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Protocolo IHQ para criosecciones 60 m

1.- Hidratar criosecciones en PBS.


Lavar tres veces (5 min cada una).
2.- Aplicar solucin bloqueo 300 L por 30 min.
3.- Sacar solucin de bloqueo sin lavar.
4.- Agregar anticuerpo primario. Refrigerar por una noche a 4C.
5.- Lavar 4 veces (8 min cada una) en PBS.
6.- Agregar anticuerpo secundario por una hora en un contenedor cerrado.
7.- Agregar DAPI por 10 min.
8.- Lavar 4 veces (5 min cada una) en PBS.
9.- Agregar tres gotas de Dako y montar.
10.- Sellar con pinta uas.

Soluciones:
PBT: 10 L tritn en 10 mL PBS.
Solucin bloqueo: Para 10 mL de PBT: 0,1 g BSA y 50 L horse serum.
Glycerol: 50%, 80%, 100%.
Sacarosa 30 %: 100 mL NaCl 0,9% y 30 g sacarosa.
Polilisina: 5mL polilisina (por 20 min, dos a tres capas).
PBS 1X: 8 grs NaCl, 0.2 grs KCl, 1.44 grs Na2HPO4, 0.24 grs KH2PO4, pH 7.4,
aforar en 1 Lt.

Aplicacin poly-lisina
1.- Primero hay que limpiar los portaobjetos con alcohol 95%, papel y fuerza
hasta que estn tan limpios como uno quisiera tener sus lentes (los que somos
miopes....).
2.- Despus, se aplican 5 ul de poly-lisina sin tritn y se esparcen con un
cubreobjetos en toda la superficie del porta.
3.- Es importante controlar esto visualmente: si el lquido se recoge, quedan
restos de aceites en la superficie.
4.- Despus se deja secar por 30 min y se repite en la direccin opuesta.

Tincin de Toluidina:
1.- Aplicar a todo el portaobjeto toluidina al 1% y esperar por 10 mins.
NOTA: Si se le agrega DAPI, primero 250L de DAPI por 10 mins, y luego la
toluidina.