Está en la página 1de 5

Tema 8.

Ratones transgnicos
Animales transgnico, por qu:
-

Para introducir una propiedad deseada


Para crear ms rpidamente animales con esta propiedad
Para estudiar enfermedades humanas
Para producir biomoleculas (pharming)
Xenotransplantes.

Se peuden transferir genes a clulas germinales (esperma, huevos, embriones) o a clulas somticas. La insercin de
genes en clulas germinales produce un adulto en el que la expresin del gen transferido puede analizarse en todos
los tejidos y adems se transmite a la progenie.
Transgnico : Animales que han sido manipulados de este modo.
Otra manera de producir individuos transgnicos consiste en introducir un gen concreto en unas pocas clulas
embrionarias y estas en el embrin. Los tejido del individuo resultante pueden derivarse de las clulas manipuladas
o de las endgenas (QUIMERA TRANSGNICA). Esta quimera puede producir descendencia totalmente modificada si
las clulas introducidas contribuyen a la formacin de la lnea germinal. Un tercer modo de modificar un organismo
es con la manipulacin ex vivo que consiste en aislar clulas de un individuo, modificarlas genticamente in vitro y
reintroducirlas en el organismo de partida. Las manipulaciones ex vivo se usan como terapia gnica humana.

Animales transgnicos. Mtodo de obtencin de animales transgnicos.


Animal transgnico: organismo con genes de otro organismo.
Existen dos mtodos fundamentales para la obtencin de animales transgnico:
-

Microinjeccin de DNA a huevos fecundados . Alta proporcin de transgnicos integrales, es decir, animales
que han introducido el transgen a todas las clulas del organismo y ms baja de quimeras transgnicas o
animales que solo han sido modificados en algunos tejidos. Si uno
de los tejidos afectados son las gonadas al menos la mitad de la
descendencia ser transgnica integral.
Introduccin de DNA a embrioblastos del blastocito.

Microinyeccin
Xenopus laevis, mus musculus.
Consiste esencialmente en la introduccin del DNA lineal que se desee
insertar en proncleos de huevos de raton fecundados.
La ovulacin en el ratn ocurre de manera natural. Despus de la copula,
se extraen los huevos fecundados, que contienen dos proncleos. La
inyeccin se hace en el proncleo masculino.

Se reimplantan los huevos en madres notrizas pseudopreadas (han copulado


con machos estriles) (lo que hay que oir).
Solo 1/3 de la descendencia es transgnica.
Estos deberan haber integrado el gen heterlogo en el genoma de todas las
clulas del organismo, pero an as, el 20% de los individuos inyectados
producen quimeras, lo que indica que la integracin del DNA ha ocurrido en
estadios posteriores a la inyeccin y no ha afectado a todos los tejidos del
ratoncito.
La confirmacin de que un individuo ha incorporado el DNA inyectado y es
transgnico se obtiene analizando el DNA de todos los individuos de la
progenie.

Resumen:
En la primera fase, se aslan un nmero grande de vulos fertilizados.. En la segunda
fase, los cigotos obtenidos se manipulan uno a uno y con una micropipeta a modo de
aguja, se introduce una solucin que contiene ADN.
En la tercera fase, estos vulos son reimplantados en hembras que actuarn como
nodrizas permitiendo la gestacin hasta trmino. Por ltimo, tras el destete de los
recin nacidos, stos se chequean, para ver si ha ocurrido la incorporacin del
transgn.

Introduccin de DNA a embrioblastos del blastocito.


Produce transgnicos integrales a partir de quimeras.
Se pueden aislar los blastocitos del tero materno . Del blastocito se aslan blastmeros (embrioblastos) que se
cultivan en una capa de clulas alimentadoras que actan de soporte.
La introduccin del DNA puede hacerse por infeccin con retrovirus u otros tipos de transfeccin.
Las clulas troncales manipuladas son reinsertadas en un nuevo blastocito y este en una madre pseudopreada. La
descendencia sern todo quimeras, que con
retrocruzamiento con padres darn lugar a la F1
que se analizara para detectar la presencia de
hemicigotos transgnicos. Un cruzamiento entre
hermanos dar lugar a homocigotos transgnicos
que permitirn establecer una lnea pura. Slo
aquellos individuos cuyas cllulas germinales hayan
adquirido el gen inyectado en la G0 seran
transgnicos.
Para la infeccin con retrovirus se utilizan como
clulas soporte, clulas roductoras de retrovirus
defectivos que lleven el transgn. La forma
replicativa del retrovirus se integra en una sola
cpia, y si esto pasa en las clulas de la linia germial,
el rovirus se transmite como carcter mendeliano.

La ventaja de esta tcnica respecto a la anterior es que hay la posibilidad de seleccionar in vitro aquellas clulas que
han incorporado el transgn antes de reincorporarlas a un blastocito. La seleccin nos permite obtener animales
transgicos producidos por recombinacin homloga y dianas gnicas.

Resumen:
Una estrategia ms poderosa para la transgnesis implica la
introduccin de ADN extrao en clulas embrionarias
totipotentes(clulas ES) o clulas embrionarias madres (clulas
EM). Estas clulas se toman del interior de la blstula en
desarrollo y se pasan a un medio donde se tratan con distintos
productos con lo que se conseguir que las clulas no se
diferencien, y se mantiene su estado embrionario.
El ADN extrao se introduce en las clulas ES mediante diversas
tcnicas, posteriormente las clulas transfectadas son
reintroducidas en una blstula y sta reimplantada en una
hembra.
Con esta tcnica los neonatos son quimeras( tienen clulas de
origen distinto, parte con el material gentico original y parte
transfectadas ); mediante el cruce de con aquellas quimeras que
hayan incorporado el transgn en su lnea germinal se consiguen
animales transgnicos.

Expresin gnica en ratones transgnicos.


Una funcin de los animales transgnicos es la capacidad de hacer knock out (eliminar funcin del gen) para
observar el efecto de la falta de funcin
en un organismo.
Los ratones knock out se hacen
introduciendo DNA a embrioblastos del
blastocito. Las clulas troncales
(embrioblastos) son infectadas con
vectores que lleven por una parte, un
fragmento del gen que se desea elimar
interrumpido por un gen de seleccin
(neo o purp) y un gen de seleccin
contra las integraciones al azar, fuera
de la regin de homologa (tk).
Permitiendo seleccionar clulas en las
que el DNA exgeno se ha incorporado
por recombinacin homologa,
sustituyendo un gen endgeno por el
interrumpido.
La frecuencia de xito es muy baja.

DNA transfer into the egg vs. ES cell transformation


1. ES cell technology works well in mice only. Other transgenic animals are produced by egg injection
2. Injection of eggs is less reliable (viability of eggs, frequency of integration), but it helps to avoid chimeric animals
3. ES approach provides more control of the integration step (selection of stably transfected ES cells)

Muchos embriones knock-out mueren y por tanto no se puede estudiar el efecto de este gen silenciado. La solucin
es hacer un knock out CONDICIONAL: ratn trangenico cuando queramos y donde queramos. Para crear un knock
out condicional primero hay que hacer un knock in.
Cre-lox technology
Consiste en utilizar el sistema de recombinacin cre/lox P.
Lox: 34pb que forman dos repeticiones inversas de
13nucleotidos separadas por 8.
Cree: gen que determina una recombinasa cpaz de
eliminar cualquier secuencia localizada entre dos sitios
loxP.
Si el gen esta flanqueado por lox P puede ser eliminado.
Podemos introducir por recombinacin homologa sitios
lox P en los extremos de un gen de inters y facilitar cre
bajo el control de un promotor tejido especfico . Se
producir la eliminacin especfica del gen diana en el
tejido controlado por el promotor.
Para esto se usan dos cepas de ratones:
-

Una con el gen flanqueado por LoxP obtenido por diana gnica en embiroblastos.
Cre como transgen controlado por el promotor.

El control del transgen se puede hacer con el sistema de resistencia a tetraciclina y un promotor sintetico formado or
varias subunidades del operador tetraciclina i el promotor CMV que constituye un elemento respuesta a tetraciclina
que se fusiona al gen.