Integrones.

Nueva causa de resistencia a antibiticos.

La transmisin de genes que confieren resistencia a determinados antibiticos
entre diferentes especies bacterianas, especialmente en enterobacterias, es un
problema siempre creciente en el mbito de las enfermedades infecciosas, y
ms an si nos referimos a infecciones nosocomiales. Muchos genes de
resistencia se localizan en plsmidos y/o transposones, de forma que se
pueden transferir fcilmente entre diferentes cepas y especies de bacterias.
Recientemente se ha descrito otro mecanismo mediante el que estos genes
pueden ser transmitidos. En este caso participan en el proceso unas piezas de
material gentico denominadas integrones.
Los integrones tienen la informacin gentica necesaria para expresar una
protena implicada en la captura y liberacin de ciertos elementos mviles IS
(inserted sequences), en los que se incluyen los genes de resistencia a
antibiticos. El proceso de integracin de estos elementos se realiza mediante
una recombinacin gentica especfica de sitio. Adems, los integrones tienen
en su estructura al menos un promotor (P1) que permite la expresin de los
genes insertados en su interior. En algunas ocasiones se puede encontrar un
segundo promotor, en una zona cercana al primero, que incrementa el grado de
transcripcin y expresin de los genes.
ESTRUCTURA DEL INTEGRN
Los integrones estn constituidos por dos regiones de DNA muy conservadas,
situadas en sus extremos, que se denominan 5 CS y 3 CS (5 y 3 conserved
segments). Entre estas dos zonas se pueden insertar uno o ms genes de
resistencia a antibiticos (Fig. 1). stos pueden ser muy variados y causar
resistencia por diferentes mecanismos, como en el caso de los genes de
resistencia a los aminoglucsidos, que son los ms abundantes y da los que se
han identificado tres familias diferentes, subdivididas a su vez en varios grupos.
Cada uno de los genes de estas familias codifica para una protena diferente
(acetiltransferasas, nucleotidiltransferasas o fosfotransferasas). En el interior
del integrn tambin se han encontrado genes de resistencia a trimetoprima,
cloranfenicol y betalactmicos. Hasta el momento se han identificado ms de
40 genes de resistencia que pueden incluirse en la estructura del integrn.
Adems existen fragmentos de lectura abierta (orf) cuya funcin no se conoce
todava y que tambin pueden representar genes de resistencia a otras clases
de antibiticos.
EXTREMO 5 CS
Este segmento de DNA tiene una longitud de 1,36 kb (1, 2). Se caracteriza
porque cuenta con un promotor, un gen int, que codifica para una integrasa o
recombinasa encargada de catalizar una recombinacin gentica especfica de
sitio, y una zona attI que es uno de los lugares donde se insertan las IS.
En la hebra de DNA complementaria a la que codifica para la integrasa (y su
promotor) se incluye al menos un promotor, necesario para que se expresen los

genes de resistencia insertados entre las secuencias 3 y 5 CS, ya que la

mayora de estos genes no cuentan con sus propios promotores (3). En
algunas ocasiones se observa en unin con este primer promotor (y nunca de
forma aislada) un segundo promotor (4, 5), formado por la insercin de 3
residuos de G entre las secuencias -10 y -35 (6). De esta forma, mediante la
accin de este segundo promotor, se puede incrementar la transcripcin de los
genes de las IS.
En el extremo 3 de la regin 5 CS se encuentra una zona receptora (attI),
donde pueden insertarse las IS. Tanto esta reaccin de insercin como la de
escisin estn mediadas por la IntI (7, 8).
Los nuevos genes pueden provenir tanto de otros integrones que perdern el
gen (9, 10) como de genes circulares aislados que se han separado
previamente de un integrn (9). En cualquier caso, si la expresin del nuevo
gen supone un beneficio para la bacteria, debido a que sta se encuentra en un
ambiente donde exista un determinado antibitico frente al que el gen en
cuestin confiere resistencia, la bacteria dispondr de una ventaja selectiva que
le permitir desplazar a las dems.
EXTREMO 3 CS
El extremo 3 CS tiene una longitud de al menos 2 kb (1, 2) y la secuencia de
esta zona se halla menos conservada entre los distintos integrones que la de la
zona 5 CS. En este segmento se incluyen unos genes que dotan a la bacteria
de resistencia a distintos compuestos, no slo antibiticos. El gen qacEA1 es
un determinante de resistencia a compuestos cuaternarios de amonio (11),
como determinados antispticos y desinfectantes. El gen sulI determina
resistencia a las sulfonamidas. Despus de stos, se inserta un fragmento de
lectura abierta (orf 5) cuya funcin se desconoce hasta el momento.
En algunos ocasiones se han detectado integrones que carecen de los genes
qacEA1 y sulI en este extremo 3 CS. Varios autores han sugerido que podra
tratarse de un integrn primitivo, a partir del cual han evolucionado los actuales,
en los que dichos genes se insertaron y conservaron (12), probablemente por
la ventaja selectiva que supone la expresin de estos genes frente al masivo
uso clnico de compuestos tales como cloruro de benzalconio, acriflavina, etc.
(13).
Estructura
La

gentica
actividad

de

un

integrn

requiere:

Gen intI: Codifica una protena con actividad recombinasa especfica de

sitio (intL), la integrasa.

Sitio attI: Adyacente al intI, es el sitio de recombinacin especfica de

sitio, en el que se integra el casete gentico de resistencia.

La enzima integrasa media la recombinacin entre un sitio de recombinacin

primaria (atLI) y una secuencia blanco denominada sitio attC (o elemento
59pb).
Entre intiI y attI se
encuentran
dos
promotores
divergentes:
P1, promotor para la expresin de los casetes genticos (dirige la transcripcin
de los casetes integrados). Hasta el momento no se han encontrado casetes
con
promotores
propios.
Casetes

genticos

Son crculos covalentemente cerrados independientes, no replicativos, que

contienen slo un marco de lectura abierta completo orf o gen de resistencia. a
continuacin del orf, se encuentra un sitio de recombinacin especfica, el
elemento 59 pb, localizado en el extremo 3del gen. Los casetes genticos no
codifican enzimas u otros productos involucrados en su propia movilizacin.
La transcripcin de los casetes integrados, attC o 59 pb, se lleva a cabo desde
un promotor localizado en 5CS. Pequeas variaciones nucleotdicas en ste
afectan la fuerza de transcripcin del promotor, llegando a niveles tan bajos de
expresin que la bacteria aparece fenotpicamente sensible, aunque es, en
potencia, resistente por la presencia del gen que codifica resistencia.
Los integrones han sido detectados en bacilos gramnegativos fermentadores,
como
las
pseudomonas
y
acinetobacterias.
Tambin se han descrito en grampositivos e incluso en Mycobacterium fortuim.
El nivel de resistencia a un determinado antibitico, codificado por un casete de
resistencia,
depende
de
la
posicin
en
el
integrn.
Un integrn funcional "plataforma" requiere 2:

Una integrasa: Inti, una recombinasa tirosina responsables para su

incorporacin en el genoma

Un sitio de recombinacin proximal: Atti, que acta como el lugar de

reincorporacin al genoma. Se combina con un sitio attC en el sitio de
insercin.
Los integrones estan constituidos por dos regiones DNA situados en los
extremos 5'CS y 3'CS (sedmentos conservados) en los que se pueden insertar
varios genes de resistencia a los antibioticos que a modo de caja vacia los
recibe. Tiene en su esctructura promotores (P) de genes de la resistencia.
Se ha comprobado la transferencia de IS entre diferentes cepas y especies de
enterobacterias, pseudomonas, etc. Muchos genes de resistencia se localizan
en PLASMIDOS, TRANSPOSONES E INTEGRONES.
SECUENCIAS INSERTADAS
Las secuencias que pueden insertarse entre los extremos 5 y 3 CS son unos
pequeos trozos de DNA, de unos pocos cientos de bases, que contienen un

gen de resistencia para un antimicrobiano. Estos elementos tienen en su

extremo final (3) una secuencia de 59 pares de bases. Esta secuencia es
variable tanto en la composicin de sus bases como en longitud (3), aunque
como consenso se toma 59 pb, ya que primero fue descubierta e interpretada
como una secuencia de 59 pb imperfectamente repetidas (14). A travs de
estas zonas se va a producir la insercin y escisin de las IS, mediante una
recombinacin gentica especfica de sitio catalizada por la integrasa y en la
que participan, adems, la zona attI, o bien otro elemento de 59 pb de otra IS.
En este proceso est implicado de forma ms activa un triplete GTT (1, 9, 15,
16) incluido en una regin de 7 bases, tambin denominada "core". El core es
una pequea secuencia muy conservada entre los diferentes elementos de 59
pb, que se repite al principio de las IS y al final, en la zona de 59 pb.
Normalmente estas IS no incluyen en su estructura promotores y se transcriben
a partir de los promotores existentes en la regin 5 CS. Para ello es necesario
que estas IS se inserten siempre en la misma direccin. Se supone que las
secuencias de 59 pb, implicadas en las inserciones de los genes en el interior
del integrn, son las que dotan a la insercin de una direccionalidad. De de
esta forma, varios de estos IS insertados uno detrs de otro pueden ser ledos
a partir de los promotores comunes. En este sentido, y dado que puede haber
insertados ms de un gen de resistencia, cabe destacar que los genes situados
en una zona ms distal de los promotores tienen una expresin ms baja que
los situados al principio. Algunos autores proponen que esto se debe a la
labilidad de los RNAm, aunque se sospecha que existen unas secuencias
terminadoras de la transcripcin, no muy eficaces (ya que la transcripcin
contina, aunque en menor grado segn nos alejamos del promotor), en la
zona de 59 pb (4). De esta forma, a partir del primer gen se va perdiendo
eficacia en la transcripcin y expresin de los genes de resistencia.
Las nuevas IS que se inserten pueden ser incluidas tanto en la zona attI como
en zonas ms distales respecto de los promotores en el caso de que se
produzcan recombinaciones entre dos elementos de 59 pb. En este sentido se
ha demostrado que es ms probable que se produzcan recombinaciones entre
un elemento de 59 pb y la zona attI (15) que entre dos elementos de 59 pb. De
esta forma, el gen que se inserta el ltimo cronolgicamente ocupar la primera
posicin, la ms cercana a los promotores, y sera el ms eficazmente
transcrito. Estas caractersticas de las IS hacen posible que, cuando el
ambiente de una bacteria cambia (debido a la presencia de antibiticos en el
medio), uno de los genes que se expresa poco (lejano respecto al promotor)
pueda ser intercambiado de posicin pasando a posiciones ms activas. En
otros casos puede producirse una recombinacin con otro integrn de similares
caractersticas, que "done" uno de los genes que se integre en la primera
posicin, duplicndose por tanto en la bacteria receptora el gen integrado. En
este caso se ha comprobado que existen integrones con ms de una copia de
iguales genes de resistencia, lo que aumenta el producto de la expresin de
estos genes y, por tanto, la resistencia de las bacterias que los posean (1).
Este gran nmero de posibilidades de recombinacin e intercambio que poseen
los integrones y los genes de resistencia proporciona a las bacterias que los
incluyan en su estructura una gran versatilidad para hacer frente a los

antibiticos, determinando en algunos casos la eficacia de stos (17), ya que

las bacterias pueden cambiar la posicin y la expresin de sus genes en
funcin de la presin ambiental provocada por los antimicrobianos.
Por otra parte, aunque es un fenmeno no comprobado, se supone que los
integrones completos pueden intercambiarse entre diferentes especies y cepas
bacterianas, sin que ello suponga la transferencia total del plsmido o el
transposn donde estuviera incluido el integrn. Para apoyar esta teora se
estn estudiando integrones de similares caractersticas y con las mismas IS
en su interior, rodeados de diferentes secuencias exteriores. Esta transferencia
de integrones completos ampla an ms las posibilidades de diseminacin y
transferencia de los genes de resistencia entre diferentes bacterias.
TIPOS DE INTEGRONES
Los integrones a que se ha hecho referencia son los ms estudiados, ya que
son los que ms se presentan en los aislamientos clnicos y pertenecen todos a
una misma familia caracterizada porque el gen intI codifica para una integrasa
de tipo I. Los pertenecientes a una subclase de stos, con el mismo gen de la
integrasa e iguales caractersticas de la regin 5 CS, son los que carecen de
los genes qacEAI y sulI en el extremo 3 CS. Existe, sin embargo, otra clase de
integrones menos estudiados y caracterizados porque el gen int codifica para
una integrasa diferente (intI 2). La secuencia de este gen comparte un 40% de
similitud con el gen intI (18). Este tipo de integrasa 2 slo se ha encontrado en
el interior del transposn Tn7 y otros semejantes. Recientemente se ha
detectado una tercera clase de integrn (19) cuya integrasa (intI 3) es similar
en un 61% al gen de la integrasa de tipo I
TRANSPOSOMAS O TRANSPOSONES
En los aos 50 se descubri una propiedad espantosa de las bacterias
patgenas, esto ocurri en los hospitales japoneses, al darse cuenta que en
pacientes con disentera bacteriana, causada por el gnero Shigella, resultaban
ser resistentes a muchas drogas, incluyendo la penicilina, tetraciclina, la
sulfalalamida, la estreptomicina y el clorafenicol. Este fenotipo de resistencia
mltiple se heredaba como un paquete gentico nico, y poda ser transmitido
de manera infecciosa, no solo a otras cepas de shigella sensibles, sino tambin
a
otras
especies
relacionadas.
Estos elementos saltarines, pueden moverse desde una localizacin a otra en
el
genoma.
Definicin
Un transposn es una secuencia de ADN que puede moverse
autosuficientemente a diferentes partes del genoma de una celula, un
fenmeno conocido como transposicion (pueden "saltar" de un plsmido a otro,
de un plsmido al cromosoma bacteriano y viceversa ). Al conducirse de esta
manera, los transposones crean mutaciones por inserciones y cambio en la
cantidad de ADN del genoma.La importancia de los transposones residen en
que algunos codifican factores de virulencia y resistencia a antimicrobianos,
ademas tienen importancia en la mutagnesis, pues al insertarse dentro de un

gen, lo inactivan, es decir interrumpen la continuidad del cdigo gentico y a

diferencia de los plsmidos y bacterifagos, no poseen la informacin gentica
necesaria
para
su
propia
replicacin.
Se pueden distinguir tres tipos principales de elementos transponibles basados
en el mecanismo de transposicin:
1.

Elementos de Clase I o retrotransposones : Se mueven en el genoma

siendo transcritos a ARN y despus en ADN por retrotranscriptasa

2.

Elementos de clase II o DNA transposones: Se mueven directamente

de una posicin a otra en el genoma usando una transcriptasa para copiar y
pegarse en otro locus del mismo
3.
Clase III: Son minitransposones que se comportan como elementos
mviles. Un ejemplo de este tipo son los elementos conocidos con las siglas
MITE
"Miniature
Inverted-repeats
Transposable
Elements"
Los transposones pueden moverse por el genoma gracias a la accin de la
enzima transposasa. Los transposones que codifican una enzima transposasa
en su propia secuencia se conocen como elementos autnomos frente a
aquellos que no la incluyen que se conocen como elementos no autnomos.
El transposn modifica el ADN de sus inmediaciones, ya sea arrastrando un
gen codificador de un cromosoma a otro, rompindolo por la mitad o haciendo
que desaparezca del todo. En algunas especies, la mayor parte del (hasta un
50%
del
total
del
genoma)
corresponde
a
transposones.
Los transposones pueden servir de sustrato para los sistemas celulares de
recombinacin, funcionando como " regiones porttiles de hemologa " ; Dos
copias de un transposn ubicados en sitios diferentes pueden proporcionar
sustratos para la recombinacin reciproca. Estos intercambios pueden originar
deleciones,
inserciones,
inversiones
o
translocaciones.
A diferencia de los provirus, los transposones integran en el ADN celular en
lugares bien determinados y tambin pueden integrarse en el ADN plasmdico.
Los transposones no pueden replicarse independientemente. La replicacin
solamente tiene lugar durante el proceso replicativo de un cromosoma
bacteriano o del plsmido en el que estn insertados,pueden realizar la
transferencia de material gnico de un plsmido a otro, o de ADN cromosomico
a un plsmido, de un plsmido a un bacterifago, etc y esta transferencia de la
informacin gnica recibe el nombre de transposicin. Se ha comprobado que
algunos transposones pueden pasar del cromosoma de una bacteria a otra, sin
ir vinculados por un bacterufago o plsmido. Este tipo de transposones se han
descrito en bacterias Grampositivas y se les llama transposones conjugados.
Elementos genticos transponibles
Los elementos genticos transponibles, son secuencias de ADN que tienen la
propiedad de cambiar de posicin dentro del genoma, por tal causa, tambin
reciben el nombre de elementos genticos mviles. Por tanto, cuando cambian
de posicin y abandonan el lugar en el que estaban, en ese sitio, se produce un
delecin o prdida de bases. Si el elemento transponible estaba insertado en el
interior de un gen, puede que se recupere la funcin de dicho gen. De igual

forma, si el elemento gentico mvil al cambiar de posicin se inserta dentro de

un gen, se produce una adicin de una gran cantidad de nucletidos que tendr
como consecuencia la prdida de la funcin de dicho gen. es decir los
elementos genticos transponibles producen mutaciones. En el fenmeno de la
transposicin no se ha encontrado una relacin clara entre la secuencia de la
sede donadora (lugar en el que est el transposn) y la sede aceptora (lugar al
que
se
incorpora
el
transposn).
Tipos de transposones

Transposones simples: Son los elementos de secuencia de Insercin o

Elemento de Insercin (IS): Poseen solamente aquellos genes requeridos para
la incorporacin en nuevas localizaciones. La mayora de los elementos IS
contienen entre 700 y 1500 pares de bases de DNA bacteriano. Estos
elementos se caracterizan por portar un solo gen, que codifica para la
expresin de la enzima tranposasa, la cuel promueve la transposicin.Los
transposones simples contienen una secuencia central con informacin para la
transposasa y en los extremos una secuencia repetida en orden inverso. Esta
secuencia repetida en orden inverso no es necesariamente idntica, aunque
muy parecida. Cuando un transposn simple se integra en un determinado
punto del ADN aparece una repeticin directa de la secuencia diana (5-12 pb).

Transposn Compuesto o Complejo (Tn): Llevan un carcter

asociado para funciones especializadas, poseen genes adicionales, tales como
los que codifican resistencias antibiticas que pueden asegurar la
supervivencia en el curso de una terapia antimicrobiana. Contienen un
elemento de insercin (IS) en cada extremo en orden directo o inverso y una
regin central que adems suele contener informacin de otro tipo. Por
ejemplo, los Factores de transferencia de resistencia (RTF), poseen
informacin en la zona central para resistencia a antibiticos (cloranfenico,
Kanamicida, tetraciclina, etc.). La insercin de un transposn en un gen
esencial para la supervivencia bacteriana da lugar a la muerte de la clula. La
mayor parte de estos Tn estn contenidos en plsmidos que pueden ser
pasados entre espedies de bacterias, por lo que se permite una rapida
diseminacin de la resistencia.

Los transposones tipo A: Estos no poseen elementos de IS repetidos

en los extremos y tienen secuencias terminales, cortas, invertidas y repetidas.
Estos Tn, adems de portar genes auxiliares, codifican dos enzimas en la
transposicin, una transposasa y una resolvasa, que cataliza la resolucin de
replicones fusionados. Esta clase est en el Tn3, un Tn de 4700 pb, que
transporta un gen betalactamasa.
Transposicin
La tansposicin es un proceso espontaneo ampliamente difundido en los
organismos vivos, por el cual una secuencia de DNA se inserta a s misma en

un nuevo lugar del genoma. Este tipo de secuencia de DNA se denomina

transposn o elemento transponible. Los transposones son una de las
principales fuentes de variacin gnica y juegan un papel importante en la
formacin
de
los
genomas.
La transposicin utiliza la recombinacin, pero no genera un intercambio. En
realidad, un transposn se mueve directamente desde un sitio del genoma
hacia otro sin un intermediario como el DNA plasmdico o el de un fago. Esto
provoca reordenamientos que crean secuencias nuevasy cambian las
funciones de las secuencias blanco. En algunos casos cuando se insertan
dentro de un gen funcional causan enfermedad.

1. Collis, C.M., Hall, R.M. Site-specific deletion and rearrangement of insert

genes catalyzed by the DNA integrase. Journal of Bacteriol 1992; 174
(5): 1574-1585.
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elements encoding site-specific geneintegration functions: integrons.
Molec Microbiol 1989; 3 (12): 1669-1683.
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element. Microbiology 1995; 141: 3015-3027.
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several integrons. Gene 1994; 142: 49-54.
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analysis of 2"-aminoglycoside nucleotidyl-transferase ANT(2") from
Tn4000: Its relationship with AAD(3") and impact on Tn21 evolution. Mol
Microbiol 1988; 2: 709-717.

2. TINCIN DE GRAM
2.1 Mtodo
2.1.1 Extensin: En un porta bien limpio (con alcohol, papel de
filtro y flameado) se coloca una gota de agua destilada a la que.
con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se
lleva una pequea cantidad de suspensin de bacterias o, en su
caso, de una colonia.
Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el porta y
se fija la extensin por el calor, calentando suavemente a la
llama del mechero hasta que se seque.

2.1.2 Coloracin:
a) 1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se decolora con alcohol de 95 (decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en fucsina bsica (colorante de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro
Una vez que la preparacin est totalmente seca, poner una
gota muy pequea de aceite de cedro y observar al microscopio
con el objetivo de inmersin.

2.2. Observacin
Debe utilizarse el
objetivo de
inmersin.
Se coloca una
gota de aceite de
cedro sobre la
preparacin. Se
enfoca,
preferentemente,
con el
micromtrico.
Despus de
utilizar el
objetivo de inmersin debe limpiarse con xilol

Observaciones realizadas: antalas en tu cuaderno Qu forma

tienen las bacterias observadas? Las bacterias aparecen
aisladas o agrupadas? En caso de que aparezcan agrupadas
indicar el tipo de asociacin. Indica tipo de Gram.