Construccin DNA recombinante

Prctica 1
CLONAJE DE GENES EN PLSMIDOS BACTERIANOS: Construccin del
DNA recombinante
Introduccin
Los plsmidos bacterianos son molculas de DNA extracromosmico capaces de
replicar autnomamente. La mayora estn constituidos por un DNA bicatenario circular
cerrado de tamao muy variable (1 a >200 kb), que se puede aislar de la bacteria en
forma superenrollada. Se encuentran en una gran variedad de especies bacterianas, pero
suelen tener un rango de hospedador estrecho. La replicacin y transcripcin de los
plsmidos dependen, en mayor o menor extensin, de protenas codificadas por genes
de la bacteria. A su vez, los plsmidos contienen con frecuencia genes que codifican
enzimas tiles para la bacteria hospedadora como genes de resistencia a o produccin de
antibiticos, de degradacin de compuestos orgnicos, de toxinas, y de produccin de
enzimas de restriccin y modificacin, entre otros.
Los plsmidos pueden utilizarse como vectores de clonaje y amplificacin de
fragmentos de DNA que se hayan insertado en los mismos mediante tcnicas de
Ingeniera Gentica. Estos fragmentos replican y se transmiten a las clulas hijas
conjuntamente con el resto del plsmido. Los primeros plsmidos usados como vectores
eran de origen natural, pero en la actualidad se usan plsmidos modificados en los que
se han introducido caractersticas tiles para el clonaje, a expensas de eliminar muchas
secuencias innecesarias del plsmido original. Por ejemplo:
1. Marcadores de seleccin. Generalmente genes de resistencia a antibiticos como
ampicilina, kanamicina, tetraciclina, etc.
2. Un sitio de policlonaje que es una secuencia sinttica que contiene las secuencias
reconocidas por varias enzimas de restriccin.
3. Este sitio de policlonaje puede estar insertado dentro de un gen marcador lo que
permite la seleccin directa de los recombinantes. Por ejemplo, existen plsmidos en
los que el sitio de policlonaje se encuentra dentro de una secuencia de DNA que
codifica un fragmento () N-terminal de la -galactosidasa. En la Prctica 2
usaremos este gen marcador para la seleccin de transformantes.
4. El origen de replicacin deriva normalmente del plsmido ColE1. Este origen
permite conseguir un nmero de copias elevado del plsmido. Muchos plsmidos
que se usan en Ingeniera Gentica, como el que usamos en estas prcticas,
contienen un segundo origen de replicacin derivado de un fago con DNA
monocatenario (M13, f1), que permite replicar una sola de las cadenas del plsmido
originando copias monocatenarias del DNA clonado, tiles para secuenciacin,
mutagnesis, etc.
5. Promotores de fagos (T7, SP6) delante del sitio de policlonaje. tiles para la
transcripcin in vitro del DNA clonado, o para su expresin regulada in vivo si el
plmido recombinante se introduce en bacterias que expresan la RNA polimerasa
viral.
6. En los vectores de expresin, se suelen introducir adems de promotores regulables,
para expresar el gen clonado en respuesta a cambios en las condiciones de cultivo, la
secuencia Shine-Dalgarno (ribosome binding site, RBS) que confiere alta
eficiencia de traduccin, y una secuencia de nucletidos que codifica un pequeo
polipptido (una etiqueta) que puede ser reconocido por anticuerpos especficos.
El gen clonado y la etiqueta se expresan conjuntamente originando una protena de

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fusin, fcilmente detectable con los anticuerpos. Tambin existen etiquetas (p.ej.
6 His) que permiten la purificacin rpida de la protena de fusin por cromatografa
de afinidad.
7. Muchos plsmidos vectores contienen secuencias complementarias a primers
universales que permiten secuenciar cualquier inserto introducido.
Las enzimas de restriccin del tipo II constituyen la herramienta enzimtica esencial
para la construccin de DNAs recombinantes. Se trata de endonucleasas que reconocen
secuencias cortas y especficas en el DNA, cortndolo por dicha regin siempre que
determinadas bases de la secuencia no estn metiladas. Existen enzimas de restriccin,
denominadas isoesquizmeras, que reconocen total o parcialmente la misma secuencia.
El corte puede producir extremos protuberantes (tambin denominados cohesivos) o
romos. Se denominan con varias letras y un nmero romano. La primera letra se refiere
al gnero, las dos siguientes a la especie y la ltima a la cepa de la bacteria de donde se
aisl. Los nmeros se usan cuando hay ms de un sistema de restriccin-modificacin
en la misma bacteria. Otras enzimas importantes en la construccin de DNAs
recombinantes son las DNA ligasas, que catalizan la formacin del enlace fosfodister
entre los extremos 3-OH y 5-P adyacentes en un DNA, utilizando como cofactor ATP
o NAD+. La ms usada es la DNA ligasa del fago T4 que puede unir extremos
cohesivos e incluso romos en presencia de ATP/Mg2+.
El fraccionamiento, identificacin y purificacin de molculas de DNA se hace
normalmente mediante electroforesis en geles de agarosa (o de poliacrilamida cuando se
quieren resolver pequeos fragmentos de DNA de tamaos muy parecidos ya que tiene
mayor nivel de resolucin). La agarosa es un polmero lineal constituido por unidades
alternantes de D- y L-galactosa unidas por enlaces glicosdicos -(13) y -(14). Se
funde bien a temperaturas elevadas y al bajar la temperatura gelidifica formando un
entramado tridimensional con poros de un dimetro entre 50 nm - >200 nm. En estos
geles, las molculas lineales de DNA migran hacia el polo positivo con una velocidad
inversamente proporcional a su tamao, dentro de ciertos lmites. Estos geles tambin
son tiles para distinguir diversas estructuras que puede formar una misma molcula de
DNA bicatenaria, como DNA lineal, DNA circular cerrado superenrollado o DNA
circular abierto. La movilidad del DNA lineal depende principalmente de su tamao, de
la presencia o no de agentes intercalantes, del voltaje aplicado, de la concentracin
inica del tampn de electroforesis y de la concentracin de agarosa, ya que a mayor
concentracin menor es el tamao del poro formado. Por lo tanto, se deben usar
concentraciones ms altas a medida que se desea analizar molculas ms pequeas de
DNA. A los geles de agarosa se suele aadir bromuro de etidio (3,8 diamino-6-etil-5fenilfenatridium bromuro) para visualizar el DNA. Este compuesto, que es un mutgeno
y carcingeno muy potente, se intercala entre las bases del DNA. Absorbe radiaciones a
302 y 366 nm (emitidas por las fuentes comerciales de luz ultravioleta), reemitiendo
parte de la energa absorbida a 590 nm, que corresponde a la regin rojo-naranja del
espectro visible.
Para la construccin de un plsmido recombinante que contenga el fragmento de
DNA que deseamos clonar, el plsmido vector elegido se digiere con una o dos enzimas
de restriccin y, posteriormente, se incuba con el DNA que se desea clonar, conteniendo
extremos compatibles con los extremos generados en el vector, y DNA ligasa.

Construccin DNA recombinante

Objetivos
En esta primera prctica se pretende que el alumno obtenga una visin global de los
pasos experimentales que hay que realizar para construir un plsmido recombinante
constituido por el plsmido vector y un fragmento de DNA insertado en el mismo. En
concreto, como vector elegimos inicialmente el plsmido de expresin pRSET-T7
(http://products.invitrogen.com), por tener unas caractersticas muy interesantes que se
discutirn en prcticas, y como fragmento de DNA a insertar un cDNA que codifica el
factor de iniciacin de la traduccin eIF4E de Drosophila melanogaster. Este cDNA fue
aislado a partir de una genoteca de expresin de D. melanogaster construida en el fago
lambda, y posteriormente clonado en el sitio EcoRI del plsmido pBluescript
(www.stratagene.com; http://www.genomics.agilent.com). En consecuencia, el proceso
de construccin del plsmido recombinante en esta Prctica consistira en:
1) Digestin del plsmido recombinante pBluescript-cDNA(eIF4E) y del plsmido
vector pRSET-T7 con EcoRI. Anlisis cualitativo de los productos de la digestin
mediante electroforesis en gel de agarosa.
2) Purificacin del pRSET-T7 digerido mediante extraccin con fenol/cloroformo y
precipitacin con etanol.
3) Aislamiento y purificacin del cDNA(eIF4E) mediante electroforesis preparativa en
gel de agarosa, elucin de la banda correspondiente al cDNA del gel y
cromatografa.
4) Cuantificacin de las concentraciones de ambos DNAs lineales purificados
(pRSET-T7 y cDNA) mediante electroforesis analtica en gel de agarosa.
5) Ligacin de los dos DNAs lineales en presencia de DNA ligasa del fago T4.
Sin embargo, dado el tiempo oficialmente permitido para el desarrollo del conjunto
de prcticas (experimentales y de ordenador) de esta asignatura, se ha optado por hacer
un protocolo experimental alternativo al anterior mucho ms reducido, que se resume en
los siguientes apartados:
1) Digestin del plsmido recombinante pBluescript-cDNA(eIF4E) con EcoRI.
Anlisis cualitativo de los productos de la digestin mediante electroforesis en gel
de agarosa.
2) Purificacin de los productos de la digestin (pBluescript y cDNA) mediante
extraccin con fenol/cloroformo y precipitacin con etanol.
3) Ligacin de los dos DNAs lineales en presencia de DNA ligasa del fago T4. Es
decir, se reconstruye el plsmido recombinante original.
Es importante destacar que esta modificacin del protocolo experimental tiene varias
ventajas, adicionales al objetivo de reduccin del tiempo, que se resumen en: a) La
utilizacin del plsmido pBluescript nos permite hacer una doble seleccin (resistencia
a ampicilina y color de las colonias) para distinguir los clones bacterianos que contienen
el plsmido recombinante de los clones que contienen el plsmido recircularizado sin
inserto segn se ver en la Prctica 2. Por el contrario, el plsmido pRSET no permite
esta doble seleccin. b) La ligacin del DNA vector (pBluescript) con el cDNA no se
hace en una relacin molar ptima lo que nos permite introducir al alumno aspectos de
cuantificacin de DNA, a los que est poco habituado, e interpretativos del resultado
obtenido (% de bacterias con plsmido recombinante). Por otra parte, el protocolo
reducido no ofrece ninguna desventaja significativa pues los alumnos siguen realizando
todas las tcnicas previstas en el protocolo inicial ya que una cromatografa similar a la
suprimida en esta Prctica se realiza en la Prctica 3 y en las Prcticas 3 y 4 se hacen
dos electroforesis adicionales en geles de agarosa.

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Materiales
Nota: Se utiliza material estril. Material de vidrio y plstico se esteriliza en autoclave.
Medios lquidos, a excepcin de compuestos orgnicos (fenol, cloroformo, etanol), se
esterilizan en autoclave o por filtracin.
Equipo y Materiales generales ubicados en las mesas y vitrinas laterales:
Papel para secarse las manos; Jabn y escobillas; Papel de filtro; Pinzas; Cinta
adhesiva de colores y para autoclave; Asas de siembra (6-12); Asas de extensin de
plstico estriles (o de vidrio y vasos con etanol para esterilizarlas); Rotuladores
para pizarra de varios colores y borrador; Probetas, vasos y matraces de
vidrio/plstico de diversos tamaos; Pipetas estriles de 1 ml y 5 ml; Propipetas;
Bolsas con tubos eppendorf de todos los tamaos y puntas de pipeta para reponer;
Bolsas de plstico grandes para desechar material contaminado con Bromuro de
Etidio (1) y placas de Petri usadas (1); Dos baos termostatizados con agitacin a
37C: uno con gradilla para tubos de dilucin y flotadores para tubos eppendorf; y el
otro con abrazaderas para matraces de 100 ml y 25 ml; Frigorfico con congelador;
Transiluminador luz UV y gafas protectoras (y/o pantalla protectora); Bloque
trmico; Espectrofotmetro y cubetas de plstico; Pipetas Pasteur de plstico;
Equipo PCR; Estufa a 30-37C; Balanza/granatario para equilibrar tubos con dos
vasos; Centrifuga de mesa con rotor para tubos Falcon de 50 ml; Balanza de
precisin; Papel de aluminio para pesar; Esptulas; Microondas y guantes
aislantes(2); Maquina de hacer hielo y contenedores para hielo; Agarosa
(Hispanaagar, low electroendosmosis).
Equipo y Materiales generales ubicados en las mesas (3) de los alumnos:
Papel de filtro (1/pareja); Guiones de prcticas (1/alumno); Gradillas plstico
(1/pareja); Gradillas acero para tubos dilucin (2/mesa); Gradillas para tubos
eppendorf de 0,1 ml (2/mesa); Pipetas automticas (1 juego/pareja); Puntas de pipeta
estriles de tres tamaos (2 juegos/mesa); Contenedores para desecho de las puntas
(2/mesa); Tubos eppendorf estriles en botes de vidrio de 1,5 ml, 0,5 ml y 0,1 ml (2
juegos/mesa); Rotuladores para tubos (2/mesa); Parafilm (1/mesa); Tijeras (1/mesa);
Guantes tres tamaos (1 juego/mesa); H2O estril (2 botellas de 50 ml /mesa);
Equipos de electroforesis (1/mesa para la Practica 1; 2/mesa para las Prcticas 3+4);
Fuentes de alimentacin (1/mesa); Microfugas (1-2/mesa); Matraces de 250 ml
(1/mesa) y probetas de 100 ml (1/mesa); Garrafa con H2O destilada (1/laboratorio);
Mecheros de gas (2-4/mesa) y cerillas (2/mesa);
Otros materiales necesarios para la Prctica 1:
Plsmido
recombinante
pBluescript
www.stratagene.com;
http://www.genomics.agilent.com)
con
el
cDNA(eIF4E)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ; search: nucleotide, for: U16139; referencia
original: Hernndez, G. & Sierra, J. M. 1995 Biochim Biophys Acta 1261,427-31)
clonado en el sitio EcoRI. Sin diluir y diluido 1/20.
EcoRI y tampn H para la reaccin de digestin. Consultar caractersticas en la
informacin de la casa comercial que tiene el Profesor.
Tampn TAE: 40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA.
Bromuro de etidio (5 mg/ml).
Marcadores de masa molecular de DNA del fago 29 digerido con HindIII.

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Tampn de carga de electroforesis (6X) que contiene los colorantes bromophenol

blue y xylene cyanol FF, as como sacarosa o glicerol en agua.
Fenol (Sigma). Antes de la prctica preparar alcuotas de 0,5 ml en tubos eppendorf
(2/mesa).
Cloroformo (Merck). Antes de la prctica preparar alcuotas de 0,5 ml en tubos
eppendorf (2/mesa).
3 M NaAc, pH 5,2. Antes de la prctica preparar alcuotas de 0,5 ml en tubos
eppendorf (2/mesa).
Etanol (Merck). Varias botellas conteniendo etanol absoluto y etanol al 70% en agua
destilada estril. Se guardan en el congelador del frigorfico.
DNA ligasa del bacterifago T4 y tampn de ligacin. Consultar caractersticas en
la informacin de la casa comercial que tiene el Profesor.

Procedimiento
A) Digestin del plsmido recombinante pBluescript-cDNA(eIF4E) con EcoRI.
1. Preparar el termoblock a 37C.
2. En un tubo eppendorf de 1,5 ml, rotulado con el nmero de la pareja, preparar la
mezcla de incubacin siguiente, aadiendo los componentes en el orden indicado
(el alumno debe calcular previamente los volmenes a aadir de DNA, tampn H
y H2O estril):
Componente

Concentracin
del stock

Concentracin o
cantidad requerida
en la mezcla de
incubacin

Volumen a
aadir

H2O estril
l
Tampn H
10X
1X
l
DNA (pBlue-4E)
4000
ng
0,8 g/l
l
EcoRI
10 unidades/l
2 l*
Volumen final
25 l
* EcoRI se suministra en un tampn que contiene 50% glicerol. Las concentraciones
superiores al 5% de glicerol en la mezcla de digestin pueden afectar a la actividad
enzimtica por lo que el volumen de EcoRI no debe superar 1/10 del volumen final de la
mezcla de reaccin.

3. Poner los tubos en el termoblock e incubar a 37C durante 60-90 min.

4. Detener la reaccin elevando la temperatura del termoblock a 65C e incubando
las muestras durante 5 min.
5. Mantener las muestras en la nevera hasta su uso.

B) Anlisis de los productos de la digestin mediante electroforesis en gel de agarosa en

presencia de bromuro de etidio.
Notas de advertencia importantes sobre posibles peligros:
El bromuro de etidio es un agente mutagnico y carcinognico muy potente. Es
obligatorio usar guantes para su manipulacin y la de los geles, cubetas, puntas de

Construccin DNA recombinante

pipeta, etc., que hayan estado en contacto con este compuesto. Si hubiese que
preparar una disolucin stock habra que usar mascarilla para pesarlo.
La electroforesis se realiza con corriente continua a 100 voltios por lo que una
descarga elctrica es peligrosa. Si fuese necesario manipular la cubeta durante la
electroforesis hay que desenchufar previamente la fuente de alimentacin.
La visualizacin de las bandas de DNA en el gel de electroforesis se hace haciendo
pasar luz ultravioleta a travs del gel. Est absolutamente prohibido mirar el gel sin
la debida proteccin con gafas y/o pantalla protectoras para evitar que la luz UV
dae la retina del ojo.

Se preparar un nico gel por mesa por lo que las operaciones que se indican a
continuacin se deben distribuir entre los alumnos de cada mesa como se considere ms
oportuno:
1. Preparar el soporte donde se colocar la agarosa sellndolo con cinta adhesiva en los
dos laterales abiertos y colocar el peine adecuado en la posicin indicada. Mantener
encima de un papel de filtro fuera de la cubeta de electroforesis.
2. Una pareja de alumnos se encargar de preparar 2-3 litros de tampn TAE (1X) a
partir de un stock TAE (50X) y de distribuir a todas las parejas y mesas.
3. Preparar el gel de agarosa al 1%:
Pesar 0,7 g de agarosa y ponerla en un matraz de 250 ml.
Aadir 70 ml de TAE (1X).
Calentar en el microondas hasta que la agarosa quede fundida (unos 2 min).
Sacar el matraz usando guantes aislantes.
Dejar enfriar unos minutos y aadir 7 l de una disolucin stock de bromuro de
etidio de 5 mg/ml (concentracin final en el gel: 0,5 g/ml).
Verter inmediatamente en el soporte preparado segn el apartado 1. Dejar unos
10 min en reposo para que el gel polimerice.
Retirar con cuidado la cinta adhesiva y el peine e introducir el soporte con el gel
en la cubeta de electroforesis (dnde deben quedar situados los pocillos del gel
con respecto a los electrodos de la cubeta?).
Aadir suavemente tampn TAE (1X) hasta sobrepasar el nivel del gel.
Nota: Normalmente el tampn TAE (1X) usado en la electroforesis se suplementa
con bromuro de etidio (concentracin final 0,5 g/l) para mejorar la visualizacin
de las bandas de DNA. Sin embargo, nosotros no lo aadimos para evitar la
generacin de grandes volmenes de material de desecho que no pueden ser
eliminados por la pila. En todo caso, la visualizacin de las bandas de DNA en
nuestras condiciones es adecuada.
4. Aplicacin de las muestras y electroforesis:
Preparar ocho tubos eppendorf de 0,5 ml segn se indica en la Tabla siguiente:

Construccin DNA recombinante

1
3 l

Mezcla de digestin
Parejas 1(5, 9)
Mezcla de digestin
Parejas 2 (6, 10)
pBlue-4E sin digerir
(dilucin 1/20)
Marcadores DNA
(29)
Mezcla de digestin
Parejas 3 (7, 11)
Mezcla de digestin
Parejas 4 (8, 12)
pBlue-4E sin digerir
(dilucin 1/20)
o
Mezcla de digestin
de una pareja
Marcadores DNA
(29)
o
Mezcla de digestin
de una pareja
H2O
(ajustar hasta 10 l)
7 l
Tampn de carga
(6X)

2 l

3 l
6 l
4 l
3l
3 l
4 l
o
1 l
3 l
o
1 l

7 l

4 l

6 l

7 l

7 l

2 l

2 l

2 l

2 l

2 l

6 l
o
9 l
2 l

7 l
o
9 l
2 l

Nota: Calcular los ng de DNA total presente en la mezcla de digestin y en la muestra

del pBlue-4E sin digerir que ha puesto en cada tubo.

Aplicar suavemente los 12 l totales de cada muestra en los pocillos

correspondientes del gel. Hay que evitar perforar el fondo del pocillo o que la
muestra se salga por la parte superior del mismo. Cada alumno debe aplicar una
muestra.
Cerrar con cuidado la cubeta de electroforesis y conectarla a la fuente de
alimentacin. Correr la electroforesis a 100 V durante 90-120 min (hasta que el
colorante azul est prximo al final del gel). El bromophenol blue migra
aproximadamente como un DNA bicatenario lineal de 300 bp (prcticamente
con el frente) y el xylene cyanol FF como un DNA bicatenario lineal de 4 kb.
Parar la electroforesis y desconectar la cubeta de la fuente de alimentacin.
Sacar el soporte con el gel escurrindolo bien y ponerlo encima de un papel de
filtro doblado.
Llevar el soporte con el gel al transiluminador y visualizar los DNAs haciendo
pasar luz ultravioleta. NO mirar el gel sin gafas o pantalla protectora. Se pueden
sacar fotografas con ayuda de un telfono mvil que tenga cmara fotogrfica.
Analizar los resultados obtenidos y contestar a las preguntas que se formulan en
el apartado de Resultados y cuestiones.

Construccin DNA recombinante

C) Purificacin de los productos de la digestin (pBluescript y cDNA) mediante

extraccin con fenol/cloroformo y precipitacin con etanol.
1. Pasar la mezcla de digestin restante conteniendo los dos DNAs a un tubo
eppendorf de 0,5 ml, estimando el volumen remanente. El tubo debe estar marcado
con el nmero de pareja.
2. Eliminar la protena contaminante aadiendo un volumen de fenol saturado y
mezclar bien.
3. Centrifugar a 12000 rpm en microfuga durante 2 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Como los tubos de 0,5 ml son mas pequeos que los huecos de la centrifuga
hay que ponerlos DENTRO de un tubo eppendorf de 1,5 ml al que se ha cortado
previamente la tapa.
4. Retirar la fase acuosa (la superior), con cuidado de no recoger la interfase que
contiene la protena desnaturalizada, y pasar a otro tubo eppendorf de 0,5 ml,
marcado con el nmero de pareja, estimando el volumen recogido.
5. Si el volumen de esta fase acuosa es superior a 15 l (si es inferior NO es
aconsejable hacer la extraccin con cloroformo), aadir un volumen igual de
cloroformo, mezclar bien y repetir la centrifugacin y obtencin de la fase acuosa
como antes (pasos 3 y 4). El cloroformo elimina los restos de fenol que queden en la
fase acuosa.
6. Precipitar el DNA aadiendo a la fase acuosa final (la obtenida despus de la
extraccin con fenol o con cloroformo) 1/10 vol final de 3M NaAc, pH 5.2 y 2
volmenes de etanol absoluto (enfriado a 20C). Mezclar suavemente y guardar en
el congelador del frigorfico hasta el da siguiente.
7. Al da siguiente, sacar los tubos del congelador y centrifugar a 12000 rpm en
microfuga durante 15 minutos. Marcar la posicin del tubo en la microfuga.
Decantar el sobrenadante sobre un papel de filtro.
8. Lavar el precipitado de DNA aadiendo 300 l de etanol al 70%. Agitar suavemente
y centrifugar de nuevo en la microfuga durante 5 minutos. Decantar el sobrenadante
sobre un papel de filtro y con golpecitos suaves para eliminar el resto de lquido.
9. Dejar secar a temperatura ambiente unos 5 minutos, manteniendo el tubo abierto
entre los dedos.
10. Resuspender el DNA en 20 l de agua destilada estril. Guardar en nevera hasta su
uso. Los tubos deben seguir marcados con el nmero de la pareja.

D) Ligacin de los DNAs linearizados y desproteinizados (cDNA del eIF4E y plsmido

pBluescript).
1. Preparar un tubo eppendorf de 0,1 ml marcado con el nmero de cada pareja
conteniendo los componentes siguientes, aadidos en el orden que se indica:
Componente
Volumen
H2O estril
7 o 5 l
Tampn para la ligasa (10X)
1
1 l
Mezcla de DNAs resuspendidos
1 o 2 l
en 20 l de H2O estril (*)
DNA ligasa de T4 (1 U/l)
1 o 2 l
Volumen final
10 l
(*) Hay que tener presente que para favorecer la formacin de molculas recombinantes
se debe usar, como mnimo, una razn molar inserto/vector de 3/1. Los alumnos deben

Construccin DNA recombinante

determinar la razn molar que usamos en este experimento y qu implicaciones tendr

en relacin con los porcentajes de colonias bacterianas que se obtendrn conteniendo el
plsmido recombinante y el plsmido recircularizado sin inserto.
2. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos (normalmente la incubacin se
hace a 16C durante toda la noche).

Resultados y cuestiones
1) a) Buscar la secuencia de nucletidos del cDNA del eIF4E de Drosophila
melanogaster usado en esta prctica en la base de datos del NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ; search: nucleotide, for: U16139). b) Fjese en la
secuencia de aa de la protena codificada y deduzca los codones de iniciacin y
terminacin de la traduccin usados. c) Cmo buscara vd el codn de iniciacin
de un mRNA que codifica una protena eucaritica?. Explique la respuesta. Podra
aplicar el mismo criterio para un mRNA procaritico?.
Nota: El mapa de restriccin de este cDNA, con ayuda del programa informtico
accesible en la direccin: http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php , lo har en las
prcticas de Bioinformtica de esta asignatura. Esperara vd encontrar una diana
para EcoRI dentro de este cDNA?. Explique la respuesta.
2) Busque los mapas de los plsmidos pBluescript (Stratagene), usado en esta prctica,
y pRSET-T7 (Invitrogen) y explique de forma concisa en su cuaderno de prcticas
las caractersticas que le parecen ms significativas y tiles de los mismos.
3) En la Figura se muestra un gel semejante al obtenido en esta Prctica: plsmido
recombinante pBluescript-cDNA(eIF4E) digerido (canales 2, 3) o sin digerir
(canales 4, 5) (160 ng, canales 2, 4 y 320 ng, canales 3, 5); marcadores de DNA de
29 digerido con HindIII (canales 1, 6) cuyos tamaos (en pb) y cantidades (en ng)
se indican en la Tabla. En su cuaderno de prcticas dibuje un esquema del resultado
real obtenido en su mesa y conteste a las preguntas siguientes: a) Hubo digestin
del plsmido recombinante?, Fue una digestin parcial o completa?. b) Cules
son los tamaos aproximados (en pb) de los DNAs obtenidos en la digestin?. Son
los tamaos esperados?. c) Puede vd deducir alguna conclusin al comparar la
movilidad del plsmido recombinante no digerido con respecto a la movilidad de los
dos DNAs linearizados?. Explique su respuesta. d) Podra vd estimar, de forma
aproximada, la cantidad de DNA presente en las bandas correspondientes al
cDNA(eIF4E) y al pBluescript linearizado resultantes de la digestin?. Por qu
disminuye la cantidad de DNA presente en las bandas al disminuir el tamao del
fragmento?.
Fragmento Tamao (pb) Cantidad (ng)
1
2
3
4
5
6
1
4370
227
2
2899
150
3
2498
130
4
2201
114
5
1933
100
6
1331
69
7
1150
60
8
759
39

Construccin DNA recombinante

10

4) En el canal 5 de la Figura anterior, que corresponde a una muestra en la que se puso

un exceso de plsmido recombinante sin digerir, se vislumbran bandas minoritarias
con menor o mayor movilidad electrofortica que la del plsmido recombinante. La
mayora de estas bandas parece que han desaparecido en la muestra digerida
correspondiente (canal 3). a) Qu tipo de DNA puede estar presente en una banda
minoritaria que migra ms lentamente que el plsmido recombinante sin digerir?. b)
Y en una banda que migra ms rpidamente?. c) Las preguntas anteriores tienen
varias contestaciones posibles, cmo podra vd distinguir experimentalmente cada
una de estas posibilidades?. Razone con detalle sus respuestas.
5) a) Por qu hemos tenido que usar EcoRI para hacer la digestin y no otra enzima
de restriccin?. b) En el caso de que hubisemos usado el pRSET como vector con
qu enzima de restriccin lo hubisemos digerido?. Explique la respuesta. c)
Escriba la secuencia diana de EcoRI. Qu tipo de extremos genera esta enzima?.
Qu ventajas tienen este tipo de extremos para la clonacin de fragmentos de
DNA?.
6) En el laboratorio de prcticas hemos usado para la digestin 5 l de un stock 0,8
g/l de pBluescript-cDNA(eIF4E) (4,2 kb). De los 25 l de la mezcla de digestin,
se usaron 3 l para analizar los productos de la digestin y 22 l para la extraccin
con fenol/cloroformo seguida de precipitacin con etanol. El DNA precipitado se
resuspendi en 20 l de agua estril. Suponga que durante todo el proceso anterior
hemos recuperado solamente el 30% del DNA presente en los 22 l iniciales.
Finalmente, en la reaccin de ligacin (volumen final, 10 l) hemos usado 1 o 2 l
de los 20 l de disolucin acuosa de DNA. Otros datos: la masa molar de 1 pb es
660 g/mol.
a) Calcule los nanomoles del plsmido recombinante pBluescript-cDNA(eIF4E)
aadidos a la mezcla de digestin. b) Cuntos nanomoles de pBluescript
linearizado y de cDNA(eIF4E) hemos obtenido despus de la digestin con EcoRI?.
Y nanogramos de estos dos DNAs?. c) Cuntos nanogramos de pBluescript
linearizado y de cDNA(eIF4E) estima vd que tenemos en los 20 l de disolucin
acuosa de DNA teniendo en cuenta el % de recuperacin indicado?. Y nanomoles?.
d) Qu cantidad (en nanogramos) de DNA total estima vd que tendremos en la
mezcla de DNA ligado?.
7) a) Cul es la proporcin molar cDNA(eIF4E) / pBluescript que hemos usado en la
reaccin de ligacin realizada en esta prctica?. b) Por qu se recomienda que la
proporcin molar inserto/vector sea al menos 3/1 para una reaccin de ligacin?. c)
Qu otras dos estrategias se le ocurren para resolver los problemas que acaba de
comentar?.

Transformacin de bacterias

Prctica 2
CLONAJE DE GENES EN PLSMIDOS BACTERIANOS: Transformacin de
clulas competentes de Escherichia coli y seleccin de transformantes.
Introduccin
Para el clonaje y amplificacin del plsmido recombinante preparado en la prctica
anterior es necesario introducirlo en una bacteria mediante un proceso que se denomina
transformacin. La mayora de las bacterias, como por ejemplo E. coli, son
impermeables a la entrada de cidos nucleicos exgenos en condiciones normales de
crecimiento. Sin embargo, se han desarrollado mtodos qumicos y fsicos que facilitan
este proceso al menos en E. coli.
Todos los mtodos qumicos de transformacin que se utilizan actualmente derivan
de la observacin de Mandel y Higa (1970, J. Mol. Biol. 53, 159-162) segn la cual las
bacterias tratadas en fro con una disolucin de CaCl2, y a continuacin sometidas a un
choque trmico a 42C, se hacen competentes y permiten la entrada del DNA del fago
lambda. Este mtodo se extrapol posteriormente a DNA de plsmidos (Cohen et al.,
1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114). Los mtodos actualmente en uso son
variaciones del original, encaminadas a optimizar la eficiencia de transformacin de
cada cepa bacteriana, que suele oscilar entre 106 a 109 transformantes por g de DNA
plasmdico. Una posible explicacin sobre el mecanismo molecular por el que las
clulas se hacen competentes a la entrada de DNA exgeno lo puede ver en el
siguiente enlace: http://www.dnalc.org/resources/animations/transformation2.html
Por otra parte, de entre los mtodos fsicos de transformacin de bacterias podemos
destacar la electroporacin. Consiste en exponer las clulas de E. coli a una descarga
elctrica, que induce la formacin transitoria de poros en las membranas por donde
penetran las molculas de DNA.
Los plsmidos que estamos usando en estas prcticas de clonaje (pBluescript o
pRSET-T7) tienen el gen de resistencia a ampicilina (bla). Este gen codifica una lactamasa que hidroliza el anillo -lactmico de la ampicilina, inactivndola. La
ampicilina es una aminopenicilina con actividad antimicrobiana de amplio espectro.
Inhibe la sntesis del pptidoglicano, constituyente de la pared bacteriana, en clulas en
fase activa de crecimiento. Las bacterias que contienen este tipo de plsmidos se pueden
seleccionar crecindolas en presencia de ampicilina. Obviamente, las bacterias que no
han incorporado el plsmido no crecern en este medio de cultivo.
Para diferenciar las bacterias que han incorporado el plsmido recombinante de las
que han incorporado el plsmido recircularizado sin inserto se pueden usar varios
mtodos. Uno de los ms conocidos es el de la complementacin del fragmento de la
-galactosidasa. Este mtodo requiere que el vector usado (por ejemplo, el plsmido
pBluescript pero no as el plsmido pRSET-T7) contenga el sitio de policlonaje dentro
de la regin codificante del fragmento y la bacteria hospedadora exprese el otro
fragmento de la -galactosidasa necesario para la complementacin (lacZM15;
presente normalmente en el profago 80 o en F). En los plsmidos recombinantes, la
incorporacin del inserto inactiva el fragmento de forma que las bacterias que
contienen estos plsmidos carecen de actividad -galactosidasa, originando colonias
blancas en un medio de cultivo que contiene el sustrato incoloro X-GAL. Las bacterias

Transformacin de bacterias

transformadas con plsmidos sin inserto aparecen como colonias azules en este medio
pues son capaces de sintetizar -galactosidasa.

Objetivos
Preparacin de bacterias competentes de E. coli, su transformacin posterior
mediante un choque trmico con los plsmidos obtenidos en la Prctica 1, y seleccin
de los clones bacterianos conteniendo especficamente el plsmido recombinante
pBluescript-cDNA(eIF4E) de Drosophila melanogaster. Uno de estos clones se
utilizar en la Prctica 3.

Materiales
Equipo y Materiales generales: ver Prctica 1
Otros materiales necesarios para la Prctica 2:
2%
(p/v)
X-GAL
(5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactsido)
en
dimetilformamida.
20% (p/v; 0,8 M) IPTG (isopropil-tio--D-galactsido).
Placas de Petri con medio LB (Luria-Bertani) slido (10 g de triptona, 5 g de
extracto de levadura, 10 g de NaCl, 15g de bacto agar, y agua destilada hasta 1000
ml) SIN ampicilina. Estas placas las utiliza el Profesor para crecer la bacteria usada
en la transformacin.
Placas de Petri con medio LB (Luria-Bertani) slido CON AMPICILINA (0,1
mg/ml). Para crecer bacterias transformadas.
E. coli XL1-Blue (ver caractersticas en www.stratagene.com ) (1-2 placas de Petri
con colonias/mesa).
Medio LB lquido (igual composicin que el LB slido pero sin agar y SIN
ampicilina): Tubos de dilucin con 2 ml de medio y matraces de 100 ml con 25 ml
de medio. Para crecer la bacteria antes de la transformacin.
Tubos Falcon de 50 ml (1/pareja).
0.1 M CaCl2 estril (2 botellas/mesa). Mantener en fro (nevera; hielo).
Mezcla de ligacin realizada en la Prctica 1.
Plsmido recombinante pBluescript-cDNA(eIF4E) sin digerir y diluido 1/80.

Procedimiento
A) Adicin de IPTG y X-GAL a placas de Petri con medio LB + ampicilina
1. La tarde anterior al inicio de la prctica (da 1) distribuir 3 placas de Petri
conteniendo medio LB + ampicilina por pareja mas 2 placas por mesa. Cada
pareja marcar en la base sus 3 placas con el nmero de pareja seguido de 1, 2, 3,
respectivamente. Las dos placas sobrantes se marcaran con el nmero de la mesa.
2. Para cada mesa preparar en un tubo eppendorf de 1,5 ml, el premix que se
indica en la ltima columna de la tabla siguiente:
Componente
l / placa
l / 15 placas (1 mesa)
X-GAL (2%)
40
600
IPTG (20%)
7
105
Volumen final
47
705

Transformacin de bacterias

3. Poner 47 l del premix anterior en el centro de cada una de las placas de Petri
y extender uniformemente con ayuda de un asa de plstico estril.
4. Dejar secar las placas boca arriba y tapadas hasta el da siguiente. Si no se usaran
este da se guardarn en la nevera.
B) Crecimiento de Escherichia coli.
1. La tarde anterior al inicio de la prctica (da 1) cada pareja picar una colonia de
bacterias E. coli XL1-Blue de un placa de Petri conteniendo medio LB preparada
recientemente y la transferir a un tubo de dilucin con tapn conteniendo 2 ml
de medio LB (sin ampicilina). Sujetar el tapn del tubo con cinta aislante sin
bloquear la entrada de aire al tubo, marcar con el nmero de pareja e incubar en
bao a 37C con fuerte agitacin durante toda la noche.
2. A la maana siguiente (13:30-13:45 h), transferir 0,5-0,8 ml del cultivo crecido
en cada tubo a sendos matraces de 100 ml conteniendo 25 ml de medio LB fresco
precalentado a 37C. Incubar con fuerte agitacin en bao a 37C.
3. A las 15:30-15:45 h, medir la A550 nm del cultivo. Parar el crecimiento cuando se
alcance un valor 0,28-0,32, poniendo el matraz con el cultivo en hielo.
Nota: En estas condiciones de crecimiento el nmero de bacterias duplica en unos
20 min.
C) Preparacin de clulas competentes.
1. Transferir el cultivo enfriado a un tubo Falcon de 50 ml estril y mantener en
hielo.
2. Equilibrar tubos de dos en dos con ayuda de una balanza/granatario.
3. Recuperar las bacterias por centrifugacin a 5000 rpm durante 10 min. Tener
cuidado de poner enfrentados los tubos que se han equilibrado previamente en
parejas.
4. Decantar el sobrenadante rpidamente en la pila. Dejar el tubo invertido sobre el
papel de filtro durante 1 min con objeto de eliminar los restos de medio.
5. Resuspender las bacterias en 5 ml de 0,1 M CaCl2 fro usando la propipeta
P1000. Mezclar con suavidad con ayuda de la pipeta eliminando completamente
todos los agregados de clulas.
6. Despus de unos 20 min en hielo, recuperar las bacterias por centrifugacin a
5000 rpm durante 10 min, y decantar de nuevo el sobrenadante como antes.
7. Resuspender las bacterias en 0,5 ml de 0.1 M CaCl2 fro y mantener en hielo.
Notas:
a) Dado que la centrifuga que disponemos en el laboratorio slo tiene capacidad
para 6 tubos Falcon de 50 ml, y el nmero de parejas por grupo es de 12, se
puede reducir el nmero de centrifugaciones a la mitad mezclando los cultivos
crecidos de dos parejas en un tubo Falcon. En este caso, las bacterias se
resuspenderan inicialmente en 10 ml de de 0,1 M CaCl2 fro y despus en 1,0 ml.
Finalmente, cada pareja recuperara 0,5 ml de esta ltima suspensin de
bacterias.
b) En el caso de que las bacterias competentes no se vayan a utilizar
inmediatamente para la transformacin se pueden dividir en alcuotas, congelar
rpidamente y conservar a 70C siguiendo el protocolo siguiente: A 1 ml de
bacterias aadir 35 l de DMSO (dimetilsulfxido) y mezclar suavemente,
manteniendo la suspensin en hielo durante 15 min. Aadir otros 35 l de
DMSO, mezclar y volver a poner en hielo. Enfriar tubos eppendorf en hielo

Transformacin de bacterias

seco/etanol (o nitrgeno lquido) y poner alcuotas de 100-107 l de la

suspensin de bacterias con DMSO en cada tubo. Las alcuotas se mantienen
congeladas a -70C. Cuando se necesiten, descongelar el tubo con la mano y
mantener en hielo durante 10 min.
D) Transformacin de las bacterias.
1. Preparar 3 tubos eppendorf de 1,5 ml por pareja en hielo. Marcarlos con el
nmero de pareja y los nmeros 1, 2 y 3, respectivamente. Aadir a cada uno de
ellos los componentes que se indican en la tabla siguiente:
Componente
Clulas competentes
Mezcla ligacin (prctica 1)
pBluescript-eIF4E sin digerir
(dilucin 1/80)
H2O estril

Tubo 1
100 l
2 l
----------

Tubo 2
100 l
-------2 l

----------

-----------

Tubo 3
100 l
----------------2 l

2. Mantener en hielo durante 30 min agitando suavemente la suspensin de vez en

cuando.
3. Transferir los tubos a un bloque trmico a 42C y mantener 2 min.
4. Detener el choque trmico transfiriendo los tubos a contenedores con hielo.
E) Crecimiento y seleccin de los transformantes.
1. Aadir a cada tubo 500 l de medio LB SIN ampicilina e incubar a 37C con
agitacin intensa durante 1 hora. Si la incubacin se hace sin agitacin, conviene
agitar las clulas a intervalos de tiempo para resuspenderlas.
2. Plaquear alcuotas de 100 l de cada uno de los tubos en las placas de Petri
correspondientes (es decir, tubo 1 a placa 1, etc.) conteniendo medio LB slido
CON ampicilina + IPTG + X-GAL preparadas el da anterior. Extender
uniformemente la suspensin de bacterias sobre la superficie de la placa con
ayuda de un asa de plstico estril (usar un asa distinta para cada placa).
Mantener las placas boca arriba y tapadas hasta que sequen bien.
3. Una vez secas, invertir las placas, comprobar que estn debidamente marcadas e
incubarlas en estufa a 37C durante unas 24-36 horas.
4. Recoger las placas de la estufa y analizar los resultados: nmero y color de las
colonias; uniformidad de las colonias en la placa; etc.

Resultados y Cuestiones
1) a) Busque las caractersticas de la cepa bacteriana usada en esta prctica e
interprtelas brevemente en su cuaderno. b) Cul le parece ms imprescindible
para la seleccin de clones recombinantes que hemos realizado en este
experimento?.
2) Para qu se crecen las bacterias en medio LB lquido sin ampicilina durante una
hora antes de pasarlas al medio slido que contiene ampicilina (+IPTG + X-GAL)?.
3) a) Por qu se crecen las bacterias durante toda la noche en un medio slido con
ampicilina?. b) Qu resultado esperara vd encontrar si nos hubisemos olvidado
de aadir ampicilina al medio de cultivo?.

Transformacin de bacterias

4) a) Para qu usamos IPTG y X-GAL en el medio de cultivo?. b) Qu tipo de

colonias (blancas o azules) aparecen mas frecuentemente en su placa 1?. Por qu?.
c) De qu color son las colonias que aparecen en la placa 2?. Por qu?. d) Para
qu nos sirve el anlisis de la placa de Petri nmero 3 procedente del tubo 3?.
Interprete los resultados que vd ha obtenido en dicha placa.
5) El mtodo de seleccin de bacterias conteniendo plsmidos recombinantes basado
en la complementacin del fragmento falla en ocasiones, observndose resultados
contrarios a lo esperado: colonias azules de bacterias transformadas con el plsmido
recombinante y colonias blancas de bacterias transformadas con el plsmido sin
inserto. A qu se pueden deber estos resultados?.
6) Determine la eficiencia de transformacin (nmero de colonias/g de DNA)
utilizando la placa de Petri nmero 2 procedente de la transformacin con el
plsmido recombinante pBluescript-cDNA(eIF4E) no digerido y diluido 1/80 (tubo
2) suponiendo que en esta placa ha obtenido 100 colonias.
7) Podramos hacer una estimacin de la cantidad de DNA (plsmido recombinante +
plsmido sin inserto) presente en la mezcla de ligacin de la Prctica 1 usada en la
transformacin del tubo 1 observando los resultados de la placa 1?. Explique su
respuesta y haga los clculos en su cuaderno de prcticas suponiendo que en esta
placa ha obtenido 70 colonias.

Prctica 3
CLONAJE DE GENES EN PLSMIDOS BACTERIANOS: Aislamiento de DNA
plasmdico y anlisis del mismo por digestin con enzimas de restriccin.
Introduccin
La aparicin de colonias blancas en placas con ampicilina, si bien es un buen indicio, no
garantiza que contengan el vector recombinante, ya que puede tratarse de falsos positivos, como
sera el caso de dmeros de vectores religados o la presencia de mutaciones en la -galactosidasa.
Por esa razn es imprescindible, despus de la seleccin, hacer un anlisis de los clones para
comprobar la presencia del inserto digiriendo el DNA plasmdico con enzimas de restriccin y
analizando los fragmentos resultantes por electroforesis en gel de agarosa. Una vez comprobada la
presencia del inserto, en algunas ocasiones hay que secuenciarlo para asegurarse que no contiene
mutaciones. Los vectores de clonaje tienen secuencias flanqueantes al sitio de policlonaje
complementarias a primers denominados universales, pues sirven para cualquier inserto.
Objetivos
Los clones recombinantes seleccionados en presencia de ampicilina y de color blanco debido
a la inactivacin de la -galactosidasa, se crecern en medio LB en presencia de ampicilina y se
aislar el DNA plasmdico para su posterior anlisis. El anlisis estructural de los plsmidos
recombinantes tiene un doble objetivo: 1) la identificacin y confirmacin de la presencia del
inserto en los clones que contengan el vector y 2) la determinacin de la orientacin del mismo.
Todo ello se llevar a cabo mediante anlisis de restriccin del DNA plasmdico e identificacin
de los fragmentos resultantes por electroforesis en agarosa.
Materiales
Adems del material general descrito en la Prctica 1, en esta prctica utilizaremos:
- Erlenmeyer con 5 ml de medio LB conteniendo 100 g/ml de ampicilina.
- Kit Wizard Plus SV Minipreps (Promega).
- Enzimas de restriccin Eco RI, Bam HI y Kpn I, y sus correspondientes tampones.
- Para la electroforesis necesitamos:
Agarosa
Tampn TAE: 40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA.
GelRed
DNA Molecular Weight Marker XVI, 250bp ladder
Solucin de carga de electroforesis conteniendo azul de bromofenol y xylene cyanol
FF.
Procedimiento
A) Crecimiento de clones bacterianos. (dia 2)
Coger una colonia blanca seleccionada de placas con ampicilina, IPTG y X-gal con un asa de
cultivo e inocular un erlenmeyer con 5 ml de LB conteniendo 100 g/ml de ampicilina. Crecer a
37C con agitacin durante la noche.
B) Aislamiento del DNA plasmdico (Miniprep). (dia 3)
Al da siguiente se aislar el DNA plasmdico a pequea escala por el mtodo de la lisis alcalina
utilizando el Kit comercial Wizard Plus SV Minipreps (Promega). Informacin suministrada por
el fabricante en: www.promega.com/tbs/tb225/tb225.pdf
Para ello se seguir el siguiente protocolo:
- Poner 1.5 ml del cultivo crecido durante la noche en un tubo eppendorf. Recoger las clulas por
centrifugacin a mxima velocidad en minifuga 3 min. Tirar el sobrenadante, escurrir el tubo boca
abajo sobre papel de filtro.
- Resuspender en Vortex o con micropipeta el sedimento celular en 250 l de solucin R (50 mM
Tris-HCl pH 7.5, 10 mM EDTA, 100 g/ml RNasa A). QUE NO QUEDEN GRUMOS.
- Lisar las clulas con 250 l de solucin L (0.2 M NaOH, 1% SDS), mezclar suavemente por
inversin. Observar el aumento de viscosidad. NO DEJARLO MS DE 5 min, pues el DNA
desnaturalizado es mucho ms frgil que el nativo.

- Degradar las protenas del lisado con 10 l de solucin P (proteasa alcalina), mezclar por
inversin. NO DEJARLO MS DE 5 min.
- Neutralizar con 350 l de solucin N (4.09 M hidrocloruro de guanidina, 0.759 M acetato
potsico, 2.12 M acido actico), mezclar por inversin. Aparecer un abundante precipitado
blanco correspondiente al DNA bacteriano, que queremos eliminar.
- Centrifugar 10 min.
- En este paso hay que tener especial cuidado, pues es el ms crtico. Transferir cuidadosamente
por decantacin o con micropipeta el sobrenadante claro conteniendo el DNA plasmdico al filtro
suministrado en el Kit, adaptado a un tubo colector. Debemos coger CUANTO MAS
SOBRENADANTE MEJOR PERO EVITANDO QUE NO CAIGA EL PRECIPITADO
BLANCO. En caso de que esto ocurra, devolverlo al tubo y centrifugar otra vez. Repetir el
proceso.
- Centrifugar 1 min el material del filtro adaptado al tubo colector. Previamente dar dos o tres
pulsos (centrifugacin muy corta). El filtro no se tapa, pues la fuerza centrfuga impide que se
salga el lquido. En estas condiciones el DNA plasmdico queda retenido en el filtro.
- Vaciar el tubo colector, lavar el filtro con 750 l de solucin W (8.3 mM Tris-HCl, 0.04 mM
EDTA, 60 mM acetato potsico, 60% etanol), centrifugar 1 min.
- Repetir el proceso lavando con 250 l de solucin W, centrifugar 2 min.
- Poner el filtro, asegurndose de que no tiene solucin W, en un eppendorf nuevo al que
previamente habremos cortado la tapa. La tapa la guardaremos para despus de las
centrifugaciones.
.
- Extraer el plsmido del filtro con 60 l de agua sin nucleasas (H). Dejar unos instantes y dar dos
o tres pulsos antes de centrifugar 1 min.
C) Anlisis de restriccin del plsmido:
El anlisis se realizar mediante digestin con tres enzimas de restriccin: Bam HI, Eco RI y Kpn I.
El DNA plasmdico se distribuir en tres tubos marcados E, B y K para digerirlos con Eco RI,
Bam HI y Kpn I, respectivamente, segn el siguiente protocolo en el que cada enzima se incuba
con su propio tampn recomendado por el fabricante para optimizar la digestin:
tubo DNA

Tx10

enzima

plasmdico

17 l

2 l TE

1 l E

17 l

2 l TB

1 l B

17 l

2 l TK 1 l K

Los tubos, con un volumen total de 20 l, se incubarn a 37C al menos durante 1 h.

D) Separacin de fragmentos de restriccin por electroforesis en geles de agarosa (da 4)
Los fragmentos obtenidos en las digestiones enzimticas se analizarn por electroforesis
anlogamente a como se describi en la prctica 1 Procedimiento B).
- Preparar un gel de agarosa de 70 ml al 0.7% (0.49 gr) en TAE 1X, utilizando el peine de 15
pocillos. Aadir a la agarosa fundida 2 l de GelRed.
- Aadir 4 l de solucin de carga a las muestras correspondientes a las digestiones enzimticas, y
cargar todas las muestras en el gel de electroforesis. Cargar en un extremo, 18 l de marcadores de
tamao (Molecular Weight Marker XVI, 250bp ladder).
- Correr el gel a 100V, hasta que el azul de bromofenol est a 1/3 del final del gel, visualizarlo al
ultravioleta.
E) Anlisis y discusin de los resultados.
- Calcular, a partir de la posicin de las bandas en el gel, el tamao de los fragmentos obtenidos
tras la digestin con las distintas enzimas de restriccin.
- Determinar la orientacin del inserto.

Cuestiones
1) Deducir el nmero y tamao de los fragmentos obtenidos tras la digestin con Eco RI, Bam HI
y Kpn I (ver Apndice, considerar despreciable el tamao del sitio de policlonaje).
2) Con qu otros enzimas podramos determinar la orientacin del inserto? (ver Apndice)
3) Buscar en el Apndice la secuencia codificante del eIF-4E (primer ATG). Teniendo en cuenta
la fase de lectura y el cdigo gentico, determinar:
a) el n de aminocidos de la protena.
b) la secuencia de los 5 aminocidos N-terminales.
c) la secuencia de los 5 aminocidos C-terminales.
4) Con los datos obtenidos en la cuestin 3, disea un primer de 10 nucletidos para obtener por
mutagnesis dirigida el cambio Arg7-Ser.
5) Determinar si en el recombinante con la orientacin correcta el gen de la protena eIF-4E est
en fase con el de la -galactosidasa (ver Apndice).
En caso negativo a) Cuntos aminocidos tendra la protena de fusin resultante?, b) Cmo
se podran poner en fase el gen de la -galactosidasa y el cDNA del F-4E ?.
6) Tericamente el inserto se podra colocar en cualquier orientacin, sin embargo en el anlisis de
los recombinantes mayoritariamente se obtiene una. Podras proponer una hiptesis para
explicar este resultado?.
7) Disea los primers para insertar de forma unidireccional (empleando dos enzimas distintas) el
cDNA de eIF-4E en el plsmido pBluescript IIKS, y detalla el procedimiento a seguir en el
clonaje. Qu condiciones deben cumplir las enzimas seleccionados?.

PRCTICA 4
DETECCIN DE AGENTES INFECCIOSOS POR PCR (REACCIN EN CADENA DE
LA POLIMERASA)
Introduccin
Pocos avances en gentica molecular han tenido tantos campos de aplicacin como la
PCR (reaccin en cadena de la polimerasa, vulgarmente conocida como prueba del ADN), de
ah que, aunque existan precedentes, a quien la desarroll en su forma actual, Kary Mullis, se
le concediera el Premio Nobel en 1993. La idea es muy simple, la hibridacin de unos primers
flanqueantes a la secuencia a amplificar y su posterior elongacin, permite la duplicacin de
su secuencia. Si la elongacin se efecta con una DNA polimerasa termoestable, la
desnaturalizacin de los productos elongados y la repeticin cclica del proceso permite una
enorme amplificacin de la secuencia inicial, 1012 veces despus de 40 ciclos. A pesar de su
simplicidad hay ciertos parmetros que hay que tener muy en cuenta para una correcta
amplificacin. En primer lugar es esencial la eleccin de los primers, que han de hibridar con
una secuencia nica, lo que se logra con un tamao suficientemente largo (20-25 nts), no han
de presentar complementariedad inter o intra-molecular, Tms similares, y a ser posible con
pares GC en sus extremos para una mayor estabilidad. Los mejores resultados se obtienen con
primers distantes entre si, de 100 a 500 nucletidos. En algunas ocasiones no existe una total
complementariedad, como es el caso de la mutagnesis dirigida, donde el nucletido
cambiado, la delecin o insercin presente en el primer, debe colocarse en el centro de la
secuencia, nuevamente para mayor estabilidad. Otro parmetro crucial es la temperatura de
hibridacin de los primers, unos 5-10C por debajo de su temperatura de fusin (Tm). Una
temperatura demasiado alta dara lugar a una pobre amplificacin, por el contrario una
temperatura demasiado baja podra dar lugar a hibridaciones inespecficas con secuencias
similares, obtenindose mltiples productos. . Otro paso importante a tener en cuenta es el
tiempo de extensin empleado, dado que la mayora de las DNA polimerasas elongan en un
minuto alrededor de 1 Kb de DNA, si se amplificasen fragmentos de mayor tamao debe
aumentarse dicho tiempo.
Igualmente se puede amplificar una secuencia de RNA utilizando previamente la
transcriptasa inversa para copiarla a DNA, esta tcnica, RT-PCR (reverse transcripcion PCR) de
amplia utilizacin, permite detectar cantidades minsculas de RNA. La PCR no solo sirve para
amplificar una secuencia, la PCR cuantitativa permite determinar la concentracin inicial de un
DNA (qPCR) un RNA (qRT-PCR) en una muestra. Utilizando agentes intercalantes
fluorescentes podemos monitorizar la amplificacin en tiempo real y, con DNAs de concentracin
conocida utilizados como estndar determinar la concentracin inicial de nuestra muestra. Los
campos de aplicacin de la PCR son enormes, stos son solo algunos ejemplos: en investigacin
es una herramienta imprescindible de uso cotidiano, la mutagnesis dirigida mencionada antes, la
deteccin de agentes infecciosos, objetivo de esta prctica, diagnosis de enfermedades o riesgo
potencial de padecerlas, pruebas de paternidad y aplicaciones forenses, tanto de identificacin de
restos biolgicos como de pruebas criminalsticas.
Objetivos
El objetivo de esta prctica es el aprendizaje de la tcnica de la PCR y su aplicacin en la
deteccin de agentes infecciosos. En este caso el agente infeccioso es un peligroso virus que
contamina unas muestras de agua (en realidad esto es una simulacin, pues el virus utilizado es el
bacterifago 29 que infecta a Bacilus subtillis y por tanto totalmente inocuo). Se suministrarn
dos muestras, una infectada con el virus y otra no, marcadas una de color rojo y otra azul, y
mediante esta tcnica se determinar cul de las muestras est infectada, si la roja o la azul. En
esta prctica se explicarn las bases tericas de la tcnica y se indicarn los parmetros a tener en
cuenta para el diseo de los primers de la reaccin.
La reaccin en cadena de la polimerasa es la tcnica estndar para la amplificacin de un
fragmento de DNA incluido en un DNA molde, utilizando oligonucletidos de secuencia nica
(primers) complementaria a ambos lados del fragmento que se desea amplificar. Esta
amplificacin se lleva a cabo mediante una serie de ciclos, generalmente 30, cada uno de los
cuales consta de tres etapas: 1) Desnaturalizacin del DNA; 2) Hibridacin de los primers y 3)

Extensin mediante el uso de la enzima Taq polimerasa (u otra DNA polimerasa de caractersticas
similares). El desarrollo de la PCR est basado precisamente en el descubrimiento de esta
polimerasa, que, a diferencia de las previamente conocidas, es termoestable y acta a altas
temperaturas.
Materiales

DNA de virus
4 dNTP
Taq polimerasa
Tampn de reaccin de PCR (Tris-HCl 100 mM, pH 8.3, KCl 500 mM)
MgCl2
Primers
Termociclador
El material necesario para la electroforesis se describe en la prctica 3.

Procedimiento
A) Preparacin de las mezclas de reaccin (da 3)
- Preparar las mezclas de reaccin para las muestras control y problema, a partir del protocolo
indicado, teniendo en cuenta las concentraciones inicial y final de cada uno de los reactivos
utilizados. Los controles son dos: uno positivo con DNA viral, para comprobar que todo se ha
realizado correctamente y uno negativo sin l, para comprobar que no ha habido ninguna
contaminacin en los reactivos empleados. Si los controles son correctos se determinar si nuestra
muestra problema est contaminada o no.
-Componentes:
Muestra problema, DNA molde del virus infeccioso (control positivo) o H20 (control negativo),
dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dTTP,
Taq polimerasa,
MgCl2,
Tampn de reaccin (10X): Tris-HCl 100 mM, pH 8.3, KCl 500 mM ,
Primers: GCCCACATACTTTGTTGATTGG
AAAGTAAGCCCCCACCCTCACATG
Para ello se seguir el siguiente protocolo:
Mezcla de reaccin
Concentracin Stock
Concentracin final
Tampn de la reaccin 10X
1X
MgCl2 25 mM
2.5 mM
dNTPs 2.5 mM (cada uno)
250 M (cada uno)
Primers 5 M (cada uno)
0.5 M (cada uno)
Taq polimerasa 5U/l
1U
Se preparar una nica mezcla de reaccin para toda la mesa (10 tubos). Calcular el volumen que
hay que aadir de cada uno de los componentes para un volumen final de 200 l completando con
H20 hasta 180 l.
Cada pareja deber poner 18 l de mezcla de reaccin en 2 tubos Eppendorf de 0.2 ml numerados
(pequeos de 200 l, pues de lo contrario no caben en el termociclador), aadiendo 2 l de
muestra problema (tubo rojo o azul) a uno y 2l (20 ng) de DNA molde (10 ng/l) como control
positivo a otro. Adicionalmente una pareja de cada mesa aadir 2 l de H20 como control
negativo.
CERRAR BIEN LOS TUBOS y ponerlos en el termociclador
B) Programacin del termociclador y realizacin de la PCR
Programar el termociclador, de acuerdo a las siguientes condiciones:
- 4 min de desnaturalizacin previa a 94C
- 30 ciclos de amplificacin, cada uno consistente en:
60 sec-desnaturalizacin a 94C
60 sec-reanillamiento a 59C
60 sec-extensin a 72C
- 10 min de extensin a 72C
En la prctica el termociclador est ya previamente programado.

-Una vez finalizados los ciclos las muestras se mantienen a 4C hasta su posterior anlisis.
Los tiempos de desnaturalizacin, reanillamiento y extensin varan segn el termociclador y las
muestras utilizadas .
La Tm se calcula por la frmula Tm=(G+C)x4+(A+T)x2, aunque no es muy exacto, la
simplicidad de la frmula es til para tener un valor aproximado.
C) Anlisis de los productos de PCR mediante electroforesis en geles de agarosa. (da 4)
Anlogo a lo descrito en la prctica 3, Procedimiento D) y prctica 1, Procedimiento B).
- Preparar un gel de 70 ml de agarosa al 1% (0.7 gr) en TAE 1X, utilizando el peine de 15
pocillos. Aadir a la agarosa fundida 2 l de GelRed.
- Aadir 4 l de solucin de carga a cada uno de los tubos y cargar la totalidad de las muestras en
los pocillos del gel de electroforesis. En un extremo cargar 18 l de marcadores de tamao (DNA
Molecular Weight Marker XVI, 250bp ladder).
- Correr el gel a 100V, hasta que el Azul de Bromofenol est a la mitad del gel. Una vez concluida
la misma, visualizar el gel al ultravioleta.
D) Anlisis de los resultados
-Comprobar que la mezcla de reaccin no est contaminada (control negativo).
-Comprobar que el DNA viral se ha amplificado correctamente (control positivo).
- Determinar cul de las muestras, la roja o la azul, est contaminada
Cuestiones
1) Calcular la Tm de los primers utilizados (ver la frmula en el guin de prcticas).
2) Calcular el tamao del DNA amplificado por PCR a partir de la secuencia del extremo del DNA
de 29 (ver Apndice) y las secuencias de los primers utilizados (ver guin de prcticas).
3) Disear los primers (20 nucletidos) para amplificar 400 pb del extremo izquierdo del DNA del
virus (ver Apndice).
4) Razonar cul sera el resultado en una electroforesis de PCRs realizadas en las siguientes
condiciones: a) se te olvida aadir uno de los primers a la mezcla de reaccin, b) uno de los
primers hibrida en varios sitios del DNA molde, c) hay un solo corte en banda simple en el DNA
molde entre los primers, d) hay un solo corte en banda doble en el DNA molde entre los primers,
e) si se desea amplificar solo una zona incluida en un DNA de mayor longitud. A partir de qu
ciclo se obtienen fragmentos de DNA de doble banda del tamao requerido?
5) En algunos casos, sobre todo cuando la PCR ha fallado, se observa una banda difusa de mayor
movilidad. A qu puede corresponder esta banda?
6) La figura muestra los resultados obtenidos en
cuatro PCRs realizadas a las temperaturas de
reanillamiento indicadas. Las electroforesis se
corrieron durante tiempos distintos, as la muestra
de 60C se corri ms que la de 55C y sta ms
que la de 52C. Cargndose distintas cantidades
de DNA de los mismos marcadores (M)
(60C>58C y 55C>52C). Interpreta estos
resultados.
Razona
la
temperatura
de
reanillamiento que utilizaras.

APENDICE
cDNA de eIF-4E (n acceso U16139)
AATTCGCTCTCTCGCACACACACGCACCAACCAACTATCAACTATCACAAACA
CCGCGACAGAGAGAGAGCGGCAAGTGAATCACGGCGAATCGAAACCGATC
CGAACCCACTCCGGAGCCGAAAAAGAACTGATCCTACCATCAAACGCATCC
AATAAACACGGCCGCCAACATGCAGAGCGACTTTCACAGAATGAAGAACTT
TGCCAATCCCAAGTCCATGTTCAAAACCAGCGCCCCCAGCACCGAGCAGGG
TCGTCCGGAACCACCAACTTCGGCTGCAGCGCCCGCCGAGGCTAAGGATGT
CAAGCCCAAGGAGGACCCACAGGAGACTGGTGAACCAGCAGGCAACACTG
CAACCACTACTGCTCCTGCCGGCGACGATGCTGTGCGCACCGAGCATTTATA
CAAACACCCGCTCATGAATGTCTGGACGCTGTGGTACCTTGAAAACGATCG
GTCCAAGTCCTGGGAGGACATGCAAAACGAGATCACCAGCTTCGATACCGT
CGAGGACTTCTGGAGCCTATACAACCACATCAAGCCCCCATCAGAGATCAA
GCTGGGTAGTGACTACTCGCTATTCAAGAAGAACATTCGTCCCATGTGGGA
GGATGCAGCCAACAAACAGGGCGGTCGTTGGGTCATTACCCTTAACAAAAG
CTCCAAGACCGATCTGGATAACCTATGGCTCGATGTGCTGCTCTGCCTGATT
GGCGAGGCCTTCGATCACTCCGATCAGATCTGCGGCGCTGTTATAAACATTC
GCGGCAAGAGCAACAAGATATCCATCTGGACTGCCGACGGAAACAACGAG
GAAGCTGCCCTTGAGATTGGTCACAAGCTGCGCGATGCCTTGCGTCTGGGA
CGCAACAACTCGCTGCAGTATCAGTTGCACAAGGACACGATGGTCAAGCAG
GGCTCCAACGTGAAATCGATCTACACTTTGTAGGCGGCTAATAACTGGCCG
CTCCTTACTCGGTCCGATCCCACACAGATTAGTTTGTCTTTCATTTATTTATC
GTTATAAGCAACAGTAGCGATTAATCGTGACTATTGTCTAAGACCCGCGTA
ACGAAACCGAAACGGAACCCCCTTTGTTATCAAAAATCGGCATAATATAAA
ATCTATCCGCTTTTTGTAGTCACTGTCAATAATGGATTAGACGGAAAAGTAT
ATTAATAAAAACCTACATTAAAACCGG
NOTA: las dos primeras As no aparecen en la secuencia del banco de datos,
pero estn en el fragmento al estar originado por digestin con EcoRI
Sitios nicos de restriccin, enzima, posicin de la diana y tamao de los
fragmentos generados.
Enzyme Site
<-- Pos. -->
Eag I c/ggccg
HgiE II accnnnnnnggt
Sty I c/cwwgg
EcoO109 I rg/gnccy
PpuM I rg/gwccy
BsmA I gtctc 1/5
Cfr10 I r/ccggy
Nae I gcc/ggc
Fsp I tgc/gca
BspH I t/catga
Asp718 g/gtacc
Ban I g/gyrcc
Kpn I ggtac/c
Rsa I gt/ac
Pvu I cgat/cg
PflM I ccannnn/ntgg
BstN I cc/wgg
EcoR II /ccwgg
ScrF I cc/ngg
Gsu I ctggag 16/14
Xcm I ccannnnn/nnnntgg
Bgl I gccnnnn/nggc
Hae I wgg/ccw
Stu I agg/cct
Bgl II a/gatct
BstY I r/gatcy
EcoR V gat/atc
Drd I gacnnnn/nngtc
Ban II grgcy/c
Bsp1286 I gdgch/c
Mme I tccrac 20/18
Mae II a/cgt
Cla I at/cgat
Rsr II cg/gwccg

160
243
310
316
316
327
372
372
388
418
439
439
439
440
452
460
466
466
466
518
664
706
718
718
739
739
782
900
917
917
921
925
932
978

161
244
311
317
317
328
373
373
389
419
440
440
440
441
453
461
467
467
467
519
665
707
719
719
740
740
783
901
918
918
922
926
933
979

1043
960
893
887
887
876
831
831
815
785
764
764
764
763
751
743
737
737
737
685
539
497
485
485
464
464
421
303
286
286
282
278
271
225

claves
r=A o G
w= A o T
n= A, T, G o C
y= C o T

TTT
TTC
TTA
TTG

phe
phe
leu
leu

F
F
L
L

TCT
TCC
TCA
TCG

ser
ser
ser
ser

S
S
S
S

TAT
TAC
TAA
TAG

tyr Y
tyr Y
STOP
STOP

TGT
TGC
TGA
TGG

cys C
cys C
STOP
trp W

CTT
CTC
CTA
CTG

leu
leu
leu
leu

L
L
L
L

CCT
CCC
CCA
CCG

pro
pro
pro
pro

P
P
P
P

CAT
CAC
CAA
CAG

his
his
gln
gln

H
H
Q
Q

CGT
CGC
CGA
CGG

arg
arg
arg
arg

R
R
R
R

ATT
ATC
ATA
ATG

ile
ile
ile
met

I
I
I
M

ACT
ACC
ACA
ACG

thr
thr
thr
thr

T
T
T
T

AAT
AAC
AAA
AAG

asn
asn
lys
lys

N
N
K
K

AGT
AGC
AGA
AGG

ser
ser
arg
arg

S
S
R
R

GTT
GTC
GTA
GTG

val
val
val
val

V
V
V
V

GCT
GCC
GCA
GCG

ala
ala
ala
ala

A
A
A
A

GAT
GAC
GAA
GAG

asp
asp
glu
glu

D
D
E
E

GGT
GGC
GGA
GGG

gly
gly
gly
gly

G
G
G
G

Secuencia del extremo izquierdo del DNA del fago 29

(n acceso V01121)

1
61
121
181
241
301
361
421

AAAGTAAGCC
CTCGGCATAC
TAGATAGGTT
TCTGTGTCGC
ATCAACAAAG
TGGAAGTACC
TAATAGTTAA
TC

CCCACCCTCA
CATGATCAGG
TGTCAATGAA
ATGTAAAAGG
TATGTGGGCT
GTACCATTGA
TTCTCCCATT

CATGATACCA
GAGGGAAACT
CAACATAAAA
TTATCAAAGT
GAACTCAATC
TACTACCATT
CTAAAACGAT

TTCTCCTAAT
ACTACTTAAT
CGACACAGAA
AGCGTGCACT
AGGGTTTAAT
ATAGCATACT
TTGATCGTTT

ATCGACATAA
ATATCAATCT
TCCCACGTTT
TTTGCCATGA
CCCCAACATA
CTGTAATAGT
ATTTCTACAA

Marcadores de tamao (Roche DNA Molecular Weight Marker XVI, 250bp

ladder)

TCCGTCGATC
ATAGACCTAC
TAGCGCTTCG
TTGACAACCA
CACATGACAA
TGTCAAACAT
TTAGATGGAC