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ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN................................................................................................1
2. OBJETIVOS........................................................................................................2
2.1

OBJETIVO GENERAL..................................................................................3

2.2

OBJETIVOS ESPECIFICOS........................................................................3

3. TINCIÓN DE GRAM............................................................................................3
3.1

MORFOLOGÍA ULTRAMICROSCÓPICA DE LAS BACTERIAS:

ESTRUCTURAS INTERNAS.................................................................................5
3.1.1

PARED CELULAR.................................................................................5

3.1.2

MORFOTIPOS.......................................................................................7

3.1.3

EL MECANISMO DE LA TINCIÓN GRAM ES EL RESEÑADO EN EL

SIGUIENTE ESQUEMA......................................................................................7
3.2

MÉTODOS....................................................................................................9

3.2.1

EXTENSIÓN..........................................................................................9

3.2.2

COLORACIÓN.....................................................................................10

3.2.3

OBSERVACIÓN...................................................................................11

4. RESULTADOS..................................................................................................12
5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS.......................................................................13
6. CONCLUSIONES.............................................................................................15
7. BIBLIOGRAFÍA.................................................................................................16
8. FOTOGRAFÍAS.................................................................................................17

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En fin. Posteriormente. según su comportamiento ante esta tinción. se le agrega lugol y se lava con alcohol-acetona con el fin de eliminar el colorante no fijado.tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Lugol (modiente). se cubre con un colorante de contaste. Todo este proceso tiene una duración inferior a 10 minutos. Alcohol-Cetona (decolorante) y Safranina (colorante de contraste). Los reactivos empleados en la tinción de Gram son el Cristal Violeta (colorante básico). INTRODUCCIÓN La tinción de Gram es de gran importancia en microbiología porque permite diferencia de dos grandes grupos de baterías (Gram + y Gram -). para teñir de rojo las células que no hayan retenido el cristal violeta. safranina. 2 . El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared. la tinción de Gram es una prueba útil y de fácil realización que permite diferenciar las dos principales clases de bacterias con el objeto de instaurar un tratamiento.1. mientras que las bacterias Gram . Se colocan sobre un portaobjetos bacterias fijadas por calor o secadas de algún otro modo y se tiñen con cristal violeta luego se lava con agua.

TINCIÓN DE GRAM 3 . OBJETIVOS 2. 3.3 Identificar la morfología (coco.) y tipo de tinción (Gram positiva o Gram negativa) de las bacterias proporcionadas.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 2. 2.2. bacilo.1 OBJETIVO GENERAL Mostar la importancia de la tinción para la diferenciación de bacterias basándose en las propiedades estructurales de la pared celular.1 Utilizar técnicas sencillas para la observación de microorganismos.2. 2.2 Conocer el manejo del microscopio óptico para la observación de bacterias (importancia del objetivo de inmersión). aplicando el mecanismo de la coloración de Gram.2.2. etc. 2.

Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram. únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos. Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias. contiene una capa mucho más delgada.20% de la pared de la célula Gram-negativa es peptidoglicano. bacilos. por otro lado. positivos. La pared de la célula Gram-negativa. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico. las bacterias pueden dividirse en dos grupos. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos. Generalmente. lipopolisacáridos. quien la desarrolló en 1844. y lipoproteínas. Sólo10% .La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram.) se basan justamente en la tinción de GRAM. 80% . etc. describiremos aquí 4 . La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Gram positivas y Gram negativas (en este caso. sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias).90% de la pared de la célula Grampositiva es peptidoglicano. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. negativos. Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares.

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram: 1. La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células Gram positivas. El yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células. Cultivos más viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta . disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. 3. Habitualmente es un colorante de color rojo. Las células Gram positivas. 2.con algún detalle la tinción de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqué de su funcionamiento. 3. unas veces Gram positivos y otras Gram negativos. no son permeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros. como la safranina o la fucsina básica. El carácter de Gram positivo no es siempre un fenómeno del todo o nada.yodo. Algunos organismos son más Gram positivos que otros y algunos son Gramvariables. mientras que las Gram positivas permanecen azules. es decir. El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido).1 MORFOLOGÍA ULTRAMICROSCÓPICA DE LAS BACTERIAS: ESTRUCTURAS INTERNAS 5 . Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas.

3. Para explicar el mecanismo de la tinción de gram se han propuesto varias hipótesis fundadas en la naturaleza química de las paredes celulares de los microorganismos. Estas sustancias están enlazadas formando el polímero complejo que forma la pared celular. el contenido graso es mucho más elevado en las Gram-negativas que en las Gram-positivas. como son las cápsulas y cubiertas mucilaginosas. amino azúcares. Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales. las paredes de las bacterias Gram-positivas contienen menos aminoácidos que las Gram-negativas. se encuentra la pared celular. Aquí puedes ver las diferencias estructurales y químicas de los dos tipos de pared bacteriana: PARED GRAM + → Capa densa y uniforme de 200 a 800 A. Por ejemplo.1.1 PARED CELULAR Debajo de las sustancias extracelulares. azúcares y grasas. → Ácidos teicoicos → Polisacáridos → Proteínas (pocas veces) → Glicopéptidos (50% del peso seco) 6 . Constituyentes importantes de la pared celular son los aminoácidos. Este hecho se ha propuesto como explicación del mecanismo de la reacción al Gram (ver las dos imágenes juntas). y en la periferia de una delicada membrana que está en inmediato contacto con el citoplasma. Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas existen importantes diferencias.

3.2 MORFOTIPOS → Los cocos son de forma esférica → Los bacilos poseen forma alargada → Los vibriones que son bacilos en forma de coma o curvados → Los espirilos.1.1.PARED GRAM → Capa interna delgada de 20 a 30 A cubierta por capas externas de densidad menor) → Lipopolisacáridos → Lipoproteínas → Proteínas → Glicopéptidos (10% del peso seco) 3. que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son blandas y onduladas Pueden aparecer agrupados de diferentes formas: → Aparecer por pares Diplococos → Formar cadenas Estreptococos → Agrupar de manera irregular Estafilococos → Los bacilos en general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada.3 EL MECANISMO DE LA TINCIÓN GRAM ES EL RESEÑADO EN EL SIGUIENTE ESQUEMA 7 .

permeabilidad. E. Se forma el complejo CV-I. El no sale de las células que complejo CV-I se separa de la continúan teñidas de color célula. quedan Células decoloradas.C.Soluciones aplicadas por GRAM + GRAM - su orden CRISTAL Las bacterias se tiñen en color Las bacterias se tiñen en color VIOLETA violeta. Pelcazr. Se las paredes contraen Disminuye los Eliminación por extracción de la grasas de las paredes celulares. Se deshidratan celulares. de color rosado. violeta.. Chan Cuarta edición Pag. El complejo CV-I Aumenta la porosidad. violeta. se tiñen teñidas de color violeta.S. Reid. SAFRANINA Células no decoloradas. poros. ALCOHOLACETONA color violeta. Roger D. Las LUGOL células continúan teñidas de células continúan teñidas de color violeta. Fuente Michael J. 58 8 . Las Se forma el complejo CV-I.

calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se seque. de una colonia.2.2 MÉTODOS 3.1 EXTENSIÓN En un portaobjeto bien limpio (con alcohol. Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el porta y se fija la extensión por el calor.3. previamente esterilizada a la llama. 9 . papel de filtro y flameado) se coloca una gota de agua destilada a la que con el asa de siembra. en su caso. se lleva una pequeña cantidad de suspensión de bacterias o.

3 1 minuto en lugol (mordiente) 3.5 Se lava con agua destilada 3.11 Se agrega aceite de inmersión para observar en el microscopio 10 .2.2.2.2.1 1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial) 3.2 COLORACIÓN 3.2.2 Se lava con agua 3.2.6 1 minuto en fucsina básica (colorante de contraste) 3.2.2.2.9 Se agrega safranina 3.7 Se lava con agua corriente 3.2.8 Se medió flameó 3.2.4 Se decolora con alcohol-acetona (decolorante) 3.2.2.2.2.2.2.2.10 Se lava con agua de grifo 3.2.2.2.2.3.2.

2. → Después de utilizar el objetivo de inmersión debe limpiarse con xilol 11 .3. Se enfoca. → Se coloca una gota de aceite de inmersión sobre la preparación. con el micrométrico. preferentemente.3 OBSERVACIÓN → Debe utilizarse el objetivo de inmersión.

RESULTADOS BACTERI A Escherichia Coli Bacillus Subtilis Estafilococo OBSERVACIÓN MORFOTIP CLASIFICACIÓ O N Cocos Gram Negativo Bacilo Gram Positivo Cocos Gram Positivo 12 .4.

La tinción de Gram es una técnica diferencial comúnmente empleada en el diagnóstico de microbiológico. lugol (mordiente). Los reactivos empelados en la tinción de Gram son el Cristal Violeta (colorante básico). Las bacterias Gram negativas pierden el colorante básico cuando son tratadas con el decolorante debido a que el alcohol disuelve el contenido lipídico de la pared celular (lo que aumenta la permeabilidad celular). alcohol-cetona (decolorante) y safranina (colorante de contraste). con ayuda del mordiente (lugol) que refuerza la unión del colorante. teñidas y examinadas en el microscopio. La mayor parte de las muestras sometidas a examen es cuando se sospecha que existe una infección bacteriana y deben ser extendidas en frotis sobre portaobjetos. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. dando como resultado la pérdida del complejo cristal violeta-lugol. debido a la estructura y composición bioquímica de su pared celular retienen el complejo cristal violeta-lugol y aun después del tratamiento con el decolorante conserva el colorante básico. Las bacterias Gram positivas. por lo que se observan de color púrpura o violeta al microscopio. DISCUSIÓN DE RESULTADOS El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico.5. El cristal violeta sirve como colorante básico uniéndose a la pared celular bacteriana. Las bacterias decoloradas captan 13 . El modo más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.

entonces el colorante de contraste. y una de las más importantes. tanto por su aplicación clínica para hacer una identificación preliminar de la bacteria causal de la infección y por su practicidad. El estudio de la literatura acerca de la tinción de Gram nos permite tener un preámbulo para poder diferenciar frente al microscopio los diferentes tipos de microorganismos. Es por eso que esta técnica se vuelve fundamental en el estudio de la microbiología. Se identificaron en Bacillus Subtilis. y el conocimiento de su correcta realización es prácticamente obligatoria para todo aquel que se encuentra estudiando ingeniería química. bacilos Gram positivos como en la muestra Estafilococos que existen coco Gram positivos. En la muestra Escherichia Coli se observó que conteníamos como un coco Gram negativo. La técnica de tinción tiene como finalidad crear un contraste entre la célula y el medio que la rodea. 14 . no hay que pasar por alto que es de suma importancia tener un completo estudio previo de los organismos y su reacción a la tinción para poder dar una respuesta certera ante el cuestionamiento de la naturaleza de un microorganismo. razón por la cual estas bacterias se observan de color rojo al microscopio. es la tinción de Gram. Sin embargo. La dictaminarían que del químico al dar los resultados sobre un estudio de Gram positiva o negativa es realmente importante para el diagnóstico y buen tratamiento de la patología relacionada microorganismos es necesario saber cómo influyen en las manifestaciones clínicas las diferencias existentes entre la pared celular de la bacteria Gram positivas y Gram negativas en su detección y en el tratamiento.

6. para poder tener una correcta interpretación de los datos que nos otorga la diferenciación de Gram positiva y negativa concluyendo que debido a la estructura de sus paredes celulares tendrán o no propiedades patológicas diferentes. 6.1 Aunque las bacterias no aparecen en diferentes medio que las rodea. difieren mucho químicamente esta diferencia química es los que permite distinguir las bacterias por tinción.2 La tinción de Gram es una herramienta muy útil en el laboratorio de microbiología así como en los análisis clínicos y diagnostico medico siendo ineludible conocer su fundamento y procedimiento. 6. 15 . el colorante reacciona con la célula bacteriana. pues generalmente. CONCLUSIONES 6. pero no reacciona con su medio exterior. Bacillus Subtilis posee una forma alargada parecida a un bastón por lo que se concluye que es un bacilo y Estafilococo posee una forma redonda o circular por lo que se concluye es un coco. Bacillus Subtilis es Gram-positiva y Escherichia Coli es Gram-negativa.3 Las bacterias analizadas presentan las siguientes formas: Escherichia Coli posee una forma circular por lo que se concluye que es un coco. 6.4 La clasificación de cada bacteria es: Estafilococo es Gram-positiva.

. Melnick y Alderberg”. Editorial Médica Panamericana. 9ª Edición. 19ª Edición. GERARD. A. 8. (2009): “Técnicas para el análisis microbiológico de alimentos”.2 Camacho. México. 7. 69-71 páginas. CHRISTINE (2007): “Introducción a la Microbiología”.7. BIBLIOGRAFÍA 7. México. CASE.3 TORTORA. 2ª Edición. Capítulo 3. 702-703 páginas. 7. etal.1 Jawetz E. BERDELL. (2008): “Microbiología Médica de Jawetz. Editorial Manual Moderno. Facultad de Química. Argentina. UNAM. etal. FUNKE. FOTOGRAFÍAS 16 .

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