotecas de DNA genmicos de gran tamao, ya que permiten la
introduccin de insertos de DNA de hasta 45 kb, el doble que los vectores derivados de la
eliminacin de parte del genoma del fago , los fagmidos.
Realmente un csmido consiste en un plsmido al cual se le han adicionado unos
segmentos del genoma de un bacterifago, el fago .
Un csmido contiene:

Del plsmido, el ori C y un gen de resistencia a un antibitico, esto depende del

tipo de plsmido del cual derive y, por tanto puede contener ms segmentos como por
ejemplo el gen LacZ, que permite la seleccin blanco/azul de las colonias.

Del fago , los extremos COS, extremos complementarios del genoma del fago y
que se emplean para la recircularizacin del mismo.

Estos vectores facilitan el trabajo porque permiten el empaquetamiento in vitro de las

secuencias entre dos extremos COS y usar los fagos empaquetados para transfectarcepas
de E. coli, consiguiendo un plsmido en la bacteria, ya que el csmido se recirculariza al
entrar gracias a los extremos COS.
Tambin tiene genes de resistencia a antibiticos de origen plasmdico, que ayudan en la
identificacin de clulas huspedes que contienen los csmicos recombinantes. Despus
de insertar fragmentos de DNA, los csmidos recombinantes se empaquetan en la cpside
proteica de para formar partculas fgicas infectivas. Una vez que en la clula husped,
el csmido se replica como plsmido.

Procedimiento de clonacin[editar]

a) Segn los sitios de mltiple clonamiento (MSC) o los sitios de restriccin, se

digiere el csmido con la enzima de restriccin correspondiente a la estrategia
experimental, cortando al csmido por los extremos cos, linealizndolo.

b) Se trata con una fosforilasa, que hidroliza los grupos P de los extremos 5, con el
fin de evitar que el inserto se agregue a un extremo.

c) Se trata nuestra muestra de ADN y el csmido con enzimas de restriccin

compatibles.
d) Se mezcla la muestra con el csmido y se aade ADN ligasa.
Si seleccionamos aquellos csmidos que hayan quedado con un tamao
apropiado, podemos encapsidarlos en el fago lambda. Despus infectamos y
seleccionamos las bacterias gracias a que el csmido lleva un gen de resistencia
a ampicilina

Virin.
Unidad
estructural
de
los virus.
Consta
fundamentalmente de dos estructuras imprescindibles: un cido
nucleico (ADN o ARN) y una envoltura proteica (cpside). A
estas estructuras bsicas se aade en algunos casos una
envoltura lipdica (peplos) y/o espculas de glucoprotena.

Estructura
La partcula vrica morfolgicamente completa e infecciosa est
compuesta por:

cido nucleico vrico: Ya sea ADN o ARN, pero solo uno

de ellos, de cadena doble o sencilla. Resultan ms
frecuentes el ADN bicatenario, lineal o circular, y el ARN
monocatenario lineal.

Protenas vricas: Conforman la cubierta externa

o cpside,
compuesta
por
subunidades
denominadas capsmeros. Los capsmeros estn formados
por una o ms subunidades proteicas especficas para
cada virus. Los capsmeros son protenas estructurales,
pero el virin puede tener tambin protenas enzimticas y
aglutinantes.

Nucleocpside: Esta es la cpside junto al genoma vrico.

Presenta distintas formas. En aquellos virus que poseen
envoltura, el virin contiene tambin una membrana lipdica
que envuelve a la nucleocpside y contiene protenas de

origen viral y algunas protenas de la clula infectada. Entre

estos se encuentran virus como el del VIH (con
las glicoprotenas gp120 y gp41 virales y algunas molculas
celulares)
y
el
de
la
gripe
(con neuraminidasa yhemaglutinina virales).

Cromosoma artificial bacteriano

BAC, o cromosoma artificial bacteriano, es un Vector de clonacin usado para clonar
fragmentos de ADN (de 100 a 300 kb de tamao; media de 150 kb) en Escherichia coli,
basado en el plsmido factor-F encontrado de modo natural en la bacteria E. coli.
Es uno de los tipos de vectores de clonacin conocidos como "vectores de alta capacidad",
que incluye csmidos, BACs, PACs y YACs (cromosoma artificial de levadura), por
contraposicin con plsmidos, vectores derivadores de fago
lambda, fagmidos y fsmidos, que son de baja capacidad.
Los BACs son muy utilizados como vectores de clonacin para la construccin
de genotecas genmicas, como en el Proyecto Genoma Humano. Su gran utilizacin se
debe a su notable capacidad, su gran estabilidad y su bajo porcentaje de quimerismo.
Dado el gran tamao de los BAC recombinantes las estrategias de introduccin ms
eficientes han sido mediante electroporacin.
Un BAC tpico consta de:

OriS: origen de replicacin del factor F

repE: control de la replicacin del plsmido

parA, B, C: control de la replicacin

CMr: cloranfenicol acetil-transferasa (CAT) (gen de resistencia a cloranfenicol)

LacZ: con un polilinker en su interior. Se usa para el ensayo de alfacomplementacin.

Procedimiento de clonacin[editar]

a) Se corta el vector con HindIII para linealizarlo.

b) Se desfosforilan los extremos 5 del vector para evitar autoligacin.

c) Se digiere nuestra muestra con HindIII o compatible. Se seleccionan los

fragmentos segn su tamao por electroforesis y se purifican.

d) Llevamos a cabo la reaccin de ligacin.

e) Transferencia de los vectores a una clula por electroporacin.

f) Seleccin de los clones en un medio con cloranfenicol y X-gal (son positivos los
que sobreviven en cloranfenicol y carecen de actividad beta-galactosidasa.