Mtodos para la determinacin de protena total

Introduccin
El bioqumico Oliver H. Lowry era una de las mximas autoridades en el
desarrollo de mtodos histoqumicos cuantitativos.
Entre 1942 y 1947, Lowry trabaj en el Instituto de Investigacin en
Salud Pblica en la ciudad de Nueva York, donde desarroll mtodos
micro con lo cual podra buscar deficiencias de vitaminas en los nios
que utilizaban cantidades muy pequeas de sangre. Fue durante este
perodo que Lowry trabaj un mtodo innovador y sencillo para medir,
con un alto nivel de sensibilidad, la cantidad de protena y fosfato
inorgnico en solucin.
Se aplican estos mtodos para lograr ultramicro determinaciones de los
componentes celulares y enzimas.
El ensayo de Lowry es un mtodo colorimtrico de valoracin
cuantitativa de las protenas. A la muestra se aade un reactivo que
forma un complejo coloreado con las protenas, siendo la intensidad de
color proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de
Lambert-Beer.
El mismo se fundamenta en la aplicacin del reactivo de Folin a una
protena, sta se reduce a un complejo azul de molibdeno por la
oxidacin de los aminocidos tirosina, triptfano, cistina, cistena e
histidina.
El espectro de absorcin del reactivo de Folin reducido presenta un
mximo de absorcin de 640 nm y su intensidad es proporcional a la de
protenas que existe en la muestra.

Informe N4
MTODOS PARA LA DETERMINACIN DE PROTENA TOTAL

Objetivos:

Demostrar mediante ensayos los diferentes mtodos para

cuantificar protenas.
Demostrar que la relacin directa de absorbancia-concentracin
cumple la ley de Lambert-Beer.
Cuantificar la cantidad de protena que hay en dos alimentos.

Resumen
Para determinar la concentracin de protenas de las muestras se
construir una curva de calibracin a partir de una solucin patrn (BSA
0,6mg/ml).
Pasos a seguir:

En ocho tubos de ensayo se agrega con una pipeta la cantidad

indicada de SDS al 1%
Dos de los ocho tubos se marcarn con las letras M1 y M2 y
posterior al SDS se le aade los ml de muestra a utilizar (lentejas y
macarrones)
Pipetear las cantidades del patrn de BSA
Agregar el volumen correspondiente de solucin alcalina.
A continuacin se espera en reposo por 10 min
Posterior a ello, se procede a aadir la cantidad correspondiente
de reactivo de Folin
Se espera por 30 min. Acabado el tiempo de espera se leen las
absorbancias de los ocho tubos de ensayo.

Resultados
Tubo
ml de SDS al 1%
ml de la
muestra
ml del patrn de
BSA
ml de solucin
alcalina

B
0.5

M1
0.25
0.25

M2
0.25
0.25

5.0

5.0

5.0

ml de reactivo
de Folin

0.5

0.5

0.5

P1
0.4

P2
0.3

P3
0.2

P4
0.1

P5
------

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

Esperar 10 minutos
0.5
0.5
0.5

0.5

0.5

Esperar 30 minutos y leer la absorbancia

660 nm contra blanco
mg de protena
0.00
Absorbancia a
660 nm

0.00

0.08

0.13

0.06

0.12

0.18

0.24

0.30

0.171

0.283

0.117

0.245

0.345

0.295
0.392

0.44
4

Serie 1

absorbancia a 540 nm

Linear (Serie 1)

0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0

mg de protena

Representacin grfi ca. Obtencin de los valores de las

concentraciones de la muestras de manera grfi ca.

Clculos para obtener los valores de las concentraciones de las

muestras de forma analtica.
Ecuacin de la recta

y=mx +b

A=mC +b

Donde A es la absorbancia
m es la pendiente
C es la concentracin
b es el punto de interseccin

Pendiente

A 2 A1 0.2450.117
=
=2.13
C 2C1
0.120.06

Despejando C de la ecuacin podemos obtener las concentraciones de las

muestras.

C=

Ab
m

Clculo de la M1 donde el valor de absorbancia es 0.171 nm

C=

0.1710
=0.08 mg
2.13

Clculo de la M2 donde el valor de absorbancia es 0.283 nm

C=

0.2830
=0.13mg
2.13

Interpretacin de resultados
Los resultados indican que existe una relacin proporcional entre los
miligramos de protena y la absorbancia. A medida que aumenta la

concentracin de protena en la solucin mayor es el valor de

absorbancia registrado.
Bsicamente la ley de Beer establece que la absorbancia de una
muestra a determinada longitud de onda depende de la cantidad de
especie absorbente con la que se encuentra la luz al pasar por la
muestra. Y este principio puede apreciarse en los resultados obtenidos.
Aunque el ensayo de Lowry es bastante preciso, el mismo cuenta con
algunas desventajas como el hecho que la respuesta del color vara de
acuerdo al tipo de protena. La intensidad del color no es estrictamente
proporcional a la concentracin de protena.
La concentracin de protenas en la Muestra 1 y 2 (lentejas y
macarrones) fueron de 0,08 y 0.14 respectivamente.

Conclusin
La capacidad de cuantificar fcil y fiable contenido de protena total en
las muestras es de suma importancia para muchos ensayos biolgicos.
El ensayo de Lowry tiene la ventaja de ser extremadamente sensible,
capaz de detectar cantidades del orden de 10 microgramos de protena;
su inconveniente principal es que al evaluar los fenoles presentes en la
protena (esencialmente residuos de tiroxina), la intensidad del color
resultante vara entre las distintas protenas. Pero cuando tratamos con
mezclas biolgicas complejas, podemos perfectamente calibrar el
mtodo con alguna protena comercial, como es la seroalbumina bovina.
Otro factor que es importante mencionar es que aunque el mtodo de
Lowry es muy sensible tambin es un mtodos que se basa en la
presencia de aminocidos fcilmente oxidables tales como tirosina,
cistena, triptfano y existe una hay una variacin en la respuesta de las
protenas con diferentes contenido de aminocidos.

Bibliografa

Voet, D., Voet J. 2004. BIOQUMICA. Tercera edicin. Buenos Aires:

Mdica Panamericana.