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Universidad Nacional

Autnoma de Mxico
Facultad de qumica
Laboratorio de Bioqumica
Experimental
Alans Hernndez Janeth,
Gonzlez Ruiz Jessica Iracel,
Hernndez Tenorio Adriana Estela,
Ochoa Muoz Itzel, Equipo: 7
Cuestionario. ACTIVIDAD ENZIMTICA
PARTE I: CURVAS TEMPORALES DE ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA
LACTATO DESHIDROGENASA DE MSCULO ESQUELTICO DE POLLO.
1. Qu solucin se us como blanco para calibrar el espectrofotmetro
en la prctica? Por qu?
R= Se utiliz todo lo que se encontraba en el medio, menos el piruvato y
el NADH porque esto era lo que queramos cuantificar, es por eso que no
se considera en el medio.
2. Realiza el anlisis dimensional de la frmula que se propone para
calcular la actividad de la enzima.
R=
||
min

(1 ml)

Actividad =

||
min

volumen de reaccin
m
Actividad =

Mediante esta frmula es posible obtener la actividad de la enzima,


tomando en cuenta los resultados obtenidos de la curva patrn por el
mtodo de Bradford.
3. Define actividad especfica y katal.
R= La propiedad ms caracterstica de una enzima (E) es su actividad
cataltica, as que debemos medir sta para saber la capacidad de la
enzima para catalizar reacciones y poder compararla con otras. A tiempo
(t) corto, la presencia de la E se notar por la concentracin de producto
([P]) mucho mayor que en su ausencia (y la [sustrato, S] menor, por
tanto cambios de concentracin). Segn la magnitud de estos cambios
en la velocidad de la reaccin bioqumica, la capacidad de la E para
catalizar reacciones ser mayor o menor. Para expresar estos cambios, y
por tanto la actividad de una enzima, se utiliza una de estas dos
unidades:
Unidad (internacional) de actividad enzimtica (UI,U): cantidad de E
necesaria para transformar 1 mmol S min -1 a 25 C en condiciones
ptimas de medida.
Katal o catal (Unidad de actividad enzimtica del SI): cantidad de E
necesaria para transformar 1 mol S s -1a 25 C en condiciones ptimas de
medida.
4. Propn un protocolo para determinar la actividad de la enzima que no
sea el de realizar una curva temporal de aparicin de productos.
MTODO INDIRECTO
Colocar la muestra con los
componentes cuantificados
para realizar la reaccin
(sustrato, cofactores)

Cuantificar la cantidad de
sustrato por medio de
algn mtodo
colorimtrico.

Despus de un tiempo
determinado detener la
reaccin

Por Calor: Colocar la


muestra en bao mara
hasta desnaturalizar la
enzima

Relacionar concentraciones
y determinar actividad
enzimtica.

5. Analizando los resultados que se encuentran en la tabla 3.2 menciona


cul fue el paso en el que la protena se enriqueci ms. A qu crees
que se debe?
R= En F4 se enriqueci ms la protena, despus de la segunda
cromatografa (intercambio inico) se obtuvo mayor actividad y
purificacin, esto probablemente debido a que este tipo de
cromatografa es ms especfico, pues depende de la carga de la
protena en un pH establecido.
6. Al analizar en conjunto los datos obtenidos en la electroforesis y los
de actividad en qu pasos de la purificacin se eliminan ms
contaminantes?
R= En la electroforesis se observa disminucin de bandas despus de la
fraccin 4, es decir el nmero de contaminantes disminuy
considerablemente
durante
estos
pasos,
que
incluyen
las
cromatografas. Al analizar con la actividad enzimtica, se observa que
hay mayor actividad en las ltimas fracciones tambin, durante el
segundo salado y la cromatografa.
7. Cul es la utilidad de realizar una tabla de purificacin en la que se
toma en cuenta la actividad de la enzima?
Son expresiones simples y tiles para obtener los valores de Km y
Vmax, son ampliamente usados para evaluar o analizar el efecto de
inhibidores sobre la actividad enzimtica.
De igual forma nos sirve mediante la regresin lineal conocer diversos
parmetros como la actividad total y especifica de la enzima as como el
rendimiento que se obtiene al purificar.

PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS:


EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO Y DE UN INHIBIDOR.
1. Por qu es importante determinar los valores de Km y Vmax de una
enzima?
R= Los valores de Km y Vmax son caractersticos de una enzima, y se
conocen como parmetros cinticos de la enzima. Aunque son
constantes, dependen de las condiciones en las que se lleva a cabo la
reaccin, ya que hay que recordar que la enzima es una protena cuya
estructura y carga elctrica se modifican cuando los componentes de la
solucin cambian.
3. Cul fue el blanco de la reaccin?
R= Agua, ya que con esta se ajust el espectrofotmetro a cero.
4. En qu intervalo de concentracin la reaccin de la LDH muestra un
comportamiento de primer orden?
R= En la primera parte, a bajas concentraciones de sustrato, la
velocidad es proporcional a la concentracin de sustrato, de tal manera
que si se duplica la concentracin de sustrato, se duplica la velocidad
(reaccin de primer orden).
5. En qu intervalo de concentracin la reaccin de la LDH muestra un
comportamiento de orden cero?
R= La ltima parte de la curva, a altas concentraciones de sustrato, la
velocidad es independiente de la concentracin de sustrato (reaccin de
orden cero), as la velocidad alcanzada es cercana a la mxima.
6. En qu intervalo de concentracin la reaccin de la LDH muestra un
comportamiento de orden cero y en cul ser de orden mixto?
R= A concentraciones altas de sustrato la velocidad es independiente
del sustrato dando una cintica de orden cero, mixta aquella donde la
concentracin es intermedia ya que se encuentra una cintica de primer

orden y una de orden cero lo cual nos indica que se comporta de manera
mixta.
7. Define Km e indica qu unidades tiene.
R= Es la concentracin del sustrato a la cual la velocidad de la reaccin
es la mitad de la velocidad mxima.
8. Define Vmax e indica qu unidades tiene.
R= La Vmax es la velocidad terica mxima de la reaccin catalizada
por la enzima.
9. Compara los valores de Km y Vmax obtenidos en las tres diferentes
grficas que realizaste.
R= Comparando los grficos de concentracin y con inhibidor se observa
que la Vmx es muy similar en ambos grficos, sin embargo Km
aumenta, es decir, se requiere mayor concentracin de sustrato en
presencia del inhibidor.
10. Qu tipo de inhibidor es el oxamato? Fundamenta tu respuesta.
R= Inhibidor competitivo sobre la LDH debido al gran parecido
estructural con el sustrato de la enzima (piruvato), lo cual se evidenciara
al aumentar la Km y no verse modificada la Vmax.
11. Cules son los inhibidores naturales de la LDH de msculo?
R= La LDH es una enzima cercana al equilibrio, por tanto, no reguladora,
pero s regulada por la razn NADH / NAD + y por la posibilidad de
presentar formas isoenzimticas con caractersticas distintas tanto
cinticas como de inhibicin por sustrato. La inhibicin por exceso de
sustrato tiene lugar por la formacin de un complejo NAD - piruvato que
compite con el NADH por el centro activo del enzima. Asimismo, la LDH
presenta inhibicin por intermediarios de ciclo tricarboxlico: oxalacetato
y citrato. Se conocen otros inhibidores como oxalato y oxamato.
12. En el humano, cules tejidos contienen LDH?
R= Es una enzima catalizadora que se encuentra en muchos tejidos del
cuerpo, pero su presencia es mayor en el corazn, hgado, riones,
msculos, glbulos rojos, cerebro y pulmones.
13. Qu es el ciclo de Cori y cmo participa la LDH en l?
R= Es el ciclo de reacciones metablicas que envuelve dos rutas de
transporte de productos entre los msculos y el hgado.
El ciclo de cori es la circulacin cclica de la glucosa y el lactato entre el
msculo y el hgado, la LDH participa en el metabolismo energtico
anaerobio, reduciendo el piruvato (procedente de la gluclisis) para
regenerar el NAD+, que en presencia de glucosa es el sustrato limitante
de la va glucoltica.