Actividad Microbiana en Empresas de Alimentos

CARTA DE AUTORIZACIN DE LOS AUTORES PARA LA CONSULTA, LA
REPRODUCCIN PARCIAL O TOTAL, Y PUBLICACIN ELECTRNICA DEL TEXTO

COMPLETO.
Bogot, D.C., Fecha 23 de julio de 2009

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Trabajo de Grado
Seores
BIBLIOTECA GENERAL
Cuidad
Estimados Seores:
Las suscritas MARGARITA LUCIA PERDOMO GIRALDO, con C.C. No. 53.177.830,
y MAYRA ALEXANDRA TLLEZ CORRAL, con C.C. No. 53.107.672, autor(es) del
trabajo de grado titulado EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE
LA FRACCION ACTIVA DE Isertia laevis OBTENIDA A PARTIR DE DOS
METODOLOGAS DE EXTRACCION
SOBRE Streptococcus mutans y
Streptococcus sobrinus, presentado y aprobado en el ao 2009 como requisito
para optar al ttulo de Bacterilogas; autorizo (amos) a la Biblioteca General de
la Universidad Javeriana para que con fines acadmicos, muestre al mundo la
produccin intelectual de la Universidad Javeriana, a travs de la visibilidad de
su contenido de la siguiente manera:
Los usuarios puedan consultar el contenido de este trabajo de grado en

Biblos, en los sitios web que administra la Universidad, en Bases de Datos,
en otros Catlogos y en otros sitios web, Redes y Sistemas de Informacin
nacionales e internacionales Open Access y en las redes de informacin
del pas y del exterior, con las cuales tenga convenio la Universidad
Javeriana.
Permita la consulta, la reproduccin, a los usuarios interesados en el

contenido de este trabajo, para todos los usos que tengan finalidad
acadmica, ya sea en formato CD-ROM o digital desde Internet, Intranet,
etc., y en general para cualquier formato conocido o por conocer.
Contino conservando los correspondientes derechos sin modificacin o

restriccin alguna; puesto que de acuerdo con la legislacin colombiana
aplicable, el presente es un acuerdo jurdico que en ningn caso conlleva la
enajenacin del derecho de autor y sus conexos.
De conformidad con lo establecido en el artculo 30 de la Ley 23 de 1982 y el

artculo 11 de la Decisin Andina 351 de 1993, Los derechos morales
sobre el trabajo son propiedad de los autores, los cuales son
irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables.
Margarita Luca Perdomo Giraldo

C.C. 53.177.830 de Bogot
Mayra Alexandra Tllez Corral

C.C. 53.107.672 de Bogot
NOTA IMPORTANTE: El autor y o autores certifican que conocen las derivadas

jurdicas que se generan en aplicacin de los principios del derecho de autor.
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA ACADMICO: BACTERIOLOGA
TTULO COMPLETO DEL TRABAJO DE GRADO: EVALUACIN DE LA

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LA FRACCION ACTIVA DE Isertia laevis
OBTENIDA A PARTIR DE DOS METODOLOGAS DE EXTRACCION
SOBRE
Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus.

AUTOR O AUTORES
Apellidos Completos
Perdomo Giraldo
Tllez Corral
Gamboa Jaimes
Tllez Alfonso
Nombres Completos
Margarita Luca
Mayra Alexandra
Fredy Omar
Alba Nohem
DIRECTOR (ES) DEL TRABAJO DE GRADO

Apellidos Completos
Nombres Completos
Gamboa Jaimes
Fredy Omar
ASESOR (ES) O CODIRECTOR

Apellidos Completos
Tllez Alfonso
Nombres Completos
Alba Nohem
TRABAJO PARA OPTAR AL TTULO DE: Bacteriloga.

FACULTAD: Ciencias Bsicas.
PROGRAMA: Carrera X
NOMBRE DEL PROGRAMA: Bacteriologa.
NOMBRES Y APELLIDOS DEL DIRECTOR DEL PROGRAMA: Luz Amparo
Maldonado.
CIUDAD: Bogot AO DE PRESENTACIN DEL TRABAJO DE GRADO: 2009
NMERO DE PGINAS: 79.
TIPO DE ILUSTRACIONES:
Mapas
Tablas, grficos y diagramas
Fotografas
PALABRAS CLAVES:
ESPAOL
Actividad antimicrobiana
Fraccionamiento Lquido/Lquido
INGLS
Antimicrobial activity
Isertia laevis
Isertia laevis
S. mutans ATCC 25175
Liquid/Liquid fractionation
VCC (Vacuum Column
Chromatography)
S. sobrinus
CCV (Cromatografa en Columna al
Vaco)
RESUMEN DEL CONTENIDO EN ESPAOL:
En este estudio se evaluaron dos mtodos de extraccin para la obtencin de
la fraccin activa antimicrobiana a partir del extracto etanlico de hojas de
Isertia laevis: el primer
mtodo de fraccionamiento, fue la tcnica
Cromatografa en Columna al Vaco (CCV), donde se utilizaron como FE: RP-18
y FM: MeOH:H2O, MeOH, MeOH: CH2Cl2 y CH2Cl2. Y el segundo mtodo fue
Fraccionamiento Lquido/liquido continuo con solventes en orden creciente de
polaridad (petrol, CH2Cl2, AcOEt, BuOH). En los dos mtodos se encontraron las
fracciones con actividad inhibitoria sobre S. mutans ATCC 25175 y S.
sobrinus. En CCV, las fracciones activas fueron fraccin MeOH, fraccin MeOHCH2Cl2 y en el Fraccionamiento Lquido/Lquido fue la fraccin CH2Cl2. Se utiliz
la Bioautografa como mtodo alternativo en la evaluacin de las fracciones,
dando como resultado inhibicin en la fraccin MeOH y la fraccin CH2Cl2. Por
medio de tcnicas qumicas cualitativas se determin que las fracciones
activas contienen terpenoides, esteroides y saponinas. Los dos mtodos
permitieron la separacin de la fraccin activa antimicrobiana de la planta,
mostrando diferencias significativas en cuanto a los costos, cantidad obtenida
y grado de mezcla, adems se demostr y comprob la reproducibilidad en la
separacin de la fraccin activa y su accin.
RESUMEN DEL CONTENIDO EN INGLS
In this study, were evaluated two extraction methods for obtaining the
antimicrobial active fraction from ethanol extract of leaves of Isertia laevis: the
first method of fractionation was the technique of Vacuum Column
Chromatography (VCC), which were used as FE: RP-18 and FM: MeOH: H2O,
MeOH, MeOH:CH2Cl2 and CH2Cl2. The second method was Continuous
Fractionation Liquid/liquid with solvents in order of increasing polarity (petrol,
CH2Cl2, AcOEt, BuOH). In the two methods were the fractions with inhibitory
activity against S. mutans ATCC 25175 and S. sobrinus. In the VCC, the active
fractions were fraction MeOH, fraction MeOH-CH2Cl2 and the fractionation
liquid/liquid was fraction CH2Cl2. Bioautography was used as an alternative
method in the evaluation of the fractions, resulting in the inhibition of fraction
MeOH and fraction CH2Cl2. Through Qualitative chemical was found that the
active fractions containing terpenoids, steroids and saponins. The two methods
allowed the separation of the antimicrobial active fraction of the plant, showing
significant differences in cost, quantity and degree of mixing obtained also
demonstrated the reproducibility and found in the separation of the active
fraction and its action.
EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LA FRACCION ACTIVA DE

Isertia laevis OBTENIDA A PARTIR DE DOS METODOLOGAS DE EXTRACCION SOBRE
Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus
MARGARITA LUCA PERDOMO GIRALDO

MAYRA ALEXANDRA TLLEZ CORRAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

CARRERA DE BACTERIOLOGIA
BOGOT, D.C.
2009


TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar al ttulo de
BACTERILOGA (S)
FREDY O. GAMBOA JAIMES, PhD

DIRECTOR
ALBA NOHEMI TLLEZ, PhD
CODIRECTOR
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

CARRERA DE BACTERIOLOGIA
BOGOT, D.C.
2009
NOTA DE ADVERTENCIA
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar
la verdad y la justicia.


APROBADO
FREDY O. GAMBOA, M.Sc. PhD.
NOHEMI TELLEZ ALFONSO Dra.Sc
DIRECTOR
CO DIRECTORA
JORGE ROBLES
JAIRO BUSTILLO
JURADO
JURADO

Streptococcus mutans ATCC 25175 y Streptococcus sobrinus

APROBADO
INGRID SCHULER Phd.

Decana Acadmica
Facultad de Ciencias
LUZ AMPARO MALDONADO

Directora Carrera de Bacteriologa
DEDICATORIA
A Dios por su amor, fuerza y respaldo incondicional.

A nuestras familias por su apoyo, compaa y comprensin
AGRADECIMIENTOS
Al Doctor Fredy Gamboa y al Centro de Investigaciones Odontolgicas por permitirnos el

desarrollo de este trabajo en las instalaciones de sus laboratorios.
A la Doctora Nohem Tellez por su gran colaboracin y enseanza como codirectora.
A John Jairo Rojas por toda la ayuda y el apoyo proporcionados.
Julio Pedrozo por su colaboracin.
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIN
21
2. MARCO TERICO
23
2.1 CARIES DENTAL
24
2.1.1 Factores Microbianos
25
2.1.1.1 Colonizacin Primaria
26
2.1.1.2 Colonizacin Secundaria
27
2.1.1.3 Placa Madura
28
2.1.1.4 Fase de Mineralizacin
28
2.1.2 Determinantes Bacterianos de Patogenicidad
29
2.1.2.1 Gnero Streptococcus
29
2.1.2.2 Gnero Lactobacillus
30
2.1.2.3 Gnero Actinomyces
30
2.1.2.4 Gnero Staphylococcus
30
2.2 EXTRACTOS VEGETALES Y ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
31
2.3 FAMILIA Rubiaceae
32
2.3.1 Gnero Isertia
33
2..3.1.1 Isertia laevis
33
2.4 MTODOS DE EXTRACCIN
35
2.4.1 Cromatografa en Columna al Vaco CCV
35
(Vacuum Column Chromatography - VCC)

2.4.2 Fraccionamiento Lquido/Lquido Continuo
35
2.5 MTODOS PARA LA EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD

ANTIMICROBIANA
35
2.5.1 Mtodo de difusin en pozo
35
2.5.2 Mtodo de difusin en disco
36
2.5.3 Bioautografas
36
2.5.4 Mtodo MTT
37
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN
38
3.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA
38
3.2 JUSTIFICACIN
38
3.3 PREGUNTA DE INVESTIGACIN
38
4. OBJETIVOS
39
4.1 OBJETIVO GENERAL
39
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
39
5. MATERIALES Y MTODOS
40
5.1 MATERIAL VEGETAL
40
5.1.1 Desengrase del Material
40
5.1.2 Obtencin de Extractos
40
5.1.3 Mtodos de Extraccin
40
5.1.3.1 Mtodo 1: Cromatografa en Columna al Vaco CCV
40
5.1.3.2 Mtodo 2: Fraccionamiento Lquido/Lquido Continuo
41
5.1.3.3 Columna de Sephadex. Mtodo de Separacin de Clorofilas
43
5.1.4 Pruebas qumicas cualitativas
44
5.2 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE
44
EXTRACTOS, FRACCIONES Y SUBFRACCIONES

5.2.1 Cepas Evaluadas
44
5.2.2 Evaluacin Antimicrobiana
45
5.2.2.1 Mtodo Difusin en Pozo
45
5.2.2.2 Mtodo Difusin en Disco
45
5.2.2.3 Evaluacin del Efecto Antimicrobiano de la (s) fraccin (es) activa (s)
46
sobre el crecimiento de S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus por biautografas

6. RESULTADOS
47
6.1 ESTUDIO MICROBIOLGICO
47
6.1.1 Evaluacin Microbiolgica de las Fracciones obtenidas por
47
Mtodo 1: Cromatografa en Columna al Vaco (CCV)
6.
Evaluacin Microbiolgica de las Fracciones obtenidas por el
49
Mtodo 2: Fraccionamiento lquido/lquido Continuo

6.1.3 Bioautografas
6.1.4
55
Comparacin de las fracciones Activas obtenidas a partir de
56
Los dos Mtodos de Extraccin.

6.1.5
Separacin de los Metabolitos Secundarios de las
57
Fracciones Activas y su evaluacin Antimicrobiana.

6.2 ESTUDIO QUIMICO
59
6.2.1 Estudio Qumico de los Compuestos de inters
59
7. DISCUSIN
61
8. CONCLUSIONES
65
9. RECOMENDACIONES
67
10. BIBLIOGRAFA
68
ANEXOS
74
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Distribucin de Isertia laevis. (Boom, 1984)
33
Figura 2. Hojas y flores de Isertia laevis. (Tomado de
34
Neotropical Herbarium Specimens: http://fm1.fieldmuseum.org/vrrc)

Figura 3. Metabolizacin del MTT en Formazn.
37
Figura 4. Separacin del extracto etanlico de Isertia laevis por Cromatografa en
41
Columna al vaco (CCV) con fase estacionaria RP-18: Esquema del Primer mtodo.
Figura 5. Separacin del extracto etanlico de Isertia laevis por
42
Fraccionamiento lquido/lquido continuo: Mtodo 2.

Figura 6. Cromatografa en Columna con Sephadex
43
Figura 7 A) Mtodo de Separacin de Clorofilas: Columna Sephadex,
43
FE: Sephadex 10 g, FM: MeOH-CH2Cl2 (9:1). Monitoreo en Cromatografa de

Subfracciones de CH2Cl2 (FE: RP-18. FM: MeOH-CH2Cl2 (9:1).
B) Revelada con cido perclrico: a. Rf: 0,1. b. Rf: 0,32. c. Rf: 0,50.
d. Rf: 0,74 y e. Rf: 0,86 C) Luz U.V.
Figura 8. Comparacin de la difusin del los extractos en disco (A) y pozo (B)
47
Figura 9. Actividad antimicrobiana de (A) la fraccin MeOH y
48
(B) fraccin de MeOH-CH2Cl2 sobre S. mutans ATCC 25175,

a una concentracin final de 3 mg por pozo.
Figura 10. Accin antimicrobiana de la fraccin MeOH-H2O,
fraccin MeOH-H2O, fraccin MeOH, fraccin MeOH-CH2Cl2 y
fraccin
CH2Cl2 obtenidas a partir de hojas de I. laevis.
A
49
Figura 11. Halo de inhibicin sobre S. mutans ATCC 25175 producido por la
49
Fraccin CH2Cl2 a 1 mg por pozo, revelado con MTT

Figura 12. Accin antimicrobiana de las fracciones ter de Petrleo, CH2Cl2,
50
Fr. 1 de AcOEt, Fr. 2 de AcOEt, Fr. 3 de AcOET y Butanol obtenidas

a partir de hojas de I. laevis sobre S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus,
una concentracin final de 1mg por pozo.
Figura 13. Halo de inhibicin sobre S. mutans ATCC 25175 producido
51
por el extracto en CH2Cl2 a 2 mg por pozo. (A: Sin MTT. B: Revelado con MTT)
Figura 14. Accin antimicrobiana de las fracciones ter de Petrleo,
51
CH2Cl2, AcOEt y Butanol obtenidas a partir de hojas de I. laevis sobre

S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus.
Figura 15. Halos de inhibicin sobre S. mutans ATCC 25175
52
producido por la fraccin CH2Cl2 en concentraciones de (a) 0.5 mg por pozo,

a
MTT
(b) 1 mg por pozo, (c) 2 mg por pozo, (d) 5 mg por pozo, (e) 10 mg por pozo y
(f) 20 mg por pozo, sin y con MTT.
Figura 16. Accin antimicrobiana de la fraccin de la 2. Marcha a
53
concentraciones de 0.5 mg por pozo, 1 mg por pozo, 2 mg por pozo,

5 mg por pozo, 10 mg por pozo y 20 mg por pozo sobre
S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus
Figura 17. Actividad antimicrobiana de Subfraccin No. 2 de CH2Cl2..
54
Halo de inhibicin (13 mm) en S. sobrinus. (A: Sin MTT. B: Revelado con MTT)
Figura 18. Actividad antimicrobiana de Subfraccin No. 3 de CH2Cl2.
54
Figura 19. Actividad antimicrobiana de Subfraccin No. 4 de CH2Cl2. (2. Marcha).
54
Figura 20. Accin antimicrobiana de las subfracciones CH2Cl2
55
obtenidas a partir de la fraccin CH2Cl2 a una concentracin de 0.6 mg por pozo.

Figura 21. A) Cromatografa CCD (RP-18, MeOH:CH2Cl2 (9.5:0.5))
57
revelada con acido perclrico (1) fraccin MeOH, (2) fraccin MeOH:CH2Cl2,
(3) fraccin CH2Cl2 y (4) Subfraccin activa del estudio anterior de I. leavis.
B) Compuestos de inters: Rf 0,234 y 0,42.
Figura 23. Cromatografa CCD (FE: RP-18; FM: MeOH:CH2Cl2 9:1)
58
revelada con acido perclrico de los compuestos separados.

Se evidencia los compuestos de inters a (Rf: 0,37) y
compuesto de inters b (Rf: 0,51).
Figura 24. Actividad antimicrobiana de los compuestos separados [0.4 mg/pozo]:
58
C1, C2 y Fr. Activa Original sobre S. mutans ATCC 25175.

Figura 25. Accin antimicrobiana de las subfracciones purificadas [0.4 mg/pozo]:
59
C1, C2 y Fr. Activa Original sobre S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus

Figura 26. Pruebas Qumicas Cualitativas en CCD A) Prueba de Dragendorff.
B) Prueba de Lieberman-Brchard. C) Prueba de Brntrager.
D) Molibdato de Amonio. Positivas para Terpenos y Esteroides.
60
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Halos de susceptibilidad en mm, (promedio de tres pruebas)
48
presentados por S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus al estar en contacto

con la fraccin MeOH-H2O, fraccin MeOH, fraccin MeOH-CH2Cl2 y
fraccin CH2Cl2, obtenidas a partir de hojas de I. laevis
Tabla 2. Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans
50
ATCC 25175 y S. sobrinus al estar en contacto con las fracciones ter de Petrleo,
CH2Cl2, AcOEt y Butanol obtenidas a partir de hojas de I. laevis
51
ATCC 25175 y S. sobrinus al estar en contacto con las fracciones ter de Petrleo,
CH2Cl2, AcOET y Butanol obtenidas a partir de hojas de I. laevis, a una concentracin
de 2 mg por pozo.
53
ATCC 25175 y S. sobrinus al estar en contacto con la fraccin CH2Cl2

a concentraciones de 0.5 mg por pozo, 1 mg por pozo, 2 mg por pozo,
5 mg por pozo, 10 mg por pozo y 20 mg por pozo.
Tabla 5. Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans ATCC 25175
54
y S. sobrinus al estar en contacto con la fraccin CH2Cl2 de la 2. Marcha a

Concentraciones de 0.5 mg por pozo, 1 mg por pozo, 2 mg por pozo, 5 mg por pozo,
10 mg por pozo y 20 mg por pozo.
Tabla 6. Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans ATCC 25175
y S. sobrinus al estar en contacto con las subfracciones de CH2Cl2 a una
Concentracin de 0.6 mg por pozo.
56
59
ATCC 25175 y S. sobrinus al estar en contacto con los compuestos separados

(C1, C2 y Fr. Activa Original) a una concentracin de 0.4 mg/pozo
Tabla 8. Pruebas qumicas cualitativas en CCD e ndice de Espuma
60
de los compuestos de inters.

Tabla 9. Anlisis estadstico de la actividad antimicrobiana de las Fracciones
74
del Mtodo 1: fraccin MeOH-H20, fraccin MeOH, fraccin 1 MeOH-CH2Cl2,

fraccin CH2Cl2 sobre S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus..
Tabla 10. Anlisis estadstico de la actividad antimicrobiana de las fracciones del
75
Mtodo 2: Fr. ter de Petrleo, Fr. CH2Cl2, fr. AcOEt y Fr. Butanol sobre
S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus.
Tabla 11. Anlisis estadstico de la actividad antimicrobiana de las subfracciones
76
1, 2, 3 y 4 de la fraccin CH2Cl2 sobre S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus.

Tabla 12. Anlisis estadstico de la actividad antimicrobiana de los compuestos
77
separados (C1, C2 y C3) sobre S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus.

Tabla 13. Costos del Mtodo 1: Cromatografa en Columna al Vaco - CCV
78
(Vacuum Column Chromatography - VCC)

Tabla 14. Costos del Mtodo 2: Fraccionamiento Lquido/Lquido Continuo
78
INDICE DE ABREVIATURAS
AZM
Azitromicina
Microlitros
Grados Celsius
AcOEt
Acetato de Etilo
ATCC
American Type Culture Collection
BHI
Brain-Heart Infusin
BuOH
Butanol
CCD
Cromatografa en Capa Delgada
CCV
Cromatografa en Columna al Vaco
CH2Cl2
Diclorometano
CIO
Centro de Investigaciones Odontolgicas
DMSO
Dimetilsulfxido
EtOH
Etanol
FE
Fase Estacionaria
FeCl3
Cloruro Frrico
FM
Fase Mvil
Fr.
Fraccin
GIFUJ
Grupo de Investigacin Fitoqumica de la Universidad Javeriana
H2SO4
cido Sulfrico
m.s.n.m.
Metros sobre el nivel del mar
MeOH
Metanol
MeOH-CH2Cl2
Metanol- Diclorometano
MeOH-H2O
Metanol- Agua
mg
Miligramos
ml
Mililitros
MT
Medicina Tradicional
MTT
Sal de Tetrazolium
OMS
Organizacin Mundial de la Salud
Paho
Organizacin Panamericana de Salud
Subfraccin
Sf
TRA
Acid Adaptative Tolerance Responce
TSA
Agar Tripticasa Soya
U.V.
Radiacin Ultravioleta
VCC
Vacuum Column Cromatography
RESUMEN
En este estudio se evaluaron dos mtodos de extraccin para la obtencin de la fraccin

activa antimicrobiana a partir del extracto etanlico de hojas de Isertia laevis: el primer
mtodo de fraccionamiento, fue la tcnica
Cromatografa en Columna al Vaco (CCV),
donde se utilizaron como FE: RP-18 y FM: MeOH:H2O, MeOH, MeOH: CH2Cl2 y CH2Cl2. Y el
segundo mtodo fue Fraccionamiento Lquido/liquido continuo con solventes en orden
creciente de polaridad (petrol, CH2Cl2, AcOEt, BuOH). En los dos mtodos se encontraron
las fracciones con actividad inhibitoria sobre S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus. En
CCV, las fracciones activas fueron fraccin MeOH, fraccin MeOH-CH2Cl2 y en el
Fraccionamiento Lquido/Lquido fue la fraccin CH2Cl2. Se utiliz la Bioautografa como
mtodo alternativo en la evaluacin de las fracciones, dando como resultado inhibicin en la
fraccin MeOH
y la fraccin CH2Cl2. Por medio de tcnicas qumicas cualitativas
se
determin que las fracciones activas contienen terpenoides, esteroides y saponinas. Los dos
mtodos permitieron la separacin de la fraccin activa antimicrobiana de la planta,
mostrando diferencias significativas en cuanto a los costos, cantidad obtenida y grado de
mezcla, adems se demostr y comprob la reproducibilidad en la separacin de la fraccin
activa y su accin.
Palabras claves: Actividad antimicrobiana, Fraccionamiento Lquido/Lquido, Isertia laevis,

S. mutans ATCC 25175, S. sobrinus, CCV (Cromatografa en Columna al Vaco).
ABSTRACT
In this study, were evaluated two extraction methods for obtaining the antimicrobial active
fraction from ethanol extract of leaves of Isertia laevis: the first method of fractionation was
the technique of Vacuum Column Chromatography (VCC), which were used as FE: RP-18
and FM: MeOH: H2O, MeOH, MeOH:CH2Cl2 and CH2Cl2. The second method was
Continuous Fractionation Liquid/liquid with solvents in order of increasing polarity (petrol,
CH2Cl2, AcOEt, BuOH). In the two methods were the fractions with inhibitory activity against
S. mutans ATCC 25175 and S. sobrinus. In the VCC, the active fractions were fraction
MeOH, fraction MeOH-CH2Cl2 and the fractionation liquid/liquid was fraction CH2Cl2.
Bioautography was used as an alternative method in the evaluation of the fractions, resulting
in the inhibition of fraction MeOH and fraction CH2Cl2. Through Qualitative chemical was
found that the active fractions containing terpenoids, steroids and saponins. The two methods
allowed the separation of the antimicrobial active fraction of the plant, showing significant
differences in cost, quantity and degree of mixing obtained also demonstrated the
reproducibility and found in the separation of the active fraction and its action.
Keywords: Antimicrobial activity, Isertia laevis, Liquid/Liquid fractionation, S. mutans ATCC

25175, S. sobrinus, VCC (Vacuum Column Chromatography).
1. INTRODUCCIN
La caries dental y las enfermedades periodontales, son consideradas como las

enfermedades de mayor importancia en la morbilidad bucal a nivel mundial y son
consideradas actualmente como uno de los mayores problemas de salud en Colombia. La
caries dental es generada principalmente por bacterias como Streptococcus mutans y
Streptococcus sobrinus, las cuales ocasionan un proceso patolgico infeccioso caracterizado
por la destruccin localizada de los tejidos duros dentales. Se le considera multifactorial ya
que existe interaccin de tres factores principales: un husped susceptible (cavidad oral),
una microflora cariognica y un sustrato presente en un periodo de tiempo adecuado,
generando que la estructura dentaria en contacto con los depsitos microbianos y debido al
desequilibrio entre la sustancia dental y el fluido de placa circulante, genere como resultado
la alteracin paulatina de mineral de la superficie de los dientes.
Existen factores externos que hacen que este problema se incremente y su prevalencia sea
cada vez mayor en la poblacin, como los hbitos higinicos y alimenticios, el desarrollo
econmico, social y cultural, la educacin y el ambiente, lo que hace necesario establecer
acciones de promocin y prevencin en salud oral, especialmente en menores de 15 aos,
quienes son los mas susceptibles a la enfermedad. Sin embargo, en Colombia, segn el III
Estudio Nacional de Salud Bucal, el 95% de la poblacin mayor de 20 aos, tiene historial de
caries, lo que hace que esta patologa sea considerada como un problema de salud pblica.
Ahora bien, la problemtica se ha controlado por la utilizacin de sustancias qumicas como
el triclosan y fluoruro de sodio, los cuales son efectivos para eliminar estos patgenos, pero
el uso inadecuado conlleva a la alteracin de la flora oral benfica y genera resistencia
bacteriana. De esta forma, se hace necesaria la bsqueda de
nuevas alternativas
especialmente de origen vegetal, ya que segn registros histricos existen plantas que
poseen una alta actividad antimicrobiana frente a microorganismos de cavidad oral
presentan la misma efectividad de los antimicrobianos comerciales, que a la vez su uso no

perjudica la salud de los pacientes. Los pacientes tratados con plantas medicinales o
sustancias hechas a base de extractos vegetales, tienen menor probabilidad de adquirir
infecciones por microorganismos resistentes, a diferencia de los pacientes que son tratados
con medicamentos tradicionales y pueden llegar a presentar efectos secundarios.
Esta situacin nos brinda la posibilidad de estudiar y revisar mtodos y materiales

alternativos para el control microbiolgico de estas enfermedades dentales especialmente
con fitofrmacos. En la actualidad la investigacin de los fitofrmacos se basa principalmente
en el soporte cientfico de la eficacia de plantas medicinales conocidas, en la bsqueda e
identificacin
de
extractos,
fracciones
y/o
principios
activos
diferentes,
veces
desconocidos, de las plantas medicinales, y en las investigaciones farmacolgicas de los

efectos de los principios activos especficos. El grupo de investigacin Fitoqumica de la
Universidad Javeriana GIFUJ y el Centro de Investigaciones Odontolgicas CIO, desarrollan
un proyecto de investigacin titulado Evaluacin de la actividad antibacteriana de extractos
y fracciones obtenidas de 2 especies de la familia Rubiaceae: Isertia laevis y Eleagia utilis
en el cual se separ e identific la fraccin activa antibacteriana de Isertia laevis, (Alvarado
et al., 2008). Con este trabajo se demostr la reproducibilidad tanto de la separacin de la
fraccin activa como de su accin, Se prob otra estrategia de separacin con el fin de
buscar la ms efectiva y la de menor costo. Se separaron los metabolitos mayoritarios de la
mezcla y se evalu su accin con el fin de identificar el posible principio activo. Estos
resultados permitirn la obtencin de un fitoterapetico o fitomedicamento ms seguro, que
permita en el futuro disminuir el impacto en la morbilidad bucal causada por los principales
microorganismos cariognicos y generadores de la caries dental, con terapias ms
econmicas y efectivas.
2. MARCO TEORICO
CARIES DENTAL Y ENFERMEDAD PERIODONTAL

La salud oral es un aspecto fundamental de las condiciones generales de salud en Amrica
Latina, ya que tiene una gran importancia como parte de la carga global de la morbilidad
oral, el gran aporte a los tratamientos y la constante bsqueda y aplicacin de medidas
eficaces preventivas.
La caries dental es la enfermedad ms comn entre los nios;
aproximadamente 90% de los escolares (5 a 17 aos) tienen caries dental y es considerada

entre las de mayor prevalencia en la poblacin adolescente colombiana y puede aumentar
sus efectos en la medida que la edad es mayor. Sin embargo, gracias a la intervencin
temprana, la caries dental puede evitarse o tratarse a un costo reducido. (Tscon & Cabrera,
2005)
Es importante tener en cuenta que una variedad de enfermedades sistmicas o sus
secuelas, como la diabetes y el cncer de la cavidad bucal y de la faringe, producen
manifestaciones en forma de caries dental, enfermedades periodontales y prdida de
dientes. Cada vez cobran ms importancia la infeccin por el VIH/SIDA y la hepatitis B;
stas, adems de sus repercusiones clnicas, plantean el riesgo de transmisin en el entorno
de la atencin dental.
Los datos actuales sobre salud bucodental en Amrica Latina y el Caribe (LAC) indican que
la mayora de los pases tienen una elevada prevalencia de caries dental y de enfermedades
periodontales. Estn emergiendo con importancia los cnceres de la cavidad bucal y de la
faringe, la infeccin por el VIH/SIDA y la hepatitis B; adems de los efectos clnicos de la
infeccin por el VIH/SIDA en la cavidad bucal, y la hepatitis B, estas enfermedades son
importantes debido al potencial de transmisin en los entornos de la atencin odontolgica.
En general, la mayora de estas enfermedades estn distribuidas de manera desigual entre
la poblacin. (Organizacin Panamericana de la Salud)
La caries dental y las enfermedades periodontales son ms graves entre las personas de
bajos ingresos y con poco nivel educativo, lo que recrudece el problema y aumenta la
incidencia de los casos en la poblacin. En Colombia, las acciones realizadas por diferentes
entidades de salud no han logrado disminuir la caries dental, que an persiste en ms del
90% de la poblacin colombiana. (Organizacin Panamericana de la Salud)
2.1 CARIES DENTAL

La caries dental se define como un proceso patolgico, infeccioso, multifactorial, localizado,
poseruptivo y transmisible que destruye los tejidos duros dentales (Mouton, 1995; Rodrguez
y Gonzlez, 2000; Libana, 2002). En esta patologa se generan lesiones dentales o
cavidades en los dientes, a consecuencia de las alteraciones de la microflora oral, de las
grandes fuentes de energa y una predisposicin del husped, que favorecen la colonizacin
de las estructuras dentales convirtindose en flora patolgica.
Para entender la formacin inicial de la caries es importante primero conocer la composicin
del esmalte dental para tener mayor claridad del efecto de la patologa sobre esta estructura.
El esmalte dental es un tejido, considerado como el ms duro del cuerpo humano, de origen
ectodrmico que recubre la superficie coronaria del diente. Se compone principalmente en
un 94% de hidroxiapatita y en un 4% de material orgnico como lpidos, protenas y agua
(Balda et al., 1999; Reyes, 2001). Se caracteriza por ser traslcido, con espesor variable, el
cual depende de la edad y el tipo de cuidado dental que tenga el paciente.
Su componente principal, la hidroxiapatita pura y carbonada, esta dispuesta en pequeos
cristales unidos muy estrechamente con el material orgnico. stos se ubican de manera
paralela entre s, generando estructuras llamadas prismas, las cuales a su vez van a generar
la capa de esmalte dentario arreglado hexagonalmente alrededor de la dentina.
Las especies ms comunes que han sido aisladas en caries dental y placa bacteriana, o
tambin llamado sarro, son en orden de frecuencia: S. mutans, S. sobrinus y S. gordonii; y
especies de Lactobacillus y Actinomyces (Alvarado et al., 2008).
Streptococcus mutans es la bacteria que esta mayormente relacionada con caries dental y
se encuentra en la formacin de placa bacteriana. Su fuente de energa la obtiene de los
carbohidratos dietarios por medio de la va de la gluclisis, que como resultado de su
metabolismo libera hidrogeniones que acidifican el medio, siendo este uno de sus factores
de patogenicidad para poder desmineralizar la estructura dental; posteriormente se debilita el
esmalte dentario
como efecto de la alteracin de la estructura de los cristales de
hidroxiapatita, por la presencia de estos hidrogeniones ya liberados en el metabolismo y as

poder invadir y generar la caries o en su defecto la placa bacteriana.
La actividad glicoltica se disminuye a cero cuando el pH intracelular no es ptimo, es decir
un pH de 7.0; en contraste el pH extracelular tiene que ser de 6.0, lo cual se constituye como
la capacidad que tiene el microorganismo para mantener un gradiente de pH
transmembrana. (Daspher & Reynolds, 1992). De esta manera, la desmineralizacin permite

la entrada del Lactobacillus que genera la capitacin del tejido y la progresin de la misma
lesin, generando una caries avanzada.
Otros factores de cariogenicidad es la produccin de polisacridos tanto intra como
extracelulares. Los intracelulares se encargan de la produccin de cido en ausencia de
glucosa en el medio y los extracelulares contribuyen a la formacin de la matriz de la placa
bacteriana.
Esta matriz de la placa bacteriana macroscpicamente se observa como parches claros
cerca de los surcos gingivales denominadas manchas blancas donde hay prdida de la
translucidez, es decir hay un aspecto spero y sin brillo. Este tipo de lesiones son invisibles
en estados iniciales, pero a medida que existe un estmulo cariognico las superficies
atacadas tienden a adquirir un aspecto poroso y en estados avanzados se observan
hendiduras en la superficie afectada de color oscuro, acompaado por un mal olor bucal.
2.1.1
Factores microbianos
Una caracterstica importante de S. mutans para el desarrollo de la caries es la habilidad

que tiene para adherirse a la superficie del diente. Esta puede suceder de dos maneras, la
dependiente de sacarosa y la no dependiente de sacarosa (Katsura et al., 2001). En la
primera, dependiente de sacarosa debe haber presencia de la enzima glucosiltransferasa,
que
sintetiza
la sacarosa produciendo glucano-insoluble en agua, el cual modifica las
propiedades fisicoqumicas de la estructura dental, incluyendo las diferentes concentraciones

orgnicas de calcio, fluoruro y fsforo, aumentando la porosidad del diente y su
cariogenicidad (Napimoga et al., 2005). La segunda estrategia, no dependiente de sacarosa,
sucede con ayuda de una aglutinina salivaria, una glicoprotena de gran peso molecular que
se encuentra en la saliva, permite que la adhesina P1 que se encuentra en la pared de la
bacteria, se adhiera y se agregue ms fcilmente a la superficie dentaria (Ahn et al., 2008).
S. mutans y S. sobrinus son bacterias que presentan una alta Tolerancia a respuesta de
acidez adaptativa o ATR, por medio de que poseen una F-ATPasa que acta como
liberador (extruding) de protones, que funciona a pH bajos, permitindole a las bacterias
mantener
medios an ms bajos adecuados para su superviviencia volvindolos menos
susceptibles a acidificaciones letales y esta asociado a mejorar las capacidades glicolticas

y as mismo el funcionamiento de la F-ATPasa. Por medio de estudios realizados a las
bacterias acerca de su ATR se ha llegado a la conclusin que S. sobrinus es ms resistente
a medios cidos debido que en su pared posee mayor cantidad de F-ATPasa, lo que le
permite
aumentar
su
capacidad
competitiva
con
otras
bacterias,
resistiendo
experimentalmente pH hasta de 2.2. (Nascimento et al., 2004)

Por otro lado, Lactobacillus es una bacteria que se adquiere durante la niez, es transmitida
verticalmente, es decir de madre a hijo. En nios, este microorganismo se encuentra en las
superficies coronarias del diente y en la adultez en las races. Sus principales caractersticas
son la produccin de cido, por medio del metabolismo de carbohidratos, por tanto
produccin de hidrogeniones para la acidificacin del medio, llegando a disminuir el pH hasta
5.0 en la cavidad oral brindndole las condiciones necesarias para su supervivencia. Su otra
caracterstica es su capacidad de adherencia, aunque no ha sido del todo estudiado, se ha
encontrado que en la superficie de la pared bacteriana hay una protena llamada S layer o
capa S, la cual es responsable de superficie hidrofbica de la bacteria y que en presencia
de esta pierde su capacidad de adhesin. (Badet and Thebaud, 2008)
Existen cuatro procesos que intervienen en la colonizacin de las superficies dentarias por
las bacterias, desarrollo y posterior multiplicacin, los cuales son:
2.1.1.1 Colonizacin Primaria
Una vez establecida la pelcula adquirida y en ausencia de una higiene oral adecuada,
comienzan a depositarse las primeras poblaciones bacterianas en forma especfica; se debe
tener en cuenta la adsorcin selectiva de las bacterias, en este caso sobre la pelcula, o
sobre otras bacterias o sobre la placa formada con anterioridad. Los iones calcio presentes
en la saliva pueden neutralizar las cargas negativas entre las bacterias y las glucoprotenas y
actuar como puentes entre la pelcula y las bacterias.
La mayor parte de estas bacterias derivan de los ecosistemas orales baados por saliva en
primer lugar, los Streptococcus especialmente S. sanguis se adhieren mediante uniones tipo
lectina-carbohidratos. A continuacin se agrega el Actinomyces viscosus con el mecanismo
de unin protena-protena y los otros Streptococcus. Estas primeras bacterias estn unidas
al biofilm por enlaces dbiles y reversibles, aunque cierto nmero de bacterias quedan
firmemente adheridas y empiezan a proliferar, iniciando agregacin y congregacin
bacteriana e incorporando Streptococcus peroxidgenos como S. mitis, S. gordinii, S. crista y
otras bacterias como Rothia dentocariosa, Neisseria sp. y Corybacterium matruchotii. Esta
placa fina goza de un metabolismo bsico aerobio, con microorganismos con caractersticas
respiratorias de este tipo, junto a anaerobias facultativas que se adaptan perfectamente a
estas circunstancias como son los estreptococos. La excepcin la constituira la Veillonella
spp. que sobrevive a partir del lactato, piruvato, maltato o fumarato, ya que es incapaz de
fermentar los hidratos de carbono, estos metabolitos son producto de otros microorganismos
de esta placa y adems posee sistemas especiales de resistencia al oxgeno, como la
superxido dismutasa. (Gutirrez et al., 2005)
Por medio del microscopio electrnico se pueden observar en esta etapa, imgenes en
granos de maz, por el predominio de los cocos y posteriormente se observaran las tpicas
mazorcas con formas filamentosas recubiertas de cocos.
El papel del S. mutans en esta fase es variable, dado que hay placas no cariognicas, en las
que se reporta en muy bajo nmero o ausente, sin embargo, en las dos ltimas dcadas los
mecanismos de adherencia del S. mutans y el S. sobrinus en la superficie dura dental son
confusos y controvertidos. En esta situacin el pH juega un papel importante, ya que ejerce
una significativa presin ecolgica sobre estos microorganismos, por los que la capacidad de
tolerar niveles cidos de pH es crucial para su supervivencia y patogenicidad. Esta
regulacin que depende de la densidad celular, sigue siendo un esquema comn, en donde
se expresa una molcula, como seal de comunicacin intercelular llamada Qurum
sensing. Estos inductores mas caracterizados en bacterias Gram-positivas, son pptidosferomonas de 21 aminocidos. (Zhang et al., 2009; Cvitkovitch et al., 2003) Actualmente se
sabe que los componentes salivares absorbidos sirven como receptores para las protenas
de unin de S. mutans, mientras que las glucosiltransferasas (Gtf) y los glucanos adsorbidos
refuerzan esta adherencia. Es notable la especificidad de las interacciones bacterianas en la
pelcula adquirida, pero debe transcurrir un cierto tiempo hasta que la sacarosa induzca su
aparicin. Otro tanto parece que ocurre con los Lactobacilos, cuyo nmero en esta fase
parece insignificante, salvo en placas cariognas; en este caso es debido a fenmenos de
unin fsica por atropamiento en la malla que s esta formando.
2.1.1.2 Colonizacin Secundaria
En la placa, el desarrollo de las poblaciones bacterianas es un proceso de transformacin
progresivo durante el cual la biopelcula aumenta en grosor y en complejidad, comienza
entre los 3 a 5 das de la formacin de la pelcula adquirida. Siguen los fenmenos de
agregacin y coagregacin bacteriana y tambin aunque en menos grado, la adhesin de
microorganismos a la pelcula. Las bacterias comienzan una fase exponencial, y se da inicio
a un proceso de sucesin ecolgica autognica, es decir que los microorganismos viables
que modifican el ambiente de tal forma que ellos mismos pueden ser reemplazados a lo
largo del tiempo por otros ms complejos y se adaptan fcilmente al hbitat modificado. En
estas condiciones la placa es un conglomerado bacteriano proliferante y enzimticamente

activo adherida fuertemente a la superficie dentaria.
Los cambios microbianos que se van produciendo estn dados por diversas causas. Se
presentan antagonismos por competencias de sustratos, produccin de H2O2 y bacteriocinas
y especialmente por consumo de oxgeno, con lo que las bacterias ms aerbicas van
siendo sustituidas por anaerobias facultativas. Entran en juego los suministros nutricionales,
a partir de fuentes interbacterianas excretoras de elementos energticos fundamentales. Se
observan cambios morfoestructurales con un aumento de formas bacilares, especialmente
de Actinomyces spp. , los anaerobios ms estrictos invaden las zonas ms profundas de la
placa, los aerobios se disponen en la superficie, y los Streptococcus que siguen siendo los
ms abundantes y altamente facultativos se localizan en cualquier lugar de la placa. Esta
estructura viviente necesita energa para persistir, la cual es adquirida por medio del
metabolismo de los hidratos de carbono que son fermentables y provenientes de la dieta.
stos son desdoblados por la va glucoltica, las bacterias obtienen ATP, producen CO 2 y
cido lctico y en menor proporcin otros cidos orgnicos como butrico, actico etc. Los
cuales van a producir la desmineralizacin de los cristales de hidroxiapatita iniciando el
proceso carioso.
2.1.1.3 Placa Madura
sta se forma a travs del tiempo y cuando no s ha perturbado su integridad, aunque el
equilibrio puede verse afectado por algunas variaciones o fluctuaciones internas, la
composicin microbiana suele cambiar muy poco. Un hecho importante es la deteccin de
algunos treponemas en las zonas ms anaerobias (Libana, 2004), al envejecer la placa, las
capas ms profundas adems de verse privadas de oxigeno, tambin lo estarn de
nutrientes, los productos de desecho se acumulan, y hay una reduccin gradual en la
cantidad de microorganismos vivos, de tal forma que los estudios microscpicos revelan la
presencia de espacios vacos por la autolisis.
2.1.1.4 Fase de Mineralizacin
Transcurrido cierto tiempo, la placa madura puede mineralizarse originando el clculo,
trtaro o sarro. El perodo requerido es muy variable, desde das hasta semanas. La
constante salida de iones de calcio y fosfato causa la prdida de minerales de la estructura
dentaria, en consecuencia forma los depsitos calcificados o calcificantes en los dientes que
aparecen como agregados amarillos y blancos, localizados habitualmente en las uniones

dentogingivales (Nishiyama, et al., 2006)
Suelen adherirse fuertemente a los dientes y sobre su superficie puede formarse una nueva
pelcula adquirida y sobre esta una nueva pelcula y as sucesivamente. Su principal
problema es ser un obstculo para la eficacia de la higiene oral ya que son zonas de
retencin mecnica para los microorganismos y punto de salida de productos txicos
bacterianos irritantes para los tejidos blandos orales.
2.1.2
DETERMINANTES BACTERIANOS DE PATOGENICIDAD
Aunque la caries sea de etiologa polimicrobiana, ciertos microorganismos como los

estreptococos, lactobacilos y actinomicetos (placa especfica), participan en la actividad
primaria de la colonizacin, decisiva para el establecimiento y desarrollo de esta patologa.
Estas bacterias cariognicas se caracterizan por tres cualidades especficas:
Capacidad de transformar azcares en competencia con otros microorganismos de

la placa.
Capacidad de convertir rpidamente estos azcares en cido.
Capacidad de mantener estas funciones en condiciones ambientales extremas, tales

como pH bajo.
2.1.2.1 Gnero Streptococcus

En el aspecto humano, y por orden de capacidad cariognica, destacan las especies S.
mutans, S. sobrinus, S. cricetus y S. rattus.
El potencial de cariogenicidad de estos
microorganismos se basa en los siguientes factores: (Cuenca et al., 2005)
Poder acidognico o rpida produccin de cidos a partir de la sacarosa y otros

azcares. Alcanzan fcilmente el pH crtico de desmineralizacin dental.
Poder acidrico o capacidad de seguir produciendo cidos a pH cido (S. sobrinus

es el ms acidrico y S. mutans es el ms acidognico).
Poder acidfilo o ser muy tolerante a los cidos. Diversas causas se implican en este
carcter, entre las que destacan la apertura de la puerta de lactato.
Almacenamiento de productos de reserva: homopolmeros extra e intracelulares que

se movilizan ante situaciones de dficit nutricional.
La capacidad de adhesin a la pelcula adquirida.
Algunas bacterias sintetizan glucanos que no muestran propiedades adhesivas, por lo que
no son cariognicas, como S. sanguis, S. salivarius, S. gordonis, S. oralis.
2.1.2.2 Gnero Lactobacillus
Sobre todo las especies homofermentativas, ya que producen prcticamente slo lactato,
que es el cido orgnico ms desmineralizante (p. ej., L. acidophilus, L. gasseri
y L.
salivarius). Estos microorganismo tienen poder acidognico, acidrico y acidfilo, algunas

cepas sintetizan homopolmeros extra e intracelulares a partir de la sacarosa y poseen una
discreta actividad proteoltica con posibles implicaciones en la caries dental. De todos estos
factores, el ms destacado es su gran poder acidfilo, mayor
an que el de los
estreptococos del grupo mutans. Sin embargo, carecen de adhesinas para fijarse a la
pelcula adquirida. (Cuenca et al., 2005)
2.1.2.3 Gnero Actinomyces.
Con mucho menor poder de cariogenicidad, algunas de sus especies y cepas actan
produciendo
cidos,
adhirindose,
congregndose
mediante
fimbrias,
elaborando
homopolmeros intra y extracelulares (aunque estos ltimos ms nutricionales que

adherentes), dotados de una cierta actividad proteoltica. (Cuenca et al., 2005)
2.1.2.4 Gnero Staphylococcus
Aunque muchas especies de estafilococos pueden ser aisladas de la cavidad oral humana,
S. aureus es la que se detecta con mayor frecuencia. Sin embargo, este microorganismo no
se considera microbiota residente de la boca sino ms bien un simple transente, debido a la
proximidad de zonas en la que es habitual (labios, comisuras labiales o nasofaringe). S.
aureus se encuentra presente en la saliva de un tercio de la poblacin, especialmente si los
sujetos se encuentran inmunodeprimidos o llevan prtesis. (Alvarado et al., 2008)
Este microorganismo ha sido detectado frecuentemente en caries radiculares, glositis,
infecciones pulpares y periapicales, gingivitis y distintos tipos de periodontitis y se relaciona
con cuadros de parotiditis, osteomielitis maxilar, ostetis perimplantaria (que causa el fracaso
de los implantes) y estomatitis.
Con respecto a su papel en enfermedades de zonas
relacionadas con la cavidad oral, por su proximidad, hay que citar las siguientes: imptigo,
fornculo, sinusitis, mastoiditis, abscesos de amgdalas, estafilococia maligna de cara.
(Alvarado et al., 2008)
2.2
EXTRACTOS VEGETALES Y ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
En los pases en desarrollo y en particular en Colombia, personas de bajos ingresos, como

agricultores, campesinos y comunidades nativas usan la medicina tradicional para el
tratamiento de infecciones comunes. El uso de plantas en infusiones, zumos y preparados se
hicieron efectivos en quemaduras, en problemas respiratorios, y hacen que las personas que
utilizan este tipo de hierbas medicinales tengan un menor riesgo para las enfermedades
infecciosas, adquiriendo cierta resistencia a los agentes patgenos, contrario a los
habitantes en zonas urbanas tratadas con antibiticos tradicionales. (Rojas et al., 2006)
De all, comienza el inters en la investigacin de plantas posiblemente medicinales y
aprovechables en
el mbito mdico. Esta intensa investigacin se orienta hacia la
identificacin de plantas dotadas de actividad farmacolgica, y por ende al descubrimiento

de nuevas sustancias o molculas activas farmacolgicamente, para ser transformadas en
medicamentos
mediante
diversos procesos
qumicos, y
en consecuencia
validar
cientficamente nuestra etnomedicina tradicional.(Alvarado et al., 2008)

La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) a travs de la resolucin WHA 31.33, reconoce
la importancia de plantas medicinales y recomienda que sean establecidos criterios
cientficos y mtodos para asegurar la calidad de las preparaciones obtenidas con plantas
medicinales, as como su efectividad en el tratamiento de condiciones y enfermedades
especificas por diferentes profesionales del rea de la salud y el establecimiento de centros
de investigacin y capacitacin para el estudio de plantas medicinales. (Alvarado et al.,
2008)
Los pases de frica, Asia y Amrica Latina usan la medicina tradicional (MT) para ayudar a
satisfacer algunas de sus principales necesidades de atencin mdica. En frica, hasta el
80% de la poblacin utiliza la medicina tradicional para la atencin primaria de salud. En
pases industrializados, las adaptaciones de la medicina tradicional se denominan
"complementarias" o "Alternativa" (CAM). (OMS)
Ha sido bien documentado que las plantas medicinales confiere una considerable actividad
antibacteriana contra diversos
microorganismos. Los extractos de especias, aceite de
corteza de canela, clavo y aceite de yema, fueron reportados como inhibidores
del
crecimiento de muchas bacterias bucales. (Jonathan et al., 2000). Extracto de t verde, que
es habitualmente tomado despus de cada comida en Japn, se sabe que contienen varios
polifenoles que inhiben el crecimiento de S. mutans (Sakanaka, et al., 1989). Sanguinarine
es un alcaloide del extracto de rizoma de la Sanguinaria canadensis. Se report que posee

un amplio espectro contra una amplia variedad de bacterias orales (Park et al., 2003).
Por otro lado, encontramos la gran biodiversidad de las plantas que se encuentran en Brasil
que probablemente pueden
servir como una fuente importante de nuevos agentes
farmacolgicos. Las Guttiferae representan una gran familia de plantas medicinales con
aproximadamente 1350 especies, muchas de las cuales son conocidos por su sabor a frutas.
Adems, algunos gneros, como Rheedia, tienen muchos tipos de sustancias con diversas
propiedades farmacolgicas. Anteriores estudios han reportado la presencia de flavonoides,
xantonas y benzofenones en algunas especies de Rheedia, mediante el anlisis de sus
qumicos. Una clase de estos compuestos, los benzofenones, mostr una buena e
importante actividad antibacteriana frente a patgenos, lo que sugiere que el gnero
Rheedia es puede ser utilizado potencialmente como medicamento. (Almeida et al., 2007)
2.3
FAMILIA RUBIACEAE
La familia Rubiaceae es una gran familia de plantas que agrupa aproximadamente 6000
especies que se encuentran distribuidas por toda la Tierra, aunque se estn en mayor
cantidad en el trpico. Son principalmente plantas leosas tropicales y consisten la mayora
de rboles y arbustos, en tanto que en las regiones templadas predominan especies de
hbito herbceo. La familia Rubiaceae es monofiltica y que pertenece a las Gentianales,
como lo demuestra el anlisis cladstico. La ms reciente y completa clasificacin subdivide
esta gran familia en cuatro subfamilias, a saber Cinchonoideae, Ixoroideae, Antirheoideae y
Rubioideae, correspondientes a cerca de 50 tribus. No obstante,
pruebas moleculares,
morfolgicas y qumicas de complejas revisiones apoyan la existencia de la subfamilia

Antirheoideae pero en escasa cantidad. Por ejemplo, la tribu de Isertieae de Robbrecht se
subdivide en tres subfamilias; Isertia pertenecientes a Cinchonoideae, Mussaenda, Sabicea
pertenecientes a Ixoroideae y Mycetia a Rubioideae. (Mendoza et al., 2004)
La familia Rubiaceae es considerada una de las ms grandes familias de angioespermas,
comprendiendo cerca de 637 gneros y aproximadamente 10.700 especies, las cuales
tienen su origen principalmente en regiones tropicales, es de gran importancia alimenticia,
ornamental y en la industria farmacutica. Las especies de sta familia son reconocidas
como bioproductoras de alcaloides, taninos, saponinas, esteroides, terpenos y flavonoides,
adems se reporta que algunas especies son de importancia en la medicina tradicional
(Pinto et al., 2008).
Se pueden encontrar gran cantidad de terpenos dentro de las especies de la familia
Rubiaceae. Son una gran familia de metabolitos secundarios que poseen propiedades
biolgicas con funciones fisiolgicas, y por esta razn se utilizan en el rea farmacutica. Es
posible que los triterpenos constituyan el grupo ms importante de terpenos. Ellos presente
una gran cantidad de propiedades medicinales, especialmente anti-inflamatoria, analgsica
y se le atribuyen tambin efectos anti-tumorales. Por otro lado, los flavonoides forman parte
del grupo de compuestos fenlicos y se sabe que poseen propiedades antioxidantes y antiulcerosas, entre otras. (Pinto et al., 2008).
2.3.1
Gnero Isertia
Isertia esta distribuido desde Centro Amrica hasta el norte de Amrica del Sur, de origen
natural en el caribe slo en el extremo oeste de Cuba y Guadalupe. Isertia esta
principalmente distribuida en zonas de la Amazonia y en Guayana. Especies de ambas
secciones, sin embargo, estn en el norte de Colombia y Centroamrica como Costa Rica.
Este gnero es caracterstico de bosques secundarios y sucesionales (Boom, 1984) Figura
1. En Colombia esta planta presenta una distribucin entre los 300-1700 m de altitud y se
encuentra en los departamentos del Amazonas, Antioquia, Boyac, Choc, Caldas, Cauca,
Caquet, Casanare, Cundinamarca, Huila, Meta, Putumayo y Tolima. (Mendoza et al., 2004).
En los Andes se puede encontrar en elevaciones que van desde los 100 hasta los 2000
m.s.n.m y se extiende desde el norte de Costa Rica y de oriente a occidente de la Amazona.
Figura 1. Distribucin de Isertia laevis. (Boom, 1984)
2.3.1.1 Isertia laevis

Son arbustos o rboles pequeos a medianos de 12 metros de alto, ramas cuadrangulares,
delgadas y subteretes o gruesas, glabras o puberulentas. Hojas membranceas a
subcoriceas, elpticas, 29-43 cm de largo, 14-20 cm de ancho, pice agudo o cuspidado
de 1-2 cm de largo, base aguda a redondeada, haz glabro, envs blanco, pubescente.
Pecolo 40-120 mm de largo, 2-5 mm de ancho. 4 estpulas, interpeciolares, triangulares,
5-13 mm de largo. Inflorescencia en pancula. Cliz en forma de copa, 5-6 mm de largo, 3-4
mm de ancho, dentro glabro o ciliado, 5-6 lbulos. Corola blanca, tubular, 32-53 mm de
largo, con pubescencia alrededor de la boca, lbulos 5 a 6. Estambres 6 o 7, anteras
oblongas, 7-9 mm de largo. Ovario 2 a 3 locular. Estilo ciliolado, 32-47 mm de largo, estigma
con 2 lbulos oblongos, 3-5 mm de largo. Fruto en baya, elipsoidal, 8-11 mm de dimetro.
Semillas 0.7-1 mm de largo. Boom (1984), Mendoza et al., (2004)
La clasificacin taxonmica de Isertia laevis segn (Triana) B. M. Boom es la siguiente:
Reino: Plantae
Divisin: Magnoliophyta.
Clase: Magnoliopsida.
Subclase: Asteridae.
Orden: Rubiales
Familia: Rubiaceae.
Subfamilia: Cinchonoideae
Tribu: Isertieae
Gnero: Isertia
Especie: Isertia laevis
A Isertia laevis (Triana B.M. & Boom 1984) se la llama Asaquiro y Asaquir en Vaups, y
Vara Santa en Tolima; las hojas se emplean como anticancergenos y para curar
infecciones de la piel. (Garca-Barriga, 1975). Figura 2.
Figura 2. Hojas y flores de Isertia laevis. (Tomado de Neotropical Herbarium Specimens:

http://fm1.fieldmuseum.org/vrrc)
2.4 MTODOS DE EXTRACCIN
2.4.1
Cromatografa en Columna al Vaco CCV (Vacuum Column Chromatography

- VCC)
En la Cromatografa en Columna al Vaco (CCV) se utiliza una fase estacionaria (inmvil) y

otra mvil. La primera es un slido, el cual puede ser Slica Gel o RP-18, introducido en un
tubo de vidrio situado verticalmente, la segunda es un disolvente o mezcla de disolventes,
tambin llamado eluente eluyente. En primer lugar se debe empacar la fase slida con el
eluyente, de manera que al momento de separar las sustancias sea de manera uniforme.
Posteriormente se deja pasar por la columna, una solucin que contiene la mezcla de
sustancias que se desea separar. De esta forma la mezcla se hace percolar constantemente
con la fase mvil donea a diferentes volmenes, con la aplicacin de vaco al recipiente,
donde ser recoge los componentes separados. Algunos componentes de la mezcla quedan
retenidos fuertemente segn las caractersticas y las propiedades adsorbentes de la fase
estacionara, as las diferentes sustancias atraviesan la columna a distinta velocidad.
(Cannell, 1998)
2.4.2
Fraccionamiento Lquido/Lquido Continuo
Se basa en la distribucin de una sustancia entre dos fases lquidas inmiscibles, estas
sustancias no deben reaccionar, asociarse o disociarse en las fases lquidas. Es posible que
algunas veces, ambas fases puedan saturarse una de la otra. Cuando se extrae una fase
acuosa con una fase orgnica es necesario eliminar el agua disuelta, con una sal inorgnica
anhidra tal como sulfatos de sodio, antes de evaporar el solvente para recuperar el material
extrado.
El fraccionamiento lquido/lquido se puede realizar por medio de la utilizacin de dos tipos de
extractores, uno para solventes menos densos que el agua, y otro para los mas densos que
ella. Es conveniente que el solvente de fraccionamiento sea de bajo punto de ebullicin para
evitar calentamientos de la solucin (Pedrozo, 2008)
2.5 MTODOS PARA LA EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
2.5.1 Mtodo de difusin en pozo
En este mtodo, para cada caja de petri se agregan 20 mililitros (ml) de agar Tripticasa Soya
(TSA) o agar Muller Hinton, inoculado previamente con el microorganismo a evaluar. Al
solidificarse el agar, se abren pozos de un dimetro de 0.5 mm con ayuda de una pipeta
pasteur esterilizada. Posteriormente se agregan las sustancias a evaluar en cantidades de
10, 20 o 40 l. Las cajas de petri se incuban a 37C durante 24 a 72 horas. Al cabo de este
tiempo se evidencia la actividad antimicrobiana, por medio de la presencia de halos de
inhibicin alrededor de los pozos. (Rios et al., 1988. Galvin et al., 1999. Dobner et al., 2003.
Nio et al., 2007)
2.5.2
Mtodo de difusin en disco
El cultivo bacteriano se prepara mezclando algunas colonias en caldo lquido, ajustndolo a

a la escala 0.5 de Mc Farland. Posteriormente se inocula 20 ml de agar TSA fundido con
100 l del caldo anterior, se mezcla bien y es servido en cajas de petri. Despus de dejar
secar por unos diez minutos, se colocan en la superficie discos de papel filtro esterlizados
impregnados de los extractos a evaluar. Si el microorganismo es sensible a la accin del
antimicrobiano, se formar un halo de inhibicin, observndose una zona sin crecimiento
microbiano que rodea el disco impregnado. (Wilkins, et al., 1972. Zaidan et al., 2005).
2.5.3
Bioautografas
Para realizar las Bioautografas se hacen cromatografas determinando las fases mvil y
estacionaria (slica gel) mas apropiadas para las fracciones o compuestos que se quieran
evaluar. Las cromatografas se exponen a radiacin U.V. durante 30 minutos, para ser
esterilizadas y posteriormente hacer uso de ellas.
Se prepara el cultivo bacteriano a evaluar en Agar TSA fundido inoculado con 100 l de
caldo BHI con colonias de la bacteria, ajustado a la escala 0.5 de Mc Farland. Esta
suspensin se homogeniza mecnicamente y se agrega sobre la cromatografa (colocadas
en cajas de petri estriles), quedando cubierta completamente, con la pelcula de agar. La
caja de petri se incuba durante 24 horas a 37 C. Al cabo de este tiempo, las bioautografas
se revelan con una sal de tetrazolium (MTT) y se dejan incubar por 1 hora. Al agregarse el
reactivo se tornara a un color purpura donde hay crecimiento bacteriano, exceptuando los
lugares donde se produzca inhibicin. Se mide el Rf de las zonas de inhibicin. (Valgas et
al., 2007; Cunico et al., 2007; Vianna, et al., 2005; Choma, 2005; Hostettman, 1999; Erazo
et al., 1997)
2.5.4
Mtodo MTT
Ensayo colorimtrico, rpido y verstil, se basado en la reduccin metablica (aceptacin de

H+) del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) o Sal de Tetrazolio, por
la accin de las enzimas deshidrogenasas, produciendo un compuesto coloreado de color
prpura (formazan), permitiendo determinar el crecimiento y la viabilidad de las clulas
tratadas. Este mtodo ha sido muy utilizado para medir supervivencia y proliferacin celular.
La cantidad de clulas vivas es proporcional a la cantidad de formazn producido.
(Shoemaker et al., 2004; Bernas and Dobrucki 2002; Thorn et al., 1993) Figura 3.
Figura 3. Metabolizacin del MTT en Formazn.
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN
3.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA

Buscar la fraccin activa antimicrobiana de I. laevis mediante una metodologa mas simple,
con beneficios econmicos y con posibilidades de implementacin en pequeas industrias,
para el futuro desarrollo de un Fitofrmaco.
3.2 JUSTIFICACIN
Las enfermedades orales constituyen hoy en da una problemtica que afecta al 90% de la
poblacin colombiana; el nivel social, educativo, cultural y econmico, marcan la pauta para
que este hecho prevalezca y tenga mas incidencia en la poblacin. De esta manera, el
estudio de nuevas alternativas, como el determinar la accin antimicrobiana y la
concentracin mnima inhibitoria de extractos y fracciones de Isertia leavis, harn parte de
las estrategias para el control microbiolgico de estas patologas, ya que cada vez ms la
industria farmacutica, encuentran en los recursos naturales, una
fuente con actividad
biolgica, que cuenta con un alcance igual o mayor a los recursos qumicos y la medicina
tradicional. El estudio aportar puntos de vista que ayudarn a encaminar la bsqueda de
nuevos fitomedicamentos por medio de tcnicas, eficaces, econmicas y accesibles que
facilitaran el procesamiento a nivel industrial de fuentes con actividad biolgica, tiles a la
humanidad.
3.3 PREGUNTA DE INVESTIGACIN

En qu difiere en los resultados para
encontrar la fraccin antimicrobiana sobre
Streptococcus mutans ATCC 25175 y Streptococcus sobrinus al utilizar extractos, fracciones

y subfracciones de Isertia laevis obtenidas a partir de dos mtodos diferentes de extraccin?
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la actividad antimicrobiana de la (s) fraccin (es) activa (s) de Isertia laevis obtenida
(s) por medio de dos mtodos diferentes de extraccin, sobre cepas bacterianas de cavidad
oral, S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus, asociadas a la caries dental.
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Obtener extractos, fracciones y subfracciones a partir de hojas de Isertia laevis por

medio de Cromatografa en Columna tipo CCV con RP-18 y Fraccionamiento
Lquido/Lquido.
Determinar el efecto antimicrobiano sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 y

Streptococcus sobrinus de extractos obtenidos a partir de hojas de Isertia laevis con
dos diferentes mtodos; Cromatografa en Columna tipo VCC con RP-18 y
Fraccionamiento Lquido/Lquido.
Evaluar el efecto de la (s) fraccin (es) y la (s) subfraccin (es) activa(s) sobre el
crecimiento de S. mutans ATCC 25175
y S. sobrinus mediante las diferentes
tcnicas de evaluacin antimicrobiana.
Determinar la Concentracin Mnima Inhibitoria de la fraccin y de la subfraccin

activa sobre el gnero Streptococcus.
Realizar un estudio qumico a la (s) fraccin (es)
y la (s) subfraccin (es) que
resulten activas contra Streptococcus mutans ATCC 25175 y Streptococcus

sobrinus.
Comparar los resultados obtenidos con los dos mtodos de fraccionamiento para la
obtencin de la fraccin activa antimicrobiana
5. MATERIALES Y MTODOS
5.1 MATERIAL VEGETAL

El material vegetal se colect en el municipio de Medina departamento de Cundinamarca.
Se separaron las hojas de los dems rganos y secaron a la sombra en un lugar con buena
aireacin. Posteriormente, el material seco de hojas se moli y pulveriz en un molino de
cuchillas para que las partculas pequeas tengan una mayor superficie de contacto con el
solvente, se pes y se guard en un recipiente limpio y seco para uso posterior. Se envi un
ejemplar para su clasificacin taxonmica al Herbario del Instituto de Ciencias Naturales de
la Universidad Nacional de Colombia, fue determinada como Isertia laevis (Triana) B. M.
Boom, de la familia Rubiaceae. Radicado bajo el No. COL: 506495.
5.1.1
Desengrase del material
El material vegetal seco y molido se extrajo en Soxhlet con Petrol durante 72 horas. El
extracto en Petrol se concentr en un rotavapor a presin reducida para posteriormente ser
filtrado y llevado a sequedad. El marco desengrasado se extrajo por maceracin en fro con
EtOH, este extracto crudo se concentr a presin reducida en rotaevaporador.
5.1.2
Obtencin de extractos
Los extractos, fracciones y subfracciones se obtuvieron a partir de las hojas de Isertia laevis
en el Laboratorio de Fitoqumica de la Facultad de Ciencias Bsicas de la Pontificia
Universidad Javeriana.
5.1.3
Mtodos de Extraccin
Los extractos, fracciones y subfracciones de las hojas de Isertia laevis fueron obtenidos a
partir de dos mtodos diferentes de Extraccin:
5.1.3.1 Mtodo 1. Se sigui la metodologa descrita por (Alvarado et al., 2007. Alvarado et
al., 2008), cromatografa en columna al vaco tipo CCV, con las siguientes condiciones de
separacin: columna de vidrio con frita de dimetro de 5.5 cm aproximadamente y longitud

de 30 cm aproximadamente, fase estacionaria RP-18 se utilizaron 50 gramos, muestra a
separar: 1 gramo del extracto en etanol previamente desengrasado y las fases mviles
MeOH-H2O (10:2), MeOH, MeOH-CH2Cl2 (1:1) y CH2Cl2. con un volumen por solvente de 120
ml. Figura 4.
MATERIAL VEGETAL
Extracto de EtOH (1g) Isertia laevis
Cromatografa en
Columna tipo CCV:
RP-18 (50 g)
MeOH-H2O (10:2)
MeOH
120 ml
120 ml
Fraccin
MeOH-H2O
MeOH-CH2Cl2 (1:1)
CH2Cl2
120 ml
120ml
Fraccin
Fraccin
Fraccin
MeOH
MeOH-CH2Cl2
CH2Cl2
Se concentraron en rotavapor 40C

Figura 4. Separacin del extracto etanlico de Isertia laevis por Cromatografa en Columna al
vaco (CCV) con fase estacionaria RP-18: Esquema del Primer mtodo.
5.1.3.2 Mtodo 2. Fraccionamiento Lquido/Lquido contino con
solventes en orden
ascendente de polaridad.
Condiciones de separacin: A 1 gramo del extracto de etanol (EtOH), disuelto en 10 ml de
EtOH, se realiz fraccionamiento lquido/liquido continuo con ter de petrleo (EtOH) 1000
ml, diclorometano (CH2Cl2) 2000 ml, acetato de etilo (AcOEt) 1000 ml y butanol (BuOH) 500
ml. Estas fracciones se llevaron a rotavapor a 40C para concentrar a sequedad. Figura 5.
MATERIAL VEGETAL
Extracto de EtOH (1g): Isertia laevis
Fraccionamiento
lquido/lquido
ter de petrleo 1000 ml
Fraccin ter de Petrleo
Fraccin Acuosa
Fracionamiento
Se concentr en
rotavapor 40C
lquido/lquido
CH2Cl2 2000 ml
Fraccin CH2Cl2
Fraccin Acuosa
Fraccionamiento
Se concentr en
rotavapor 40C
Fraccin AcOEt
lquido/lquido
AcOEt 1000 ml
Fraccin Acuosa
Fraccionamiento
Lquido/Lquido
Se concentr en
rotavapor 40C
Butanol 500 ml
Fraccin Butanol
Se concentr en
rotavapor 40C
Figura 5. Separacin del extracto etanlico de Isertia laevis por Fraccionamiento

lquido/lquido continuo: Mtodo 2.
Residuo
5.1.3.3 Columna de Sephadex. Mtodo de Separacin de Clorofilas.

(Obtencin de Subfracciones de la Fraccin Activa) con las siguientes
condiciones de separacin: columna de vidrio con frita de dimetro de 2.5
cm y longitud de 35 cm aproximadamente, fase estacionaria Sephadex:
se utilizaron 10 gramos, muestra a separar: 100 mg de la Fraccin CH 2Cl2
y la fase mvil MeOH-CH2Cl2 (9:1) 150 ml. Figura 6 y 7.
Figura 6. Cromatografa en Columna con Sephadex
Fraccin Activa
Fraccin CH2Cl2
100 mg
e
d
Cromatografia
Sephadex 10 g
c
b
Sf 1
Sf 2
Sf 3
Sf 4
a
1
Se concentr en rotavapor 40C

A
Figura 7 A) Mtodo de Separacin de Clorofilas: Columna Sephadex, FE: Sephadex 10 g,

FM: MeOH-CH2Cl2 (9:1). Monitoreo en Cromatografa de Subfracciones de CH2Cl2 (FE:
RP-18. FM: MeOH-CH2Cl2 (9:1). B) Revelada con cido perclrico: a. Rf: 0,1. b. Rf: 0,32. c.
Rf: 0,50. d. Rf: 0,74 y e. Rf: 0,86 C) Luz U.V.
5.1.4
Pruebas qumicas cualitativas

Prueba de Liebermann-Brchard: Para revelar la presencia de compuestos
orgnicos como triterpenos y esteroides, se mezcla en partes iguales de anhdrido
actico y cido sulfrico. Los triterpenos se evidencian por una coloracin violeta y
los esteroides dan coloraciones que varan del rosa, naranja, rojo y verde. (Cannell
1998)
Molibdato de amonio: Se disuelve Molibdato de amonio en H2SO4, para evidenciar la

presencia de Terpenos especialmente Diterpenos, visualizndose un color azul.
(Cannell 1998)
Reaccin de Brntrager: Detecta grupos antraquinnicos y cumarinicos. Consiste en

agregar una solucin alcalina de KOH al 5 10%, la aparicin de una coloracin roja
indica la presencia de estos grupos. (Cannell 1998)
Reactivo de Dragendorff: Constituido por yoduro doble de bismuto y potasio que

reacciona formando sales dobles que se visualizan por una coloracin naranja, en el
caso de los alcaloides. (Cannell 1998)
Cloruro Frrico (FeCl3): Se prepar el FeCl3 al 5% en HCl para revelar la presencia

de compuestos fenlicos, por coloraciones desde azul-negro hasta verde. (Cannell
1998)
ndice de espuma: este ensayo permite detectar la presencia de saponinas

(sustancias con propiedades tensoactivas) a travs de la formacin de espuma
persistente (durante 15 min), usando un 1 g de extracto vegetal seco, en un volumen
apropiado de agua destilada. (Cannell 1998)
5.2 EVALUACIN
DE
LA
ACTIVIDAD
FRACCIONES Y SUBFRACCIONES
5.2.1
Cepas evaluadas
ANTIMICROBIANA
DE
EXTRACTOS,
Se evaluaron dos (2) cepas de cavidad oral asociadas a caries dental. Las cepas de
referencia son Streptococcus mutans ATCC 25175
y Streptococcus sobrinus (Cepa
espaola, Universidad de Granada), las cuales fueron suministradas por el Centro de

Investigaciones Odontolgicas (CIO) de la Pontificia Universidad Javeriana.
5.2.2
Evaluacin de la actividad antimicrobiana
5.2.2.1 Mtodo de Difusin en Pozo

La actividad antimicrobiana de los extractos y fracciones frente a las cepas de cavidad oral
se realiz segn la tcnica descrita por M. Galvn et al., 1999 y Dobner et al., 2003. A partir
de un cultivo puro de cada una de las cepas a evaluar (S. mutans ATCC 25175 y S.
sobrinus), se hizo una suspensin en Caldo
BHI (Brain-Heart Infusin) ajustada por
turbidimetra a la escala 0.5 de Mc Farland. Para prepara una caja de petri, se tomaron 100
l y se agregaron a 20 ml de agar Tripticasa Soya (TSA) fundido, se mezcl y se sirvi en la
caja (este procedimiento se realiz para el total de cajas a utilizar en las pruebas de
actividad antimicrobiana). Al solidificarse y de esperar aproximadamente 20 minutos, a cada
caja de petri se le abrieron de 3 a 4 pozos con ayuda de una pipeta pasteur estril. En cada
pozo se agregaron independientemente de 20 a 50 l de los extractos y las fracciones
disueltas previamente en Dimetilsulfxido (DMSO) a una concentracin de 100mg/ml. Como
control positivo se utilizaron 50 l de Azitromicina y como control negativo DMSO 50 l. En
seguida, las cajas de petri se incubaron en sistema de anaerobiosis a 37C durante 24- 30
horas. Al trmino de la incubacin se determinaron los dimetros de la inhibicin
antimicrobiana y la no presencia de actividad.
5.2.2.2 Mtodo Difusin en Disco
La actividad antimicrobiana de los extractos y fracciones
tambin se evaluaron por el
Mtodo Difusin en Disco segn la tcnica descrita por G. More et al. 2008. A partir de un
cultivo puro de cada una de las cepas a evaluar (S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus), se
hizo una suspensin en Caldo BHI ajustada por turbidimetra a la escala 0.5 de Mc Farland.
De esta suspensin se agregaron 100 l a 20 ml de agar TSA fundido, se mezcl y se sirvi
en caja y se dejo enfriar. Previamente los extractos se disolvieron en DMSO a una
concentracin final de 100 mg/ml. Se tomaron diferentes cantidades a probar de cada uno de
los extractos; 20 l (2 mg/disco), 30 l (3 mg/disco), 40 l (4 mg/disco), 50 l (5 mg/disco) y
60l (6 mg/disco), estas cantidades se transfirieron a discos de papel filtro esterilizados de 5
mm de dimetro. Se utilizaron como control positivo Azitromicina (30l) y como control
negativo DMSO en disco en las mismas concentraciones que los extractos. Las cajas de
petri se incubaron en anaerobiosis a 37C por 24 - 30 horas. Al trmino de la incubacin se
determinaron los dimetros de la inhibicin antimicrobiana y la no presencia de actividad.
5.2.2.3 Evaluacin del efecto antimicrobiano de la(s) fraccin (es) activa (s) sobre el
crecimiento de Streptococcus mutans ATCC 25175 y Streptococcus sobrinus
por Bioautografas
Las fracciones que resultaron positivas para la actividad antimicrobiana por los mtodos
anteriores, se les realizaron Bioautografas segn la tcnica descrita por Valgas et al., 2007;
Cunico et al., 2007; Vianna, et al., 2005; Choma, 2005; Hostettman, 1999;
Erazo et al.,
1997, sembrando placas cromatogrficas de 7,5 cm. de largo x 2.5 cm. de ancho con cada
uno de las fracciones. Se corrieron las fracciones MeOH (2), MeOH: CH2Cl2de la Segunda
Marcha CH2Cl2, utilizando como fase estacionaria slica gel, y como fase mvil CH 2Cl2MeOH (9.5:0.5). Estas placas cromatogrficas se expusieron a la radiacin U.V. ( 260 nm)
durante 30 minutos con el propsito de esterilizarlas para su posterior uso.
Se prepararon suspensiones en Caldo BHI para cada bacteria S. mutans ATCC 25175 y S.
sobrinus, ajustadas por turbidimetra a la escala 0.5 de Mc Farland. De cada suspensin se
tomaron 200 l y se agregaron a 20 ml de agar TSA fundido, se mezclaron y se sirvieron 10
ml del agar TSA inoculado a cada caja de petri, donde se colocaron previamente las placas
Cromatogrficas, utilizando una caja de petri por placa. Las cajas de petri se incubaron en
anaerobiosis a 37C por 24 - 30 horas. Al trmino de la incubacin las Bioautografas se
revelaron agregando a su superficie
sal de tetrazolium (MTT) preparada con solucin
acuosa a una concentracin de 2.5 mg/ml y se dejaron incubando por 6 horas. Transcurrido
este tiempo, las bioautografas tomaron un color violeta intenso, exceptuando las zonas
donde se gener la inhibicin del crecimiento bacteriano por parte de los metabolitos activos
presentes en las cromatografas de cada fraccin activa, quedando estas zonas de color
marfil, a los cuales se les midi su Rf.
6. RESULTADOS
6.1 ESTUDIO MICROBIOLGICO

Durante la realizacin del estudio microbiolgico de las fracciones se utiliz Mtodo Difusin
en Pozo y Mtodo Difusin en Disco. Tras la realizacin de varios ensayos con el Mtodo de
Difusin en Disco, los halos de inhibicin eran de difcil visualizacin, debido a la baja
difusin del extracto en el papel filtro esterilizado y poco contacto que tena ste con el agar
inoculado con las bacterias en evaluacin. Por esta razn, se decide utilizar solamente el
Mtodo Difusin Pozo, con el cual los halos de inhibicin se observan con claridad. Figura 8.
Figura 8. Comparacin de la difusin del los extractos en disco (A) y pozo (B)
6.1.1. Evaluacin microbiolgica de las fracciones obtenidas por el mtodo 1:

Cromatografa en Columna al Vaco (CCV)
Se realiz una prueba inicial, evaluando la accin antimicrobiana
de las fracciones
obtenidas por el Mtodo 1 (FE: RP-18 Y FM: MeOH-H2O (10:2), MeOH, MeOH-CH2Cl2 (1:1)
y CH2Cl2): Fraccin MeOH-H2O, fraccin MeOH, fraccin MeOH-CH2Cl2 y fraccin CH2Cl2, a
una concentracin final de 3 mg por pozo. Se observ que la fraccin MeOH y la fraccin
MeOH-CH2Cl2, presentaron actividad antimicrobiana sobre S. mutans ATCC 25175 y S.
sobrinus (Tabla 1, Figuras 9 y 10)
Figura 9. Actividad antimicrobiana de (A) la fraccin MeOH y (B) fraccin de MeOH-CH2Cl2

sobre S. mutans ATCC 25175, a una concentracin final de 3 mg por pozo.
Extracto
S. Sobrinus
Fr. MeOH-H2O
Fr. MeOH
Fr. MeOH-CH2Cl2
11
11
Fr. CH2Cl2
DMSO
15
15
Azitromicina (AZM)
Tabla 1. Halos de susceptibilidad en mm, (promedio de tres pruebas) presentados por S.

mutans ATCC 25175 y S. sobrinus al estar en contacto con la fraccin MeOH-H2O, fraccin
MeOH, fraccin MeOH-CH2Cl2 y fraccin CH2Cl2, obtenidas a partir de hojas de I. laevis.
14
12
10
S. m utans ATCC 251 75
S. sobrinus
6
4
AZM
DMSO
Fr.
CH2 Cl2
Fr.
MeOHCH2 Cl2
Fr. MeOH
2
Fr.
MeOHH2 O
Halos de inhibicin (mm)
16
3 m g/pozo
Figura 10. Accin antimicrobiana de la fraccin MeOH-H2O, fraccin MeOH-H2O, fraccin

MeOH, fraccin MeOH-CH2Cl2 y fraccin CH2Cl2 obtenidas a partir de hojas de I. laevis.
6.1.2 Evaluacin microbiolgica de las fracciones obtenidas por el mtodo 2:
Fraccionamiento lquido/lquido Continuo
Se determin la evaluacin de la accin antimicrobiana de las fracciones del Mtodo 2: ter
de Petrleo, CH2Cl2, AcOEt y Butanol a una concentracin final de 1mg por pozo sobre S.
mutans ATCC 25175 y S. sobrinus. Se observ que solo el extracto CH2Cl2, present
actividad antimicrobiana
sobre estos dos microorganismos (Tabla 2, Figuras 11 y 12).
Razn por la cual se contina la evaluacin de las mismas fracciones a mayor

concentracin.
Figura 11. Halo de inhibicin (6 mm)sobre S. mutans ATCC 25175 producido por la fraccin
CH2Cl2 a 1 mg por pozo, revelado con MTT
Extracto
S. Sobrinus
ter de petrleo
CH2Cl2
AcOEt
Butanol
DMSO
14
13
AZM
Tabla 2. Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans ATCC 25175 y S.

sobrinus al estar en contacto con las fracciones ter de Petrleo, CH2Cl2, AcOEt y Butanol
obtenidas a partir de hojas de I. laevis
16
14
12
10
Halos de
inhibicin 8
(m m )
6
S. mutans
ATCC 251 75
S. sobrinus
Columnas 1 9
AZM
DMSO
Butanol
AcOEt
Eter de
Petroleo
CH2 Cl2
1 m g por pozo
Figura 12. Accin antimicrobiana de las fracciones ter de Petrleo, CH2Cl2, AcOET
Butanol obtenidas a partir de hojas de I. laevis sobre S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus,
una concentracin final de 1mg por pozo.
Los microorganismos en evaluacin presentaron susceptibilidad con halos de inhibicin entre
6 mm y 7 mm, ante la fraccin CH2Cl2 a una concentracin de 2 mg por pozo, exceptuando
las dems fracciones que no muestran ninguna accin antimicrobiana. (Tabla 3, Figuras 13 y
14)
Figura 13. Halo de inhibicin (7 mm) sobre S. mutans ATCC 25175 producido por el extracto
en CH2Cl2 a 2 mg por pozo. (A: Sin MTT. B: Revelado con MTT)
Extracto
S. Sobrinus
ter de petrleo
CH2Cl2
AcOEt
Butanol
DMSO
14
13
Azitromicina

sobrinus al estar en contacto con las fracciones ter de Petrleo, CH2Cl2, AcOET y Butanol
obtenidas a partir de hojas de I. laevis, a una concentracin de 2 mg por pozo.
16
14
12
Halos de 1 0
inhibicin 8
(m m )
6
S. mutans
ATCC 251 75
S. sobrinus
AZM
DMSO
Butanol
AcOEt
Eter de
Petroleo
CH2 Cl2
2 m g por pozo
Figura 14. Accin antimicrobiana de las fracciones ter de Petrleo, CH2Cl2, AcOEt y Butanol
obtenidas a partir de hojas de I. laevis sobre S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus.
Despus de conocer la actividad antimicrobiana de la fraccin CH2Cl2 obtenida a partir del

Mtodo 2 sobre S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus, se contino haciendo un tamizaje
(CMI) de la misma fraccin a concentraciones de 0.5 mg por pozo, 1 mg por pozo, 2 mg por
pozo, 5 mg por pozo, 10 mg por pozo y 20 mg por pozo. En la Tabla 4, figura 15 y 16 se
observan los resultados de esta evaluacin.
Figura 15. Halos de inhibicin sobre S. mutans ATCC 25175 producido por la fraccin
CH2Cl2 en concentraciones de (a) 0.5 mg por pozo, (b) 1 mg por pozo, (c) 2 mg por pozo, (d)
a
5 mg por pozo, (e) 10 mg por pozo y (f) 20 mg por pozo, sin y con MTT.
MTT
Fraccin CH2Cl2
(mg/pozo)
0.5
10
20
DMSO
AZM
S. mutans
6.5
10
15
S. sobrinus
6.5
7.5
10
15

sobrinus al estar en contacto con la fraccin CH2Cl2 a concentraciones de 0.5 mg por pozo,
1 mg por pozo, 2 mg por pozo, 5 mg por pozo, 10 mg por pozo y 20 mg por pozo.
16
14
12
10
S. muitans
ATCC 25175
8
6
S. sobrinus
4
2
0
0,5
10
20
DMSO
AZM
mg/pozo
Figura 16. Accin antimicrobiana de la fraccin de la 2. Marcha a concentraciones de 0.5

mg por pozo, 1 mg por pozo, 2 mg por pozo, 5 mg por pozo, 10 mg por pozo y 20 mg por
pozo sobre S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus.
Debido a la actividad antimicrobiana de la fraccin CH2Cl2, se obtienen cuatro subfracciones
libres de clorofila por medio de Cromatografa en Columna con FE: Sephadex (10 g) y FM:
MeOH:CH2Cl2 9:1 (100 ml). Posteriormente fueron monitoreadas por cromatografa en cada
delgada
CCD (RP18, MeOH:CH2Cl2 9:1) y reveladas con
cido Perclrico. Con las
subfracciones obtenidas y a una concentracin de 0.6 mg por pozo se realiz un tamizaje

antimicrobiano sobre S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus. Se evidencia la accin por
medio del Mtodo de MTT. En la Tabla 6, Figura 17, 18, 19 y 20 se observan los resultados
de esta evaluacin.
Figura 17. Actividad antimicrobiana de Subfraccin No. 2 de CH 2Cl2. Halo de inhibicin (13
mm) en S. sobrinus. (A: Sin MTT. B: Revelado con MTT) a una concentracin de 0.6 mg por
pozo.
Figura 18. Actividad antimicrobiana de Subfraccin No. 3 de CH2Cl2. Halo de inhibicin (7

pozo.
Figura 19. Actividad antimicrobiana de Subfraccin No. 4 de CH2Cl2. Halo de inhibicin (8

pozo.
Subfraccin
S. Sobrinus
No.
1
12
13
DMSO
Azitromicina
15
14

sobrinus al estar en contacto con las subfracciones de CH2Cl2 a una concentracin de 0.6
mg por pozo.
16
12
10
S. mutans ATCC 251 75
S. sobrinus
6
4
AZM
DMSO
Sf 2
Sf 1
Sf 4
2
Sf 3
14
0 .6 m g por pozo
Figura 20. Accin antimicrobiana de las subfracciones CH2Cl2 obtenidas a partir de la

fraccin CH2Cl2 a una concentracin de 0.6 mg por pozo.
6.1.3 Biautografas
La fraccin MeOH, fraccin MeOH:CH2Cl2 y la fraccin CH2Cl2 se corrieron en CCD,

FE:Slica Gel con FM: MeOH:CH2Cl2 (1:9) y se realiz la bioautografa. En ella se logr
observar inhibicin en la fraccin MeOH (Rf: 0.298 y 0.32) y en la fraccin de CH 2Cl2 (Rf:
0.32). Figura 21.
0,298 y 0.32
0,32
Figura 21. Bioautografa con FE: Slica Gel y FM: MeOH:CH2Cl2 (1:9) revelada con MTT (1)
fraccin MeOH, presencia de zonas de inhibicin: Rf 0,298 y 0,32. (2) fraccin CH2Cl2,
presencia de zona de inhibicin: Rf 0.32.
6.1.4 Comparacin de las fracciones activas obtenidas a partir de los dos Mtodos de
extraccin.
Se realiz un monitoreo de las fracciones con actividad antimicrobiana: fraccin MeOH,
MeOH:CH2Cl2 y la fraccin CH2Cl2, comparadas con la subfraccin activa del estudio anterior
de I. laevis, por cromatografa CCD (RP-18, MeOH:CH2Cl2 (9.5:0.5)) revelada con cido
perclrico. Los Rf de las sustancias detectadas en la fraccin MeOH, fraccin MeOH:CH 2Cl2
fueron 0,234 y 0,421. Los Rf de la fraccin CH 2Cl2 fueron 0,078, 0,234, 0,418 y 0,568. Los Rf
de la subfraccin activa del estudio anterior fueron 0,234 y 0,419. En la figura 21 se observa
que existen dos sustancias fcilmente detectables y comunes en las fracciones, que
corresponde a los Rf 0,234 y 0,42. Esto nos demuestra que por medio de los dos Mtodos
de extraccin se logra obtener la fraccin Activa. Con el Mtodo 1 se obtiene la fraccin
activa con un menor grado de mezcla, a comparacin del Mtodo 2, con el cual se obtiene la
fraccin activa con mayor grado mezcla (Con clorofilas). Sin embargo la cantidad de fraccin
activa obtenida por el Mtodo 1 es mucho menor, a la obtenida por el Mtodo 2. (Fr. MeOH=
188,7 mg, Fr. MeOH:CH2Cl2 = 323,5 mg Vs. CH2Cl2= 716,6 mg)
B
0,42
0,234
Figura 21. A) Cromatografa CCD (RP-18, MeOH:CH2Cl2 (9.5:0.5)) revelada con acido
perclrico (1) fraccin MeOH, (2) fraccin MeOH:CH2Cl2, (3) fraccin CH2Cl2 y (4) ubfraccin
activa del estudio anterior de I. leavis. B) Compuestos de inters: Rf 0,234 y 0,42.
6.1.5 Separacin de los metabolitos secundarios de las fracciones activas y su
evaluacin antimicrobiana.
Se eligi las fracciones del Mtodo 1 (MeOH y MeOH:CH2Cl2) para obtener mayor muestra
con los compuestos de inters, por medio de repetidas Cromatografas en Columna por
gravedad con FE: RP-18 y FM: MeOH:CH2Cl2 9:1. Se obtuvieron tres muestras, donde se
encuentran los dos compuestos de inters que presentan actividad antimicrobiana. En la
figura 22 se observa la Cromatografa en Capa Delgada (FE: RP-18; FM: MeOH:CH2Cl2 9:1)
revelada con cido perclrico de las tres muestras obtenidas, denominadas as: Compuesto
1 (C1), Compuesto 2 (C2) y la Fraccin Activa Original (Fr. A.O.)
C1
C2
Fr. A.O.
Figura 23. Cromatografa CCD (FE: RP-18; FM: MeOH:CH2Cl2 9:1) revelada con acido
perclrico de los compuestos separados. Se evidencia los compuestos de inters a (Rf: 0,37)
y compuesto de inters b (Rf: 0,51).
En la tabla 7, figura 24 y 25 se observan los resultados de la evaluacin microbiolgica de
Los compuestos (C1, C2 y Fr. Activa Original) obtenidos de las fracciones activas obtenidos
del Mtodo 1, a una concentracin de 0.4 mg/pozo, en el siguiente orden: C1: que contiene
en mayor cantidad del compuesto de inters b, C2: que contiene en mayor cantidad el
compuesto de inters a y la Fraccin Activa Original que posee los dos compuestos a y b.
C1
C2
Fr. Activa Original
Figura 24. Actividad antimicrobiana de los compuestos separados [0.4 mg/pozo]: C1, C2 y
Fr. Activa Original sobre S. mutans ATCC 25175.
Compuesto No.
Fr. Activa Original
DMSO
AZM
S. mutans
6.5
6.2
8.5
15
S. sobrinus
6.5
6.2
8.5
14

sobrinus al estar en contacto con los compuestos separados (C1, C2 y Fr. Activa Original) a
una concentracin de 0.4 mg/pozo
16
14
12
10
S. sobrinus
6
4
2
0
C1
C2
Fr. Activa
Original
DMSO
AZM
0,4 m g/pozo
Figura 25. Accin antimicrobiana de las subfracciones purificadas [0.4 mg/pozo]: C1, C2 y
Fr. Activa Original sobre S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus
6.2 ESTUDIO QUIMICO
6.2.1
Estudio qumico de los compuestos de inters.
En la tabla 8 y figura 26 se presenta el anlisis qumico cualitativo realizado a los

compuestos de inters (C1, C2 y Fr. Activa Original), mediante cromatografa en capa fina
(CCD), para investigar la presencia de metabolitos secundarios, emplendose como FE:
RP-18 y FM: MeOH: CH2Cl2 (9:1) y el ndice de espuma. Se evidencia la presencia de

terpenos, esteroides y saponinas.
C1
C2 Fr.A.O.
C1
C2
Fr. A.O.
C1
C2 Fr.A.O.
C1
C2 Fr.A.O.
Figura 26. Pruebas Qumicas Cualitativas en CCD A) Prueba de Dragendorff. B) Prueba de

Lieberman-Brchard. C) Prueba de Brntrager D) Molibdato de Amonio. Positivas para
Terpenos y Esteroides.
Prueba
Lieberman-Brchard (Triterpenos y esteroides)
Molibdato de Amonio (Diterpenos)
Brntrager (Antraquinonas)
Dragendorff (Alcaloides)
Cloruro Frrico (FeCl3) (Fenoles)
Indice de Espuma
Resultado
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Tabla 8. Pruebas qumicas cualitativas en CCD e ndice de Espuma de los compuestos de

inters.
7. DISCUSIN
Colombia es un pas destacado en el mundo por sus recursos naturales, la gran variedad de
flora que se encuentra en ella, ha permitido el desarrollo de la medicina artesanal. (Rojas et
al., 2006).Las culturas indgenas marcaron la pauta en el uso de las plantas, basados en la
experiencia y el conocimiento emprico, lograron obtener sustancias tiles para la curacin y
tratamiento de enfermedades. Este conocimiento que ha permanecido durante el tiempo y
aun es utilizado como medicina alternativa, ha creado inters en muchos para seguir con la
bsqueda de nuevas fuentes medicinales que ayuden a disminuir la incidencia y prevalencia
de enfermedades que aquejan a la humanidad, y mejor an teniendo como fuente las
plantas, que por su eficacia, accesibilidad y costo, se ha establecido como la mejor opcin
para desarrollar medicamentos.
La caries dental aun es considerada un problema de salud pblica que afecta a muchos
pases incluyendo Colombia. El desequilibrio entre las especies microbianas y diferentes
factores externos como la alimentacin, la higiene oral y el nivel socio-econmico influyen en
el desarrollo de esta patologa. La microflora oral es un sistema complejo que contienen una
gran variedad de especies bacterianas. Entre los principales microorganismos asociados a la
caries dental son, en orden de importancia: S. mutans, en menor proporcin S. sobrinus, y
especies de Lactobacillus y Actinomyces. (Shigeyuki H. and Hutton D. 1980). Est claro que
el S. mutans cumple un papel importante en la patognesis de la caries dental, su
prevencin debe estar encaminada en la inhibicin de la adhesin de este microorganismo a
la superficie del diente y la inhibicin de la glusiltransferasa para formar glucano insoluble en
agua, el cual es esencial para la misma adherencia. Al tener presentes estos dos mecanismo
de accin de la bacteria nos hace plantear estrategias eficaces para la disminucin o
eliminacin de la misma en cavidad oral, ya que los tratamientos dentales usualmente son
costosos y de difcil acceso, especialmente en pases en desarrollo como Colombia
(Napimoga et al., 2005)
Muchos estudios se han encaminado a la identificacin de compuestos o metabolitos

secundarios de productos naturales, contra Streptococcus mutans, gran variedad de familias
de plantas han demostrado actividad inhibitoria, como las fabceas (Katsura et al., 2001),
familia Moraceae (Park et al., 2003), familia Clusiaceae (Almeida et al., 2007), familia
Theaceae (Tsai et al., 2007), familia Rubiaceae (Jayasinghe et al., 2002) , familia Vitaceae
(Rivero, et al., 2008), familia Asteraceae (Yatsuda, et al., 2005), familia Zingiberaceae ( Xiao,
et al., 2006), entre otras. Una familia que en su gran mayora encontramos en Colombia es la
Rubiceae, que contienen sustancias comunes que poseen actividad biolgica, especialmente
del gnero Isertia, lo que da una razn para ampliar el estudio de este gnero el cual
presenta un amplio espectro de inhibicin, por medio de la bsqueda de tcnicas asequibles
y eficientes para encontrar sustancias antimicrobianas.
En este estudio se realizaron dos mtodos para la obtencin de fracciones y subfracciones,
de las cuales se obtuvieron resultados positivos para la actividad antimicrobiana. Durante la
realizacin del Mtodo 1: Cromatografa en Columna al Vaco CCV, se demostr actividad
inhibitoria en las fracciones de MeOH y MeOH:CH2Cl2 (1:1). La columna se eluy con
volmenes de 120 ml aproximadamente. Las fracciones que presentaron actividad fueron
obtenidas durante los ltimos volmenes de solventes que se agregarn a la columna, es
decir de MeOH y MeOH:CH2Cl2 (1:1), comparndose estos resultados
con estudios
anteriores de I. laevis (Alvarado et al., 2008), las fracciones que presentaban inhibicin sobre
las bacterias, se encontraban en la fraccin de MeOH:H2O, ya que se obtuvieron con cuatro
veces el volumen que se utiliz en el presente estudio, es decir, los mismos compuestos se
lograron obtener solo al final de la marcha de la columna lo que difiere al estudio anterior.
Ahora bien, con el Mtodo 2: Fraccionamiento lquido/lquido continuo, se logr extraer la
fraccin activa, sin embargo esta no se encontr en la misma fase mvil utilizada en la
primera metodologa, ya que se extrajo en Diclorometano (Fraccin CH2:Cl2). Esto nos indica
que la fraccin antimicrobiana tiene sustancias polares y no polares. Con la Cromatografa
en Columna al Vaco CCV, las fracciones con actividad se extrajeron con disolventes con
mayor polaridad como el Metanol y con el fraccionamiento lquido/lquido Continuo, se
obtuvieron con disolventes de mediana o baja polaridad como lo es el Diclorometano. La
cantidad de volmenes utilizados influy en que se encontrar la fraccin activa en
diferentes solventes, pues a diferencia del mtodo 1, se utilizaron hasta 2000 ml de solvente,
logrando una extraccin ms eficiente y relativamente rpida.
El fraccionamiento lquido/lquido proporcion una tcnica eficaz en la obtencin de la

fraccin activa a mayor cantidad y debido a su bajo costo, ya que solo es necesaria la
utilizacin de solventes y calor, esto representa una opcin econmica para la extraccin de
sustancias, lo que podr permitir que esta tcnica puede ser implementada a nivel industrial,
debido a que los materiales utilizados no cambian, ni modifican las sustancias que se
quieren encontrar, debido a su bajo procesamiento, contrario al mtodo de Cromatografa
en Columna al Vaco CCV, donde se obtiene poca cantidad de extracto, con materiales
como el RP-18, el cual no se utiliza industrialmente, por su costo y viabilidad. Sin embargo,
CCV permite obtener fracciones con un grado de mezcla menor, lo que no se puede esperar
del fraccionamiento liquido/lquido donde el grado de mezcla de las sustancias extradas es
mucho mayor, lo que se logro evidenciar en el monitoreo con CCD (FE: RP-18, FM:
MeOH:CH2Cl2 9:1)
Al evaluarse las fracciones obtenidas de cada mtodo, se obtuvieron mejores resultados
con la tcnica Difusin en pozo, pues los extractos lograban una mayor difusin en el agar a
diferencia de la tcnica Difusin en disco que como lo reporta More et al., 2008, esta
proporciona buenos resultados, sin embargo, al evaluarse la actividad antimicrobiana de las
fracciones de este trabajo, parte del mismo aplicado al papel filtro esterilizado, no permiti su
correcta difusin y es posible que el mismo papel generar interferencias en los resultados.
Contrario a los presentados por el mtodo Difusin en pozo que segn autores como Galvin
et al., 1999, permiten una fcil difusin y contacto completo del extracto con el agar
inoculado con las bacterias en estudio.
Al obtenerse resultados positivos, similares en el porcentaje de inhibicin tanto para S.
mutans ATCC 25175 as como para S. sobrinus, nos hace pensar que existan compuestos
presentes en las fracciones que in vitro, pueden ser los responsables de interferir en los
factores de virulencia y por ende afectar la sobrevivencia de estos microorganismos, como lo
confirma Almeida et al., 2007, por lo que creemos de importancia evaluar estos compuestos
in vivo.
Las fracciones activas se evaluaron a concentraciones de 0,5 a 20 mg por pozo, con las
fracciones del Mtodo 1 se evidenciaron resultados positivos a 2 mg por pozo, la fraccin
con actividad antimicrobiana del Mtodo 2 mostr resultado positivo a 1 mg por pozo. Las
subfracciones se obtuvieron a partir de la fraccin Diclorometano (CH2:Cl2) debido a la
cantidad que se tena, contrario a las fracciones del Mtodo 1, del cual se obtuvo poca
muestra. En la evaluacin de estas subfracciones se evidencio excelente inhibicin en la
Subfraccin 2, monitoreada por cromatografa RP-18 corrida con MeOH:CH2Cl2 (9:1) dos
compuestos que se destacaban visualmente, y adicionalmente mostraba menor grado de
mezcla. La Subfraccin 3 produjo inhibicin en menos proporcin, ya que contaba con cierta
cantidad de clorofila, lo que nos hace pensar que este componente se comporta como un
interferente en la accin antimicrobiana de la fraccin.
Las Fracciones activas se evaluaron por medio de Bioautografas, las cuales se revelaron
con Sal de tetrazolium o MTT, para permitir la visualizacin de zonas de inhibicin, por
medio de la reduccin metablica del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol
por parte de las bacterias viables, produciendo formazan, el cual se caracteriza por una
coloracin azul-prpura, indicndonos la presencia de crecimiento bacterial donde el extracto
no produjo ninguna accin antimicrobiana. La Bioautografa es entonces un mtodo que nos
permite, saber si los compuestos que se separan por medio de la cromatografa, tienen
accin por si solos o es necesaria su unin para producir un efecto inhibitorio significativo.
Los resultados presentados nos demuestra que la accin antimicrobiana se da por los dos
compuestos de inters sin embargo la unin de los dos produce mayor efecto inhibitorio.
El mtodo MTT, no solo fue aplicado a las Bioautografas, sino tambin se implemento en la
visualizacin de los halos de inhibicin, producidos por los extractos evaluados por medio del
Mtodo de Difusin en Pozo, permitindonos una fcil lectura del dimetro de los halos.
Todas las fracciones activas fueran monitoreadas de la misma forma, comparadas con la
subfraccin activa del estudio anterior de la misma planta, en estas cromatografas se logro
observar que todas las sustancias poseen en comn dos compuestos con Rf de 0,42 y 0,23,
confirmndose que se logr extraer los mismos compuestos del estudio anterior por dos
diferentes mtodos.
A partir de esto se llega a la separacin de los compuestos de inters, obteniendo tanto el
compuesto 1 como el compuesto 2 y su mezcla. La evaluacin microbiolgica de estos
compuestos separados, nos demuestra que tienen la capacidad de inhibir las bacterias, la
cual se aumenta con la interaccin de su mezcla.
Al observarse la excelente accin
antimicrobiana de estas sustancias, se realiz estudio qumico cualitativo, que demostraron

que los compuestos separados contienen Terpenos y esteroides lo que concuerda con
Murphy 1999, quien reporta la accin inhibitoria de estos metabolitos sobre bacterias, por
medio de la interrupcin de la formacin de la pared celular de las mismas. De igual forma
se presencia saponinas en las fracciones activas, las cuales tienen efecto inhibitorio tanto en
bacterias Gram-positivas como bacterias Gram-Negativas segn lo reportado por Sparg et

al., 2004.
8. CONCLUSIONES
La planta Isertia laevis ha sido objeto de pocos estudios microbiolgicos, donde se evidencia
su capacidad antimicrobiana en otras enfermedades, diferentes a la caries dental, dando un
razn para seguir su estudio qumico y microbiolgico, que permita el desarrollo de nuevos
fitomedicamentos.
Se logr obtener fracciones con actividad antimicrobiana de las hojas I. laevis por medio de
dos mtodos diferentes: Cromatografa en Columna al Vaco CCV y Fraccionamiento
Liquido/Liquido Continuo.
Al separar las fracciones activas se determinaron dos compuestos con Rf de 0,37 y 0,51,
presentados tambin por la subfraccin inhibitoria del estudio anterior de la planta (Alvarado
et al., 2008), lo que permite concluir que estas contienen los metabolitos que generar el
efecto antimicrobiano.
Los compuestos separados de las fracciones activas, por si solos tienen actividad inhibitoria,
sin embargo, en sinergia aumentan su efecto sobre las bacterias evaluadas.
Se determin que con la CCV se extrajeron las fracciones activas en poca cantidad pero con
un menor grado de mezcla, es decir que al ser evaluadas con bajas concentraciones se
obtuvieron excelentes resultados de inhibicin. Con el fraccionamiento lquido/lquido la
extraccin de la fraccin activa se obtuvo con un grado de mezcla mayor, sin embargo la
cantidad de extracto comparado con la cantidad que se extrajo con el Mtodo 1. Este grado
de mezcla, interfiere en la accin antimicrobiana del mismo extracto (Presencia de clorofilas),
lo cual disminuye la actividad inhibitoria, por lo tanto es necesario realizar su respectiva
purificacin o separacin de compuestos.
La concentracin mnima inhibitoria del mtodo 1 fue 2 mg por pozo y la concentracin
inhibitoria del mtodo 2 fue 1 mg por pozo.
El fraccionamiento lquido/lquido puede ser la mejor opcin para extraer industrialmente

extractos de plantas, debido a su bajo costo y poco procesamiento de las sustancias.
Se concluye tambin que el mtodo MTT dio excelentes resultados para visualizar de
manera fcil los halos de inhibicin producidos por las fracciones evaluadas en el mtodo
difusin en pozo, permitiendo la lectura correcta del dimetro de los halos.
9. RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar pruebas microbiolgicas de las fracciones activas en otras cepas

bacterianas (Mycobaterias) asociadas a otras patologas humanas.
Es importante evaluar el efecto txico en clulas humanas sanas de las fracciones y de igual
forma evaluar el efecto farmacolgico, toxicolgico y realizar estudios clnicos de la fraccin
activa.
Se recomienda aislar, purificar e identificar algunos de los componentes de la mezcla para
posteriormente cuantificar su contenido y estandarizar la fraccin activa
Se sugiere buscar sustancias bioactivas que tengan efecto antimicrobiano en otras plantas
de la familia Rubiaceae.
Sera de gran importancia determinar el efecto biolgico de las fracciones activas sobre las
bacterias en estudio y otras de importancia clnica.
Se recomienda el uso del MTT para pruebas microbiologas en la evidencia de halos de
inhibicin.
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and
Biophysical
Research
ANEXOS
ANLISIS ESTADSTICO
S. mutans
ATCC 25175
Fr. 1 de
MeOH: H2O
Fr. 2 de
MeOH
0
Promedio
6.33
Desviacin estndar
0.577350
% inhibicin
43.178
Fr. 3
MeOH: Fr.2 de
CH2Cl2
CH2Cl2
12
0
12
11
11.66
0.577350
79.536
13
13
12
12.66
0.577350
86.357
Azitromicina
DMSO
15
15
14
14.66
0.577350
100
15
15
14
S. sobrinus
Promedio
6.33
Desviacin estndar
0.577350
% inhibicin
43.178
14.66
0.577350
100
Tabla 9. Anlisis estadstico de la actividad antimicrobiana de las Fracciones del Mtodo 1: fraccin MeOH-H20, fraccin MeOH, fraccin 1
MeOH-CH2Cl2, fraccin CH2Cl2 sobre S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus..
Fr. ter de
Petrleo
Fr. CH2Cl2
0
Fr. AcOEt
Fr. Butanol
Azitromicina
DMSO
14
14
6.5
15
10
15
15
Promedio
7.3
14.6
Desviacin estndar
1,29099445
0,54772256
% inhibicin
50
100
13
13
13
5.5
15
7.5
13
Promedio
6.8
13.4
Desviacin estndar
1,73205081
0,89442719
% inhibicin
50.746
100
S. sobrinus
Tabla 10. Anlisis estadstico de la actividad antimicrobiana de las fracciones del Mtodo 2: Fr. ter de Petrleo, Fr. CH2Cl2, fr. AcOEt y Fr.
Butanol sobre S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus.
Subf. 1 de
CH2Cl2
Subf. 2 de
CH2Cl2
Subf. 3 de
CH2Cl2
Subf. 4 de
CH2Cl2
Azitromicina
DMSO
12
15
11
14
12
15
Promedio
11.6
6.6
8.3
14.6
Desviacin estndar
0,57735027
0,57735027
0,57735027
0,57735027
% inhibicin
79.452
45.205
56.849
100
13
14
13
15
12
13
Promedio
12.6
6.6
8.3
14
Desviacin estndar
0,57735027
0,57735027
0,57735027
% inhibicin
90
47.142
59.285
100
S. sobrinus
Tabla 11. Anlisis estadstico de la actividad antimicrobiana de las subfracciones 1, 2, 3 y 4 de la fraccin CH2Cl2 sobre S. mutans ATCC
25175 y S. sobrinus.
Promedio
Desviacin estndar
% inhibicin
C1
C2
C3
Azitromicina
DMSO
6.5
6.2
8.5
15
6.4
6.3
8.5
15
6.5
6.1
8.4
14
6.5
6.2
8.5
14.66
44.33
42.29
57.98
100
0
0
6.5
6.3
8.4
14
6.4
6.2
8.5
15
6.5
6.1
8.5
13
6.5
6.2
8.5
14
44.33
42.29
57.98
S. sobrinus
Promedio
Desviacin estndar
% inhibicin
0
100
Tabla 12. Anlisis estadstico de la actividad antimicrobiana de los compuestos separados (C1, C2 y C3) sobre S. mutans ATCC 25175 y
S. sobrinus.
COSTOS DE LOS MTODOS FITOQUMICOS
MATERIALES
CANTIDAD UTILIZADA
PRECIO
Slica Gel RP-18
100 gramos
Metanol (MeOH)
1200 mililitros
67.200
Diclorometano (CH2Cl2)
500 mililitros
28.000
TOTAL
1.000.000
1.095.200
Tabla 13. Costos del Mtodo 1: Cromatografa en Columna al Vaco - CCV (Vacuum Column Chromatography - VCC)
MATERIALES
ter de Petrleo
CANTIDAD UTILIZADA
1 litro
2 litros
TOTAL
Tabla 14. Costos del Mtodo 2: Fraccionamiento Lquido/Lquido Continuo
PRECIO
26.380
112.000
138.380
Tllez et al.
EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LA FRACCIN
ACTIVA DE Isertia laevis OBTENIDA A PARTIR DE DOS METODOLOGAS
DE EXTRACCIN SOBRE S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus
Mayra Tllez-Corral, Margarita Perdomo-Giraldo, Nohemi Tllez y Fredy Gamboa
Departamento de Qumica y Grupo de Fitoqumica.
Departamento de Microbiologa y Centro de Investigaciones Odontolgicas
Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana
Bogot, D.C.
tellezm@javeriana.edu.co, m.perdomo@javeriana.edu.co, ntellez@javeriana.edu.co,
gamboa@javeriana.edu.co
RESUMEN
En este estudio se evaluaron dos mtodos de extraccin para la obtencin de la fraccin
activa antimicrobiana a partir del extracto etanlico de hojas de Isertia laevis: el primer
mtodo de fraccionamiento, fue la tcnica Cromatografa en Columna al Vaco (CCV),
donde se utilizaron como FE: RP-18 y FM: MeOH:H2O, MeOH, MeOH: CH2Cl2 y
CH2Cl2. Y el segundo mtodo fue Fraccionamiento Lquido/liquido continuo con
solventes en orden creciente de polaridad (petrol, CH2Cl2, AcOEt, BuOH). En los dos
mtodos se encontraron las fracciones con actividad inhibitoria sobre S. mutans ATCC
25175 y S. sobrinus. En CCV, las fracciones activas fueron fraccin MeOH, fraccin
MeOH-CH2Cl2 y en el Fraccionamiento Lquido/Lquido fue la fraccin CH2Cl2. Se
utiliz la Bioautografa como mtodo alternativo en la evaluacin de las fracciones,
dando como resultado inhibicin en la fraccin MeOH y la fraccin CH 2Cl2. Por medio
de Tcnicas Qumicas Cualitativas se determin que las fracciones activas contienen
terpenoides, esteroides y saponinas. Los dos mtodos permitieron la separacin de la
fraccin activa antimicrobiana de la planta, mostrando diferencias significativas en
cuanto a los costos, cantidad obtenida y grado de mezcla, adems se demostr y
comprob la reproducibilidad en la separacin de la fraccin activa y su accin.
Palabras claves: Actividad antimicrobiana, Fraccionamiento Lquido/Lquido, Isertia
laevis, S. mutans ATCC 25175, S. sobrinus, CCV (Cromatografa en Columna al Vaco
ABSTRACT
In this study, were evaluated two extraction methods for obtaining the antimicrobial
active fraction from ethanol extract of leaves of Isertia laevis: the first method of
fractionation was the technique of Vacuum Column Chromatography (VCC), which
were used as FE: RP-18 and FM: MeOH: H2O, MeOH, MeOH:CH2Cl2 and CH2Cl2. The
second method was Continuous Fractionation Liquid/liquid with solvents in order of
increasing polarity (petrol, CH2Cl2, AcOEt, BuOH). In the two methods were the
fractions with inhibitory activity against S. mutans ATCC 25175 and S. sobrinus. In the
VCC, the active fractions were fraction MeOH, fraction MeOH-CH2Cl2 and the
fractionation liquid/liquid was fraction CH2Cl2. Bioautography was used as an
alternative method in the evaluation of the fractions, resulting in the inhibition of
fraction MeOH and fraction CH2Cl2. Through Qualitative chemical tests was found that
the active fractions contain terpenoids, steroids and saponins. The two methods allowed
the separation of the antimicrobial active fraction of the plant, showing significant
differences in cost, quantity and degree of mixing obtained also demonstrated the
reproducibility and found in the separation of the active fraction and its action.
Keywords: Antimicrobial activity, Isertia laevis, Liquid/Liquid fractionation, S.
mutans ATCC 25175, S. sobrinus, VCC (Vacuum Column Chromatography).
1
Tllez et al.
INTRODUCCIN
controlado por la utilizacin de sustancias
La caries dental y las enfermedades
qumicas como el triclosan y fluoruro de
periodontales, son consideradas como las
sodio, pero el uso inadecuado conlleva a
enfermedades de mayor importancia en la
la alteracin de la flora oral benfica y
morbilidad bucal a nivel mundial y es
genera resistencia bacteriana, a parte de
considerada actualmente como uno de los
generar consecuencias a la salud del
mayores
paciente. De esta forma, se hace necesaria
Colombia.
problemas
Estas
de
salud
enfermedades
en
son
la bsqueda de
nuevas alternativas
infecciones generadas principalmente por
especialmente de origen vegetal, ya que
bacterias como Streptococcus mutans y
segn registros histricos existen plantas
Streptococcus
que
ocasionan
infeccioso
sobrinus,
un
las
proceso
cuales
patolgico
caracterizado
por
la
poseen
una
alta
actividad
antimicrobiana frente microorganismos

de cavidad oral y presentan la misma
destruccin localizada o caries en los
efectividad
tejidos duros dentales. Esta se considera
comerciales,
una enfermedad multifactorial, ya que
econmicos y ms asequibles a todo
requiere de de tres factores principales:
pblico. Esta situacin nos brinda la
un husped susceptible (cavidad oral),
posibilidad
una microflora cariognica y un sustrato
mtodos y materiales alternativos para el
presente en un periodo de tiempo
control
adecuado, causando exposicin de la
enfermedades dentales. Por ello, es
estructura
depsitos
nuestro objetivo evaluar y establecer la
microbianos, ms al desequilibrio entre la
efectividad antimicrobiana de extractos
sustancia dental y el fluido de placa
de Isertia laevis, haciendo de ellas un
circulante,
recurso para disminuir el impacto en la
dentaria
de
como
resultado
la
de
los
antimicrobianos
siendo
para
estos
estudiar
microbiolgico
bucal
revisar
de
por
estas
alteracin paulatina de mineral de la
morbilidad
superficie de los dientes.
principales microorganismos criognicos
Sumado a estos factores, extisten los
y generadores de la caries dental, a travs
extrenos, como los hbitos higinicos y
de la comparacin de metodologas para
alimenticios, el desarrollo econmico,
la extraccin de fracciones y su estudio
social y cultural, la educacin y el
del mecanismo de accin de los extractos
ambiente influyen en la proliferancin
sobre
bacterina oral patgena.
investigacin.
los
causada
ms
microorganismos
los
en
Ahora bien, la problemtica se ha

2
Tllez et al.
Caries Dental
en Colombia, personas de bajos ingresos,
La caries se define como un proceso
como
patolgico,
comunidades nativas usan la medicina
infeccioso,
multifactorial,
agricultores,
tradicional
que destruye los tejidos duros dentales
infecciones comunes. (Rojas et al., 2006).
(Libana, 2002), en donde se generan
Los pases de frica, Asia y Amrica
lesiones dentales o cavidades en los
Latina usan la medicina tradicional (MT)
dientes, a consecuencia que flora normal
para ayudar a satisfacer algunas de sus
oral que al haber alteraciones en el medio,
principales
grandes fuentes de energa o alimento y
mdica. En frica, hasta el 80% de la
una predisposicin del husped, favorece
poblacin utiliza la medicina tradicional
la colonizacin de las estructuras dentales
para la atencin primaria de salud. En
convirtindose en flora patolgica.
pases industrializados, las adaptaciones
Aunque la caries sea de etiologa
de la medicina tradicional se denominan
polimicrobiana, ciertos microorganismos
"complementarias"
como los estreptococos, lactobacilos y
"Alternativa" (CAM). (OMS).
actinomicetos
especfica),
Ha sido bien documentado que las plantas
participan en la actividad primaria de la
medicinales confiere una considerable
colonizacin,
el
actividad antibacteriana contra diversos
establecimiento y desarrollo de esta
microorganismos. Como el extracto de t
patologa. Estas bacterias cariognicas se
verde, que es habitualmente tomado
caracterizan
despus de cada comida en Japn, se sabe
decisiva
por
para
tres
cualidades
el
tratamiento
localizado, poseruptivo y transmisible
(placa
para
campesinos
necesidades
de
de
atencin
especficas:
que contienen varios polifenoles que
Capacidad de transformar azcares en
inhiben el crecimiento de S. mutans
competencia
(Sakanaka, et al., 1989).
con
otros
microorganismos de la placa.
Capacidad de convertir rpidamente
Isertia laevis
estos azcares en cido.
Perteneciente
la
familia
de
las
estas
Rubiaceas a Isertia laevis (Triana) B.M.
funciones en condiciones ambientales
Boom (1984) se la llama As0aquiro y
extremas, tales como pH bajo.
Asaquir en Vaups, y Vara Santa en
Capacidad
Extractos
de
Vegetales
mantener
Actividad
Tolima; las hojas se emplean como
Antimicrobiana
anticancergenos y para curar infecciones
En los pases en desarrollo y en particular
de la piel. Se puede encontrar en

Colombia
entre los 300-1700 m de

3
Tllez et al.
altitud
se
encuentra
en
los
obtencin de fracciones): Del extracto de
departamentos del Amazonas, Antioquia,
Etanol (EtOH) obtenido del desengrase
Boyac, Choc, Caldas, Cauca, Caquet,
se tom 1 gramo, el cual se pas por una
Casanare, Cundinamarca, Huila, Meta,
Cromatografa en Columna tipo CCV con
Putumayo y Tolima. (Mendoza et al.,
RP-18 y se eluy con MeOH-H2O (10:2),
2004). En los Andes se puede encontrar
MeOH, MeOH-CH2Cl2 (1:1) y CH2Cl2.
en elevaciones que van desde los 100
Estas fracciones se concentraron en
hasta los 2000 m.s.n.m y se extiende
rotavapor a 40C con vaco. Se obtuvo
desde el norte de Costa Rica y de oriente
una fraccin de MeOH-H2O, de MeOH,
a occidente de la Amazona.
MeOH-CH2Cl2 y CH2Cl2.
MATERIALES Y MTODOS
Fraccionamiento Lquido/Lquido o L/L

(Mtodo 2 para obtencin de Fracciones).
1. Material Vegetal
Fraccionamiento
El material vegetal seco y molido de I.
continuo
Laevis se extrajo en Soxhlet con Petrol
ascendente de polaridad.
durante 72 horas. El extracto en Petrol se
Condiciones de separacin: A 1 gramo
concentr en un rotavapor a presin
del extracto de etanol (EtOH) se realiz
reducida para posteriormente ser filtrado
fraccionamiento lquido/liquido continuo
y llevado a sequedad.
El marco
con eter de petrleo (EtOH) 1000 ml,
desengrasado se extrajo por maceracin
diclorometano (CH2Cl2) 2000 ml, acetato
en fro con EtOH, este extracto crudo se
de etilo (AcOEt) 1000 ml y butanol
concentr
(BuOH) 500 ml. Estas fracciones se
presin
reducida
en
con
Lquido/Lquido
solventes
rotaevaporador.
llevaron
rotavapor
2. Mtodos de Extraccin
concentrar a sequedad.
en
orden
40C
para
Los extractos, fracciones y subfracciones

de las hojas de Isertia
laevis
fueron
3.
Evaluacin
obtenidos a partir de dos metodologas
Antimicrobiana
diferentes de Extraccin: Cromatografa
Subfracciones
de
de
la
Actividad
Fracciones
en Columna al vaco CCV con RP-18 y

Fraccionamiento
Lquido/Lquido
Cepas Evaluadas
continuo.
Se evaluaron dos (2) cepas de cavidad
oral asociadas a caries dental. Las cepas
CCV con RP-18 (Mtodo 1 para la
de referencia son Streptococcus mutans

ATCC 25175 y Streptococcus sobrinus,
4
Tllez et al.
(Coleccin Espaola: Universidad de
concentracin de 50-100mg/ml. Como
Granada) las cuales fueron suministradas
control positivo se utilizaron 50 l de
por
Azitromicina
el
Centro
de
Investigaciones
y como control negativo
Odontolgicas (CIO) de la Pontificia
DMSO 50 l. En seguida, las cajas de
Universidad Javeriana.
petri
se
incubaron
en
sistema
de
anaerobiosis a 37C durante 24- 30 horas.

Evaluacin
de
la
Actividad
Antimicrobiana
Al
trmino
de
la
determinaron
los
dimetros
inhibicin
Mtodo de Difusin en Pozo
La actividad
incubacin
se
de
la
la
no
antimicrobiana
de
los
antimicrobiana
presencia de actividad.
antimicrobiana de los
extractos y fracciones frente a las cepas
Mtodo Difusin en Disco
de cavidad oral se realiz segn la tcnica
La
descrita por Dobner et al., 2003. A partir
extractos y fracciones
de un cultivo puro de cada una de las
evaluaron por el Mtodo Difusin en
cepas a evaluar (S. mutans ATCC 25175 y
Disco segn la tcnica descrita por G.
S. sobrinus), se hizo una suspensin en
More et al. 2008. A partir de un cultivo
Caldo
(Brain-Heart Infusin)
puro de cada una de las cepas a evaluar
ajustada por turbidimetra a la escala 0.5
(S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus), se
de Mc Farland. Para prepara una caja de
hizo una suspensin en Caldo BHI
petri, se tomaron 100 l y se agregaron a
ajustada por turbidimetra a la escala 0.5
20 ml de agar Tripticasa Soya (TSA)
de Mc Farland. De esta suspensin se
fundido, se mezcl y se sirvi en la caja
agregaron 100 l a 20 ml de agar TSA
(este procedimiento se realiz para el
fundido, se mezcl y se sirvi en caja y se
total de cajas a utilizar en las pruebas de
dejo enfriar. Previamente los extractos se
actividad antimicrobiana). Al solidificarse
disolvieron en DMSO a concentraciones
20
de 50-100 mg/ml. Se tomaron diferentes
minutos, a cada caja de petri se le
cantidades a probar de cada uno de los
abrieron de 3 a 4 pozos con ayuda de una
extractos; 20 l (2 mg/disco), 30 l (3
de
BHI
esperar
aproximadamente
pipeta pasteur estril. En cada pozo se

agregaron independientemente de 20 a 50
l de los extractos y las fracciones
disueltas
Dimetilsulfxido
previamente
(DMSO)
en
a
una
actividad
tambin se
mg/disco), 40 l (4 mg/disco), 50 l (5
mg/disco) y 60 l (6 mg/disco), estas
cantidades se transfirieron a discos de
papel filtro esterilizados de 5 mm de
dimetro.
Se utilizaron como control

5
Tllez et al.
positivo Azitromicina (30l) y como
200 l y se agregaron a 20 ml de agar
control negativo DMSO en disco en las
TSA fundido, se mezclaron y se sirvieron
mismas
los
10 ml del agar TSA inoculado a cada caja
extractos. Las cajas de petri se incubaron
de petri, donde se colocaron previamente
en anaerobiosis a 37C por 24 - 30 horas.
las placas Cromatogrficas, utilizando
Al
se
una caja de petri por placa. Las cajas de
de
la
petri se incubaron en anaerobiosis a 37C
la
no
por 24 - 30 horas. Al trmino de la
concentraciones
que
trmino
de
la
determinaron
los
dimetros
inhibicin
incubacin
antimicrobiana
presencia de actividad.
incubacin
las
Bioautografas
se
revelaron agregando a su superficie sal

4. Evaluacin del efecto antimicrobiano
de tetrazolium (MTT) preparada con
de la(s) fraccin (es) activa (s) por
solucin acuosa a una concentracin de
Bioautografas
2.5 mg/ml y se dejaron incubando por 6
Las fracciones que resultaron positivas
horas. Transcurrido este tiempo, las
para la actividad antimicrobiana por los
bioautografas tomaron un color violeta
mtodos anteriores, se les realizaron
intenso, exceptuando las zonas donde se
Bioautografas segn la tcnica descrita
gener la inhibicin del crecimiento
por Cunico et al., 2007; Vianna, et al.,
bacteriano por parte de los metabolitos
2005; Choma, 2005; Hostettman, 1999;
activos presentes en las cromatografas de
Erazo et al., 1997, sembrando placas
cada fraccin activa, quedando estas
cromatogrficas de 7,5 cm. de largo x 2.5
zonas de color marfil, a los cuales se les
cm. de ancho con cada uno de las
midi su Rf.
fracciones. Se corrieron las fracciones

MeOH,
MeOH:CH2Cl2
CH2Cl2,
RESULTADOS
utilizando como fase estacionaria slica

gel, y como fase mvil CH2Cl2- MeOH
Estudio Microbiolgico
(9.5:0.5). Estas placas cromatogrficas se
Durante
expusieron a la radiacin U.V. (260 nm)
microbiolgico de las fracciones se
durante 30 minutos con el propsito de
utiliz mtodo de difusin en pozo y
esterilizarlas para su posterior uso.
difusin en disco. Tras la realizacin de
Se prepararon suspensiones en Caldo BHI
varios ensayos con el mtodo difusin en
para cada bacteria S. mutans ATCC
disco, los halos de inhibicin eran de
25175 y S. sobrinus, ajustadas por
difcil visualizacin debido a la baja
turbidimetra a la escala 0.5 de Mc
difusin del extracto en el papel filtro
Farland. De cada suspensin se tomaron
esterilizado y poco contacto que tena este
la
realizacin
del
estudio
Tllez et al.
Cromatografa
6
4
2
0
por
en columna al vaco
(CCV)
Se realiz una prueba inicia, evaluando la
S. m utans ATCC 25175
AZM
obtenidas
Fr. MeOH-H2O
Fracciones
10
DMSO
se observan con claridad.
12
Fr. MeOH-CH2Cl2
pozo, con el cual los halos de inhibicin
2 m g/pozo
14
Fr. MeOH
utilizar slo en mtodo de difusin en
16
evaluacin. Por esta razn se decide
Fr. CH2Cl2
con el agar inoculado con las bacterias en
S. sobrinus
accin antimicrobiana de las fracciones
Figura 2. Accin antimicrobiana de
obtenidas
fraccin
MeOH,
por
CCV,
MeOH-CH2Cl2
MeOH-H2O,
MeOH-H2O,
fraccin
la
MeOH,
y CH2Cl2. Se
fraccin MeOH-CH2Cl2 y fraccin CH2Cl2 a
observ que las fracciones de MeOH y
una concentracin de 2 mg/pozo obtenidas a
MeOH-CH2Cl2
presentaron
partir de hojas de I. laevis.
antimicrobiana
sobre S. mutans ATCC
actividad
25175 y S. sobrinus a una concentracin

de 2 mg por pozo. Figura 1 y 2.
Fraccionamiento
lquido/lquido
continuo.
Se determin la evaluacin de la accin
antimicrobiana
segundo
de las fracciones del
mtodo
Lquido/Lquido)
(Fraccionamiento
ter
de
Petrleo,
CH2Cl2, AcOEt y Butanol se evaluaron a

una concentracin final de 1 mg por pozo,
A
Figura
de
sobrinus. Se observ que solo el extracto
MeOH (A) y MeOH-CH2Cl2 (B)
CH2Cl2, present actividad antimicrobiana
1. Actividad
fraccin
sobre S. mutans ATCC 25175 y S.
B
antimicrobiana
Se
sobre estos dos microorganismos, Figura
evidenciaron halos de inhibicin de 6 mm de
3 y 4. Razn por la cual se contina la
MeOH y 11 de MeOH-CH2Cl2.
evaluacin de la misma fraccin a mayor
sobre
S.
mutans
ATCC
25175.
concentracin.
Tllez et al.
MeOH:CH2Cl2 9:1; fueron monitoreadas
por
CCD
(FE:
RP18,
FM:
MeOH:CH2Cl2 9:1) y reveladas con

cido Perclrico. Con las subfracciones
obtenidas y a una concentracin de 0.6
Figura 3. Halo de inhibicin sobre S. mutans
mg por pozo se realiz un tamizaje
ATCC 25175
antimicrobiano sobre S. mutans ATCC
producido por la fraccin
CH2Cl2 a 1 mg por pozo, revelado con MTT.
25175 y S. sobrinus. Se evidencia la

accin por medio del Mtodo de MTT.
16
Como resultado se obtuvo que las
14
subfracciones 2, 3 y 4, presentaron halos
1 m g por pozo
12
de inhibicin, como se muestra en la
Halos de
inhibicin
(mm)
10
figura 5.
8
6
4
2
AZ
M
DM
SO
ol
Bu
tan
Ac
OE
t
CH
2C
l2
Ete
rd
eP
etr
ol e
o

S. sobrinus
Columnas 18
Figura
Figura 4. Accin antimicrobiana de las

fracciones ter de Petrleo, CH2Cl2, AcOEt
y Butanol obtenidas a partir de hojas de I.
laevis sobre S. mutans ATCC 25175 y S.
B
5.
Halos
C
de
inhibicin
de
subfracciones de CH2Cl2. 2 (13 mm),

CH2Cl2. 3 (7 mm) y CH2Cl2. 4 (8 mm) en
S. sobrinus.
sobrinus, una concentracin final de 1mg por

pozo.
Biautografas
Debido a la actividad de la fraccin
La
CH2Cl2 del Mtodo 2 o fraccionamiento
MeOH:CH2Cl2 y la fraccin de CH2Cl2
Liqudo/lquido,
eliminar
del mtodo 2, se corrieron en Slica Gel
sustancias interferentes como la clorofila
con MeOH:CH2Cl2 (1:9). Se realiz la
para obtener fracciones separadas y
bioautografa
descartar que la clorofila no interfiera en
inhibicin en la fraccin de MeOH (Rf:
la accin antimicrbiana de la fraccin de
0.298 y 0.32) y en la fraccin de CH2Cl2
CH2Cl2. Se obtienen cuatro subfracciones
(Rf: 0.32). Figura 6.
en
Columna
se
de
decide
Sephadex
fraccin
MeOH,
se
logr
fraccin
observar
con
8
Tllez et al.
0,298 y 0.32
1
1
0,32
Figura 6. Bioautografa
en Slica Gel de MeOH y CH2Cl2
Figura 6. Bioautografa en Slica Gel de
revelada con MTT.
MeOH y CH2Cl2 revelada con MTT.
Figura
Separacin
de
los
Metabolitos
7.
Cromatografa
en
RP-18
revelada con cido perclrico. Fraccin
Secundarios de las Fracciones Activas
MeOH (1), Fraccin MeOH:CH2Cl2 (2),
Se realiz un monitoreo de las fracciones
Fraccin CH2Cl2 (3) y subfraccin activa
con actividad antimicrobiana del Mtodo
de estudio anterior de I. laevis. Los RF
1: fraccin MeOH y MeOH:CH2Cl2, y la
fueron A) 0.42 y B) 0.234.
fraccin CH2Cl2 del Mtodo 2 por

cromatografa CCD (FE: RP-18, FM:
Estudio qumico de las fracciones con
MeOH:CH2Cl2 (9.5:0.5)) revelada con
Actividad Antimicrobiana.
cido perclrico. Los Rf de las sustancias
Se eligi las fracciones del CCV para
detectadas en la fraccin de MeOH y la
obtener
fraccin MeOH:CH2Cl2 y fueron 0,234 y
compuestos de inters, por medio de
0,421. Los Rf de la fraccin CH2Cl2
repetidas cromatografas en columna por
fueron 0,078, 0,234, 0,418 y 0,568.
gravedad FE: RP-18 FM: MeOH-CH2Cl2
Comparados con los Rf de la subfraccin
9:1. Se obtuvieron tres muestras donde se
activa del estudio anterior sobre I. laevis
encuentran los dos compuestos de inters
fueron 0,234 y 0,419. En la figura 7 se
que presentan actividad antimicrobiana,
observa
sustancias
compuesto 1 (C1), compuesto 2 (C2) y
fcilmente detectables y comunes en las
compuesto 3 (C3 mezcla de los dos
fracciones, que corresponde a los Rf
compuestos anteriores).
que
existen
dos
mayor
muestra
con
los
0,234 y 0,42.
9
Tllez et al.
Estudio Qumico de los Compuestos de
conocimiento
que
inters.
durante el tiempo y aun es
Se realiz el estudio qumico cualitativo
como
de los compuestos de inters (C1, C2 y
inters en muchos para seguir con la
C3) mediante CCD con FE: RP-18 y FM:
bsqueda de nuevas fuentes medicinales
MeO:HCH2Cl2 (9:1) para investigar la
que ayuden a disminuir la incidencia y
presencia de metabolitos secundarios.
prevalencia de enfermedades que aquejan
Este evidencia la presencia de terpenos y
a la humanidad, y mejor an teniendo
esteroides, como se muestra en la Tabla 1.
como fuente las plantas, que por su
As mismo se realiz el ndice de Espuma
eficacia, accesibilidad y costo, se ha
para la determinar la presencia de
establecido como la mejor opcin para
saponinas en los compuestos de inters, el
desarrollar medicamentos.
medicina
ha
permanecido
utilizado
alternativa,
creando
cual dio positivo para la presencia de las

mismas.
La caries dental an es considerada un
Prueba
Lieberman-Brchard
(Triterpenos y esteroides)
Molibdato de Amonio
(Diterpenos)
Brntrager (Antraquinonas)
Dragendorff (Alcaloides)
Cloruro Frrico (FeCl3)
(Fenoles)
Resultado
problema de salud pblica que afecta a
Positivo
muchos pases incluyendo Colombia. El
Positivo
Negativo
Negativo
desequilibrio
1.
Resultados
determinacin
de
especies
y el nivel socio-econmico influyen en el
Negativo
obtenidos
las
microbianas y diferentes factores externos

desarrollo
Tabla
entre
en
metabolitos
secundarios.
de
esta
patologa.
La
microflora oral es un sistema complejo

que contienen
una gran variedad de
especies bacterianas. Entre los principales

microorganismos asociados a la caries
DISCUSIN
dental son, en orden de importancia: S.
Colombia es un pas destacado en el
mutans, S. sobrinus, en menor proporcin
mundo por sus recursos naturales, la gran
(Shigeyuki H. and Hutton D. 1980). Est
variedad de flora que se encuentra en ella,
claro que el S. mutans cumple un papel
ha permitido el desarrollo de la medicina
importante en la patognesis de la caries
artesanal. (Rojas et al., 2006). Las
dental,
culturas indgenas utilizaron las plantas
encaminada
basados
el
adhesin de este microorganismo a la
conocimiento emprico, lograron obtener
superficie del diente y la inhibicin de la
sustancias tiles para la curacin y
glusiltransferasa para formar glucano
tratamiento
insoluble en agua, el cual es esencial para
en
la
de
experiencia
enfermedades.
Este
su
prevencin
debe
estar
en la inhibicin de la
10
Tllez et al.
la misma adherencia. Al tener presentes
En este estudio se realizaron dos mtodo
estos dos mecanismo de accin del la
para la obtencin
bacteria nos hace plantear estrategias
subfracciones, en el Mtodo 1 o Columna
eficaces
Cromatografa al Vaco - CCV, se
eliminacin de la misma en cavidad oral,
demostr actividad inhibitoria en las
ya
fracciones de MeOH y MeOH:CH2Cl2
para
que
los
la
disminucin
tratamientos
dentales
usualmente son costosos y de difcil
(1:1).
acceso,
volmenes de 120 ml aproximadamente.
especialmente en
pases en
desarrollo como Colombia.
La
columna
de fracciones y
se
eluy
con
Las fracciones que presentaron actividad

fueron obtenidas durante los ltimos
Muchos estudios se han encaminado a la
volmenes de solventes que se agreg a
identificacin
la columna, es decir de MeOH y
metabolitos secundarios de productos
MeOH:CH2Cl2 (1:1), comparndose estos
naturales, contra Streptococcus mutans,
resultados con estudios anteriores de I.
gran variedad de familias de plantas han
laevis (Alvarado et al., 2007), las
demostrado actividad inhibitoria, como
fracciones que presentaban inhibicin
las fabceas (Ktsura et al., 2001), familia
sobre las bacterias, se encontraban en la
Moraceae (Park et al., 2003), familia
fraccin de MeOH:H2O, ya que se
Clusiaceae
2007),
obtuvieron con cuatro veces el volumen
familia Theaceae (Tsai et al., 2007),
que se utiliz en el presente estudio, es
familia Rubiaceae (Jayasinghe et al.,
decir, los mismos compuestos se lograron
2002) , familia Vitaceae (Rivero, et al.,
obtener solo al final de la marcha de la
2008), familia Asteraceae (Yatsuda, et
columna lo que difiere al estudio anterior.
al., 2005), familia Zingiberaceae ( Xiao,
Con el Mtodo 2 o Fraccionamiento
et al., 2006), entre otras. Una familia que
lquido/lquido continuo, se logr extraer
en su gran mayora encontramos en
la fraccin activa, sin embargo esta no se
Colombia es la Rubiceae, que contienen
encontr en la misma fase mvil utilizada
sustancias comunes que poseen actividad
en la primera metodologa, ya que se
biolgica,
extrajo
de
(Almeida
compuestos
et
especialmente
al.,
del
gnero
en
Diclorometano
(Fraccin
Isertia, lo que da una razn para ampliar
CH2:Cl2). Esto nos indica que la fraccin
el estudio de este gnero el cual presenta
antimicrobiana tiene sustancias polares y
un amplio espectro de inhibicin, por
no polares. Con la Cromatografa en
medio de la bsqueda de tcnicas
Columna al Vacio CCV, las fracciones
asequibles y eficientes para encontrar
con
sustancias antimicrobianas.
disolventes con mayor polaridad como el
actividad
se
extrajeron
con
11
Tllez et al.
Metanol
con
lquido/lquido,
el
se
fraccionamiento
obtuvieron
con
Al evaluarse las fracciones obtenidas de

cada mtodo,
se obtuvieron mejores
disolventes de mediana o baja polaridad
resultados con la tcnica Difusin en
como lo es el Diclorometano. La cantidad
pozo, pues los extractos lograban una
de volmenes utilizados influy en que se
mayor difusin en el agar a diferencia de
encontrar la fraccin activa en diferentes
la tcnica Difusin en disco que como lo
solventes, pues a diferencia del primer
reporta
mtodo, se utilizaron hasta 2000 ml de
proporciona
solvente,
embargo,
logrando una extraccin ms
eficiente y relativamente rpida.
More
et
buenos
al
al.,
2008,
resultados,
evaluarse
la
esta
sin
actividad
antimicrobiana de las fracciones de este

trabajo, parte del mismo aplicado al papel
El
fraccionamiento
lquido/lquido
filtro esterilizado, no permiti su correcta
proporcion una tcnica eficaz en la
difusin y es posible que el mismo papel
obtencin de la fraccin activa a mayor
generar interferencias en los resultados.
cantidad y debido a su bajo costo, ya que
Contrario a los presentados por el mtodo
solo es necesaria la utilizacin de
Difusin en pozo que segn autores como
solventes y calor, esto representa una
Galvin et al., 1999, permiten una fcil
opcin econmica para la extraccin de
difusin y contacto completo del extracto
sustancias, lo que podr permitir que esta
con el agar inoculado con las bacterias en
tcnica puede ser implementada a nivel
estudio.
industrial, debido a que los materiales
Al
utilizados no cambian, ni modifican las
similares en el porcentaje de inhibicin
sustancias que se quieren encontrar,
para S. mutans ATCC 25175 como para S.
debido
procesamiento,
sobrinus, nos hace pensar que existen
contrario al Mtodo 1 o CCV, donde se
compuestos naturales extrados en las
obtiene poca cantidad de extracto, con
fracciones, que son los responsables de
materiales como el RP-18, el cual no se
interferir en los factores de virulencia y
utiliza industrialmente, por su costo y
por ende la sobrevivencia de estos
viabilidad. Sin embargo, la CCV permite
microorganismos
obtener fracciones con un grado de
confirma Almeida et al., 2007, sin
mezcla menor, lo que no se puede esperar
embargo sera importante evaluar estos
del
compuestos in vivo.
Mtodo
su
bajo
fraccionamiento
obtenerse
resultados
in
Vitro,
positivos,
como
lo
liquido/lquido donde el grado de mezcla
Las fracciones activas se evaluaron a
de las sustancias extradas es mucho
concentraciones de 0,5 a 20 mg por pozo,
mayor.
las fracciones deL Mtodo 1 evidenciaron

12
Tllez et al.
resultado positivo a 2 mg por pozo, la
efecto inhibitorio significativo.
fraccin con actividad antimicrobiana del
El mtodo MTT, nos solo fue aplicado a
Mtodo 2 mostr resultados positivos a 1
las Bioautografas, sino tambin se
mg por pozo. Las subfracciones se
implemento en la visualizacin de los
obtuvieron
halos de inhibicin, producidos por los
a partir
de la
fraccin
Diclorometano (CH2:Cl2) debido a la
extractos
evaluados
cantidad que se tena, contrario a las
Mtodo
de
fracciones del Mtodo 1, del cual se
permitindonos una fcil lectura del
obtuvo poca muestra. En la evaluacin de
dimetro de los halos.
estas
subfracciones
se
por
Difusin
medio
en
del
Pozo,
evidencio
excelente inhibicin en la Subfraccin 2,
Todas las fracciones activas fueran
la cual se mostraba en el monitoreo por
monitoreadas
cromatografa
con
comparadas con la subfraccin activa del
MeOH:CH2Cl2 (9:1) dos compuestos que
estudio anterior de la misma planta, en
se
estas cromatografas se logro observar
adicionalmente mostraba menor grado de
que todas las sustancias poseen en comn
mezcla.
dos compuestos con Rf de 0,42 y 0,23,
Estas mismas fracciones se evaluaron por
confirmndose que se logr extraer los
medio de Biautografas, las cuales se
mismos compuestos del estudio anterior
revelaron con Sal de tetrazolium o MTT,
por dos diferentes metodologas.
para permitir la visualizacin de zonas de
A partir de esto se llega a la separacin de
inhibicin, por medio de la reduccin
los compuestos de inters, obteniendo
metablica del Bromuro de 3-(4,5-
tanto el compuesto 1 como el compuesto
dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol por
2 y su combinacin. La evaluacin
parte
microbiolgica
de los mismos, nos
demuestra
los
RP-18
destacaban
de
produciendo
las
corrida
visualmente,
bacterias
formazan,
el
viables,
cual
se
de
que
la
misma
forma,
compuestos
por
caracteriza por una coloracin azul-
separado tienen la capacidad de inhibir
prpura, indicndonos la presencia de
las bacterias, la cual se aumenta con la
crecimiento bacterial donde el extracto no
interaccin de los dos compuestos. Al
produjo ninguna accin antimicrobiana.
observarse
La bioautografa es entonces un mtodo
antimicrobiana de estas sustancias, se
que nos permite, saber si los compuestos
realiz estudio qumico cualitativo, que
que
la
demostraron que contienen Terpenos y
cromatografa, tienen accin por si solos
esteroides, lo que concuerda con Murphy
o es necesaria su unin para producir un
1999, quien reporta la accin inhibitoria
se
separan
por
medio
de
la
excelente
accin
13
Tllez et al.
de estos metabolitos sobre bacterias, por
medio de la interrupcin de la formacin
Los
compuestos
separados
de
las
de la pared celular de las mismas. De
fracciones activas, por si solos tienen
igual forma se presencia saponinas en las
actividad inhibitoria, sin embargo, en
fracciones activas, las cuales tienen efecto
sinergia aumentan su efecto sobre las
inhibitorio tanto en bacterias Gram-
bacterias evaluadas.
positivas como bacterias Gram-Negativas

segn lo reportado por Sparg et al., 2004
Se determin que con la CCV se

extrajeron las fracciones activas en poca
CONCLUSIONES
cantidad pero con un menor grado de
La planta Isertia laevis ha sido objeto de

pocos estudios microbiolgicos, donde se
evidencia su capacidad antimicrobiana en
otras enfermedades, diferentes a la caries
dental, dando un razn para seguir su
estudio qumico y microbiolgico, que
permita
el
desarrollo
de
nuevos
mezcla, es decir que al ser evaluadas con

bajas
concentraciones
se
obtuvieron
excelentes resultados de inhibicin. Con

el
fraccionamiento
lquido/lquido
la
extraccin de la fraccin activa se obtuvo

con un grado de mezcla mayor, sin
embargo
la
cantidad
de
extracto
comparado con la cantidad que se extrajo
fitomedicamentos.
con el Mtodo 1. Este grado de mezcla,

Se logr obtener fracciones con actividad
antimicrobiana de las hojas I. laevis por
medio
dos
mtodos
diferentes:
Cromatografa en Columna al Vaco CCV

y
Fraccionamiento
Liquido/Liquido
mismo extracto (Presencia de clorofilas),

lo cual disminuye la actividad inhibitoria,
por lo tanto es necesario realizar su
respectiva purificacin o separacin de
compuestos.
Continuo.
Al separar las fracciones activas se
determinaron dos compuestos con Rf de
0,37 y 0,51, presentados tambin por la
subfraccin
interfiere en la accin antimicrobiana del
inhibitoria
del
estudio
La concentracin mnima inhibitoria del

mtodo 1 fue 2 mg por pozo y la
concentracin inhibitoria del mtodo 2
fue 1 mg por pozo.
anterior de la planta (Alvarado et al.,

2008), lo que permite concluir que estas
contienen los metabolitos que generar el
efecto antimicrobiano.
El fraccionamiento lquido/lquido puede

ser
la
mejor
opcin
para
extraer
extractos
de
plantas,
debido a su bajo costo y
poco
industrialmente
14
Tllez et al.
procesamiento de las sustancias.
Se concluye tambin que el mtodo MTT
dio excelentes resultados para visualizar
de manera fcil los halos de inhibicin
producidos por las fracciones evaluadas
en
el
mtodo
permitiendo
la
difusin
lectura
en
correcta
pozo,
del
Libana, J.; Castillo, A.M.; lvarez, M.;

2004;
Enfermedades
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15
Tllez et al.
16
EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

DE LA FRACCION ACTIVA DE Isertia laevis
OBTENIDA A PARTIR DE DOS METODOLOGAS DE
EXTRACCION SOBRE
Margarita Lucia Perdomo Giraldo
Mayra Alexandra Tllez Corral
Bacteriologa
Pontificia Universidad Javeriana
2009
EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LA FRACCION

ACTIVA DE Isertia laevis OBTENIDA A PARTIR DE DOS
METODOLOGAS DE EXTRACCION SOBRE
Fredy O. Gamboa, M.Sc. PhD

Director
PUJ
Nohemi Tllez Alfonso, Dr.Sc.

Directora
Grupo de Investigacin Fitoqumica
PUJ
Agradecimientos
Dr.
Fredy Gamboa
Dra. Nohemi Tllez
Centro de Investigaciones
Odontolgicas
Grupo de Investigacin Fitoqumica.
Dra. Andrea Alvarado
Lic. John Jairo Rojas
Extractos Vegetales y
Actividad
Antimicrobiana
Pases en desarrollo: Alternativas de bajo costo.
Agricultores, campesinos y comunidades nativas

usan la medicina tradicional para el tratamiento de
infecciones comunes.
El uso de plantas en infusiones, zumos y preparados

se hicieron efectivos en quemaduras, en problemas
respiratorios.
Los habitantes de zonas rurales tienen menor

riesgo para adquirir enfermedades infecciosas,
desarrollan resistencia a los agentes patgenos,
contrario a los habitantes en zonas urbanas
tratadas con antibiticos tradicionales. (Rojas et al.,
2006)
Los extractos de especias, aceite de corteza

de canela, clavo y aceite de yema, fueron
reportados como inhibidores del crecimiento
de muchas bacterias bucales. (Jonathan et al.,
2000)
Extracto de t verde, que es habitualmente

tomado despus de cada comida en Japn, se
sabe que contienen varios polifenoles que
inhiben el crecimiento de S. mutans
(Sakanaka, et al., 1989)
Sanguinarine es un alcaloide del extracto de

rizoma de la Sanguinaria canadensis. Se
report que posee un amplio espectro contra
una amplia variedad de bacterias orales
(Park et al., 2003)
OMS (Resolucin WHA 31.33):

Importancia
de plantas medicinales.
Establecer criterios cientficos y mtodos
para asegurar la calidad de las
preparaciones obtenidas con plantas
medicinales.
Bsqueda efectividad en el tratamiento de
condiciones y enfermedades especificas.
Medicina Alternativa: Capacitacin estudio
de plantas.
Familia Rubiaceae
Hasta 10.000 especies

Distribuidas por toda la Tierra, mayor
cantidad en el trpico.
Es de gran importancia alimenticia,
ornamental y en la industria
farmacutica (Medicina Tradicional).
Las especies de sta familia son
reconocidas como bioproductoras de
alcaloides, taninos, saponinas,
esteroides, terpenos y flavonoides.
Propiedades medicinales,
especialmente anti-inflamatoria,
analgsica y efectos anti-tumorales.
Otros propiedades antioxidantes y
anti-ulcerosas
Gnero Isertia
(Boom, 1984)
En Colombia esta planta presenta una distribucin entre los 300-1700 m

de altitud y se encuentra en los departamentos del Amazonas, Antioquia,
Boyac, Choc, Caldas, Cauca, Caquet, Casanare, Cundinamarca, Huila,
Meta, Putumayo y Tolima. (Mendoza et al., 2004).
Isertia laevis
Neotropical Herbarium
Specimens
Asaquiro y Asaquir en
Vaups, y Vara Santa en
Tolima
Evaluacin Antimicrobiana de
I. laevis
Estudio
de 2007-2008: Grupo de
Fitoqumica PUJ.
Mtodo de Extraccin: Cromatografa
en Columna al Vaco CCV.
Se obtuvo la fraccin con Actividad
Antimicrobiana contra bacterias
cariogenicas. (Fr. y Sf. 9 de
MeOH:H2O)
Alvarado, et al., 2008
Caries Dental
La caries dental se define como un proceso

patolgico, infeccioso, multifactorial, localizado,
poseruptivo y transmisible que destruye los
tejidos duros dentales.
En esta patologa se generan lesiones dentales
o cavidades en los dientes, a consecuencia de
las alteraciones de la microflora oral, de las
grandes fuentes de energa y una
predisposicin del husped, que favorecen la
colonizacin de las estructuras dentales
convirtindose en flora patolgica.
(Mouton, 1995; Rodrguez y Gonzlez, 2000; Libana, 2002).
Estructura Dental
Corona Dental
Esmalte
Dentina
Pulpa
Hendidura
gingival
Cemento
Raz del Diente
Imagen de Microscopia Electrnica

de los Cristales de Hidroxiapatita
del esmalte dental humano
Membrana
Periodontal
Orificio de la
Raz
(Reyes, 2001)
Conducto de
la Raz
Diente
Cuello del
Enca
Proceso Cariognico
Formacin y Desarrollo de la
Placa Dental o Biofilm
Se define como una masa bacteriana
proliferante constituida por S.
mutans, S. sobrinus y S. gordonii; y
especies de Lactobacillus y
Actinomyces, adherida fuertemente
a la superficie dentaria por su
actividad enzimtica, bioqumica y
metablica
(OMS)
Gnero Streptococcus
Streptus: flexible, coccus: grano
Bacterias esfricas u ovoides que

crecen en pares o cadenas de
longitud variable.
La mayora son anaerobios
facultativos, existiendo algunas
especies anaerobios obligados.
Son Gram positivos
Fermentadores de
Glucosa
cido lctico
No formadores de esporos
Catalasa negativos
DennisKunkelMicroscopy,Inc
Gnero Lactobacillus
lactis: leche, bacillu: pequeos bacilos
Clulas en forma de
bacilos largos (bcilos
cortos o coco-bacilos.
Son Gram positivos
Crecimiento ptimo en
condiciones
microaeroflicas o
anaerbicas
Fermentadores de
Glucosa
cido lctico
Poder acidognico,
acidrico y acidfilo
The Microbial World
Gnero Actinomyces
Bcilos
GramPositivos
Anaerobios
facultativos o
estrictos
Poder acidognico y
actividad
proteoltica.
The Microbial World
Fases del Proceso Cariogenico
Colonizacin Primaria: Adherencia a la

pelcula adquirida.
Colonizacin secundaria: Agregacin

interbacteriana y Multiplicacin.
Maduracin de la placa: Ausencia de O2 y

nutrientes, acumulacin de desechos,
reduccin de microorganismos vivos.
Fase de Mineralizacin: Salida de iones (Ca

y PO): Agregados calcificados uniones
dentogingivales.
(Libana, 2004 Nishiyama, et al., 2006)
Forma de
Accin:
S. mutans
Proteasas
Hemoliticas
Glucanos
Glucotransferas
Sacaros
a
S.
mutans
Gluclisis
S. sobrinus
Azcares
Proteasa
cido
SAG
PAc: Antgeno
I//II
Dao
Superficie dental
* Poder acidognico.
* Poder acidrico.
* Poder acidfilo.
* Almacenamiento de
productos de reserva
* La capacidad de
adhesin a la pelcula
adquirida.
Mtodos de
Extraccin
Cromatografa en
Columna al
Vaco (CCV)
Sustancia a separar
RP-18 / Slica Gel
Empacado
Fase Estacionaria
RP-18 / Slica Gel
Fase Mvil
Solventes de
diferentes
polaridades
Componentes
separados
Recipiente
vaco
con
Fraccionamiento Lquido/Lquido
Fraccionamiento L/L con

disolventes de menor
densidad a la del agua
Fraccionamiento L/L con

disolventes de mayor
densidad a la del agua
Cromatografa
en Columna al
Vaco
Separacin en menor
tiempo.
Utilizacin de Fases
estacionarias y fases
mviles (en pocas
cantidades)
Obtencin de fracciones con
menor grado de mezcla.
Menor cantidad (g) de las
fracciones obtenidas.
Mayor costo de los
materiales utilizados.
Difcil implementacin
industrial.
Fraccionamiento
Lquido/Lquido
Separacin lenta.
Utilizacin de fases
mviles (en mayor
cantidad)
Obtencin de fracciones
con mayor grado de
mezcla.
Mayor cantidad (g) de
fracciones obtenidas.
Bajo costo.
Mtodo fcil
implementacin industrial.
Costos de Los Mtodos de Extraccin

Mtodo 1: Cromatografa en Columna al Vaco - CCV
MATERIALES
CANTIDAD UTILIZADA
PRECIO
Slica Gel RP-18
100 gramos
Metanol (MeOH)
1200 mililitros
67.200
500 mililitros
28.000
TOTAL
1.000.000
1.095.200
Mtodo 2: Fraccionamiento Lquido/Lquido Continuo

MATERIALES
CANTIDAD UTILIZADA
ter de Petrleo
1 litro
2 litros
TOTAL
PRECIO
$
26.380
112.000
138.380
Mtodos Para la Evaluacin

Antimicrobiana
Difusin en Pozo
(Rios et al., 1988.)
Difusin en Disco
Wilkins, et al., 1972
Bioautografas
Erazo et al., 1997)
Ensayo Colorimtrico
Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol
Deshidrogenasa
MTT
Thorn et al., 1993
Formazn
Formulacin del Problema

Buscar la fraccion activa
antimicrobiana de I. laevis
mediante una metodologia mas
simple, con beneficios economicos
y con posibilidades de
implementacion en pequeas
industrias, para el futuro desarrollo
de un Fitofarmaco.
Justificacin
Nuevas
alternativas: Fitomedicamentos.
Estrategias de control microbiolgico.
Disminucin de la Prevalencia e
Incidencia de las Enfermedades Orales:
Caries dental.
Tcnicas eficaces, econmicas,
accesibles: Fcil proceso industrial.
Objetivo General
Evaluar la actividad antimicrobiana
de la fraccin activa de Isertia laevis
obtenida por medio de dos mtodos
diferentes de extraccin, sobre cepas
bacterianas de cavidad oral, S.
mutans ATCC 25175 y S. sobrinus,
asociadas a la caries dental.
Objetivos Especficos
Obtener extractos, fracciones y subfracciones a

partir de hojas de Isertia laevis por medio de
Cromatografa en Columna tipo CCV con RP-18 y
Fraccionamiento Lquido/Lquido.
Determinar el efecto antimicrobiano sobre

Streptococcus mutans ATCC 25175 y Streptococcus
sobrinus de extractos obtenidos a partir de hojas de
Isertia laevis con los dos diferentes mtodos de
extraccin.
Evaluar el efecto de la (s) fraccin (es) y la (s)

subfraccin (es) activa (s) sobre el crecimiento de
S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus mediante
pruebas de susceptibilidad en agar.
Determinar la Concentracin Mnima Inhibitoria

de la fraccin y subfraccin activa obtenida en el
segundo mtodo sobre S.mutans ATCC 25175 y
S. sobrinus.
Comparar desde el punto de vista qumico y

microbiolgico los resultados obtenidos en los dos
mtodos de fraccionamiento para la obtencin de
la fraccin activa antimicrobiana.
Separar los componentes qumicos mayoritarios

de la fraccin activa y realizar su evaluacin
antimicrobiana.
Materiales y Mtodos
Obtencin
del material vegetal: Municipio

de Medina (Cundinamarca).
Clasificacin
taxonmica del Herbario del

Instituto de Ciencias Naturales (UNAL):
como Isertia laevis (Triana) B. M. Boom,
de la familia Rubiaceae. Radicado bajo el
No. COL: 506495.
Seleccin
de las hojas: secadas y

pulverizadas
Grupo de Fitoqumica PUJ
Desengrase
del material
pulverizado: Soxhlet; Petrol
72 horas.
Maceracin en fro con
EtOH.
Extracto EtOH.
Obtencin de Extractos:
Dos Mtodos de
comparacin. (Mtodo 1:
Cromatografa en Columna
al Vaco- CCV y Mtodo 2:
Fraccionamiento
Lquido/Lquido Continuo)
Soxhlet
MATERIAL VEGETAL
Cromatografa
en Columna tipo
CCV: RP-18 (50
g)
MeOH-H2O (10:2)
MeOH
CH2Cl2
120 ml
120 ml
Fraccin
MeOH-H2O
Fraccin
MeOH
MeOH-CH2Cl2 (1:1)
120 ml
Fraccin
MeOH-CH2Cl2
120ml
Fraccin
CH2Cl2
Mtodo 1:
MATERIAL VEGETAL
Fr. L/L
ter de petrleo
1000 ml
Fraccin
ter de Petrleo
Fraccin Acuosa
Fr. L/L
CH2Cl2 2000 ml
Se concentr en
rotavapor 40C
Fracci
n
CH2Cl2
Mtodo 2:
Fraccionamiento
Lquido/Lquido
Fraccin Acuosa
Fr. L/L
AcOEt 1000 ml
Se concentr en
rotavapor 40C
Fraccin
AcOEt
Fraccin Acuosa
Fr. L/L
Butanol 500 ml
Se concentr en
rotavapor 40C
Fraccin
Butanol
Se concentr en
rotavapor 40C
Residuo
Evaluacin de la
Actividad
Antimicrobiana
Mtodo Difusin en Pozo

Escala 0.5 de Mc Farland
100 ul
Suspensin en
Caldo BHI
20 ml de
agar TSA fundido
Solidificacin
Sistema de Anaerobiosis
37C durante 24- 30 horas
20 a 50 ul de los extractos
Control (+) (AZM)

Control (-) DMSO
Visualizacin de los dimetros de

la inhibicin antimicrobiana
Incubacin en
37C/6h
Se aplica la Sal de tetrazolium
Mtodo Difusin en Disco

100 ul
Suspensin en
Caldo BHI
20 ml de
agar TSA fundido
Solidificacin
20 a 50 ul
extractos
Se agrega los extractos a

los discos
Discos de papel filtro

(previamente
esterilizados)
Incubacin
37C/6h
Visualizacin de los dimetros de

la inhibicin antimicrobiana
Bioautografa
Luz U.V.
Cromatografa
Esterilizacin 30 min
100 ul
Suspensin en
Caldo BHI
20 ml de
agar TSA fundido
Se deja solidificar el agar TSA

sobre la cromatografa
Se agrega el agar TSA
Visualizacin de
halos en
determinados Rf
37C/6 h
Resultados
Estudio Microbiolgico:
Mtodo
Pozo
Difusin en Disco/Difusin en
Disco
Pozo
Comparacin de la difusin del los extractos
ESTUDIO MICROBIOLGICO DE
LAS FRACCIONES OBTENIDAS
POR EL MTODO 1:
CROMATOGRAFA EN COLUMNA
AL VACO
MATERIAL VEGETAL
Cromatografa
en Columna tipo
CCV: RP-18 (50
g)
MeOH-H2O (10:2)
MeOH
CH2Cl2
120 ml
120 ml
Fraccin
MeOH-H2O
Fraccin
MeOH
MeOH-CH2Cl2 (1:1)
120 ml
Fraccin
MeOH-CH2Cl2
120ml
Fraccin
CH2Cl2
Mtodo 1:
Fracciones Mtodo 1: CCV

Extracto
S. Mutans
Fr. MeOH-H2O
S.
Sobri
0nus
Fr. MeOH
11
11
Fr. CH2Cl2
DMSO
15
15
Fr. MeOH-CH2Cl2
AZM
14
12
10
8
S. mutans
ATCC 25175
S. sobrinus
4
2
ZM
A
SO
M
D
C
Fr
.
-C
H
M
eO
H
Fr
.
H2
C
2C
l2
eO
H
M
Fr
.
M
eO
H
Fr
.
l2
-H
2O
16
3 mg/pozo
Actividad antimicrobiana sobre

Fraccin MeOH
Fraccin MeOH-CH2Cl2
[3 mg/pozo]
ESTUDIO MICROBIOLGICO DE
LAS FRACCIONES OBTENIDAS
POR EL MTODO 2:
FRACCIONAMIENTO
LIQUIDO/LIQUIDO CONTINUO
MATERIAL VEGETAL
Fr. L/L
ter de petrleo
1000 ml
Fraccin
ter de Petrleo
Fraccin Acuosa
Fr. L/L
CH2Cl2 2000 ml
Se concentr en
rotavapor 40C
Fracci
n
CH2Cl2
Mtodo 2:
Fraccionamiento
Lquido/Lquido
Fraccin Acuosa
Fr. L/L
AcOEt 1000 ml
Se concentr en
rotavapor 40C
Fraccin
AcOEt
Fraccin Acuosa
Fr. L/L
Butanol 500 ml
Se concentr en
rotavapor 40C
Fraccin
Butanol
Se concentr en
rotavapor 40C
Residuo
Fracciones Mtodo 2: Fraccionamiento

L/L
14
13
ZM
M
SO
DMSO
ut
an
ol
1 mg por pozo
Et
er
d
Butanol
Et
cO
AcOEt
S. sobrinus
l2
S. mutans
10
2C
CH2Cl2
12
14
ter de
petrleo
AZM
16
S.
Sobrinu
s
0
Pe
tr
ol
eo
S. mutans
Halos de
inhibicin
(mm)
Extracto
MTT
Halo de inhibicin (6 mm)
sobre
producido por la fraccin
CH2Cl2
[1 mg/pozo]
Fraccionamiento L/L: [2 mg/pozo]

16
Extracto
S. mutans
ATCC 25175
S. Sobrinus
ter de
petrleo
CH2Cl2
AcOEt
Butanol
DMSO
14
13
14
12
AZM
S. mutans
10
Halos de
inhibicin 8
(mm)
6
S. sobrinus
2 mg por pozo
2
0
r
Ete
l
t
no
Cl2
SO
OE
a
2
c
t
M
H
u
A
D
C
B
M
AZ

sobre S. mutans ATCC 25175
producido por el extracto en
CH2Cl2
Sin MTT
[2 mg/pozo]
Con
MTT
Bioautografa de
Las Fracciones Activas
obtenidas a partir de
Los Dos Mtodos de
extraccin
Bioautografa
Rf: 0,298 y
0.32
Rf: 0,32
1
1. Fraccin MeOH,
2. Fraccin CH2Cl2
FE: Slica Gel

FM: MeOH:CH2Cl2 (1:9)
Tamizaje Concentracin
Mnima Inhibitoria de la
Fraccin Activa del Mtodo 2
(Fr. CH2Cl2)
Tamizaje Concentracin Mnima Inhibitoria

Fraccin
CH2Cl2
(mg/pozo)
S.
mutans
0.5
10
20
DMSO
AZM
6.
10
15
S. sobrinus
6.
7.
10
15
16
14
12
10
S. mutans
8
6
S. sobrinus
4
2
0
0,5
10
mg/pozo
20
DMSO
AZM
Sin MTT
Con MTT
a
b
c
d
e
f
20 mg/pozo
10 mg/pozo
5 mg/pozo
Sin MTT
Con MTT
2 mg/pozo
1 mg/pozo
0.5 mg/pozo
Halos de inhibicin sobre S. mutans ATCC 25175 producido por la fraccin CH2Cl2
Comparacin Cromatogrfica
de
Las Fracciones Activas
obtenidas a partir de
Los Dos Mtodos de
extraccin
Cromatografa de Capa
Delgada
FE: RP-18, FM: MeOH:CH2Cl2
(9.5:0.5)
Revelada con acido perclrico
1.
2.
3.
4.
Rf: 0,42
Rf: 0,234
Fr. MeOH (Metodo 1)

Fr. MeOH:CH2Cl2 (Metodo 1)
Fr. CH2Cl2 (Metodo 2)
Subfraccin activa del estudio
anterior de I. laevis.
Obtencin de Subfracciones
de la Fraccin Activa
(CH2Cl2)
del Mtodo 2
Mtodo de Separacin de
Clorofilas Columna de Sephadex:
FE:
Sephadex (10 g)
FM: MeOH-CH2Cl2 (9:1) 150 ml
Muestra
a separar: 100 mg
Fr. CH2Cl2
Fraccin Activa
Fraccin CH2Cl2 100
mg
Cromatografia
Sephadex 10 g
Sf 1
Sf 2
Sf 3
Se concentr en rotavapor 40C
Sf
Monitoreo en CCD de Subfracciones de CH2Cl2

FE: RP-18. FM: MeOH-CH2Cl2 (9:1)
e
b. Rf: 0,1.
c. Rf: 0,32
d. Rf: 0,50
e. Rf: 0,74
e. Rf: 0,86
Revelada con
cido perclrico
Luz U.V.
Subfraccin
No.
S. mutans
ATCC 25175
S. Sobrinus
12
13
DMSO
AZM
15
14
16
14
12
10

S. sobrinus
8
6
4
2
0
0.6 m g por pozo
Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans ATCC 25175 y S.

sobrinus
al estar en contacto con las subfracciones de CH2Cl2 [0.6 mg por pozo]
Sf. 2 de CH2Cl2
A
S. Sobrinus
Fraccin
Activa [0.6
mg/pozo]
Sf. 3 de CH2Cl2
A
Sf. 4 de CH2Cl2
A
A: Sin MTT. B: Revelado con MTT
Fraccionamiento Bioguado
de las Fracciones Activas
10g Extracto de EtOH

Isertia laevis.
Mtodo 1
a
Fraccin
Activa
Cromatografa en
Columna abierta:
FE: RP-18
FM: MeOH-CH2Cl2
(9:1)
Compuesto 1
(C1)
Original
Compuesto 2
Fraccin Activa
(C2)
C1
Activa
C2
Fr.
Original
FM: MeOH-CH2Cl2
(9.5:0.5)
FE: RP-18
C1
C2
Fraccin Activa
Original
Actividad antimicrobiana de los compuestos

separados [0.4 mg/pozo]
sobre S. mutans ATCC 25175.
C1
Activa
C2
Fr.
Original
Compuesto No.
Fr. Activa
Original
DMSO
AZM
S. mutans
6.5
6.2
8.5
15
S. sobrinus
6.5
6.2
8.5
14
16
14
12
10
S. sobrinus
6
4
2
0
C1
C2
Fr. Activa
Orig.
DMSO
AZM
0,4 m g/pozo
Accin antimicrobiana de los compuestos C1, C2 y Fr. Activa Original

[0.4 mg/pozo] sobre S. mutans ATCC 25175 y S. sobrinus
Pruebas Qumicas
Cualitativas en CCD de
los Compuestos Separados
Prueba de Brntrager
C1
C2
Fr. Activa
Negativa para Antraquinonas
Prueba de Dragendorff
C1
Activa
C2
Fr.
Original
Negativa para
Alcaloides
Lieberman-Brchard
C1
C2
Fr. Activa
Positiva para Terpenos y Esteroides
Molibdato de Amonio
C1
C2
Fr. Activa
Positivo para Terpenos
Prueba
Prueba
de Molish: Positiva
de Espuma: Positiva
Posiblemente Saponinas
Discusin
Los
medicamentos o productos qumicos

sintetizados no son la unica estrategia para
el control microbiologico de la caries
dental, ya que la prevalencia e incidencia
de la misma no ha disminuido a traves del
tiempo.
Los
fitomedicamentos obtenidos mediante

metodos econmicos, accesibles y
reproducibles, se contituyen en una
alternativa para el tratamiento de diversas
patologas.
Los dos metodos de fraccionamiento nos

permitieron obtener la fraccion activa.
La fraccion activa obtenida por medio del

metodo 1, tuvo un grado de mezcla menor en
comparacion con la fraccion obtenida con el
metodo 2.
Efecto antimicrobiano de las fracciones fue

similar en las dos bacterias en estudio.
El fraccionamiento L/L es la tcnica ms

recomendada para la obtencion de la fraccion
activa a mayor cantidad , bajo costo y con
similar actividad antimicrobiana, por tanto el
metodo 2 puede ser una opcion aplicable a la
Agroindustria.
Por
medio de la pruebas quimicas

cualitativas parciales aplicadas a las
fracciones activas, se logro demostrar estas
contienen terpenos y esteroides
posiblemente glicosilados (saponinas)
Murphy 1999
Los
metabolitos encontrados pueden ser los

responsables del efecto inhibitorio en las
cepas en estudio.
Se
demostr actividad antibacteriana para

los componentes mayoritarios separados de
la fraccin activa, sin embargo la mezcla
present una mayor accin inhibitoria, lo
que nos permite sugerir la posible accin
sinrgica de los componentes de la mezcla.
Conclusiones
A partir del extracto etanlico de Isertia laevis se obtiene

una fraccin con accin antimicrobiana frente S. mutans
y S. sobrinus.
La fraccin activa de Isertia laevis se puede obtener

mediante dos mtodos de extraccin: Cromatografa en
Columna al Vaco CCV y Fraccionamiento Liquido/Liquido
Continuo, demostrndose su reproducibilidad tanto en
su contenido qumico, como en su accin
antimicrobiana.
La concentracin minima inhibitoria de la fraccin activa

obtenida por el mtodo 2 fue 1 mg por pozo frente a S.
mutans y S. sobrinus
Se determin que con el mtodo de separacin CCV se

obtuvo la fraccion activa con un menor grado de mezcla,
con respecto a la fraccin activa obtenidad por el
Fraccionamiento L/L.
El grado de mezcla y la presencia de clorofilas

interfiere en la accin antimicrobiana de la fraccin
activa obtenida por el metodo 2, por ello es
necesario realizar la eliminacion de posibles
sustancias interferentes para aumentar la actividad,
como lo demuestran los resultados obtenidos:
Fraccin Activa con sustancias interferentes a 2
mg/pozo present halos de inhibicin de 6.5 mm
para las dos bacterias y la fraccin activa sin
sustancias interferentes aumenta la accin a una
concentraccion mas baja de 0.6 mg/pozo y con
mayor halo de inhibicion (12 y 13 mm)
Los compuestos separados de la fraccin activa con Rf:

0.37 y 0.51 (RP-18, MeOH:CH2CL2 9:1), por si solos tienen
actividad inhibitoria a 0.4 mg por pozo, frente a S. mutans y
S. sobrinus con halos de inhibicin : Sustancia Rf 0.37: 6,2
mm y Sustancia Rf 0.51: 6,5 mm para las dos bacterias
evaluadas.
El fraccionamiento lquido/lquido puede ser la mejor

opcin para obtener fitofarmacos a nivel industrial,
debido a su bajo costo y poco procesamiento de las
sustancias.
Se concluye tambin que el mtodo MTT dio

excelentes resultados para visualizar de manera fcil
los halos de inhibicin producidos por las fracciones
evaluadas en el mtodo difusin en pozo, permitiendo
la lectura correcta del dimetro de los halos.
Recomendaciones
Se
recomienda realizar pruebas

microbiolgicas de las fracciones activas
en otras cepas bacterianas (Mycobaterias)
asociadas a otras patologas humanas.
Es
importante evaluar el efecto

farmacolgico, toxicologico y estudios
clnicos de la fraccin activa.
Se
recomienda aislar, purificar e identificar

algunos de los componentes de la mezcla
para posteriormente cuantificar su
contenido y estandarizar la fraccin activa.
Se
sugiere buscar sustancias bioactivas

que tengan efecto antimicrobiano en
otras plantas de la familia Rubiaceae.
Sera
de gran importancia determinar el

mecanismo biolgico de las fracciones
activas sobre las bacterias en estudio.
Se
recomienda el uso del MTT para

mejorar la visualizacin y la medida de
los halos de inhibicin en el Mtodo
Difusin en Pozo.
Gracias

Actividad Microbiana en Empresas de Alimentos

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CARTA DE AUTORIZACIN DE LOS AUTORES PARA LA CONSULTA, LA

REPRODUCCIN PARCIAL O TOTAL, Y PUBLICACIN ELECTRNICA DEL TEXTO

Bogot, D.C., Fecha 23 de julio de 2009

Los usuarios puedan consultar el contenido de este trabajo de grado en

Permita la consulta, la reproduccin, a los usuarios interesados en el

Contino conservando los correspondientes derechos sin modificacin o

De conformidad con lo establecido en el artculo 30 de la Ley 23 de 1982 y el

Margarita Luca Perdomo Giraldo

Mayra Alexandra Tllez Corral

NOTA IMPORTANTE: El autor y o autores certifican que conocen las derivadas

PROGRAMA ACADMICO: BACTERIOLOGA

TTULO COMPLETO DEL TRABAJO DE GRADO: EVALUACIN DE LA

Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus.

DIRECTOR (ES) DEL TRABAJO DE GRADO

ASESOR (ES) O CODIRECTOR

TRABAJO PARA OPTAR AL TTULO DE: Bacteriloga.

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LA FRACCION ACTIVA DE

MARGARITA LUCA PERDOMO GIRALDO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LA FRACCION ACTIVA DE

MARGARITA LUCA PERDOMO GIRALDO

FREDY O. GAMBOA JAIMES, PhD

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LA FRACCION ACTIVA DE

MARGARITA LUCA PERDOMO GIRALDO

FREDY O. GAMBOA, M.Sc. PhD.

NOHEMI TELLEZ ALFONSO Dra.Sc

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LA FRACCION ACTIVA DE

MARGARITA LUCA PERDOMO GIRALDO

INGRID SCHULER Phd.

LUZ AMPARO MALDONADO

A Dios por su amor, fuerza y respaldo incondicional.

Al Doctor Fredy Gamboa y al Centro de Investigaciones Odontolgicas por permitirnos el

2.1 CARIES DENTAL

2.1.1 Factores Microbianos

2.1.1.1 Colonizacin Primaria

2.1.1.2 Colonizacin Secundaria

2.1.1.3 Placa Madura

2.1.1.4 Fase de Mineralizacin

2.1.2 Determinantes Bacterianos de Patogenicidad

2.1.2.1 Gnero Streptococcus

2.1.2.2 Gnero Lactobacillus

2.1.2.3 Gnero Actinomyces

2.1.2.4 Gnero Staphylococcus

2.2 EXTRACTOS VEGETALES Y ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

2.3 FAMILIA Rubiaceae

2.3.1 Gnero Isertia

2..3.1.1 Isertia laevis

2.4 MTODOS DE EXTRACCIN

2.4.1 Cromatografa en Columna al Vaco CCV

(Vacuum Column Chromatography - VCC)

2.5 MTODOS PARA LA EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD

2.5.1 Mtodo de difusin en pozo

2.5.2 Mtodo de difusin en disco

2.5.4 Mtodo MTT

3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN

3.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA

3.3 PREGUNTA DE INVESTIGACIN

4.1 OBJETIVO GENERAL

4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

5.1 MATERIAL VEGETAL

5.1.1 Desengrase del Material