Receptor de Acetilcolina Nicotínico y La Base Estr

Receptor de acetilcolina
nicotnico y la base
estructural de la transmisin
neuromuscular: Publicaciones
del Torpedo membranas
postsinpticas
Nigel Unwin*
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Este artculo ha sido citado por otros artculos en PMC.
Abstracto
Ir:
1. Introduccin
Hace ms de 80 aos, Sir Henry Dale mostr que la acetilcolina (ACh) podra ser
purificado a partir de rganos de mamferos (Dale & Dudley, 1929 ), y lleg a
confirmar, con los dems, que es un neurotransmisor. Sin embargo, durante muchos
aos el receptor de membrana de accin rpida para este neurotransmisor se mantuvo
una entidad difcil de alcanzar. Slo hace relativamente poco tiempo - a principios de
1970 - podra receptor solubilizada con detergente ser purificado con reactivos de
afinidad eficientes (Karlsson et al. 1972 ; Miledi et al. 1971 ; Olsen et al. 1972 ,
abriendo as el camino para su caracterizacin como) protena sola. Despus de este
paso inicial fundamental, el receptor nicotnico ACh ha estado a la vanguardia de los
avances que conducen a nuestra comprensin actual de los canales inicos. Fue la
primera protena para producir grabaciones de un solo canal por la tcnica de patch
clamp (Neher y Sakmann, 1976 ), y el primer canal cuya funcin podra ser
reconstituidos mediante la reinsercin en membranas lipdicas (Nelson et
al. 1980 ). Sus cuatro cadenas de polipptidos se secuenciaron completamente,
utilizando mtodos recombinantes (Noda et al. 1983 ), antes de que estos mtodos se
hicieron ampliamente aplicable. La creacin de canales hbridos y subunidades
quimricas para elucidar las propiedades funcionales (Imoto et al. 1986 ; Sakmann et
al. 1985 ) es una tcnica que fue pionero con esta protena.
Ahora, cada vez con mayor efecto en las ltimas dos dcadas, ha comenzado una fase
apasionante de la exploracin estructural, sondeando el diseo, la arquitectura y la
activacin mecanismo molecular del receptor. Detalles atmicos del sitio de unin a
ACh se han vuelto disponibles a travs de la estructura cristalina de rayos X de un
homlogo soluble en agua (Brejc et al. 2001 ), lo que confirma decisivamente muchos
resultados bioqumicos anteriores. Arquitectura abarca la membrana complejo y
hermoso del receptor ha sido visto por microscopa electrnica. Las estructuras de los
canales homomeric relacionados han sido resueltos. Ms recientemente, como se
explica en las siguientes pginas, la forma de canal abierto transitoria del receptor ha
sido atrapado y analizado en tres dimensiones, que ilumina directamente el
funcionamiento de todo el conjunto.
Que sustenta estos avances en la mayora de los casos es una forma nica fuente rica
de la protena: el rgano elctrico del torpedo ray. Electrocitos - las clulas planas,
apiladas de los que se compone el rgano - se derivan de las clulas musculares
embrionarias, pero carecen del aparato contrctil. Sus membranas postsinpticas
parecen a los de la unin neuromuscular, la organizacin en una serie de
invaginaciones o pliegues, anlogos a los pliegues de unin '' de msculo
esqueltico. Receptores de la acetilcolina paquete a una densidad muy elevada (hasta
aproximadamente 16 000 m -2 ) en las crestas de los pliegues, frente a las zonas
activas en los terminales de las neuronas electromotor invasoras cuando se libera la
ACh. Para los experimentos bioqumicos, vesculas de receptores ricos en ACh o
protena solubilizada con detergente se pueden extraer de forma sencilla y rpida de
estas clulas, y se purificaron con un alto rendimiento. Obras estructurales ha
capitalizado el hecho de que los receptores en las membranas postsinpticas aislados
reorganizar fcilmente en matrices regulares, hacindolos susceptibles de anlisis por
cristalografa de electrones. Dado que las cadenas de polipptidos que componen
el Torpedo receptor ACh y las de msculo esqueltico humano son similares (55-80%
de identidad de aminocidos), la cantidad de informacin que ha sido obtenida de los
estudios a base de pescado tambin se aplica a la contraparte humana.
El receptor nicotnico ACh es una mquina molecular que ha sido puesto a punto a
travs de la evolucin de la transduccin de una seal qumica en una seal elctrica
con notable eficacia y rapidez. En principio, difraccin de rayos X tiene el poder de
analizar el mecanismo estructural en gran detalle. Sin embargo, este enfoque requiere
la presencia de influencias perturbadoras tales como detergente y otros reactivos
artificiales y por lo general, la modificacin recombinante para estabilizar la
protena. Por lo tanto, supondra el riesgo de distorsionar los verdaderos cerradofisiolgico y de canal abierto estados, que son inherentemente inestables.La
microscopa electrnica, por otro lado, se ha desarrollado por una serie de pasos en un
mtodo directo alternativo de determinacin de la estructura que permite al receptor
ACh para ser evaluados en su entorno nativo de la membrana, y en condiciones
inicas y de activacin que imitan estrechamente aquellos en la sinapsis. Electron
anlisis cristalogrfico de cristales tubulares, que se cultiva a partir
de Torpedo membranas, ha jugado un papel en y se beneficiaron de estos desarrollos,
ayudando a proporcionar una comprensin cada vez ms profunda de la protena

funcional.
En esta revisin, se discuten los resultados de los experimentos en los Torpedo tubos
de membrana en el contexto de los resultados de estudios estructurales bioqumicos,
biofsicos y otros, con el objetivo de lograr una descripcin razonablemente integrado
del receptor de la acetilcolina y de su modo de accin en el sinapsis. Me prestar
especial atencin a los mtodos de imagen y anlisis, dando una breve resea de su
desarrollo. Aunque en algunos aspectos adecuados de forma nica a
la Torpedo sistema, estos mtodos de formacin de imgenes pueden tambin
encontrar una aplicacin ms amplia en el futuro. El receptor de la acetilcolina del
msculo sigue siendo el nico canal inico transmisor-cerrada - y el nico canal
inico heteromrica - cuya estructura completamente intacta, asociada a la membrana
ha sido investigado, y queda por ver cmo ampliamente aplicables son algunas de las
ideas y principios a emerger desde el enfoque de imgenes. Las propiedades biofsicas
de este receptor, y las funciones desempeadas por los residuos de amino-cidos
especficos, se han examinado ampliamente, y estn cubiertos con ms detalle en otras
revisiones recientes (Colquhoun et al. 2003 ; Engel et al. 2003 ; Karlin, 2002 ;
sinusoidal, 2012 ).
Ir:
2. Un modelo de canal de iones transmisorcerrada

Los receptores nicotnicos de ACh estn presentes no slo en las membranas
postsinpticas de las clulas musculares y Torpedo electrocitos: un receptor ACh 'de
tipo neuronal' similar se encuentra en el sistema nervioso central, la transmisin de
mensajes de una clula nerviosa a la siguiente. Ambos son miembros de una
importante superfamilia de canales inicos sinptica cationes o aniones selectivo
activados por diferentes neurotransmisores (para revisiones recientes, vase: Lester et
al. 2004 ; Sine y Engel, 2006 ; Millar y Gotti,2009 ; Thompson et al. 2010 ), y que
tienen su origen en los canales inicos activados por ligando relacionados que se
encuentran en procariotas (Corringer et al. 2012 ; Tasneem et al. 2005 ). Incluyen el
vertebrado 5HT 3 , GABA A , los receptores de glicina, y el receptor de glutamato de
invertebrados, GluCl, que responden a la serotonina, cido -aminobutrico, glicina y
glutamato, respectivamente. Todos los miembros de esta superfamilia son pentmeros
de subunidades homlogas (a veces idnticos) que delimitan un camino central de
iones a travs de la membrana. Cada subunidad contiene la llamada Cys-loop - un
bucle de cido trece amino flanqueado por cistenas disulfuro unidos - que da la
superfamilia de su nombre. Dentro de cada miembro de la superfamilia puede haber
un gran nmero de subunidades paralogous, y la variacin en el tipo de subunidad,
junto con la posibilidad de diferentes combinaciones de subunidades, permite una
gran cantidad de diversidad funcional para satisfacer una amplia gama de necesidades
fisiolgicas.Receptores Cys-loop funcin en el sistema nervioso central y perifrico, y
son dianas farmacuticas para numerosas enfermedades humanas y trastornos
psiquitricos, incluyendo la miastenia gravis , la epilepsia, la depresin, la adiccin a
la nicotina, la esquizofrenia y la enfermedad de Alzheimer.
El receptor ACh muscular es un heteropentamer compuesta de cuatro cadenas
polipeptdicas: tiene dos subunidades alfa, y uno de cada uno de , y (en el
msculo humano adulto, la subunidad embrionario se sustituye por la subunidad
homloga). Como en el tejido elctrica, este receptor se concentra en las crestas de
invaginaciones o pliegues en la membrana postsinptica, acostado zonas activas
opuestas en la terminacin nerviosa presinptica de la que se libera ACh. Las
molculas pequeas (146) Da ACh, lanzado en rfagas, difusa casi instantneamente a
travs de la hendidura sinptica estrecha y se unen a las subunidades del receptor en
sus interfases con el vecino y subunidades delta. El canal del receptor se abre dentro
de unos pocos microsegundos (Chakrapani y Auerbach, 2005 ; Maconochie et
al. 1995 ), y cationes fluya a travs de ella hacia abajo sus gradientes electroqumicos
(principalmente afluencia de Na + ) a una alta velocidad (~ 20 000 iones ms 1 ). Dentro de un milisegundo ms o menos, la concentracin de ACh en la hendidura
sinptica disminuye suficientemente, como resultado de la hidrlisis por la
acetilcolinesterasa y por medio de difusin, que las molculas de ACh dbilmente
unidas se disocian de sus sitios de unin y el canal vuelve a su posicin inicial
cerrada, o estado de reposo. Los eventos de apertura y cierre son por lo tanto
extremadamente rpido, lo que permite la iniciacin rpida y terminacin de la
respuesta postsinptica.Esto es crucial para la transmisin neuromuscular, donde poco
espaciados patrones temporales de los impulsos nerviosos tienen que comunicarse con
alta fidelidad.
El proceso de liberacin provocada por un solo impulso nervioso est mediada por
100-300 vesculas sinpticas, y aumenta la concentracin local de ACh en la
hendidura sinptica a ~ 0,3 mM (Kuffler y Yoshikami, 1975 ), que luego cae
rpidamente fuera debido a la hidrlisis y difusin. La consiguiente apertura
transitoria de muchos canales despolariza la membrana muscular de su valor de
reposo, de aproximadamente -90 mV a 0 mV. Muy rpidamente un umbral puede ser
alcanzado, lo que permite un potencial de accin que se genere que hace que el
msculo se contraiga. Con el fin de producir suficiente despolarizacin con
limitaciones en el tiempo y el nmero de canales disponibles, los canales tienen una
baja probabilidad de apertura cuando la concentracin de ACh es baja, y una alta
probabilidad de apertura cuando ACh est presente en cantidades saturantes (mayor
que aproximadamente 50 M; Dilger y Brett, 1990 ). Esta gran diferencia en la
probabilidad de apertura se consigue mediante la utilizacin de las energas de unin
de dos molculas de ACh, una en cada sitio.
Los registros electrofisiolgicos a nivel de un solo canal han arrojado informacin

cuantitativa detallada sobre cmo los canales responden a la ACh y otros agonistas
(Colquhoun y Sakmann, 1985 ), incluyendo la posible participacin de los estados
cerrado intermedios (Lape et al. 2008 ; Mukhtasimova et al. 2009 ). Las grabaciones
muestran que los canales individuales permanecen abiertos durante duraciones
variables, sin embargo, invariablemente, muestran la misma respuesta de todo o
nada. Dada la misma fuerza de conduccin y condiciones inicas, el canal abierto
conduce iones a la misma velocidad que sea la concentracin de ACh (u otro agonista)
se utiliza. Incluso sin ACh presentar los canales pueden todava abierto, pero con una
probabilidad que es extremadamente bajo (Jackson, 1986 ). Por otro lado, cuando
ACh est presente en cantidades de saturacin, de modo que ambos sitios de unin
estn ocupados, los canales tienen una probabilidad de ser la unidad que se acerca
abierto (> 90%; Colquhoun y Ogden, 1988 ; Dilger y Brett, 1990; Sine et
al. 1990 ). Slo cuando ACh est presente durante un perodo prolongado (mayor de
aproximadamente 20 ms), hace esta alta eficacia disminuye debido a una fraccin
significativa de los canales de la conversin a un no conductor, estado
desensibilizado. Sin embargo, la desensibilizacin es de poca importancia para la
transmisin neuromuscular normal, donde los canales reciben una exposicin
continua ACh que duran slo unos pocos milisegundos.
Por consiguiente, el receptor ACh se comporta como una protena reguladora
alostrica tpico (Auerbach,2012 ; Changeux y Edelstein, 2005 ; Monod et al. 1965 ):
que tiene slo dos conformaciones normalmente en la sinapsis, uno que refleja la
cerrada, o estado de reposo y el otro el estado completamente abierto, o activa, con
ACh actuar simplemente para desplazar el equilibrio entre cualquiera de las
formas. Un gran cambio en la relacin de equilibrio de canales abiertos / cerrados del
sitio de unin ni siendo ocupado a ambos sitios de unin estn ocupados (~ 10 7 -fold;
Jackson, 1989 ) asegura que esta protena funciona como un casi perfecto interruptor
de encendido-apagado.
Ir:
3. Torpedo membrana postsinptica

3.1. Organizacin de ACh los receptores en la sinapsis
Receptores individuales se resuelven fcilmente en imgenes de electrones debido a
su alto peso molecular (~290 kDa), y se poda ver en las micrografas tempranas de
congelacin-fractura de Torpedo tejido, tanto en las sinapsis intacto y en aislados
fragmentos de membrana postsinptica (Cartaud et al. 1978 ; Heuser y
Salpeter, 1979 ). Las micrografas mostraron dobles filas de partculas que se
extienden a travs de la superficie de la membrana. En fragmentos de membrana
postsinptica profundas grabada ultracongeladas, estos dobles filas se ven a menudo
la mentira de dos en dos, dando lugar a una disposicin estanca el embalaje ( Fig.
1 una ). Las partculas de congelacin-fractura tenan una apariencia similar a las

formas de donut '' realizadas por receptores de la acetilcolina en las membranas
postsinpticas aislados cuando reflejado en el marcador negativo. Por lo tanto, no
hubo dificultades en la identificacin de las partculas de congelacin-fractura con la
propia protena del receptor.
HYPERLINK
"https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3820380/figure/fig01/"
Higo.1.
Filas de receptores emparejados (cintas dmero) y su relacin con los tubos. ( Un )
de congelacin-fractura, la imagen grabada profunda de la superficie extracelular
de un fragmento de membrana postsinptica obtenido a partir suavemente
esquilada Torpedo tejido, mostrando cintas dmero parcialmente ...
Una mayor comprensin de la organizacin sinptica de los receptores de vino de

estudios morfolgicos de vesculas de membrana postsinptica incubados en solucin
salina baja durante largos periodos de tiempo (Brisson, 1980 ; Brisson &
Unwin, 1984 ). El tratamiento mecnico durante el aislamiento produjo el exterior
hacia fuera vesculas con receptores densamente empaquetadas, y aparentemente al
azar organizado sobre sus superficies. Sin embargo, despus de incubacin a 17 C
durante varios das agregados que consiste en molculas pareadas alinear linealmente
y la formacin de dobles filas - cintas dmeros de receptores - podra ser visto que se
extiende sobre algunas vesculas ( Fig 1. B ). Vesculas alargadas y tubos corta mal
ordenados, hechos por la asociacin floja de lado a lado de las cintas de dmero,
tambin se podan ver en esta etapa ( Fig. 1 C ). Despus de una incubacin
adicional, la asociacin de lado a lado se convirti en ms fuerte, dando lugar a tubos
regulares ms ( Figs 1 d y 1 e ). Adems, los tubos alargados, presumiblemente por el
reclutamiento de los receptores de la piscina ya presente en la misma vescula.
Estas observaciones morfolgicas en las vesculas aisladas implican una
correspondencia estructural estrecha entre los tubos, que son simplemente vesculas
protena-lpido alargados, y la membrana de receptor-rico, tal como existe in
vivo . Dado que la formacin del tubo es ms probable impulsado por asociacin
estrecha de lado a lado de las cintas de dmero, el embalaje de los receptores en los
tubos puede ser equivalente a la delTorpedo sinapsis en las regiones donde los
receptores estn ms estrechamente empaquetados. Es notable que el radio de
curvatura de un tubo tpico (350-500 ) est cerca de la curvatura mxima de la
membrana postsinptica se encuentran en las crestas de los pliegues de unin (por
ejemplo Sealock et al. 1984 ). Por lo tanto, la regin subyacente a la zona activa
puede ser la regin ms favorecida para el embalaje receptor apretado: una situacin
que asegure la mxima respuesta postsinptica.
La implicacin de la protena de la agrupacin de receptores, RapSyn, para influir en
la organizacin de los receptores en la sinapsis, o en tubos, no era evidente a partir de
estos estudios, a pesar de que la localizacin ultraestructural utilizando anticuerpos
monoclonales muestra las dos protenas que ser coextensivo (Sealocket
al. 1984 ). Estudios posteriores de los tubos de la reconstruccin helicoidal indicaron
que RapSyn, aunque est presente en sus superficies interiores, no crea una red
regular consistente con la superficie del tubo de celosa (Toyoshima &
Unwin, 1988 ). Toda la densidad intracelular a excepcin de que al final intracelular
extrema podra ser explicada por el propio receptor (Miyazawa et al. 1999 ). Por lo
tanto es poco probable que RapSyn participa directamente en la realizacin del
embalaje cerca ordenado presente en tubos o en la sinapsis. Sin embargo, bien puede
jugar un papel en las etapas iniciales, por ejemplo, para concentrar los receptores en la
sinapsis y facilitar su asociacin en cintas dmero.
3.2. Los primeros estudios estructurales de lminas y

tubos
Mientras que las interacciones especficas que participan en la estabilizacin de los
tubos se han convertido ahora mejor entendida como un resultado de los anlisis
estructurales de alta resolucin (vase la Seccin 4.5), se reconoci en esta etapa que
un puente disulfuro hecho entre las subunidades delta de los receptores de vecinos era
ms probable responsable de la observada emparejamiento. Ambas cintas y tubos
dispersaron por completo despus de la incubacin con cantidades pequeas (1 mm)
de dithithreitol - las condiciones utilizadas para la separacin de los dmeros de
subunidades ligada delta- en estudios bioqumicos (Chang & Bock, 1977 ;
Kubalek et al. 1987 ).
La presencia de la - dmero restringido el nmero de posibles disposiciones de los
receptores y, junto con la evidencia morfolgica, sugiere fuertemente que los tubos se
componen de pares de molculas orientadas en sentido opuesto, delta--delta vinculado
organizados en un p superficie del enrejado 2. Tubos ensamblados a partir de cpsides
poliomavirus pentamrica (Baker et al. 1983 ) eran un posible precedente para este
arreglo. La clave de la disposicin de la cpside fue la presencia de manchas de
difraccin dbiles entre los principales hexagonal situados en los patrones de
difraccin calculados de las imgenes. Los patrones de difraccin a partir de imgenes
de los tubos de ACh-receptor muestran las mismas caractersticas ( Fig. 2 una), y la
disposicin del receptor emparejado se confirm por anlisis cristalogrfico (Brisson
y Unwin, 1984 ).Otras imgenes de tubos o lminas planas, que aparentemente
muestra todas las molculas que miran en la misma direccin (Kistler y Stroud, 1981 ;
Ross et al. 1977 ), o en varias direcciones (Giersig et al. 1989 , son por lo tanto no de
la normal) sinapsis relacionados con la forma polimrfica.
HYPERLINK
Higo.2.
Anlisis de tubos aplanados. ( Un ) transformada de Fourier (superior) y del
enrejado de la superficie (inferior), visto desde el exterior de un tubo. Se
transforma de tubos tpicas contienen slo un pequeo nmero de
independiente h , k picos, las amplitudes de las cuales son proporcionales a ...
3.3. Los anlisis de los tubos aplanados

Los intentos iniciales para explorar la estructura de tres dimensiones (3D) de los
receptores de ACh a partir de las matrices ordenadas fueron influenciados por el
desarrollo de un mtodo cristalogrfica electrnica para determinar las estructuras de
dos dimensiones cristales (2D) de las muestras no teidas (Henderson &
Unwin,1975 ). Con este mtodo, la propia molcula de protena se forma la imagen,
utilizando una dosis baja de electrones para reducir al mnimo los daos por radiacin,
y una imagen estadsticamente significativa de la molcula se construye por un
promedio de ms el gran nmero de copias idnticas presentes en la red cristalina
(Unwin y Henderson, 1975 ). A continuacin, para obtener diferentes puntos de vista,
los datos se registraron a partir de los cristales inclinados en varios ngulos con
respecto al haz de electrones. Por ltimo, la informacin de los diferentes puntos de
vista se combina y se utiliza para calcular un mapa en 3D. Por este mtodo, es posible
revelar la estructura interna de una protena mucho de la misma manera como se hace
por cristalografa de rayos X de cristales de 3D.
Los tubos ms amplios podran ser aplanadas fcilmente en la pelcula de soporte de
carbono y se analizaron como pares de hojas planas superpuestas. Anlisis
cristalogrfico de los tubos aplanados, inclinada en un intervalo de ngulos para
obtener las diferentes vistas, mostr que el receptor tiene una estructura cuaternaria
simtrica pseudo-cinco veces, con las caractersticas que se extienden a cierta
distancia en ambos lados de la membrana ( Fig. 2 b ; Brisson & Unwin, 1985 ;
Mitra et al. 1989 ). Al mismo tiempo, se hicieron intentos para asignar las ubicaciones
de subunidades individuales, mediante el etiquetado con reactivos de la subunidad
especfica (Kubalek et al. 1987 ). Sin embargo, la resolucin de estos estudios era
limitada, particularmente en la direccin normal al plano de la membrana, por las
pequeas dimensiones laterales de los arrays, por la incapacidad para que sean
perfectamente plana y por el rango restringido de puntos de vista de

inclinacin. Adems, la fiabilidad de la etiquetado era cuestionable, dado que la
ubicacin deducida de en medio de las dos subunidades en conflicto con la
evidencia bioqumica de que la subunidad es en ese lugar. Asignaciones definitivas
de subunidades no podan hacerse hasta que la resolucin es suficiente para rastrear
las cadenas de polipptidos (ver secciones 3.8 , 4.5 ).
3.4. familias helicoidales

Un gran avance en el campo de la microscopa electrnica biolgica se produjo
cuando Jacques Dubochet y sus colegas desarrollaron un mtodo sencillo para
congelar las muestras en una fina pelcula acuosa no podan formar tan rpidamente
que los cristales de hielo y el agua en vez entr en un estado slido amorfo (Adrian et
al., 1984 ; Dubochet et al. 1988 ). Los especmenes de la parrilla microscopio se
congelaron-inmersin en etano enfriado con nitrgeno lquido, y el uso de una etapa
de fro, que opera a una temperatura suficientemente baja para retener el hielo amorfo
(<-130 C), les permiti ser visto directamente , sin la deshidratacin en el vaco
microscopio. Especialmente llamativo eran imgenes de virus registrados a partir de
las regiones de los orificios Spanning pelcula congelados en el soporte de carbono
(Adrian et al. 1984 ).
Cuando se prepararon tubos de ACh-receptor y la imagen de esta manera, la limitada
detalle dosis baja de electrones requerido presentes en cada molcula, pero la protena
fue suficientemente grande como para ser contrastado bien contra los ms dbilmente
de electrones de dispersin de lpidos de membrana y hielo amorfo. Tubos amplia
(como en Fig. 1 e ), que estn dentro de la pelcula acuosa y unido al soporte de
carbono, se aplanan fcilmente y se analizaron como tal, suponiendo que aproximarse
a las hojas planas superpuestas (Brisson y Unwin, 1985 ; Unwin, 1996 ) . Sin
embargo, los tubos ms estrechos (<850 dimetro a), cuando suspendida sobre
agujeros en la pelcula de soporte y por lo tanto rodeada de agua (congelada) en todos
los lados, retuvieron su seccin transversal circular ( Fig. 3 ). En estas condiciones, la
red superficie formada una hlice regular, por lo que es posible llevar a cabo un
anlisis por el mtodo de Fourier de helicoidal reconstruccin de la imagen (DeRosier
y Klug, 1968 ; DeRosier & Moore, 1970 ; Toyoshima y Unwin, 1988 , 1990 ).
HYPERLINK
Higo.3.
Imgenes electrnicas de los tubos de ACh-receptores en hielo amorfo, que

abarcan los agujeros en la pelcula de soporte de carbono. Los tres tubos
mostrados pertenecen a diferentes familias helicoidales y tienen diferentes
dimetros, caractersticos de la familia en particular. En cada ejemplo, los dos ...
Una propiedad fundamental de una hlice es que presenta un conjunto completo de

puntos de vista igualmente espaciados de una molcula, por lo que es innecesario para
inclinar la muestra para obtener la informacin necesaria para calcular una estructura
3D, como era necesario con el mtodo cristalogrfica basado en tubos aplanados . La
simplificacin que resulta en la recoleccin de datos y el potencial para una mayor
resolucin de una estructura no perturbada, totalmente simtrica significaba que ahora
era preferible examinar la estructura del receptor en tubos sobre los agujeros,
tratndolos como objetos helicoidales.
Una forma simple de representar el enrejado superficie de un tubo helicoidal es de
imaginar, dibujado sobre una superficie cilndrica, que luego se corta y se dispusiera
plano ( Fig. 4 una ). La celosa se construye a partir de dmeros de receptores
(crculos unidos en la figura), dispuestos con p2 grupo de simetra plano, de modo que
los dmeros corren oblicuamente hacia arriba de izquierda a derecha. Lneas
siguientes una direccin dada representan un conjunto de hlices y pueden
caracterizarse por ( h , k ) ndices, a partir de losunos y b vectores de la celda
unidad. Un parmetro clave para la definicin de la retcula de la superficie es el
nmero de lneas (hlices) necesarios para compensar la circunferencia. En la Fig.
4 una , los nmeros de salida para los dos conjuntos principales de las lneas
correspondientes a los vectores de la celda unitaria, (1,0) y (0,1), son 16 y 6,
respectivamente. Tomando la direccin (lateralidad) en cuenta, este enrejado
superficie se refiere como perteneciente a la (-16,6) de la familia helicoidal.
HYPERLINK
Higo.4.
La helicoidal p2 celosa superficie y la reconstruccin de imgenes en 3D. ( Un ) El
enrejado de superficie consiste en una matriz regular de dmeros de los
receptores (crculos enlaces) dispuestos sobre una superficie cilndrica. El
diagrama se hace abriendo el cilindro y su visualizacin de la ...
Tubos de ACh-receptor forman muchas diferentes familias helicoidales, teniendo cada

uno un dimetro diferente, dependiendo de los nmeros de salida de las dos hlices
principales (Toyoshima & Unwin, 1990 ).Los tubos ms estrechos, los cuales se
pueden obtener imgenes en pelculas delgadas de hielo con aplanamiento mnimo,
son el tipo ms adecuado para estudios estructurales. De estos, los ms frecuentes
pertenecen a la (-15, 5), (-17,5), (-16,6), (-15,7) y (-18,6) familias. Ellos tienen
dimetros medios de 710, 760, 770, 790 y 830 A, respectivamente, con alguna
variacin intra-familia debido a ligeras diferencias en las dimensiones de la celda
unitaria de la red cristalina superficie. La hlice bsico, correspondiente a la cinta de
dmero ( Fig. 4 b ; hlice sombreada en la Fig. 4 c ), tiene un paso ligeramente
diferente, dependiendo de la familia, de nuevo con alguna variacin intra-familia.
3.5. reconstruccin de la imagen a partir de tubos bien

ordenadas
Tubos de las diferentes familias helicoidales producen patrones de difraccin
similares, con capas de lneas en posiciones ligeramente diferentes en funcin de la
familia en cuestin. Los patrones de difraccin de los tubos individuales no muestran
la capa de lneas que se extienden ms all de aproximadamente 30 de resolucin,
lo que indica un grado significativo de trastorno (vase la Seccin 3.6 ). Sin embargo,
en los intentos iniciales para elucidar la estructura 3D del receptor ACh por
reconstruccin helicoidal, una resolucin de ~ 17 fue capaz de ser alcanzado
simplemente promediando la informacin de varios tubos excepcionalmente bien
ordenadas en la misma familia (Toyoshima & Unwin, 1988 , 1990 ). Al evitar las
limitaciones tcnicas asociadas con el anlisis de tubos aplanados, el mtodo
helicoidal revel con ms precisin la forma del receptor y la va de ion central ( Fig.
4 c ).
En seccin transversal, el camino de iones a travs del receptor se resuelve ahora en
un poro estrecho que abarca ambas valvas de la bicapa lipdica y enmarcado a ambos
lados por grandes vestbulos extracelulares e intracelulares ( Fig.
5 una ). Promediando los datos de an ms (26) tubos bien ordenados, que luego se
convirti en posible extender la resolucin a ~ 9 y, por tanto, revelar incluso los
detalles ms finos (Unwin,1993 ), lo que podra estar relacionado con los resultados
de tentativamente bioqumico y mutation- combinado-con-estudios
electrofisiolgicos. Por ejemplo, se pudo observar en el mapa 3D barras dobladas de
densidad de la formacin de los poros ( Fig. 5 b ) y tentativamente alinear estas con
la secuencia de amino-cido correspondiente a la hlice putativa de poros de
revestimiento, M2 ( Fig. 5 c ; Giraudat et al. 1986 ; Hucho et al. 1986 ; Imoto et
al. 1986 ; Leonard et al. 1988 ). Esta alineacin tentativamente sugiere que un residuo
de leucina universalmente conservada (L251 de la subunidad ), cerca de la mitad de
la membrana, podra estar implicado en la formacin de la puerta del canal. Sin
embargo, la exactitud de la alineacin fue, obviamente, limitado, dadas las
caractersticas de densidad dbiles, y simplemente hizo hincapi en el hecho de que se
necesita un marco de mayor resolucin para integrar de una manera til de datos
bioqumicos y electrofisiolgicos existente.
HYPERLINK
Higo.5.
Estructuras obtenidos promediando los datos de imgenes de tubos incrustadohielo que abarcan agujeros en la pelcula de soporte de carbono. ( Un ) Seccin
transversal normal al eje del tubo que muestra la extracelular (exterior) e
intracelular (dentro de) las porciones de los receptores que se proyectan ...
3.6. La correccin de las distorsiones de imagen

Una mejora adicional del mtodo helicoidal dependa de encontrar una manera de
minimizar la prdida de seal debido a un trastorno cristalina: una propiedad que, a su
vez, est determinada por la flexibilidad inherente de los tubos y otros factores, tales
como la heterogeneidad de los lpidos endgenos. Trastorno degrada los patrones de
difraccin por causando regiones de un tubo a ser desplazados de sus posiciones
exactas de celosa, lo que lleva a un debilitamiento progresivamente ms grave de las
intensidades de difraccin a una resolucin ms alta. Los desplazamientos de unos
pocos Angstroms se generan fcilmente por slo una ligera flexin en el plano de la
imagen, la inclinacin (la flexin fuera del plano de imagen), variaciones en giro
alrededor del eje del tubo, los cambios en dimensiones de la celda unidad debido a
una ligera tensin o compresin del tubo o cambios en la composicin de los lpidos,
y por cizallamiento (de modo que la capa de lneas en los patrones de difraccin ya no
se encuentran exactamente perpendicular al eje del tubo).
En el caso de cristales 2D de membrana prpura, la correccin de los desplazamientos
de distancia de las estrictas posiciones de red se ha demostrado para restaurar una
gran fraccin de la seal (Henderson et al.1986 ), lo que permite en ltima instancia,
los detalles atmicos de bacteriorrodopsina para ser revelado. Este xito con un
desarrollo de cristal inspirado 2D de un mtodo anlogo para mejorar el anlisis de los
tubos de ACh-receptores (Beroukhim & Unwin, 1997 ). La imagen del tubo se divide
en segmentos cortos ( Fig. 6 una ), cada uno de los cuales est alineado de forma
independiente, en el espacio recproco, por correlacin cruzada contra una estructura
de referencia. Las variaciones en los diferentes parmetros se asignan a continuacin
a lo largo de la longitud del tubo ( Fig. 6 b ), y la imagen del tubo se reconstruye a
partir de los segmentos individuales con los desajustes medidos corregidos. As, cada
segmento corto se trata como una hlice perfecta, y cualquier pequeos
desplazamientos causados por las distorsiones dentro del segmento se

descuidan. Mediante el uso de segmentos cortos suficientes, todos los
desplazamientos (incluyendo aquellos dentro de los segmentos que no estn
corregidos) estn, en principio, reducirse hasta el punto de que ya no tienen un efecto
significativo. En la prctica, existe un lmite en la dificultad del segmento que puede
ser utilizado, ya que el contenido de informacin disminuye a medida que disminuye
la longitud, lo que lleva al aumento de los errores de alineacin.
HYPERLINK
Higo.6.
Medicin y la correccin de las distorsiones. ( Un ) Micrografa electrnica de un
tubo incrustado en hielo ((-15, 7) de la familia helicoidal), grabado a temperaturas
de helio lquido utilizando un microscopio de emisin de campo de 300 kV
(desenfoque: 17 400 )....
La difraccin limitada de los tubos de ACh-receptor se puede entender fcilmente,

dada la magnitud de las distorsiones presentes. Incluso cuando un tubo aparece recto y
regular, por el ojo (como en la Fig. 6 una ), puede ser bastante mal doblada hacia
fuera del plano o variable en funcin de las dimensiones de la celda unitaria (ver
grficos de ngulo de inclinacin, aparente repeticin, la figura . 6 b ). En la mayora
de los casos, aproximadamente la mitad de la prdida de seal asociada surge de los
efectos que son corregibles en el plano de la imagen (flexin, cambios en las
dimensiones de la celda unidad, la cizalladura) y alrededor de la mitad de los efectos
que requieren fuera del plano de correccin (variaciones en la inclinacin y giro
alrededor del eje del tubo). Las pruebas preliminares utilizando un tamao de
segmento similar a la de la Fig.6 un demostraron que tales prdidas podran ser
restaurados casi por completo por la realineacin de los segmentos de reconstruir una
hlice ms perfecto (Beroukhim & Unwin, 1997 ). Sin embargo, la resolucin
alcanzable luego se convirti limitada por la calidad de electrones ptica de las
imgenes.Claramente, la ventaja completa de las correcciones de distorsin slo
podra lograrse mediante el uso de un microscopio electrnico de ultra-alto
rendimiento.
La eficacia de este mtodo de Fourier segmentaria para medir y corregir las
distorsiones en tubos de deriva del hecho de que la simetra helicoidal confiere la
capacidad para determinar con precisin y corregir los desplazamientos de distorsin
inducida en las tres dimensiones. El anlisis no se limita a desplazamientos en el
plano de la imagen. Adems, el mtodo permite la evaluacin crtica de los datos (por
ejemplo, grado de conservacin de la simetra helicoidal y de doble simetra
perpendicular al eje del tubo), y la incorporacin lista de correcciones sobre el
enfoque cambia a diferentes niveles en la estructura (DeRosier, 2000 ) . Un mtodo de
espacio real alternativa tambin se ha desarrollado que evita la formulacin Fourier
mediante el tratamiento de los segmentos como una cadena de partculas individuales
(Egelman, 2007 ). Ambos mtodos han dado resultados similares cuando se aplica a
otros cristales de membranas tubulares (Coudray et al. 2013; japutas et al. 2007 ).
3.7. Microscopa a temperaturas de helio lquido

Un microscopio electrnico moderno, equipado con una pistola de emisin de campo
de alta tensin, permite que las imgenes de materiales relativamente estables, tales
como semiconductores y metales, para ser registradas de forma rutinaria con la
transferencia de contraste casi perfecto a una resolucin de alrededor de 3 . Sin
embargo, un espcimen biolgico sensible a la radiacin, mantenido en una fina capa
de hielo amorfo, es otro asunto. La probabilidad de que el movimiento producido por
un pulso corto de electrones de alta energa (haz de movimiento inducido) o, por
ejemplo, pequeos gradientes de temperatura (deriva), hace que la retencin de la
seal de electrones ptica precisa mucho ms difcil de lograr.
En el momento en que se desarroll el mtodo de correccin de distorsin, la etapa
simtrica, de entrada superior lquido refrigerado por helio, diseado por Fujiyoshi et
al. ( 1991 ), ofrece el mayor potencial para la grabacin de las imgenes de alta
calidad que se necesitan de tubos. En los experimentos que conducen a modelos
atmicos de cristales 2D (Fujiyoshi, 1998 ; Kuhlbrandt . Et al 1994 ), esta etapa se
haba demostrado excepcional deriva-estabilidad en comparacin con las etapas fras
de entrada lateral estndar, y el diseo general microscopio era muy adecuado para
una amplia GRID la bsqueda y el intercambio de muestras rpida. Del movimiento
inducido por la viga se convierte en un problema ms serio cuando la grabacin de
imgenes a la temperatura del helio lquido (4 K), debido a la gran reduccin de la
conductividad de la muestra y la consiguiente acumulacin de carga elctrica. Sin
embargo, hemos encontrado que tal movimiento en gran medida podra evitarse
mediante el uso de rejillas conductoras ms pre-irradiados de carbono y la
incorporacin de una abertura objetivo limpio, recubierto de oro (Miyazawa et
al. 1999 ).
3.8. Refinada estructura de 4

Las imgenes de mejor calidad obtenidos con la etapa de helio-enfriado lquido,
cuando se combina con correccin de la distorsin, condujeron a mejoras
significativas. Se consigui una Resolucin de 4 despus de la fusin de datos de
imgenes de tubos en cuatro familias helicoidales (equivalente a ~ 10 6 molculas),
registrados con el escenario. Esto fue suficiente, en la primera instancia, para rastrear
los cinco cadenas de polipptidos a travs de las densidades de 3D en el dominio que

atraviesa la membrana -helicoidal del receptor (Miyazawa et al. 2003 ). Ms tarde,
un modelo atmico refinada se obtuvo utilizando mtodos cristalogrficos estndar
(Unwin, 2005 ), y ayudado por el conocimiento de la estructura de rayos X de 2,7
de una protena de unin a ACh-solubles relacionadas (AChBP; Brejc et
al. 2001 ). Este modelo no permiti una interpretacin qumico completo de la
estructura, debido a la resolucin modesta, pero sin embargo proporciona una
representacin detallada de la compleja arquitectura del receptor en los tres
dominios. El modelo incluy el 80% de los aminocidos 2335 que comprenden todo
el conjunto, con la mayor parte de los residuos que faltan de ser a la larga, al parecer
desordenado (M3-M4) bucle intracelular.
AChBP es una protena homopentamrica soluble en agua de caracol, el protmero de
los cuales tiene similitud (identidad de aminocidos 20%) con la parte extracelular de
la Torpedo subunidad. Fue clave para el seguimiento de la cadena en el dominio
extracelular debido a la limitada calidad del mapa de densidad y la dificultad en la
interpretacin ms finas, las caractersticas no-alfa-helicoidal. AChBP tambin era
importante para garantizar una correcta asignacin de las subunidades de todo el
pentmero. La estructura de rayos X confirm los resultados de los experimentos
bioqumicos que identifican los residuos de ACh de unin (Grutter y
Changeux, 2001 ), y corrobor la conclusin de que es la nica subunidad entre las
dos subunidades (Karlin, 1993 ; Sine et al. 1995 ) . Slo con esta asignacin eran
residuos especficos demostrado que influyen en la unin de ACh al receptor, y
residuos equivalentes en AChBP, agrupados de una manera compatible. Por otra parte,
el uso de las manos de manifiesto en AChBP aclar el orden espacial de alfa y
alfa , las subunidades que conforman los sitios de unin a ACh en las interfaces con
y , respectivamente. Por lo tanto, una vez que la localizacin de la subunidad se
estableci al lado de uno de los ejes al doble radiales (ver la Seccin 4.5 ), las
asignaciones de alpha , , alpha y la subunidad restante siguieron
automticamente.
Ir:
4. Modelo atmico del canal cerrado

4.1. Arquitectura y doblez
Las cuatro cadenas de polipptidos del receptor son similares en tamao y tienen el
mismo pliegue 3D ( Fig. 7 una ). Forman ~ 160 subunidades en forma de bastoncillos
largos A, que se encuentran casi perpendicular a la membrana y se dividen en tres
partes bien diferenciadas: una estructuralmente N parte extracelular -terminal
organizado en torno a un ncleo de -sandwich, una parte que atraviesa la membrana
compuesta de cuatro -hlices y una parte intracelular que contiene una -hlice. La
parte extracelular tiene la organizacin ms compleja. Las dos lminas beta que
componen el -sndwich estn hechos de seis hebras (hoja interior: verde) y cuatro
hebras (hoja exterior: rosa), y se unen a travs del puente disulfuro Cys-loop.Varios de
los bucles de conexin beta-captulos son crticos para la funcin del receptor
ACh. Estos incluyen: el bucle Cys, que recubre las hlices que atraviesan la
membrana exterior; los bucles A, B y C, que en las subunidades alfa estn
involucrados en la formacin del sitio de unin a ACh-; y el 1 / 2 de bucle, la
conexin de la -hoja interna a lo interno, M2 hlice de poros de
revestimiento. Tambin especficos para las subunidades alfa es un bucle cerca del Nterminal, que forma la principal regin inmunognica (MIR), la regin en la que los
anticuerpos se unen en la enfermedad autoinmune, la miastenia gravis (Tzartos y
Lindstrom, 1980 ). En la parte que atraviesa la membrana, las hlices M1-M4 tienen
una disposicin simple pero Splay aparte hacia el final extracelular, donde se
extienden en disolvente. La hlice de poros revestimiento M2, en el canal cerrado, se
dobla hacia adentro, hacia el lumen del poro, pero no tan marcadamente como anlisis
haba sugerido menor resolucin. La parte intracelular se compone principalmente del
tramo de secuencia entre M3 y M4, e incluye una hlice curvada (MA), que precede a
M4. Como se mencion anteriormente, la mayora del resto de M3-M4 es
desordenado y no se ve en la estructura.
HYPERLINK
Higo.7.
La arquitectura y el pliegue del receptor de acetilcolina (forma de canal cerrado
(2BG9)), ilustrado con diagramas de cinta. ( Un ) El alphagamma subunidad visto
desde el lado, con el eje central del receptor a la derecha; las lminas exterior e
interior que componen ...
Las subunidades individuales ordenar lado a lado en un anillo, formando un conjunto

simtrico pseudo-cinco veces que es ~ 160 de largo y hasta 80 de dimetro ( Fig.
7 b ). El pliegue de las particiones subunidades este conjunto naturalmente en tres
dominios funcionalmente distintos ( Fig. 7 c ): un dominio extracelular, que contiene
los dos sitios de unin a ACh-; un dominio que atraviesa la membrana, que contiene la
puerta de la canal; y un dominio intracelular: un cono invertido de cinco alfa-hlices,
que interacta con la protena de la agrupacin, RapSyn, en su base. La trayectoria de
iones a lo largo del eje central se divide de manera similar, y se compone de un poro
estrecho travs de la membrana, enmarcado en el lado extracelular por una, dimetro
de un vestbulo cilndrico largo ~ 20, y en el lado intracelular por un portal de forma
cnica ms corta abertura a travs de cinco ventanas laterales en el interior de la
clula.
Los dos sitios de unin a ACh son aproximadamente 40 de la membrana, y residen
principalmente en las subunidades en las interfaces con la vecina y . Las entradas a
estos sitios estn enmarcadas por el bucle C y un residuo de triptfano coordinacin,
W149, en el bucle B de ( Fig. 7 b ). Como se describir en la Seccin 4.3 , la puerta
del canal se encuentra cerca de la mitad de la de poro que abarca la membrana, ms de
50 de distancia de los sitios de unin ( Fig. 7 c ). As, la ACh-desencaden cambio
conformacional para abrir el canal se extiende sobre una larga distancia notablemente
dado que la transicin es tan rpido.
El receptor ACh es un canal inico selectiva para los cationes, y cuando est abierto
permite slo pequeas cationes (Na + , K + y algunos Ca 2+ ) para permeado. Una
funcin de los vestbulos extracelulares e intracelulares es para mejorar la selectividad
de cationes a travs de aniones. Hay un exceso de grupos cargados negativamente, la
creacin de ambientes de cationes estabilizantes, en las paredes internas de las dos
antesalas. Anillos de carga negativa cadenas laterales tambin estn situados
estratgicamente en los extremos de las hlices de poros revestimiento (Imoto et
al. 1988 ), y en las hlices que forman el dominio intracelular, para concentrar
cationes cerca de las entradas de los poros estrecha. El "anillo intermedio 'de carga
negativa en el extremo intracelular del poro parece desempear un papel
especialmente importante. A diferencia del caso de canales de iones especficos, tales
como el canal de potasio (Doyle et al. 1998 ), el poro en s no juega un papel
importante en la discriminacin de iones pero restringe el tamao de ion que puede
pasar a travs.
4.2. sitios de unin a AChLa estructura detallada del sitio de unin a ACh, ya sea en alfa o alpha delta no se
conoce todava. Sin embargo, el sitio de unin a ACh-en AChBP comparte la misma
estructura de ncleo, ya que la clave de coordinacin aminocidos se conservan entre
las dos protenas. El sitio cannico es una forma en gran medida por restos de
aminocidos en el bucle C y en el cuerpo de la subunidad hendidura
aromtico. Figura 8 muestra cmo carbamilcolina (un anlogo cercano de ACh) se
coordina con cadenas laterales circundantes en el - director lado subunidadequivalente del protmero de AChBP (Celie et al. 2004 ). Una triptfano conservado
en el bucle B (equivalente a W149 en la Fig. 7 ), dos tirosinas conservadas en los
bucles A y C (equivalente a Y93 y Y190), as como uno de los pares de cistenas
conservadas en el bucle C (equivalente a C192) en contacto con la molcula
unida. La influencia estabilizadora ms importante es una interaccin catin- entre el
triptfano de la cadena lateral y el nitrgeno cuaternario catinico del ligando

(Zhong et al. 1998 ), pero el grupo carbonilo del triptfano y otro aromtico de la
cadena lateral en el bucle C (Y198) estn involucrados tambin. Varios residuos ms
variables en el protmero AChBP adyacente (equivalente a la o subunidad del
receptor) tambin participar en las interacciones, en consonancia con los estudios
bioqumicos que muestran que los residuos de la y subunidades delta modulan las
propiedades de los dos sitios de unin (Karlin , 2002 ; Sine, 2002 ; Xie y
Cohen, 2001 ).
HYPERLINK
Higo.8.
Sitio de AChBP ACh-unin en presencia del anlogo de ACh, carbamilcolina (1UV6;
Celie et al. 2004 ). La vista de todo el pentmero (izquierda) es equivalente a la
del receptor en la Fig.7 b , con una regin de sitio de unin identificado por un
cuadrado. La ampliacin ...
La conformacin AChBP en Fig.8 se piensa para asemejarse a la completamente

coordinado, conformacin desensibilizada agonista-estabilizada del receptor (Grutter
y Changeux, 2001 ). Sin embargo, es interesante comparar esta conformacin ( Fig.
8 ) con la de la canal cerrado ( Fig. 7 b ), como uno podra esperar que el canal
abierto para coordinarse parcialmente con una conformacin entre los dos
extremos. Una diferencia obvia entre las dos estructuras se encuentra en la orientacin
del bucle C. Este bucle se dobla hacia dentro para coordinar con la carbamilcolina
atado en la Fig.8 , pero se proyecta hacia fuera casi tangencialmente en la Fig.
7 b . As, los residuos en el sitio de unin del receptor deben contraerse alrededor de
la molcula de la acetilcolina unida, ya que los estudios han sugerido con AChBP
(Gao et al. 2005 ), pero el acceso al sitio de unin es mejorada cuando est vaco. Una
descripcin del movimiento real observada en esta regin despus de la apertura del
canal se da en la Seccin 5.3 .
Las diferencias estructurales entre los dos sitios de unin del receptor se reflejan en
sus diferentes afinidades por ACh (y de otros ligandos). Estas diferencias son
importantes en trminos del mecanismo de activacin, un concepto central de la
regulacin alostrica ser que los agonistas se unen al estado inactivo de una protena
(canal cerrado) menos fuertemente que al estado activo (canal abierto), y que esta
diferencia en la unin la energa se utiliza para conducir el evento de activacin. En el
caso de la Torpedo receptor, los estudios tanto electrofisiolgicos y bioqumicos han
indicado que la afinidad por el estado cerrado de alfa para ACh (~ 100 M) es menor
de aproximadamente 100 veces que la de alpha delta (Andreeva et al. 2006 ; sine et
al. 1990 ), mientras que el estado abierto afinidades son ms casi igual y en el rango
nanomolar (Jackson, 1988 ). Por lo tanto, alfa gamma se esperara que hacer el mayor
aporte energtico al cambio conformacional conducir la apertura del canal. Se cree
que la menor afinidad de un sitio facilita la rpida terminacin de la respuesta
sinptica, mientras que la mayor afinidad del otro sitio puede acelerar la activacin
(Jackson, 1989 ). La existencia de un segundo sitio de unin tambin puede ser
considerado el costo energtico de perfeccionar un interruptor estructural que es capaz
de conducir un cambio tan grande en el equilibrio de canal gating.
4.3. Que atraviesa la membrana de poro

Los segmentos alfa-helicoidal de las cinco subunidades ordenar regularmente en la
membrana, formando anillos concntricos alrededor de un poro cnico, lleno de agua
( Fig. 9 una ). Hay un anillo interior de las hlices (M2) que recubre el poro, y un
anillo exterior de las hlices (M1, M3 y M4) frente a los lpidos.Ambos conjuntos de
hlices Splay aparte, en cierta medida hacia el lado extracelular, pero por lo dems se
organizan de forma diferente. En el canal cerrado, las hlices interiores M2 curva
hacia el interior y slo hacen importantes contactos de lado a lado cerca de la mitad de
la bicapa y en el folleto intracelular ( Fig. 9 b). Las hlices exteriores M1 y M3 hacen
ms estrictos los contactos de lado a lado y giro alrededor de la otra como en una
bobina normal con la mano izquierda. Esta diferencia en el embalaje conduce a una
ligera separacin entre los anillos interiores interior y exterior, sobre todo en la
porcin extracelular del dominio de membrana. Las hlices M4 ms exteriores hacen
un contacto limitado con el resto de la protena, sino que interactan ampliamente con
los lpidos.
HYPERLINK
Higo.9.
Estructura de canal cerrado (2BG9) que atraviesa la membrana. ( Un ) Visin
abajo del eje del receptor (lado extracelular ms superior) que muestra la
disposicin pentagonal simtrica hecha por los ~ 40 un largo transmembrana
alfa-hlices. ...
El espacio lleno de agua entre los anillos interior y exterior parece crucial para el
mecanismo de apertura de canal ( seccin 5.5 ), ya que permitira a las hlices de
poros que recubre cierta libertad de movimiento para formar de nuevo el poro de
forma independiente de la pared exterior, donde el M1 y hlices M3 estn
empaquetados ms juntos. En el receptor ACh nicotnico 7 neuronal (que comparte
36% de identidad de secuencia con el Torpedo subunidad), compuestos sintticos
que forman los moduladores alostricos positivos y agonistas alostricos son capaces
de unirse en este espacio intersticial y potenciar o la apertura del canal de disparo. La
ubicacin en 7 de la mayora de los compuestos es intra-subunidad (Dacosta et
al. 2011; Gill et al. 2011 ; joven . Et al 2008 ), pero en el caso de la ivermectina
(Krause et al. 1998 ), la estructura de un GluCl -ivermectin compleja (Hibbs y
Gouaux, 2011 ) sugiere que un lugar entre la subunidad estara involucrado. Otros
miembros de la superfamilia de Cys-loop, en particular glicina y GABA A receptores,
albergan sitios de unin especficos para los alcoholes, los pequeos neuroesteroides y
anestsicos voltiles en la misma regin (Hosie et al. 2006 ; Li et al., 2006 ; Mascia .
Et al 2000 ).
Las regiones grupo de cabeza de fosfolpidos de la membrana son visibles en las
imgenes ( Fig. 5 una ), y por lo tanto especifica cmo las hlices, y el poro central,
se colocan en relacin con el ncleo hidrofbico de la bicapa lipdica. Las hlices se
extienden hasta aproximadamente dos vueltas ms all de los grupos de cabeza
(contornos de color rosa en la Fig. 9 b ) en el lado extracelular, pero terminan de
manera bastante uniforme en, o ligeramente antes de que los grupos de cabeza en el
lado intracelular. El poro es ms estrecho en el que pasa a travs del ncleo
hidrofbica de la bicapa, y se ensancha en el extremo extracelular. El perfil exacto de
los poros est determinado por los caminos tomados por las hlices que rodean y por
las cadenas laterales que sobresalen de ellos. En el canal cerrado, las hlices de poros
que recubre doblan ligeramente, como se puede comprobar en la figura.9 b tanto
desde el modelo atmico y una representacin de la superficie de baja resolucin
(superpuesta) obtenido a partir de un anlisis independiente (Unwin y
Fujiyoshi,2012 ; vase la seccin 5 ). El efecto de la curvatura es para constreir el
poro ms cerca de la mitad de la membrana (asterisco, Fig. 9 b ), y para mantener un
dimetro estrecho a partir de entonces hasta que se alcanza la entrada intracelular.
Una estructura atmica de alta resolucin an no est disponible para indicar las
conformaciones exactas y las posiciones de las cadenas laterales individuales que
bordean el poro, pero los detalles revelados en las estructuras cristalinas de los canales
homomeric relacionados (Bocquet et al. 2009 ; Hibbs y Gouaux, 2011 ; Hilf y
Dutzler, 2008 ) son similares a las del modelo atmico. Figura 9 b muestra la
ubicacin de algunos aminocidos clave que afectan el transporte de iones, basado en
este modelo. Los residuos de glutamato (E241 y E262; posiciones - 1 'y 20'), en las
regiones de grupo de cabeza de fosfolpidos intracelulares y extracelulares, son
componentes de los anillos intermedios y extracelulares de carga que afectan a la
conductancia de cationes a travs del poro abierto (Imoto et al. 1988 ) . La treonina
(T244; posicin 2 ') est en la regin ms de constriccin cuando el canal est
abierto (Imoto et al. 1991 ; Villarroel et al. 1991 ). Los dos residuos hidrfobos
(L251 y V255; posiciones 9 'y 13') son componentes de los anillos adyacentes de
leucinas altamente conservadas y Valines formando una faja hidrfobo apretada
alrededor del poro cerrado (Blanton et al. 1998 ; White & Cohen, 1992 ).
4.4. puerta hidrfobo

La faja formada por leucina y valina cadenas laterales (posiciones 9 'y 13') se
identific por fotomarcaje experimentos usando un pequeo compuesto no cargado
fotoactivable (3- (trifluorometil) -3- ( m - [ 125 I] yodofenil) diazarine). El compuesto
unido de manera eficiente a estas cadenas laterales en M2 y M2 nicamente en
ausencia de agonista, lo que sugiere que las hlices de poros de revestimiento se
unieron para formar el medio ambiente de unin hidrfobo compacto slo cuando el
poro fue cerrada; de lo contrario, en presencia de agonista, las hlices se ms
extendidos aparte (blanco y Cohen, 1992 ). Esta evidencia bioqumica fue interpretada
para indicar que la faja formas hidrofbicas todos, o parte de, la puerta. En la
estructura de canal cerrado, los anillos de leucina y valina cadenas laterales estn en el
nivel preciso donde el poro se vuelve ms estrecha ( Fig 9. B ; Miyazawa et
al. 2003 ). Tambin se encuentran en la regin en la que el poro se ensancha ms
sustancialmente cuando el canal se abre (ver Secciones 5.3 y 5.5 ). Los detalles
estructurales, por tanto, estn de acuerdo con la interpretacin bioqumica, y no
pueden reconciliarse con otras interpretaciones que ponen a la puerta en la superficie
de la membrana intracelular (por ejemplo Paas et al. 2005 ; Wilson & Karlin, 1998 ).
Originalmente, se pens que la puerta puede ser una barrera de oclusin a la
permeacin de iones formado por los de leucina conservados cadenas laterales que se
proyectan hacia adentro, hacia el eje del poro (Unwin, 1993 ; Fig. 5 ). Sin embargo, la
estructura de alta resolucin muestra que este no es el caso: hay un agujero de 3,0 a
3,5 radio sobre una distancia de aproximadamente 8 lo largo del eje donde se
encuentra la faja hidrfobo (Miyazawa et al. 2003 ). Aunque este radio es ms grande
que la de un Na + o K + ion, la regin no contiene grupos polares que podran
estabilizar que electrostticamente. Por lo tanto, el ion no puede arrojar fcilmente su
capa de hidratacin y, en efecto, se convierte en demasiado grande para pasar a travs
de (Beckstein et al. 2001 ; Unwin, 2000 ). Por consiguiente, la puerta funciona como
una barrera de energa, en lugar de una barrera fsica, en la prevencin de la
permeacin de iones a travs de la membrana.
Curiosamente el canal de iones mechanosensitive, MscL, parece tener una puerta
hidrfobo similar (Chang et al. 1998 ). Este canal forma un homopentmero, pero es
de otro modo no relacionado con los miembros de la Cys-loop superfamilia de canales
de iones. La puerta de MscL es tambin una constriccin, en lugar de una oclusin,
hecho por los anillos adyacentes de leucina y valina cadenas laterales que sobresalen
simtricamente desde segmentos de cinco a-helicoidales de poros de revestimiento
(Birkner et al. 2012 ). El motivo de secuencia LXXXV es comn a los dos canales, lo
que sugiere que los-leucina junto a-valina cadenas laterales alifticas expuestos
pueden ser particularmente adecuados para la formacin de la barrera de permeacin
requerido funcionalmente robusto, pero inestable.
4.5. interacciones receptor-receptor

Los mapas de densidad de cuatro familias helicoidales ((-15,7), (-17,5), (-16,6) y (18,6)) se utilizaron para obtener el modelo atmico refinada del receptor
ACh. Docking de este modelo en cada uno de los cuatro mapas permite un examen
ms a fondo de las interacciones que afectan embalaje receptor en el p2 celosa
superficie ( Fig. 10 ). De hecho, el embalaje es invariante entre las familias, a
excepcin de pequeos ajustes para tener en cuenta las diferencias en la curvatura del
tubo. En cada familia, los receptores estn ms cerca de uno al otro en los dos ejes al
doble radiales (asteriscos, Fig. 10 ). El puente disulfuro intersubunitario entre las Cys-500 residuos penltimas de receptores vecinos (DiPaola et al. 1989 ) se encuentra
cerca de la membrana en un tal eje (asterisco azul). El C bucles que sobresalen de la
alfa gamma subunidades de los receptores de la vecina mentir acerca de 40 de la
membrana en el otro (asterisco rojo). Al parecer, el par de bucles de C, como con el
enlace covalente -, hacen contactos especficos debido a que su separacin es
constante, es decir independiente de la familia helicoidal en cuestin. Ambos de estos
contactos parecen actuar como puntos de giro sobre el que los receptores se inclinan a
fin de permitir la curvatura diferente asociado a cada familia. La flexin de este tipo
podra estar implicado en la facilitacin de cambios en la curvatura de las crestas de
los pliegues de unin.
HYPERLINK
Higo.10.
Embalaje de receptores y la disposicin de la subunidad en la superficie de un
tubo, visto paralelo con (superior) y normal a (inferior) del plano de la
membrana. Las molculas individuales que ms se acercan entre s en los dos
nicos radiales al doble ejes (asteriscos). Un disulfuro ...
4.6. La comparacin con protenas relacionadas
Algunas caractersticas del modelo atmico del receptor ACh han sido confirmados
por las estructuras de rayos X de protenas o dominios relacionados. Por ejemplo, en
una estructura de rayos X 1,94 del dominio extracelular de la subunidad 1 ratn
unido a a-bungarotoxina (Dellisanti et al. 2007 ), el ncleo -hoja superpone bien con
la regin correspondiente de dicho modelo ( Fig. 11 una ). Como era de esperar, hay
un acuerdo similar con la estructura del ncleo -hoja de AChBP ( Fig. 11 b ). El
receptor Cys-loop homomeric anin selectivo, GluCl (Hibbs y Gouaux, 2011 ), as
como los canales inicos procariota homomeric ms alejadas (Bocquet et al. 2009 ;
Hilf y Dutzler, 2008 ), comparte el mismo general veces en los dominios extracelular
y de membrana ( Figs 11 c y 11 d ).
HYPERLINK
Higo.11.
Diagramas de cinta del receptor ACh y protenas relacionadas. ( Un )
Superposicin de la subunidad 1 ratn (2QC1) con el alpha gammasubunidad del
receptor ACh (2BG9). ( B ) AChBP (1I9B). ( C ) GluCl (3RIA). ( D ) La superposicin
de GluCl ( abierta del canal, ...
En detalle, hay algunas diferencias interesantes entre los canales inicos homomricos
y el receptor ACh. Por ejemplo, la porcin de MA del vestbulo intracelular no se
encuentra en los canales homomeric. Sin embargo, que desempea un papel
significativo en los receptores Cys-bucle ms altamente evolucionados, donde se
puede actuar para controlar la conductancia del canal de un solo canal (Kelley et
al. 2003 ), o para filtrar iones del tamao incorrecto y la carga (Hales et al. 2006 ; la
cancin y Corry, 2009 ; Unwin, 2005 ).Presumiblemente, las propiedades de
conduccin necesarias se pueden lograr igualmente, si no de manera ms eficiente
mediante la incorporacin de un marco que permita interacciones adicionales dbilprotena de iones lejos de la entrada intracelular estrecha del poro.
Otra diferencia es evidente en la Fig.11 d , la comparacin de las hlices que rodean
la abierta de poros de GluCl (estabilizado con ivermectina) con el cerrado de poros
del receptor ACh, en el plano de la puerta.Mientras que el poro abierto de GluCl es de
hecho ligeramente ms ancho en este nivel (basado en posiciones C), el embalaje de
sus hlices, como las de los canales de iones procariotas (Brannigan et al.2008 ), es
ms compacto. La hlice de embalaje ms flojo del receptor ACh, donde la membrana
est presente, posiblemente refleja el hecho de que los lpidos nativos tales como el
colesterol, no slo juegan un papel funcional crtico (Brannigan et al. 2008 ;
Dacosta et al. 2009 ; Dalziel y col. 1980 ), pero tambin son necesarios para conservar
la arquitectura exacta transmembrana.
Ir:
5. Transicin para abrir canales

formulario
5.1. Introduccin
Una descripcin de la forma de canal abierto transitoria del receptor es fundamental
para nuestra comprensin de cmo funciona la protena. Cules son los cambios
estructurales en el dominio extracelular producir esta forma? Cmo se acoplan con el
dominio de membrana para producir un cambio en las alfa-hlices que rodean el
poro? Cules son los movimientos de hlice que se abren los poros y permiten a los
iones a travs de? Estas preguntas se han investigado a profundidad variable mediante
una serie de tcnicas biofsicas. Por ejemplo, la tasa de equilibrio anlisis relacin de
energa libre ha sugerido que gating del canal se produce por medio de una "onda
conformacional 'que procede del dominio extracelular de la regin de la puerta
(Auerbach, 2010 ; Mitra et al. 2005 ) . Anlisis de la mutacin que define los
acoplamientos entre los residuos ha identificado una va principal de la vinculacin de
unin a ACh apertura del poro (Lee y Seno,2005 ). Medicin electrofisiolgica de la
medida de bloque actual por los residuos de lisina sustituidos ha sugerido que la
apertura del canal implica un reordenamiento sutil de hlices de todo el poro
(Cymes et al.2005 ; Cymes y Grosman, 2008 ). Simulaciones de dinmica molecular
sobre la base de la estructura del canal cerrado han iluminado la naturaleza de los
desplazamientos necesarios para alcanzar un estado totalmente conductor
(Corry, 2006 ; Wang et al. 2008 , 2009 ).
Sin embargo, el receptor ACh es un conjunto de heteromrica complejo y el cambio
conformacional real ha de implicar una gama de movimientos finamente equilibrados,
distribuida ntimamente en tres dimensiones.Las magnitudes y direcciones de tales
movimientos no pueden ser definidas en detalle por las tcnicas biofsicas, y no se
pueden predecir totalmente por incluso los clculos de energa ms precisos. Ellos
slo pueden establecerse de forma inequvoca mediante la comparacin de las
estructuras resueltas directamente de la misma protena en las formas cerradas y
canales abiertos fisiolgicas. Como se ver ms adelante, estas dos formas difieren en
la mayora de regiones por menos de una Angstrom, y los cambios relativos ellos son
asimtricos. Por lo tanto gating modelos basados en la comparacin de las estructuras
cristalinas de rayos X de los receptores procariotas homomeric, ingeniera de
diferentes cadenas de polipptidos (Bocquet et al.2009 ; Hilf y Dutzler, 2009 ), son de
validez limitada y no se refieren sin rodeos a los cambios conformacionales que
ocurren en el receptor ACh.
La microscopa electrnica de los tubos, en principio, proporciona una manera ideal

para investigar este cambio conformacional, puesto que los receptores en la red
superficie de un tubo pueden ser atrapados en forma de canal abierto (Berriman &
Unwin, 1994 ), as como en la estrecha -channel forma, y comparado.Este mtodo
evita las preocupaciones acerca de la relevancia de las estructuras de rayos X, y
adems elimina la posible ambigedad sobre el estado funcional real. En
experimentos preliminares imgenes de los canales abiertos atrapados (Unwin, 1995 ),
la resolucin era insuficiente para resolver hlices de membrana individuales y el
dominio de membrana se supone errneamente que ser cinco veces simtrica. Sin
embargo, ms recientemente, ayudado por los avances tcnicos ( Secciones
3.6 y 3.7 ), ha sido posible mejorar la resolucin y para definir los movimientos de
compuerta de las hlices individuales con una precisin demostrada (Unwin y
Fujiyoshi, 2012 ). Los siguientes prrafos se presenta una breve descripcin de los
experimentos de captura y del cambio conformacional se indica, proporcionando un
fondo para una discusin posterior sobre cmo funciona el canal.
5.2. experimentos de pulverizacin por congelacin de

captura
El aspecto resuelta en el tiempo de captura de la forma de canal abierto se puede
lograr de varias formas diferentes (por ejemplo, Lu et al. 2009 ; Mntret et al. 1991 ;
Blanco et al. 2003 ). Nuestro trabajo hecho uso de un aerosol que contiene ACh-, para
imitar la activacin sinptica, junto con la congelacin rpida, para detener la reaccin
antes de que un nmero significativo de los receptores podra convertir a un estado
desensibilizado. En la configuracin experimental ( Fig. 12 una ), una solucin que
contiene los tubos se aplica a una red de microscopio, celebrada en pinzas, y se
transfiri de manera que slo una pelcula acuosa delgada permanece. La rejilla se
hundi luego de la cada libre en etano lquido enfriado con nitrgeno. Justo antes de
que llegue a la superficie de etano, la rejilla es interceptada por una fina pulverizacin
de gotitas de ACH (dimetro ~ 1 m; ACh 200 mM) que contiene partculas de
marcador de ferritina, que se extiende y se mezcla con el contenido de la pelcula
acuosa. La distancia entre la boquilla de pulverizacin y la superficie de etano se hace
corto, de modo que el tiempo de reaccin mximo es breve (~ 10 ms). Tubos que
realmente han estado expuestos a la ACh (en concentraciones locales estimadas de 1-5
mM) se identifican en las imgenes por la presencia de partculas de ferritina cercanos
( Fig. 12 b ).
HYPERLINK
Higo.12.
Atrapamiento de pulverizacin por congelacin. ( Un ) Se deja que la solucin de
rejilla-soportado que contiene tubos de pasar por cada libre en etano lquido de
nitrgeno lquido refrigerado y se roca con una solucin que contiene partculas
de ACh marcadores de ferritina justo antes de que llegue a la superficie de
etano. ...
Un posterior refinamiento de esta tcnica hecho uso de tubos situados en una "zona de
difusin 'que se extiende ms all del borde de la ferritina delineado de la gota de
coalescencia ( Fig. 12 c ), donde los tiempos de reaccin fueron an ms corta (0-2
ms) y la concentracin de ACh inferior a 1 mM (Unwin y Fujiyoshi, 2012 ). Aunque
la concentracin de ACh se est cayendo en esta regin, que todava puede estar por
encima del nivel de saturacin requerido para asegurar una alta probabilidad de ser
canales abiertos. Por otra parte, en ausencia de "etiquetado" por las partculas de
ferritina, fue posible determinar el estado funcional a posteriori mediante la
comparacin de la estructura (promedio) del receptor en cada tubo con estructuras de
referencia cerrado y abierto canales. El proceso de seleccin se llev a
aproximadamente el mismo nmero de imgenes de clase 'abiertas' 'cerrado' y, y la
comparacin de los dos mapas de densidad igual calidad 6.2 Un obtenidos a partir de
estas imgenes permite una medicin precisa de pequeos cambios en toda la
estructura. Alrededor del 80% de las imgenes de canales abiertos utilizados en este
anlisis fueron de tubos situados en la zona de difusin. Tanto en trminos de
concentracin de ACh y de escala de tiempo, por lo tanto, las condiciones
experimentales recapitulan casi a la perfeccin las condiciones de activacin
existentes en la unin neuromuscular (Kuffler y Yoshikami, 1975 ).
5.3. cambios en el sitio de unin de la firma y la

puerta
Los ACh coordinantes de aminocidos cadenas laterales en el bucle C y los bucles A y
B de la alpha gammasubunidad estn muy separados en forma de canal cerrado del
receptor ( Figs 7 a y 7 b ), que indica que una perturbacin localizada , que implica el
cierre del bucle C, debe ocurrir despus de la activacin. De hecho, la estructura de
clase abierta en esta regin ( Fig. 13 b ) muestra el bucle C a se han movido hacia el
interior en aproximadamente 2 , en comparacin con su orientacin en la estructura
de clase cerrada ( Fig. 13 una), con lo que ms cerca de residuos, tales como W149
en el bucle B, en el otro lado del sitio de unin. Sin embargo, el bucle C no se ha
movido tan lejos hacia el interior como su homlogo en 'insensibles' AChBP (verde
rastro, Fig. 13 b ; vase tambin la Fig. 8 ). La orientacin mostrada en la Fig.13 b ,
por lo tanto, sugiere que el estado abierto puede corresponder a una conformacin
intermedia parcialmente coordinada.
HYPERLINK
Higo.13.
El cierre de bucle C y ensanchamiento de los poros de la activacin por ACh. ( Un )
y ( b ) muestran las conformaciones C-bucle de a en las formas cerradas y
canales abiertos, respectivamente, en placas equivalentes a travs de los dos
mapas de densidad de 6 . El ...
Otra firma definicin de un canal abierto es un aumento en las dimensiones de los

poros (y / o aumento de la polaridad) en la proximidad de la puerta. De hecho, el poro
de clase abierta ampla al mximo en la puerta, y en la regin extracelular contiguo,
de acuerdo con las comparaciones entre las dos estructuras de 6-a. Las Figuras 13 c y
13 d muestran los perfiles alternativos en forma por el poro-revestimiento frente
opuesta hlices de los alfa y subunidades delta. En la configuracin de canal cerrado
( Fig. 13 c ) tanto alfa M2 y M2 inclinarse hacia adentro, hacia la puerta (barra
amarilla), mientras que en la configuracin de canal abierto ( Fig. 13 d ) que ya no se
inclinan hacia adentro, pero siguen trayectorias rectas (indicado para la
alfagamma M2 por la lnea discontinua). El poro desarrolla un perfil uniforme
disminuyendo como resultado de la rectificacin de la hlice y, en esta seccin
transversal, se ensancha por casi 2 en la puerta (vase tambinla seccin 5.5 ).
5.4. cambio conformacional apertura del canal de

conduccin
El cambio de conformacin extendida que une la perturbacin en el bucle C ( Figs
13 y 13 b ) para el movimiento de la hlice gating ( Figs 13 c y 13 d ) se produce
por los movimientos mecnicamente distintos en los dominios extracelular y de la
membrana. Los principales movimientos son una reorganizacin estructural
participacin de los alfa y subunidades beta en el dominio extracelular, y una
inclinacin de cuerpo rgido de la subunidad en el dominio de membrana. El
alfa gamma subunidad, que contiene el sitio de baja afinidad de unin a ACh, es el
principal impulsor del cambio conformacional, mientras que la subunidad es el
socio principal de la transmisin de la accin a la membrana.
La figura 14 muestra los detalles esenciales de este mecanismo. Cuando el bucle C de
alpha gamma se dibuja en hacia el bolsillo de unin que trae la hoja exterior con ello,
la rotacin de la hoja en el plano de la membrana (flecha curva y el sombreado
rosa, Fig. 14 una ) y inclinndolo ligeramente en una perpendicular direccin. Para

adaptarse a este movimiento, la lmina interior (sombreado verde) es empujado hacia
la subunidad (flecha amarilla). La subunidad responde con un movimiento de
balanceo ( Fig. 14 b ): la parte extracelular se mueve hacia afuera, inclinando
ligeramente para maximizar el desplazamiento cerca de la superficie de la membrana,
mientras que la parte de membrana se inclina por ~ 2 en el sentido opuesto, en la
misma direccin. Es decir, las dos partes de mueven como cuerpos rgidos,
flexionando sobre su interfaz compartida.
HYPERLINK
Higo.14.
Cambio conformacional conducir la apertura del canal. ( Un ) de la losa que
muestra las espinas dorsales equipado C (negro, cerrado; rojo, abierta) a travs
de los mapas cerradas y densidad de clase abierta en el nivel del sitio de unin a
ACh en alfa gamma . El cierre del bucle C en torno ...
La transposicin dentro del alpha gamma subunidad se describe mejor como un

pequeo reajuste de las lminas interior y exterior que componen el -sandwich, y
puede ser contrastada, por ejemplo, con el ms grande 'clamshell "movimiento de
cierre alrededor del agonista lmite, como ocurre en los receptores de glutamato
(Gouaux, 2004 ). El ncleo -hoja de alfa , de hecho, se vuelve ms similar a los
ncleos de -hoja de las subunidades alfa no como resultado de esta transicin, y todo
el dominio extracelular se hace ms pentagonal simtrica. Por lo tanto, los -lminas
exterior e interior de a deben estar inicialmente en una configuracin o sub-ptima
"deformada", que el reajuste inducida por ACh ayuda a aliviar, lo que aumenta la
afinidad del sitio de unin. La transposicin en alpha delta (y el correspondiente
cambio en la afinidad) es menor que en alfa , pero parece contribuir en empujar
hacia el exterior, utilizando la parte extracelular de para transmitir un pequeo
desplazamiento en el mismo sentido alrededor del anillo.
El movimiento de balanceo coordinado de la subunidad debe ser el medio principal
por el cual el efecto de ACh se acopla la unin a la apertura de la puerta, porque es
la nica subunidad en desplazamientos a juego se encuentran a ambos lados de la
interfaz del dominio. Otras protenas de membrana utilizan un mecanismo similar
para la comunicacin entre los dominios de unin a ligando y de membrana
(Bublitz et al. 2010 ; Locher, 2009 ). Sin embargo mutacin combinada-conelectrofisiologa experimentos han demostrado que los contactos inter-dominio en las
subunidades restantes tambin desempean papeles importantes (Jha et al.2007 ;
Lee et al., 2009 ; Xiu . Et al 2005 ). Lo ms notable es una interaccin entre el -hoja
interna de alfa y el final de los hlice gamma M2 a travs de una cadena lateral de
valina, V46, que se proyecta desde el bucle 1 / 2 apretado ( Fig. 7 una ; Hanek et
al. 2008 ; Lee y seno, 2005 ; Miyazawa et al. 2003 ). Es evidente que es probable que
afecte la flexin de a cualquier desplazamiento de la lmina interior M2, y por lo
tanto la estabilidad de la puerta.
5.5. gating asimtrica por las hlices de membrana

Las hlices de poros que recubre m2 de la alfa , subunidades delta y beta, a travs de
la flexin (alfa , ; Higos 13 C y 13 D ) y la inclinacin (; Fig. 14 b ), llevar a
cabo los cambios ms importantes que crean un abierto poros, mientras que las hlices
de poros forro de alfa delta , y no cambian apreciablemente. Como la fig.
15 muestra los movimientos M2, y el grado de participacin de M1, M3 y M4, son
diferentes con cada subunidad. En el caso de alfa , el enderezamiento de
gamma M2 se produce independientemente de los otros tres hlices, produciendo un
desplazamiento mximo de 1,5 (flecha, Fig. 15 una ) aproximadamente hacia
gamma M3, contrayendo as el espacio intersticial. En el caso de , el
enderezamiento de M2 tambin se produce casi de forma independiente de los otros
tres hlices, pero los desplazamientos son en una direccin entre M1 y M3, es decir,
lejos de alpha M2 (flecha, Fig. 15 b ). Como resultado, una grieta 1-2-Una amplia
(cua azul, la Fig. 15 b ) se crea en entre M2 y alpha delta M2. En el caso de , la
inclinacin de M2 se produce junto con los otros hlices como parte de un dominio
rgido ( Fig. 15 c ). Dado que los movimientos de hlice relevantes no son
equivalentes con relacin al eje de poro (radial para alpha gammaM2 y M2, casi
tangencial para M2; Fig. 15 d ), el poro se vuelve notablemente ms asimtrica en
forma de canal abierto.
HYPERLINK
Higo.15.
La apertura del poro est mediada principalmente por las a , delta y
subunidades . Diferentes movimientos estn involucrados, dependiendo de la
subunidad en cuestin, como se muestra por superposiciones de las cadenas

principales de C instalados en la clase cerrada ...
Es notable que el desplazamiento mximo de gamma M2 es hacia el espacio en el

que, en el receptor ACh nicotnico 7 neuronal, los moduladores alostricos intrasubunidades parecen unirse, mientras que el desplazamiento mximo de M2 es hacia
el espacio donde alostrico inter-subunidad moduladores parecen unirse (flechas, Fig.
9 una ). Las interacciones de los moduladores alostricos con 7, por lo tanto llaman
la atencin sobre la relevancia de los espacios intersticiales para la transmisin
neuromuscular normal, que deben ser para proporcionar espacio para las hlices de
poros de revestimiento se flexionen cuando el canal se abre.
Cmo funciona el cambio conformacional transmite principalmente a travs de la
subunidad llevar a cabo este cambio en la configuracin de hlice alrededor del
poro? Hemos argumentado que las hlices de poros revestimiento de doblado hacia
adentro para formar la puerta hidrfobo, y un tanto separada de la pared de la protena
exterior, se mantienen juntas de forma simtrica por un pequeo nmero de contactos
de lado a lado entre las mismas de aminocidos conservados cadenas laterales , y que
esta organizacin hace que la puerta intrnsecamente inestable, ya que su integridad
dependera de conjuntos iguales de las interacciones entre cada componente del anillo
(Miyazawa et al. 2003 ). Por lo tanto, cuando se introduce una perturbacin, como a
travs de la inclinacin de M2, al menos un conjunto de interacciones se elimina y
todo el conjunto de puerta debe romper. Los desplazamientos no equivalentes del
alpha gamma M2 y M2 hlices a cada lado de M2 ( Fig. 15 d ), se explican
simplemente sobre esta base ya que el espacio intersticial disponible para las hlices
ahora liberados sera diferente, dependiendo de la ubicacin exacta y las
composiciones de las cadenas laterales de las hlices vecinos que forman la pared
exterior.
El argumento de que la integridad de la puerta depende de la igualdad de las
interacciones de lado a lado se apoya en el hecho de que puede ser debilitado por
perturbaciones menores en mltiples formas. Por ejemplo, en estudios de expresin de
ovocitos, la mutacin de la leucina (posicin 9 ') a serina o treonina, en cualquiera de
las subunidades, aumenta la sensibilidad de apertura del canal por aproximadamente
iguales cantidades (Filatov & White, 1995 ; Labarca et al. 1995 ). La mutacin de la
valina (posicin 13 ') a alanina, en cualquiera de las subunidades, da resultados
similares (Moriconi et al. 2010 ). De la misma manera, una pequea molcula que se
une en el espacio intersticial detrs alpha gamma M2 debe ser capaz de abrir el canal
utilizando la contraccin alrededor del ligando unido, en lugar de la inclinacin de
una subunidad, para desestabilizar la puerta. Esto parece ser el mecanismo de la
activacin del receptor nicotnico 7 neuronal por el agonista alostrico, 4BP-TQS
(Gill et al. 2011 ).
Eliminacin de la constriccin hidrfobo central a travs de la flexin y la inclinacin

de las hlices de poros revestimiento transfiere la parte ms estrecha del poro a una
regin cerca de la superficie de la membrana intracelular, donde los residuos polares
que se proyectan hacia adentro (como T244; posicin 2 ') mantendran los iones
solvatada. Aunque el poro se ha ampliado por slo una pequea cantidad en el nivel
de la constriccin (alrededor de 1 , detectada por una esfera), los movimientos de
hlice desiguales habra expuesto grupos polares enterradas en espacios en los que las
hlices han sido separados ( Fig. 15 b ) e hizo habitacin aqu, y en el lumen, para las
molculas de agua adicionales, con lo que perturban fuertemente el carcter hidrfobo
de esta regin. De hecho, la grieta polar abierto por M2 puede tener cierta analoga
con el "carril de gua 'de grupos carbonilo polares expuestos en las acuaporinas, que
permite el transporte de agua a tasas muy altas (~ 3 10 6 molculas ms -1 ) a travs
de una gran parte de lo contrario poro hidrfobo y mucho ms estrecho (~ 3 de
dimetro; Tani et al. 2009 ). Esta analoga, por lo menos, subraya la importancia de la
qumica de la superficie exacta.
Por desgracia, no es posible evaluar cuantitativamente el efecto de estos
desplazamientos de la hlice sobre las tasas de transporte de iones. El cambio en el
poro no se ha resuelto en detalle atmico, y puede incurrir en cambios adicionales en
la conformacin de la cadena lateral. Limitaciones experimentales - la imposibilidad
de grabar imgenes en las que todos los canales estn abiertos - pueden significar que
los movimientos de compuerta indican en la figura.15 han sido subestimado
ligeramente. Sin embargo, dado que el lumen del poro cerrado en la puerta ya es
bastante amplia (ver Fig. 11 d ), la pequeez del cambio no debera ser
sorprendente. Es totalmente compatible con simulaciones de dinmica molecular de
compuerta hidrfoba (Beckstein y Sansom, 2004 , 2006 ), lo que indica que slo los
reajustes menores son suficientes para lograr el flujo total de iones hidratados.
5.6. mecanismo alostrico

Estos experimentos de cristalografa de electrones en el Torpedo ayuda del receptor
para definir el mecanismo estructural que subyace en el evento de activacin en la
sinapsis. A medida que se muestran, la apertura del canal se lleva a cabo por un
cambio conformacional concertado, que incluya una serie de movimientos
interdependientes pequeos. Los cinco subunidades participan, pero tres de ellos
(alfa gamma , y ) desempean un papel dominante. Al centrarse en slo estos tres
subunidades, el cambio conformacional se puede simplificar en sus elementos
principales. Estos se representan en la Fig.16 una . La molcula de la acetilcolina,
en la coordinacin con los residuos de la alfa gamma unin a sitio, seala a la C-bucle
hacia el interior (flecha roja). La rotacin del bucle C trae la -hoja exterior con ella, y
la lmina interior reajusta moviendo en la direccin de la subunidad (flecha
verde). La subunidad es empujado de ese modo hacia el exterior, y se desplaza por
el desplazamiento de su parte extracelular y la inclinacin de su parte de membrana
(flecha amarilla). La inclinacin de la parte de la membrana de altera la puerta,

liberando las hlices de poros de revestimiento, que en consecuencia enderezan.
HYPERLINK
Higo.diecisis.
Mecanismo de conmutacin entre los estados cerrado y abierto. ( Un ) ACh al
entrar en los dos sitios de unin induce un cambio conformacional concertada, en
el que las a , y subunidades delta, que se muestran aqu, desempean los
papeles principales. La ...
Figura 16 b compara el alpha gamma configuraciones hlice M2 y M2 antes y

despus del cambio de conformacin (abierto) (cerrado) para ilustrar cmo el
enderezamiento de estas hlices aumenta el dimetro (y polaridad) del poro en la
regin de la puerta. Una vez que se ha producido de enderezamiento, la zona de la
puerta deja de funcionar como una barrera de permeacin y los iones pasan fcilmente
a travs de.
Pequeos cambios en la simetra acompaan este cambio conformacional, que se
ampla la informacin sobre el mecanismo alostrico. Como se mencion
anteriormente, el embalaje de -hoja se vuelve ms regular cuando el canal est
abierto, el fortalecimiento de la simetra quntuple del dominio extracelular. Por el
contrario, las hlices de poros revestimiento organizan menos simtricamente cuando
el canal est abierto. La simetra inicial ms dbil del dominio extracelular se puede
explicar suponiendo que las disposiciones -hoja en dos subunidades alfa
(principalmente gamma ) se distorsiona 'por sus interacciones con las subunidades
vecinas. Coordinacin de ACh con aminocidos en las bolsas de enlace a
continuacin (parcialmente) supera estas distorsiones. Esto permite un rgimen ms
ptimo de sus hojas beta, como los de las subunidades no alfa relativamente estables y
rgidas - promoviendo as el embalaje ms simtrica. La reduccin de la simetra
alrededor del poro se puede explicar suponiendo las hlices de poros de revestimiento
doblado se 'distorsionadas' por las interacciones iguales de lado a lado necesarios para
formar la puerta - interacciones, que se eliminan cuando el canal se abre.
La estructura del canal cerrado, por tanto, parece estar perturbado en ambos dominios
de una manera que no ocurrira si las interacciones entre subunidades vecinos no
estaban presentes. Dado que la unin de ACh acta para reducir estas perturbaciones
en ambos dominios, cambia toda la estructura de una 'tensa' hacia un estado ms
"relajado". Por tanto, un paralelo puede ser trazada entre el receptor de la acetilcolina
y complejos de protenas solubles o enzimas reguladoras que tienen propiedades

similares alostricos (Monod et al. 1965). Un ejemplo bien estudiado es la
hemoglobina, lo que convierte a partir de un estado de tensin baja afinidad a una alta
afinidad estado relajado cuando se une al oxgeno (Perutz, 1989 ). La forma de canal
cerrado del receptor sera equivalente a la baja afinidad estado de tensin de la
hemoglobina, y la forma de canal abierto sera ms o menos equivalente a la alta
afinidad estado relajado de la hemoglobina (aunque la forma desensibilizado es
probablemente el ms equivalente).
Uno esperara que el cambio de un estado de tensin de baja afinidad a una mayor
afinidad, estado ms relajado que la base del proceso de gating en otros miembros de
la superfamilia de receptores Cys-loop, debido a su diseo molecular compartido, lo
que implica la conservacin de la funcin. Conservacin funcional se ha demostrado
de forma convincente por la creacin de los receptores quimricos que combinan
regiones distintas de los diferentes miembros de la superfamilia de construir nuevos
receptores que tienen las propiedades funcionales de ambos (Eisel et al. 1993 ;
Grutter et al. 2005 ). Por otro lado, aspectos menos bsicos del mecanismo, tales
como el grado y la naturaleza de la participacin de cada subunidad, ciertamente
deben diferir de un miembro de la superfamilia a la siguiente. En el caso de canales
homomeric, la existencia de un estado cerrado tensa implica un cierto grado de
desviacin de la simetra de cinco veces, ya que una disposicin de -hoja perturbado
no se distribuye por igual entre las subunidades. Hasta ahora, slo simtrica 'cerrado
estatales pentmeros procariotas han sido estudiados por los rayos X (Hilf y
Dutzler,2008 ; Prevost et al. 2012 ), pero hasta qu punto las estructuras cristalinas de
estas protenas representan la forma unida a membrana fisiolgica queda verse
(Gonzlez-Gutirrez y Grosman, 2010 ; Gonzlez-Gutirrezet al. 2012 ; Zimmermann
y Dutzler, 2011 ). El requisito de cristales bien de difraccin, y las interacciones de
detergente con la puerta, puede hacer que las estructuras de rayos X del estado
genuino cerrada (o de reposo) difcil de lograr.
Otro proceso que puede ser implementado ampliamente es la inclinacin o
basculacin alrededor del interfaz de dominio de membrana extracelular ( Fig. 14 b ),
para comunicar el efecto de la unin del ligando a la puerta. Como se describe aqu,
ACh de unin a alfa conduce un reordenamiento del par de lminas beta, una accin
que empuja la parte extracelular de hacia afuera y est alojado por la inclinacin de
su parte de membrana. Sin embargo, alternativamente, la transposicin puede ser visto
como el cambio de la forma de la parte extracelular de la alpha gamma subunidad,
produciendo una pequea expansin circunferencial (esbozado en la Fig. 14 una ,
derecha). Es de suponer que en otros miembros de la superfamilia expansiones
similares ocurren cuando el ligando se une, y estos tambin debe ser acomodado de
alguna manera en el dominio de membrana. Una accin de inclinacin se ve
favorecida por otras posibilidades porque las hlices de membrana embalan solamente
juntas firmemente en la superficie de la membrana intracelular, donde la perturbacin
resultante sera menos. Si la inclinacin es por medio de un socio (equivalente a la

subunidad ) o distribuida entre varias subunidades, o por la subunidad de unin a
ligando solo, dicha accin podra ser suficiente para desestabilizar una puerta que
tiene las propiedades descritas en la Seccin 4.4 .
Finalmente, estos estudios estructurales de Torpedo membranas postsinpticas nos
han demostrado que el receptor ACh est diseado para lograr su accin gating rpida
a travs de pequeos movimientos concertados de las subunidades. Dada la
conservacin funcional, se demuestra en los estudios que utilizan receptores
quimricos, otros miembros de la superfamilia de Cys-loop debe trabajar por medio
de pequeos movimientos concertados similares. En otras palabras, la compuerta est
invariablemente logra por medio de pequeos desplazamientos alrededor del
poro. Desde gating hidrfobo requiere la menor desplazamientos para convertir un
poro cerrado en uno que est completamente abierta, parece probable que las puertas
del tipo de los utilizados por el receptor ACh sern un comn, si no un tema universal
entre los miembros de esta superfamilia de canales de iones.
Ir:
6. Conclusiones
El receptor de la acetilcolina en la unin neuromuscular se ha investigado
intensamente durante las ltimas dcadas por una amplia gama de enfoques
experimentales. Recientemente, el conocimiento derivado de estructuras de rayos X
de protenas relacionadas, y los estudios de mutagnesis que combinan con las
mediciones de la funcin del receptor han dado algunos nuevos e importantes
conocimientos. La microscopa electrnica ha complementado estos enfoques,
proporcionando una imagen estructural directa de la protena que funciona en su
entorno de membrana natural. Juntos, los investigadores han dado lugar a una amplia
comprensin de este canal inico regulado por ligando modelo, y definido algunos
principios fundamentales por los que se transduce una seal qumica en una seal
elctrica con tan alta eficiencia y velocidad.
Los experimentos sobre Torpedo membranas, resaltados en esta revisin, muestran
que el cambio conformacional para abrir el canal se lleva a cabo por medio de
pequeos movimientos concertados de las subunidades. Los desplazamientos que
unen los sitios de unin en el dominio extracelular de la puerta en el dominio de
membrana son demasiado pequeos como para requerir reajuste significativo de
enlaces no covalentes, que pueden ralentizar un cambio conformacional. Toda la
transicin puede ser explicado en trminos de un mecanismo alostrico en el que la
unin de ACh alivia estructuras de tensin pre-existentes en ambos dominios.
En la membrana, las hlices de poros que recubre tienen alternativa "cerrado" y
"abierto" configuraciones de aproximadamente la misma estabilidad, permitiendo que
los movimientos controlados asociados con el cambio conformacional simplemente
para inclinar la balanza de la una a la otra. En la configuracin cerrada, las hlices de

poros que recubre doblada hacia adentro haciendo una faja hidrfobo
constriccin. Esta faja se forma una barrera de energa a la permeacin de iones a
travs de la membrana, y as funciona como la puerta del canal. La puerta se
desestabiliza por el cambio conformacional, y el enderezamiento de la hlice hace que
el poro ms amplio y ms polar, lo que permite que los iones pasan fcilmente a
travs.
El mecanismo bsico alostrica, los medios de comunicacin entre los sitios de unin
y la puerta, y gating hidrfobo son propiedades del receptor ACh que pueden ser
compartidos por otros miembros de la Cys-loop superfamilia de canales de iones.

Receptor de Acetilcolina Nicotínico y La Base Estr

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Receptor de acetilcolina

ayudando a proporcionar una comprensin cada vez ms profunda de la protena

2. Un modelo de canal de iones transmisorcerrada

Los registros electrofisiolgicos a nivel de un solo canal han arrojado informacin

3. Torpedo membrana postsinptica

1 una ). Las partculas de congelacin-fractura tenan una apariencia similar a las

Una mayor comprensin de la organizacin sinptica de los receptores de vino de

3.2. Los primeros estudios estructurales de lminas y

3.3. Los anlisis de los tubos aplanados

perfectamente plana y por el rango restringido de puntos de vista de

3.4. familias helicoidales

Imgenes electrnicas de los tubos de ACh-receptores en hielo amorfo, que

Una propiedad fundamental de una hlice es que presenta un conjunto completo de

Tubos de ACh-receptor forman muchas diferentes familias helicoidales, teniendo cada

3.5. reconstruccin de la imagen a partir de tubos bien

3.6. La correccin de las distorsiones de imagen

desplazamientos causados por las distorsiones dentro del segmento se

La difraccin limitada de los tubos de ACh-receptor se puede entender fcilmente,

3.7. Microscopa a temperaturas de helio lquido

3.8. Refinada estructura de 4

los cinco cadenas de polipptidos a travs de las densidades de 3D en el dominio que

4. Modelo atmico del canal cerrado

Las subunidades individuales ordenar lado a lado en un anillo, formando un conjunto

triptfano de la cadena lateral y el nitrgeno cuaternario catinico del ligando

La conformacin AChBP en Fig.8 se piensa para asemejarse a la completamente

4.3. Que atraviesa la membrana de poro

4.4. puerta hidrfobo

4.5. interacciones receptor-receptor

4.6. La comparacin con protenas relacionadas

5. Transicin para abrir canales

La microscopa electrnica de los tubos, en principio, proporciona una manera ideal

5.2. experimentos de pulverizacin por congelacin de

5.3. cambios en el sitio de unin de la firma y la

Otra firma definicin de un canal abierto es un aumento en las dimensiones de los

5.4. cambio conformacional apertura del canal de

rosa, Fig. 14 una ) y inclinndolo ligeramente en una perpendicular direccin. Para

La transposicin dentro del alpha gamma subunidad se describe mejor como un

5.5. gating asimtrica por las hlices de membrana

subunidad en cuestin, como se muestra por superposiciones de las cadenas

Es notable que el desplazamiento mximo de gamma M2 es hacia el espacio en el

Eliminacin de la constriccin hidrfobo central a travs de la flexin y la inclinacin

5.6. mecanismo alostrico

(flecha amarilla). La inclinacin de la parte de la membrana de altera la puerta,

Figura 16 b compara el alpha gamma configuraciones hlice M2 y M2 antes y

y complejos de protenas solubles o enzimas reguladoras que tienen propiedades

resultante sera menos. Si la inclinacin es por medio de un socio (equivalente a la

para inclinar la balanza de la una a la otra. En la configuracin cerrada, las hlices de

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