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NDICE

1. INTRODUCCIN................................................................................................1
2. OBJETIVOS........................................................................................................2
2.1

OBJETIVO GENERAL..................................................................................3

2.2

OBJETIVOS ESPECIFICOS........................................................................3

3. TINCIN DE GRAM............................................................................................3
3.1

MORFOLOGA ULTRAMICROSCPICA DE LAS BACTERIAS:

ESTRUCTURAS INTERNAS.................................................................................5
3.1.1

PARED CELULAR.................................................................................5

3.1.2

MORFOTIPOS.......................................................................................7

3.1.3

EL MECANISMO DE LA TINCIN GRAM ES EL RESEADO EN EL

SIGUIENTE ESQUEMA......................................................................................7
3.2

MTODOS....................................................................................................9

3.2.1

EXTENSIN..........................................................................................9

3.2.2

COLORACIN.....................................................................................10

3.2.3

OBSERVACIN...................................................................................11

4. RESULTADOS..................................................................................................12
5. DISCUSIN DE RESULTADOS.......................................................................13
6. CONCLUSIONES.............................................................................................15
7. BIBLIOGRAFA.................................................................................................16
8. FOTOGRAFAS.................................................................................................17

1. INTRODUCCIN
La tincin de Gram es de gran importancia en microbiologa porque permite
diferencia de dos grandes grupos de bateras (Gram + y Gram -), segn su
comportamiento ante esta tincin. El fundamento radica en la diferente estructura
de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa
de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram - tienen una capa
de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica externa.
Los reactivos empleados en la tincin de Gram son el Cristal Violeta (colorante
bsico), Lugol (modiente), Alcohol-Cetona (decolorante) y Safranina (colorante de
contraste).
Se colocan sobre un portaobjetos bacterias fijadas por calor o secadas de
algn otro modo y se tien con cristal violeta luego se lava con agua, se le agrega
lugol y se lava con alcohol-acetona con el fin de eliminar el colorante no fijado.
Posteriormente, se cubre con un colorante de contaste, safranina, para teir de
rojo las clulas que no hayan retenido el cristal violeta. Todo este proceso tiene
una duracin inferior a 10 minutos.
En fin, la tincin de Gram es una prueba til y de fcil realizacin que permite
diferenciar las dos principales clases de bacterias con el objeto de instaurar un
tratamiento.

2. OBJETIVOS

2.1

OBJETIVO GENERAL

Mostar la importancia de la tincin para la diferenciacin de bacterias


basndose en las propiedades estructurales de la pared celular, aplicando el
mecanismo de la coloracin de Gram.

2.2

OBJETIVOS ESPECIFICOS

2.2.1 Utilizar tcnicas sencillas para la observacin de microorganismos.


2.2.2 Conocer el manejo del microscopio ptico para la observacin de
bacterias (importancia del objetivo de inmersin).
2.2.3 Identificar la morfologa (coco, bacilo, etc.) y tipo de tincin (Gram
positiva o Gram negativa) de las bacterias proporcionadas.

3. TINCIN DE GRAM
3

La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el


laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente
familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de
rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular
bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la
tincin de GRAM.

Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram,


quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas (en
este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga
elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de
bacterias).

Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tien de forma distinta debido


a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared
de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como
para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que
confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula Gram-positiva es
gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como
algo de cido teicoico. Generalmente, 80% - 90% de la pared de la clula Grampositiva es peptidoglicano. La pared de la clula Gram-negativa, por otro lado,
contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est
rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos,
y lipoprotenas. Slo10% - 20% de la pared de la clula Gram-negativa es
peptidoglicano.

Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias


fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu

con algn detalle la tincin de Gram y las interpretaciones que actualmente se


hacen sobre el porqu de su funcionamiento.

Las clulas Gram positivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas


(tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya
que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el
espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo
quede atrapado dentro de la pared celular.

Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin
de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la
fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas
son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:


1. El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El
yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas.
2. La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la
tincin las clulas Gram positivas. EI proceso de decoloracin debe ser
corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados
satisfactorios.
3. Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el
complejo cristal violeta - yodo.

El carcter de Gram positivo no es siempre un fenmeno del todo o nada.


Algunos organismos son ms Gram positivos que otros y algunos son Gramvariables, es decir, unas veces Gram positivos y otras Gram negativos.

3.1

MORFOLOGA ULTRAMICROSCPICA DE LAS BACTERIAS:


ESTRUCTURAS INTERNAS

3.1.1 PARED CELULAR


Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cpsulas y cubiertas
mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que est en inmediato
contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular. Las paredes celulares
pueden destruirse o romperse en condiciones especiales.
Constituyentes importantes de la pared celular son los aminocidos, amino
azcares, azcares y grasas. Estas sustancias estn enlazadas formando el
polmero complejo que forma la pared celular.
Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas
y Gram-negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las
bacterias Gram-positivas contienen menos aminocidos que las Gram-negativas;
el contenido graso es mucho ms elevado en las Gram-negativas que en las
Gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como explicacin del mecanismo de
la reaccin al Gram (ver las dos imgenes juntas).
Para explicar el mecanismo de la tincin de gram se han propuesto varias
hiptesis fundadas en la naturaleza qumica de las paredes celulares de los
microorganismos.
Aqu puedes ver las diferencias estructurales y qumicas de los dos tipos de
pared bacteriana:
PARED GRAM +
Capa densa y uniforme de 200 a 800 A.
cidos teicoicos
Polisacridos
Protenas (pocas veces)
Glicopptidos (50% del peso seco)

PARED GRAM Capa interna delgada de 20 a 30 A


cubierta por capas externas de
densidad menor)
Lipopolisacridos
Lipoprotenas
Protenas
Glicopptidos (10% del peso seco)
3.1.2 MORFOTIPOS
Los cocos son de forma esfrica
Los bacilos poseen forma alargada
Los vibriones que son bacilos en forma
de coma o curvados
Los espirilos, que se clasifican en
espirilos si son de forma rgida o
espiroquetas si son blandas y onduladas

Pueden aparecer agrupados de diferentes formas:


Aparecer por pares Diplococos
Formar cadenas Estreptococos
Agrupar de manera irregular
Estafilococos
Los bacilos en general suelen
agruparse en forma de cadena
(Estreptobacilos)

en

empalizada.

3.1.3 EL MECANISMO DE LA TINCIN GRAM ES EL RESEADO EN EL


SIGUIENTE ESQUEMA

Soluciones
aplicadas por

GRAM +

GRAM -

su orden

CRISTAL

Las bacterias se tien en color Las bacterias se tien en color

VIOLETA

violeta.

violeta.

Se forma el complejo CV-I. Las Se forma el complejo CV-I. Las


LUGOL

clulas continan teidas de clulas continan teidas de


color violeta.
Se

deshidratan

celulares.
ALCOHOLACETONA

color violeta.

poros.

Se

las

paredes

contraen

Disminuye

los Eliminacin por extraccin de


la grasas de las paredes celulares.

permeabilidad. El complejo CV-I Aumenta

la

porosidad.

El

no sale de las clulas que complejo CV-I se separa de la


continan

teidas

de

color clula.

violeta.

SAFRANINA

Clulas no decoloradas; quedan Clulas decoloradas; se tien


teidas de color violeta.

de color rosado.

Fuente Michael J. Pelcazr., Roger D. Reid, E.C.S. Chan Cuarta edicin Pag. 58

3.2

MTODOS

3.2.1 EXTENSIN
En un portaobjeto bien limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se coloca
una gota de agua destilada a la que con el asa de siembra, previamente
esterilizada a la llama, se lleva una pequea cantidad de suspensin de bacterias
o, en su caso, de una colonia.

Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el porta y se fija la


extensin por el calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que
se seque.

3.2.2 COLORACIN
3.2.2.1

1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial)

3.2.2.2

Se lava con agua

3.2.2.3

1 minuto en lugol (mordiente)

3.2.2.4

Se decolora con alcohol-acetona (decolorante)

3.2.2.5

Se lava con agua destilada

3.2.2.6

1 minuto en fucsina bsica (colorante de contraste)

3.2.2.7

Se lava con agua corriente

3.2.2.8

Se medi flame

3.2.2.9

Se agrega safranina

3.2.2.10 Se lava con agua de grifo


3.2.2.11 Se agrega aceite de inmersin para observar en el microscopio

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3.2.3 OBSERVACIN

Debe utilizarse el

objetivo de inmersin.

Se coloca una gota de


aceite de inmersin sobre la
preparacin. Se enfoca,
preferentemente, con el
micromtrico.

Despus de utilizar el
objetivo de inmersin debe
limpiarse con xilol

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4. RESULTADOS

BACTERI
A

Escherichia
Coli

Bacillus
Subtilis

Estafilococo

OBSERVACIN

MORFOTIP

CLASIFICACI

Cocos

Gram Negativo

Bacilo

Gram Positivo

Cocos

Gram Positivo

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5. DISCUSIN DE RESULTADOS
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles
de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la clula y el medio que la rodea. El modo ms simple de aumentar el
contraste es la utilizacin de colorantes.

La tincin de Gram es una tcnica diferencial comnmente empleada en el


diagnstico de microbiolgico.

La mayor parte de las muestras sometidas a examen es cuando se sospecha


que existe una infeccin bacteriana y deben ser extendidas en frotis sobre
portaobjetos, teidas y examinadas en el microscopio.

Los reactivos empelados en la tincin de Gram son el Cristal Violeta (colorante


bsico), lugol (mordiente), alcohol-cetona (decolorante) y safranina (colorante de
contraste).

El cristal violeta sirve como colorante bsico unindose a la pared celular


bacteriana, con ayuda del mordiente (lugol) que refuerza la unin del colorante.
Las bacterias Gram positivas, debido a la estructura y composicin bioqumica de
su pared celular retienen el complejo cristal violeta-lugol y aun despus del
tratamiento con el decolorante conserva el colorante bsico, por lo que se
observan de color prpura o violeta al microscopio.

Las bacterias Gram negativas pierden el colorante bsico cuando son tratadas
con el decolorante debido a que el alcohol disuelve el contenido lipdico de la
pared celular (lo que aumenta la permeabilidad celular), dando como resultado la
prdida del complejo cristal violeta-lugol. Las bacterias decoloradas captan

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entonces el colorante de contraste, razn por la cual estas bacterias se observan


de color rojo al microscopio.

En la muestra Escherichia Coli se observ que contenamos como un coco


Gram negativo. Se identificaron en Bacillus Subtilis, bacilos Gram positivos como
en la muestra Estafilococos que existen coco Gram positivos.

La tcnica de tincin tiene como finalidad crear un contraste entre la clula y el


medio que la rodea, y una de las ms importantes, tanto por su aplicacin clnica
para hacer una identificacin preliminar de la bacteria causal de la infeccin y por
su practicidad, es la tincin de Gram.

Es por eso que esta tcnica se vuelve fundamental en el estudio de la


microbiologa, y el conocimiento de su correcta realizacin es prcticamente
obligatoria para todo aquel que se encuentra estudiando ingeniera qumica.

El estudio de la literatura acerca de la tincin de Gram nos permite tener un


prembulo para poder diferenciar frente al microscopio los diferentes tipos de
microorganismos. Sin embargo, no hay que pasar por alto que es de suma
importancia tener un completo estudio previo de los organismos y su reaccin a la
tincin para poder dar una respuesta certera ante el cuestionamiento de la
naturaleza de un microorganismo.

La dictaminaran que del qumico al dar los resultados sobre un estudio de


Gram positiva o negativa es realmente importante para el diagnstico y buen
tratamiento de la patologa relacionada microorganismos es necesario saber cmo
influyen en las manifestaciones clnicas las diferencias existentes entre la pared
celular de la bacteria Gram positivas y Gram negativas en su deteccin y en el
tratamiento.

14

6. CONCLUSIONES
6.1 Aunque las bacterias no aparecen en diferentes medio que las rodea,
difieren mucho qumicamente esta diferencia qumica es los que permite
distinguir las bacterias por tincin, pues generalmente, el colorante
reacciona con la clula bacteriana, pero no reacciona con su medio
exterior.
6.2 La tincin de Gram es una herramienta muy til en el laboratorio de
microbiologa as como en los anlisis clnicos y diagnostico medico siendo
ineludible conocer su fundamento y procedimiento, para poder tener una
correcta interpretacin de los datos que nos otorga la diferenciacin de
Gram positiva y negativa concluyendo que debido a la estructura de sus
paredes celulares tendrn o no propiedades patolgicas diferentes.
6.3 Las bacterias analizadas presentan las siguientes formas: Escherichia Coli
posee una forma circular por lo que se concluye que es un coco, Bacillus
Subtilis posee una forma alargada parecida a un bastn por lo que se
concluye que es un bacilo y Estafilococo posee una forma redonda o
circular por lo que se concluye es un coco.
6.4 La clasificacin de cada bacteria es: Estafilococo es Gram-positiva,
Bacillus Subtilis es Gram-positiva y Escherichia Coli es Gram-negativa.

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7. BIBLIOGRAFA
7.1 Jawetz E, etal. (2008): Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y
Alderberg. Editorial Manual Moderno, 19 Edicin. Mxico. 702-703
pginas.
7.2 Camacho, A.; etal. (2009): Tcnicas para el anlisis microbiolgico de
alimentos. 2 Edicin. Facultad de Qumica, UNAM, Mxico.
7.3 TORTORA, GERARD; FUNKE, BERDELL; CASE, CHRISTINE (2007):
Introduccin

la

Microbiologa.

Edicin,

Editorial

Mdica

Panamericana. Argentina. Captulo 3, 69-71 pginas.

8. FOTOGRAFAS

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