OBJETIVO:

1) Identificar la naturaleza proteica de la enzima (presencia de enlaces

peptdicos).
2) Estudiar la actividad enzimtica en diferentes condiciones.

FUNDAMENTO TERICO:
Proteinas: Las proteinas son sustancias macromoleculares presentes en todas
las celulas vivas. Cualquiera que sea su funcin, todas las proteinas son
quimicamente similares, estan compuestas por las mismas unidades basicas
estructurales, llamadas aminocidos. Practicamente todos los procesos
biolgicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de molculas.
Alrededor de 50 % del peso seco del cuerpo humano se compone de protenas
algunas de esta protenas catalizan reacciones, transporta oxgeno, sigue como
hormonas reguladoras procesos corporales especificos y llevan a cabo otro
procesos quimicos.
Enzima: Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que catalizan
reacciones qumicas, siempre que sean termodinmicamente posibles: una
enzima hace que una reaccin qumica que es energticamente posible, pero
que trancurre a una velocidad muy baja, sea energticamente favorable, es
decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima.
Urea: La urea es un compuesto qumico cristalino e incoloro, de frmula
CO(NH2)2. Se encuentra abundantemente en la orina y en la materia fecal. Es
el principal producto terminal del metabolismo de las protenas en el humano y
en los dems mamferos. La urea es hidrolizada enzimticamente a dixido de
carbono y amonaco por la enzima ureasa.

Ureasa: La ureasa es una enzima muy especfica, que existe en varios tipos de
vegetales, por ejemplo, el frijol de soya. Se utiliza mucho como agente catlico
para la medicion cuantitativa de la urea. Tiene un peso molecular de 483.000

dalton y consta de 6 subunidades estructurales iguales. Esta enzima ha tenido

mas importancia en el desarrollo de la enzimologa moderna que ninguna otra.
La ureasa posee 3 o 4 grupos activos, es una representante de un gran nmero
de enzimas cuya actividad depende de la existencia de grupos SH, inactivos,
procedentes de cistena que forman parte de la cadena polipeptdica de la
enzima.
Enlaces peptdicos: Los aminocidos se unen covalentemente formando un
enlace amida entre los grupos -amino y -carboxilo. Y los productos que se
obtienen que se forman a partir de esta unin se llaman pptidos. El enlace
peptdico implica la perdida de una molecula de agua y la formacin de un
enlace covalente CO-NH.
Reactivo de Biuret: Esta reaccin se manifiesta por el desarrolla de una
coloracin carcterstica cuando se aade una gota de una solucin de sulfato
de cobre(II) a una solucin alcalina de una protena. Esta coloracin vara en
una gama de azul al violeta, del cual las protenasgeneran una reaccin que
coincibe una coloracin violcea o violeta amatista, y sus productos de
hidrlisis dan coloracin que varan del violeta al rosa, segn sea el grado de
hidrlisis alcanzados, esto se debe a la presencia de enlaces peptdicos que se
destruye al liberarse los aminocidos. El cobre en un medio fuertemente
alcalino, se une con los enlaces peptdicos formando un complejo de color
violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de ka concentracin de
protenas. Teniendo en cuenta de esta forma que los polipptidos de menos
peso molecular generaran pequeos coloraciones en la gama de azules
purpreos por contener pocos enlaces peptdicos que reacciones y los
aminocidos generan una coloracin azul o azul cielo, designada como
pruebas negativas (no contienen enlaces pptidicos)
Azul de bromotimol: Es un compuesto qumico derivado del trifenilmetano. Se
utiliza para detectar el PH en zonas prximas a la neutra, PH=7, porque tiene
un intervalo de viraje del amarillo al azul entre valores 6.0 y 7.6,
aproximadamente. A pesar de su nombre, el azul de bromotimol puede adoptar
diferentes colores. Amarillo o fuccia( sobre solucin cida) y verde o azul( en
solucin bsica)

Tiourea: Es un compuesto organico. Es estructuralmente similar a la urea

escepto que el tomo de oxgeno se sustituye por un tomo de azufre, pero las
propiedades de la urea y la tiourea difieren significativamente.

MATERIALES:
Materiales para la extraccin de la ureasa:

1 matraz aforado (250ml)

Papel de filtro
Embudo
Balanza
Harina de soja (15g)
Glicerina (100 mL al 75%)
Agua destilada
Vaso de bohemia
Probeta

Materiales para la actividad prctica:

1 gradilla para tubos de ensayo

1 pinza para tubos de ensayo
8 tubos de ensayo
6 pipetas graduadas
1 mechero
1 vaso de bohemia
1 probeta
4 cuenta gotas
Encendedor o fsforos
Solucin de ureasa
Reactivo indicador de PH: Azul de bromotimol
Agua destilada
Soluciones acuosas de: urea 1%
tiourea 1%
Sulfato de cobre (II) 0,1 M
Hidrxido de sodio 10%

PROCEDIMIENTO:
PROCEDIMIENTO DE EXTRACCION DE LA UREASA:
-Pesar 15g de harina de soja y colocarla en un matraz aforado de 250 ml
-Agregar 100ml de glicerina al 75%, tapar el matraz y agitar durante 15 minutos.
-Colocar en el refrigerador durante 24 horas.
-Filtrar el extracto glicerinado.
-Medir 7ml de extracto y diluir a 100ml con agua destilada.

Procedimiento de la actividad prctica:

Tomar 5 tubos de ensayo, numerarlos y colocar en cada uno, 2ml de solucin
de ureasa, excepto al tubo N2 que se le colocar 1 ml.
A) NATURALEZA PROTEICA: ensayo de biuret.
1: Al tubo N1, agregar 4 gotas de solucin acuosa de hidrxido de sodio
al 10% y solucin acuosa de sulfato de cobre (II) 0,1 M. Agitar y
observar.
2: Realizar un ensayo en blanco colocando en otro tubo 20 gotas de
solucin acuosa de hidrxido de sodio al 10% y 20 gotas de solucin
acuosa de sulfato de cobre (II) 0,1 M. Agitar y observar.
3: Comparar y registrar las observaciones.
B) 1: ACTIVIDAD ENZIMTICA.
1: Agregar al tubo N2, 0,5 ml de solucin acuosa de urea.
2: Al tubo N3, agregar 1 ml de agua destilada.
3: Luego de 5 minutos adicionar al tubo N2, 2 gotas de reactivo
indicador de PH: azul de bromotimol. Agitar, observar y registrar lo
observado.
4: Al tubo N3 (que contiene la solucin de ureasa y agua destilada),
adicionar 2 gotas de reactivo indicador: azul de bromotimol. Agitar y
observar.
B) 2: EFECTO DE LA TEMPERATURA.
1: Calentar el contenido del tubo N4 hasta la ebullicin.
2: Adicionar 1 ml de solucin acuosa de urea, agitar.

3: Luego de 5 minutos, agregar 2 gotas de indicador de PH: azul de

bromotimol. Agitar y registrar lo observado.
C) ESPECIFICIDAD ENZIMTICA.
1: Agregar al tubo N5, 1 ml de solucin acuosa de tiourea, agitar.
2: Luego de 5 minutos, adicionar 2 gotas de azul de bromotimol. Agitar,
observar y registrar lo observado.

REGISTRO Y TRATAMIENTO DE DATOS:

CUADRO:
TUBO N:

CONTENIDO:

1
ENSAYO EN BLANCO
2

Ureasa+Biuret
Biuret
Ureasa+Urea+Azul de

bromotimol
Ureasa+Agua destilada+Azul

de bromotimol
Ureasa+Urea+Azul de

bromotimol
Ureasa+Tiourea+Azul de
bromotimol

OBSERVACIONES: