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AISLAMIENTOYCARACTERIZACINDEEXOSOMASDECLULASESTROMALESMESENQUIMALES

OBTENIDASDEMDULAOSEAHUMANA

LeidyVanessaHernndezSuta
Autora

TRABAJODEGRADO
Presentadocomorequisitoparcialparaoptaralttulode

Bacteriloga

PontificiaUniversidadJaveriana
FacultaddeCiencias
CarreradeBacteriologa
BogotD.C
Diciembrede2012
1

NOTADEADVERTENCIA

"La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por los alumnos en sus tesis
degrado.Slovelarporquenosepubliquenadacontrarioaldogmayalamoralcatlica,yporqu
las tesis no contengan ataques o polmicas puramente personales, antes bien, se vea en ellas el
anhelodebuscarlaverdadylajusticia".

Artculo23delaresolucinnmero13deJuliode1946.

AGRADECIMIENTOS
InicialmentequisieraagradeceraDios,amispadres,PedroyAmanda,porquehansidoelpilarde
mivida,porbrindarmeoportunidadestanmaravillosasylasbasesnecesariasparaserunapersona
conbuenosprincipios.
A la Doctora Viviana Rodrguez y el Doctor Alfonso Barreto por su disponibilidad, enseanzas,
comprensin y colaboracin en el desarrollo de este trabajo; por brindarme da a da nuevos
conocimientosquemepermitierondarmisprimerospasoseninvestigacinqueseconvirtieronen
unabaseslidadehbitosdetrabajoconloscualesafrontarelfuturo.
A Diana Bautista y Viviana Wilches por su apoyo y colaboracin en el anlisis de las muestras y
aportesenlarealizacindelproyecto.
IgualmenteaVicerrectoraAcadmicaporelfinanciamientodelproyecto,alGrupodeInmunologa
yBiologaCelulardelaFacultaddeCienciasdelaPontificiaUniversidadJaveriana.Alospacientesy
DepartamentodeOrtopediayTraumatologadelHospitalUniversitarioSanIgnacioenelprocesode
obtencindemuestrasdemdulasea.
Amishermanos,AndrsHerrera,HaidyMorenoyamigosquemeapoyaronenelplanopersonaly
fueronejemplodeluchaconstante.

TABLADECONTENIDO

PAG

1. Introduccin

2. Justificacin

3. Marcoterico

3.1 Caractersticasgeneralesdeclulasestromalesmesenquimales

3.2 Generalidadesdeexosomas

3.3 Relacinentreclulasestromalesmesenquimalesyexosomas

4. Objetivos

4.1 General

4.2 Especficos

5. Metodologa

5.1 Aislamientodeclulasestromalesmesenquimalesdemdulaseahumana
5.2 Caracterizacineinmunotipificacindeclulasestromalesmesenquimales
5.3 Diferenciacinadipognica,condrognicayosteognicadeclulas estromales
mesenquimales

5.3.1 Diferenciacinadipognica

5.3.2 Diferenciacincondrognica

5.3.3 Diferenciacinosteognica

5.4 Aislamientodeexosomasdeclulasestromalesmesenquimales

5.5 Caracterizacindeexosomasaisladosdelasclulasestromalesmesenquimales
5.5.1 CuantificacindeprotenaspormtododeBradford

5.5.2 DeterminacindeAcetilColinesterasa

5.5.3 Evaluacindeprotenasasociadasconexosomas

5.5.4 Caracterizacindeladensidaddeexosomasaislados

6. Resultados

6.1 Establecimientoycaracterizacindeclulasestromalesmesenquimales
6.1.1 Evaluacinmorfolgicadeclulasestromalesmesenquimales

6.1.2 Inmunofenotipodeclulasestromalesmesenquimales

6.1.3 Diferenciacinadipognica,condrognicayosteognicade
clulasestromalesmesenquimales

6.2 Aislamientoycaracterizacindeexosomasderivadosdeclulas
estromalesmesenquimales.

7. Discusin

8. Conclusiones

9. Bibliografa

10. Anexos

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ARN
CEM
MO
SITC
AChE
Hsc70
MFGE8
CMH
CMVs
CDs
LB

LT

CPA
INF
NK

LTC

LTh1
IL4
LTh2
IL12
ON

TGF
IDO
UFCF
PPAR
AMP
SFB

IL11
ATP
PS

IMDM
CMNs
PBS
HRP

TABLADEABREVIATURAS

cidoribonucleico
Clulasestromalesmesenquimales
Mdulasea
SociedadInternacionaldeTerapiaCelular
Acetilcolinesterasa
Heatshockcognateprotein70
Milkfatglobuleepidermalgrowthfactor8
Complejomayordehistocompatibilidad
Cuerposmultivesiculares
Clulasdendrticas
LinfocitosB
LinfocitosT
Clulaspresentadoradeantgeno
Interferon
Naturalkillercell
LinfocitosTcitotxicos
LinfocitosThelper1
Interleucina4
LinfocitosThelper2
Interleucina12
xidontrico
Transforminggrowthfactor
Indoleamina23dioxigenasa
UnidadesformadorasdecoloniaFibroblasticas
Peroxisomeproliferatoractivatedreceptor
Adenosinmonofosfato
SueroFetalBovino
Interleucina11
Adenosintrifosfato
Phosphatidylserine
IscovesModifiedDulbeccosMedium
Clulasmononucleares
PhosphateBufferedSaline
HorseradichPeroxidase

RESUMEN
Introduccin.Losexosomassonungrupodevesculasdemembrana,compuestosporprotenasy
cido ribonucleico (ARN); que pueden ser aislados de diferentes clulas, entre ellas clulas
estromales mesenquimales (CEM). Este grupo de vesculas aisladas de CEM se han caracterizado
porposeerunefectocardioprotectorypromoverelcrecimientotumoralinvivo.Objetivo.Aislary
caracterizar exosomas a partir de clulas estromales mesenquimales aisladas de mdula sea.
Metodologa. Se realiz un aislamiento de CEM de mdula sea (MO) humana de donantes
voluntariosdelHospitalUniversitarioSanIgnacioen(Bogot,Colombia).LacaracterizacindeCEM
se realiz segn los criterios establecidos por la Sociedad Internacional de Terapia Celular (SITC):
morfologa,inmunofenotipoydiferenciacin.Posteriormenteserealizelaislamientodeexosomas
porultracentrifugaciondiferencialycaracterizacinporcuantificacindeprotenastotales,niveles
de acetilcolinesterasa (AChE), perfil de protenas asociadas a exosomas (CD63, Hsc70, MFGE8, y
CMHI) y flotacin sobre gradiente de sacarosa. Resultados. Se recolectaron 3 muestras de MO
humana a partir de las cuales se establecieron cultivos de CEM con morfologa fibroblastide,
presenciadeantgenosmesenquimalesCD105yCD73,enausenciadeantgenoshematopoyticos
CD45 y CD34. Las tinciones para evaluar diferenciacin a linaje adipognico, condrognico y
osteognicofueronpositivasencomparacinaloscontrolesnegativos.ApartirdeCEMcultivadas
se obtuvieron concentraciones de protena totales entre 18,46 y 90 g, actividad de AChE
(promedio14,82mUdeAChE),expresindeprotenasasociadasaexosomascomoCD63,Hsc70y
MFGE8.LaexpresindeCD63sedetectoenfraccionesdealtadensidad(1,121,30g/mL)enel
gradiente de sacarosa. Conclusin. El aislamiento de exosomas de CEM por ultracentrifugacin
diferencial requiere un escalonamiento de la estrategia de expansin de CEM. Los exosomas
aisladosdeCEMexpresan protenas asociadas aexosomascomoCD63,Hsc70yMFGE8, yflotan
sobregradientedesacarosaenfraccionesdealtadensidad.

AISLAMIENTOYCARACTERIZACINDEEXOSOMASDECLULASESTROMALESMESENQUIMALES
OBTENIDASDEMDULAOSEAHUMANA
1. INTRODUCCIN
Losexosomassonvesculasdemembranaqueseoriginandentrodelaclulaencompartimentos
endosomales llamados cuerpos multivesiculares (CMVs) y se caracterizan por tener un dimetro
entre40100nm.Sumorfologaesredondaenformadecopaypuedentenerunadensidaden
gradiente de sacarosa que oscila entre 1,13 1,19 g/mL; estas vesculas pueden ser obtenidas a
100.000gporultracentrifugacindiferencial[1].Susmembranasestnenriquecidasencolesterol,
esfingomielina y ceramida, tienen fofatidilserina (Phosphatidylserine, PS) expuesta y se considera
que pueden tener molculas de ARN [2]. Debido a su origen endosomal, los exosomas expresan
protenas como tetraspaninas (CD9, CD63, CD81 y CD82), protenas de choque trmico (Hsc70,
Hsp90),yprotenasinvolucradasenlabiognesisdeCMVs(Alix,Tsg101)[3].
Losexosomassonsecretadosporlasclulasalambienteextracelulardondepuedeninteractuarcon
otrasclulas;existendiferentesmecanismosporlosquesegenerastainteraccin.Enunestudio
sobre clulastumorales de melanoma,Parolini etal encontraronquelos exosomas liberadospor
estas clulas pueden fusionarse con la membrana celular de clulas tumorales a travs de la
interaccin lpido a lpido bajo condiciones especficas de pH [4]; adems se ha demostrado la
expresindediferentesprotenasenexosomasquepermitenlainteraccinconotrasclulasporla
unindereceptoresespecficosconlasuperficiecelular[5].
Lasecrecindeexosomashasidoreportadaporvariostiposdeclulas,incluyendolneascelulares
tumorales, clulas neuronales y clulas madre, adems se ha detectado en algunos fluidos
biolgicos como sangre y orina [6]. Dentro de las clulas madre se encuentran las CEM, clulas
madreadultasadherentesalplstico,definidasporsucapacidaddediferenciacinenclulascomo
adipocitos,condrocitosyosteoblastos,yporlaexpresindeCD105,CD73,yCD90,enausenciade
laexpresindemarcadoreshematopoyticos[7];yentresusprincipalesfuncionesseencuentran
propiedadesregenerativaseinmunomoduladoras[8].
Los estudios de investigacin sobre las funciones que tienen los exosomas derivados de las CEM
hasta ahora reportan que estas vesculas de membrana, poseen un efecto cardioprotector [9] y
promueveninvivolaprogresindeltumordeformasimilaralasCEM[10].

2. JUSTIFICACIN
Se ha reportado que las clulas madre ayudan significativamente en la regeneracin de tejidos y
terapias modificadoras de enfermedades [11]. Sin embargo los resultados obtenidos hasta el
momentosonmuyheterogneos,porlotantolacomprensinacercadelasinteraccionesdeestas
clulas con el microambiente del receptor es primordial para su aplicacin clnica. Las mayores
complicacionesenlaimplementacindelaterapiacelularalognicasonlarespuestainmunequese
generaylabsquedadedonantescompatibles[12];porlotantoesnecesariobuscaralternativas
en terapia celular; por ejemplo, la bsqueda de componentes de clulas madre con funciones
reguladoras,comolosexosomas.
Los exosomas han sido aislados de diferentes clulas como plaquetas, linfocitos B (LB), clulas
epitelialesintestinales,clulastumorales,clulasdendrticas(CDs)[13,14].Sehademostradoque
los exosomas son capaces de modular la respuesta inmune y sus efectos varan fuertemente
dependiendo del estado fisiolgico de las clulas que los secretan [15, 16], por ejemplo, los
exosomasaisladosdeclulasepitelialesintestinalesposeenpropiedadesinmunoreguladorassobre
los linfocitos T (LT), ya que pueden inhibir su proliferacin y disminuir su viabilidad cuando son
estimuladospoliclonalmente[14];otroestudioreportquelosexosomasdeCDsexpresanCMHde
claseIyIIqueestimulanlaproliferacindeLT[13];porlotantoesfundamentalrealizarestudios
acercadelaspropiedadesqueposeenlosexosomasespecficosdecadagrupodeclulas.
PorotroladosehaobservadoquelasCEMtambinposeenpropiedadesinmunoreguladorascomo
la inhibicin de la proliferacin de LT, LB, CDs y clulas asesinas naturales (NK), entre otras [17],
peronoesclarosilosexosomasproducidosporCEMtambintienenestafuncin;porestarazn
en este trabajo se pretende aislar y caracterizar exosomas producidos por CEM de MO humana
aisladas en cultivo mediante ultracentrifugacin y Western Blot respectivamente, con el fin de
evaluar en un futuro si los exosomas producidos por las CEM pueden promover mecanismos de
toleranciainmunolgicayregeneracintisular.

3. MARCOTERICO
3.1 Caractersticasgeneralesdeclulasestromalesmesenquimales
Las CEM son clulas madre adultas, capaces de autorenovarse, generar diversos tejidos
mesodrmicosysustentarelprocesodelahematopoyesis.LaSITChapropuestotrescriteriospara
lacaracterizacininvitrodeCEM;primero,lasCEMdebenseradherentesalplstico;segundo,las
CEM deben expresar antgenos como CD105, CD73, y CD90, en ausencia en la expresin de
marcadores hematopoyticos (CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79, CD19 y HLADR); y tercero, las
CEMdebendiferenciarsehacialinajeadipognico,condrognicoyosteognico,invitro[7].
Existen diferentes fuentes de aislamiento de CEM, como mdula sea, tejido adiposo o sangre
perifrica; o de tejidos asociados al nacimiento como la placenta, cordn umbilical, sangre de
cordn,lquidoamniticoomembranacorinica;aunqueexistendiferenciasenlascaractersticas
delasCEMderivadasdeestostejidosencuantoalacapacidaddeproliferacinylacapacidadde
diferenciacin[18].TambinsehanlogradoaislarCEMdehuesotrabecular,msculoesqueltico,
pncreas,hgado[19],membranasinovial[20],pulpadentalyligamentoperiodontal[21].
Varios estudios han demostrado que las CEM tienen la capacidad de regenerar, hueso [22],
cartlago[23],tendn[24]ymsculoesqueltico[25].Ademsdelaspropiedadesregenerativas,se
ha reportado que las CEM pueden desempear funciones especficas en el mantenimiento de la
tolerancia perifrica, la tolerancia del trasplante, la autoinmunidad, la evasin del tumor y la
toleranciamaternofetal[26].
Rastegar et al han demostrado la capacidad de las CEM para modular la respuesta inmune,
encontrando que pueden mejorarla o suprimirla [27]. Las CEM pueden promover la respuesta
inmuneactuandocomoclulaspresentadorasdeantgeno(CPA)atravsdeunavadependiente
de interfern (INF); sin embargo, cuando los niveles de INF incrementan, se inhibe
directamentelapresentacindeantgenoypromuevelainmunosupresin[28].
ElmecanismodeinmunosupresindelasCEMsebasaprincipalmenteenlacapacidaddeinhibirla
proliferacin de LT, LB, CDs, y clulas asesinas naturales (Natural killer cell, NK) induciendo un
arresto de la divisin celular en la fase G0 G1 del ciclo celular asociada con la induccin de la
expresindeciclinaD2[29].ElefectoinmunomoduladorejercidoporlasCEMenlosLT,afectala
expresindemarcadoresdeactivacin,laformacindelinfocitosTcitotxicos(LTC),laproduccin
deINFporloslinfocitosThelper1(LTh1)ylaproduccindeinterleucina4(IL4)porlinfocitosT
helper2(LTh2)[17].Adems,sehareportadoquelasCEMafectanlasfuncionesdelasCDs,yaque
inhibe la maduracin de las CDs mieloides disminuyendo la expresin de CD11c, CD83, CMH II y
molculascoestimuladoras,ascomolaproduccindeinterleucina12(IL12)[30].Igualmentese
hademostradoquelafuncindelasclulasNKseveafectadaporlasCEM,dondestasdisminuyen
susecrecindeINF[31].

10

Sato et al han expuesto que el efecto inmunosupresor de las CEM puede ser ejercido por la
secrecindefactoressolubles,yaquelasCEMproducenxidontrico(ON)enpresenciadeLTCD4+
yCD8+,resultandoenlasupresindelaproliferacindeLT[32].
Tambin se ha reportado que las CEM secretan TGF regulando procesos de diferenciacin,
crecimiento y oncognesis, e inhibe la activacin de LB. Adems la indoleamina 23 dioxigenasa
(IDO)secretadaporCEMcatalizalaconversindetriptfanoaquinurenina,yesteagotamientode
triptfanosuprimelaproliferacindeLT[18,33].
3.1.1 MorfologadeCEM
Las CEM observadas bajo microscopa invertida presentan morfologa fibroblastoide y algunos
cultivostienenlacapacidaddeformarunidadesformadorasdecoloniafibroblastoide(UFCF).Estas
clulas evaluadas mediante la tcnica citolgica Cytospin y coloreadas con tincin de Wright
presentan un ncleo redondo excntrico, con cromatina parcialmente condensada y algunos
nuclelos,elcitoplasmaesligeramentebasfilo,agranularydesprovistodeinclusiones.
3.1.2 InmunofenotipodeCEM
La caracterizacin inmunofenotipica esta basada en la determinacin de un extenso panel de
antgenos, incluyendo la expresin de protenas como CD105 tambin conocido como endoglina
(protena transmembrana homodimrica de 180 KDa), CD105 es un componente del complejo
receptor del TGF una citoquina que modula angiognesis por la regulacin de diferentes
funcionescelularesincluyendoproliferacin,diferenciacinymigracin[34].
AdemasdelantgenoCD105,tambinsehaencontradoquelasCEMexpresanlaprotenaCD73.La
protenaCD73(ecto5nucleotidasa)esunaprotenade70KDaunidaaunamolculadeglicosil
fosfatidilinositol(GPI)enlamembranacelular[35];lafuncinprincipaldelaecto5nucleotidasaes
metabolizarel5adenosinmonofosfato(AMP)enadenosina[36].
3.1.3 DiferenciacindeCEM
Otra de las caractersticas importantes que definen a las CEM, es su capacidad de diferenciacin
haciamultipleslinajes,loquehapermitidoestudiossobrelascondicionesdecultivoparainducirla
diferenciacinylasdiferentesvasrelacionadasencadalinaje.Ladiferenciacinadipognicadelas
CEMiniciaconlaaparicingradualdepequeasvacuolaslipdicasenelcitoplasma,seguidodeun
redondeamiento de la clula mientras las vacuolas lipdicas se van agrandando para fusionarse y
formarunasolavacuola,formandoasadipocitos;sehaencontradoqueelreceptoractivadorde
proliferacindelosperoxisomas(PPAR)actacomosintetizadordecidosgrasosyjuegaun
papel importante en la regulacin de la funcin de genes especficos de adipocitos [37]. Esta
diferenciacinsegeneramediantelaexposicinafactoresexgenosopormediosdecultivoque
contienen isobutildexametasona, insulina y dexametasona [27]; la isobutamildexametasona es un
inductor de adenosin monofosfato cclico (cAMP) el cual inicia la adipognesis mediante la
activacin temprana de C/EBP (Protena de unin a un elemento de respuesta a cAMP) que
11

participa en la induccin de la expresin del factor de transcripcin C/EBP necesario para el


proceso de diferenciacin; la insulina promueve la adipognesis por supresin de la actividad
inhibitoriadelfactordetranscripcinProteinboxforkheadO1(FoxO1)[38]yladexametasonaesun
estimulante, que acta a nivel celular sobre el factor de transcripcin C/EBP que induce la
expresin de C/EBP y PPAR, los cuales permanecen elevados durante el proceso de
diferenciacinpromoviendolaexpresindemarcadoresdediferenciacinadipognica[39].
La diferenciacin condrognica ocurre cuando las CEM crecen bajo condiciones que incluyen un
mediolibredesueroylaadicindeunmiembrodelasperfamiliadeTGF;enpresenciadeestas
condicioneslasclulasrpidamentepierdensumorfologafibroblastoideeinicianlaexpresinde
componentes de matriz extracelular especficas de cartlago, incluyendo la biosntesis de
glicosaminoglicanos [40]; tambin se ha estudiado la sobreexpresin de genes como SRYbox 9
(Sox9)quecooperaconprotenascomoSox5ySox6parapromoverlaproliferacincondroctiica,la
maduracinylaformacindematriz[41].
La diferenciacin osteognica es inducida por factores como dexametasona, glicerolfosfato,
cidoascrbicoysuerofetalbovino(SFB),lasCEMenpresenciadeestossuplementosadquieren
unamorfologaosteoblasticaconsobreregulacindelaactividadfosfatasaalcalinayformacinde
una matriz extracelular mineralizada enriquecida en depsitos de calcio [40]. La dexametasona
regulalafosforilacindeunresiduodeserinadelaprotenaRunt2(Runx2),ungenreguladordela
diferenciacinosteognicatempranaqueactasinrgicamenteconTGF,regulandolaexpresin
de la interleucina 11 (IL11) que reduce la adipognesis, mientras promueve la diferenciacin
osteognicaycondrognica[42];elglicerolfosfatoesutilizadocomosuplementoporlacapacidad
deestimularlacalcificacindelasclulasinvivo,induciendolaformacindecalcio[43]yelcido
ascrbicoestimulalahidroxilacindeaminocidosparalaformacindelasfibrasdecolgenoen
triplehlicequepermitemantenerlaestructurade lostejidos[44];otroinductorosteognicoes
osterix, que suprime la condrogenesis y promueve la diferenciacin osteoblstica en una etapa
posterior[45].
3.2 Generalidadesdeexosomas
Enlosltimosaossehaestudiadoquelasclulastienenlacapacidaddesecretardistintostiposde
vesculasdemembrana.Lasvesculasdemembranasonestructurasesfricasqueestnlimitadas
por una bicapa lipdica y contienen componentes hidrofilicos solubles. Las clulas pueden formar
vesculasdemembranaquesonsecretadasalespacioextracelular,estasvesculaspuedenformarse
por desprendimiento directo de la membrana plasmtica o se pueden originar a partir de
compartimentosinternos(Figura1)[46].

12


FIGURA 1. Diferentes tipos de vesculas de membrana secretadas. Tomado de: Thery, C., M.
Ostrowski,andE.Segura,Membranevesiclesasconveyorsofimmuneresponses.NatRevImmunol,
2009.9(8):p.58193.
Existenvariostiposdevesculasdemembranaquesecaracterizanporsuestructuraypropiedades
bioqumicasdependiendodesulugardeorigen.Vesculasdemembranagrandes(Dimetro>100
nm) que son secretadas por desprendimiento de la membrana plasmtica, tales vesculas se han
definidocomomicrovesculas,ectosomas,micropartculasyexovesculas.Otrotipodevesculasde
membranamspequeas(Dimetro<100nm)tambinsecretadasporlamembranaplasmtica,
incluyenvirusenvueltoscomoelVIHyexosomas[46].
En el ao de 1983, en un estudio sobre reticulocitos de ovejas, se observ que la formacin de
exosomas es una va para la eliminacin de protenas tales como el receptor de transferrina o
integrinas, durante su maduracin eritroide [47]. Hacia 1996, Raposo et al demostraron que los
exosomasestaninvolucradosenlapresentacindeantgenos,encontrandoquelasCPAcontienen
compartimentosendocticostardosenriquecidosconCMHIIquecontienenensuinteriorvesculas
de membrana llamadas exosomas con las mismas caractersticas en su membrana, estos
compartimentos pueden fusionarse con la membrana plasmtica resutando en la liberacin de
exosomasquecontienenCMHII[48].
Losexosomassehancaracterizadopormicroscopaelectrnicacomovesculasde40100nmde
dimetroconestructuraredondaenformadecopa[1],unaflotacinsobregradientedesacarosa
entrelasfraccionesde1,141,18g/mL[48]yporposeerunacomposicindeprotenasparticular
quepuedevariarenfuncindelasclulasdeorigen.
Variosestudioshandemostradoquelosexosomasseencuentranenelmediodecultivodevarios
tipos de clulas, incluyendo clulas de origen hematopoytico [49, 50], clulas tumorales [51],
clulasneuronales[52],clulasdeepiteliointestinal[53],ydefluidosbiolgicoscomoorina[54],
plasma[55],fluidodelavadobronquial[56]yfluidosinovial[57].
13

Dependiendo de la clula o tejido de origen, diferentes funciones han sido atribuidas a los
exosomas. Estudios recientes han demostrado que los exosomas pueden interactuar de forma
especfica con un receptor de la clula diana, lo que permite la comunicacin intercelular [6].
AdemssecreequelapresenciademRNAsymiRNAsenexosomasdemastocitosindicaunanueva
funcinparalacomunicacinclulaaclula,ylatransferenciadematerialgentico[58].
Tambinsehademostradoelpapeldelosexosomassobrelarespuestainmune,encontrandoque
losexosomastienenlacapacidaddeestimularlarespuestainmune,ascomodeinhibirla.Theryet
al han expuesto que los exosomas de CDs contienen en su membrana varias protenas que
involucranlaestimulacindeLT,incluyendoCMHdeclaseIyIIymolculascoestimuladorascomo
CD86; encontrando que estos exosomas inducen la estimulacin de LT CD4+ vrgenes in vitro, ya
que las CDs maduras utilizan los exosomas de CDs como fuente de antgeno incrementando el
nmerodeCDsquellevanunpptidoparticular,amplificandolarespuestainmuneadaptativa[59].
La inhibicin de la respuesta inmune por exosomas fue demostrada en exosomas derivados de
clulastumoralesdemesoteliomaquetienenlacapacidaddedisminuirlarespuestaproliferativaa
IL2 en poblaciones de linfocitos [60]. Del mismo modo recientemente se ha demostrado en la
Universidad Javeriana que durante la infeccin por rotavirus de clulas epiteliales intestinales se
produce una poblacin de vescula de membrana entre las cuales se encuentran exosomas, que
podranasociarseconmecanismosdetoleranciafrentealvirusdebidoaquepuedeninhibirtantola
proliferacincomodisminuirlaviabilidaddeLTestimuladospoliclonalmente[14].
3.2.1 Biognesisdeexosomas
Dentro del extenso grupo de vesculas de membrana, los CMVs se han definido como los
precursores de exosomas; por que posiblemente la maquinara de formacin de CMVs est
relacionadaconlaproduccindeexosomas.EnunmodelodeformacindeCMVssepropusieron
dospasossecuenciales,elprimeroinvolucralaseleccindeprotenashacialamembranalmiteyel
segundo la formacin de vesculas hacia el interior con la incorporacin simultnea de protenas
seleccionadas[61].Sehaobservadoquelosexosomasseoriginandentrodeestoscompartimentos
multivesiculares internos por lo tanto diferentes estudios se han enfocado en identificar los
mecanismosmolecularesimplicadosenlaformacindevesculasintracelularesylafusindeestos
conlamembranaplasmtica(Figura2)[62].

14


FIGURA2.Molculasinvolucradasenlabiognesisysecrecindeexosomas.Tomadode:Bobrie,
A.,etal.,Exosomesecretion:molecularmechanismsandrolesinimmuneresponses.Traffic,2011.
12(12):p.165968.

Algunasprotenasinvolucradasenlabiognesisdevesculascomoexosomas,sonloscomplejosde
protenasESCRT(EndosomaslSortingComplexRequiredforTransport)yaqueserequierenparala
formacindeCMVsylaclasificacindeprotenasendosomalesenlasvesculas[63];tambinseha
demostrado que pequeas guanosin trifosfatasas (GTPasas) de la familia de las Rab estn
involucradas,encontrandoqueRab11serequiereparalasecrecindeexosomasdependientesde
calcio en la lnea celular eritroleucemia K562 [64], Rab 35 est involucrada en la secrecin de
exosomas enriquecidos de protenas proteolipdicas en clulas oligodendrogliales [65], Rab27a y
Rab27bjueganunpapelcomplementarioenlasecrecinespontaneadeexosomasquellevanCMH
IIenclulasHeLa[66].EncuantoalmecanismomoleculardelafusindeCMVsconlamembrana
plasmtica se ha reportado que las protenas SNARE (Soluble Nethylmaleimidesensitive factor
Attachment Protein) estn implicadas ya que se encuentran involucradas en varios eventos de
exocitosisreguladaporcalcio[62].
3.2.2 Protenasasociadasaexosomas
Existen diferentesprotenas que se hanutilizado para la caracterizacin deexosomas, entreellas
encontramoselCMHI,unantgenoconformadoporunacadenapesadaunidanocovalentementea
la2microglobulinayqueseexpresaenlasuperficiedelamayoradelasclulas.Enunestudiose
report que los exosomas derivados de CDs expresan CMHI sustituyendo a los expresados en la
membranaplasmticadeCDsmaduras[67].
Tambin se ha identificado un grupo de protenas que al parecer son comunes en todos los
exosomas;porejemplo,Hsc70unaprotenadechoquetrmicode73KDa,quesehaencontradoen
exosomaspurificados de LBhumanos [68]. LaprotenaHsc70ensuestructurabsicaincluyetres
dominiosunoaminoterminaldelaadenosinatrifosfatasa(ATPasa)de44KDa,unpptidodominio
deuninde18KDa,yundominocarboxiloterminalde10KDa.Hsc70esunachaperonaquepuede
15

protegerlasclulasdeldaocausadoporagresionesfsicasoqumicas,tambinesunamolculade
uninaadenosinatrifosfato(ATP)ytieneunaactividadintrnsecaATPasayaquepuedehidrolizarel
ATPenADP[69].Apartirdeestasfunciones,GeminardetaldeterminaronlarelacinentreHsc70y
el receptor de transferrina liberado en exosomas durante la maduracin de reticulocitos,
encontrandoqueelantgenoHsc70seunealreceptordetransferrinaexosomalconunainteraccin
chaperona/pptidoqueesnecesariadurantelamaduracin[70].
MFGE8, tambin llamada lactaderina, es una protena que se une de forma no covalente a
fosfolpidos aninicos en la superficie de los glbulos de grasa de leche a travs del factor VIII,
adems se une a integrinas av3 y v5 a travs de una secuencia Arg gly Asp en su primer
dominioyalasclulasapoptticasqueposeenfosfolpidosaninicos,comolaPS[71].Elantgeno
MFGE8sehadescritocomounamolculamultifuncionalqueparticipaenvarioseventosregulados
mediantelasuperficiecelularinvolucrandodiferentesclulasytejidos;entresusfuncionesestel
mantenimientodelahomeostasisdelepiteliointestinalypromoverlareparacindelamucosa,en
otros tejidos tiene funciones de remodelacin tisular y angiognesis por unin a receptores de
integrina[72].EnunestudiosobreexosomasdeCDsdeMOseidentificlaexpresindeMFGE8,
encontrandoenensayosdeestimulacinaLTCD4queexosomasdeCDsdeficientesdeMFGE8son
menoseficientesquelosexosomasquelollevanensumembrana[71].
En la caracterizacin de exosomas tambin se encuentra involucrada la protena CD63 que
pertenece a la familia de las tetraspaninas, localizada dentro del sistema endosomal y en la
superficie celular. En su estructura posee 4 dominios transmembrana hidrofbicos, con un loop
pequeo, uno grande y 2 colas intracelulares amino y carboxilo. La mayora de las funciones
descritasdeCD63tienenlugarenlasuperficiecelular,talescomolaendocitosisdeprotenasyla
motilidaddeclulastumorales[73].DiferentesautoreshandemostradoquelatetraspaninaCD63
se expresa en exosomas liberados por LB humanos [74], CDs [75] y plaquetas [76]. Hasta el
momentoesteesunodelosmejoresmarcadoresdeexosomas.
3.2.3

Cuantificacindeacetilcolinesterasacomoparmetroparacaracterizacindeexosomas

Adems de la anteriores protenas descritas en la caracterizacin de exosomas, otro parmetro


utilizadoparasucaracterizacinesladeterminacindelaactividaddelaAChE;staesunaenzima
reguladoraquecontrolalatransmisindelosimpulsosnerviososatravsdelasinapsiscolinrgica
porhidrlisisdeltransmisorexcitadoracetilcolina[77].Cantinetaldemostraronquelosexosomas
son similares a los retrovirus en trminos de tamao, densidad y capacidad de activar clulas
inmunes;por loque determinque la AChEesunmarcador de exosomas ya que la fraccin que
contena AChE incluye exosomas, mientras que la fraccin sin AChE contena solo viriones
infectados, confirmando que para obtener una preparacin altamente purificada de exosomas es
tildeterminarlaactividaddeAChE[78].
3.3 Relacinentreclulasestromalesmesenquimalesyexosomas
En estudios previos, han identificado que las CEM tienen acciones paracrinas, que pueden ser
explicadas por la liberacin de vesculas de membrana llamadas exosomas que pueden ser
16

potencialesreguladoresdelosprocesosinflamatorioseinmunolgicos[79];estosexosomaslogran
actuar como vehculos para la transferencia de informacin ya que contienen protenas y ARN,
desempeandounpapelfundamentalenlacomunicacinclulaaclula[80].
SobreestudiosdeexosomasderivadosdeCEMsehareportadoenunmodeloderatnconlesin
deisquemiademiocardio,quelasCEMposeenunefectocardioprotectoratravsdepartculasde
50 100 nm, que pueden ser visualizadas por microscopa electrnica y coinmunoprecipitan con
protenas asociadas a exosomas como CD81, CD9 y Alix, lo que sugiere que estas partculas son
exosomas;esteefectorepresentauncambioenlacomprensindelareparacindetejidos,yaque
estosexosomasrepresentaranunvehculoidealparaefectuarunarespuestafisiolgicainmediata
pararepararlesionesatravsdelarpidaentregadeprotenasfuncionales[9].
Zhu et al demostraron que los exosomas derivados de CEM promueven in vivo la progresin del
tumor de forma similar a las CEM, ya que facilitan la angiognesis y la proliferacin de clulas
tumorales [10]. Otro estudio sugiere que los exosomas de CEM podran ser un vehculo para la
administracindefrmacos,debidoaqueestudiosanterioreshansugeridoquelasCEMproducen
unagrancantidaddeexosomasnoinmunognicos,loquepermitiralaadministracinintravenosa
bientolerada,facilitandounadosificacinmsexactadelacargadelfrmaco[81].

17

4. OBJETIVOS
4.1 General
Aislarycaracterizarexosomasapartirdeclulasestromalesmesenquimalesaisladasdemdula
seahumana.
4.2 Especficos
4.2.1

Aislar y caracterizar clulas estromales mesenquimales a partir de mdula sea de


donantesvoluntarios.

4.2.2

Aislar y caracterizar exosomas de clulas estromales mesenquimales mediante la


expresin de protenas de exosomas y su capacidad de flotacin en gradiente de
sacarosa.

18

5. METODOLOGIA
5.1 Aislamientodeclulasestromalesmesenquimalesdemdulaseahumana
LasmuestrasdeMOserecolectarondepacientessometidosaprocesoquirrgicoderemplazototal
de cadera con previa aceptacin del consentimiento informado (ANEXO 1), que asistan al
departamento de Ortopedia y Traumatologa del Hospital Universitario San Ignacio, Bogot, DC.
(Colombia). Durante el procedimiento, se recolectaron muestras de rimado acetabular de fmur
y/o aspirado de MO en un tubo estril con anticoagulante EDTA 0.25%, y posteriormente las
muestras se llevaron al laboratorio de Hematologa de la Facultad de Ciencias de la Pontificia
UniversidadJaveriana,dondefueronprocesadas.
ApartirdelamuestradeMOrecolectada,serealizunacentrifugacina800gdurante20minutos
para obtener el buffy coat, seguido de la separacin de clulas mononucleares (CMNs) por
gradiente de densidad con Ficoll Hypaque (Histopaque d=1.077 g/cm3, SigmaAldrich) con una
relacinde1:3ysedeterminlaviabilidadcelularmedianteelusodelcolorantedeexclusinde
azul de tripano 0.025%. Las CMNs obtenidas, fueron cultivadas en cajas de T175 cm2 (160.000
clulasporcm2)conmedioIscovesModifiedDulbeccosMedium(IMDM,Gibco)suplementadocon
SFBal10%(Cat.10bio100B,LGCBiotecnologia),1%deaminocidosnoesenciales(M7145MEM
100X, SigmaAldrich), 1% de piruvato de sodio (S8636, SigmaAldrich), 0.5% de penicilina
estreptomicina (N SV30079.01, Hyclone) y 0.1% de ciprofloxacina (L.CI1011171, Corpaul), y se
incubarona37Ccon5%deCO2.Lasclulasnoadherentesfueronremovidas,realizandocambios
demedioalda3,6,9y12,sedejaronencultivohastaquelasclulasalcanzaronunaconfluencia
de 75% para realizar los correspondientes pases celulares por medio de tripsinizacin (tripsina
0,25%yEDTA1mM).
Para aislar exosomas de CEM, fue necesario realizar un escalonamiento celular, para esto se
cultivaronaproximadamenteentre912cajasde175cm2cadaunacon30mLdemediodecultivo
IMDM. Para realizar la caracterizacin de la poblacin de CEM y aislamiento de exosomas se
tomaron2muestrasensegundopase(MO63MO68)y1muestraentercerpase(MO70).
5.2 CaracterizacineInmunotipificacindeclulasestromalesmesenquimales
LacaracterizacindeCEMserealizsegnloscriteriosdelaSITC,inicialmenteporsuadherenciaal
plstico y morfologa fibroblastoide in vitro con el microscopio invertido Olympus, seguido del
inmunofenotipo para el que se utilizaron CEM cultivadas, para evaluar la expresin de antgenos
comoCD105yCD73enausenciadeexpresindemarcadoreshematopoyticoscomoCD34yCD45
(Tabla 1: Anticuerpos y fluorocromos utilizados en la caracterizacin in vitro de las CEM) por
citometradeflujo.

19

TABLA1:AnticuerposyfluorocromosutilizadosenlacaracterizacininvitrodelasCEM.
ANTICUERPO

CLONA

FLUOROCROMO

CD34(IgG2a)

AC136

Aloficocianina(APC)

CD45(IgG1)

2D1

Protenaclorofila
peridinina(PerCP)

CD105(IgG1)

SN6

Ficoeritrina(PE)

CD73(IgG1)

AD2

Isotiocianatode
fluorescena(FITC)

REFERENCIACOMERCIAL
MiltenyBiotecMACS
(130090954)
BDBiosciences
(347464)
Invitrogen
(MHCD10504)
BDBiosciences
(561254)

5.3 Diferenciacin adipognica, condrognica y osteognica de clulas estromales


mesenquimales
La diferenciacin de las clulas madre mesenquimales en adipoblastos, condroblastos, y/o
osteoblastosserealizenelsegundopase(MO63MO68)ytercerpase(MO70).
5.3.1 Diferenciacinadipognica
Laadipognesisfueinducidacultivando4.000CEMenunpozode2cm2conunvolumende1mLde
medio de cultivo STEMPRO Adipogenesis Differentiation Kit Ref. A1007001 (InvitroGen, 2008)
(ANEXO2),serealizaroncambiosdemediocada4dashastacompletar14dasendiferenciacin,
ladiferenciacinfueevaluadamediantelatincindeSudannegrouncoloranteliposolublebsico,
quesecombinaconlosgruposcidosdelmateriallipdicodelaclula,tiendounaampliavariedad
delpidos,incluyendofosfolpidos,grasasneutrasyesteroles.Paraelprocedimientodelatincin
lasCEMfueronfijadasconformalinapor30minutos,luegoserealizaronlavadosconaguadestilada
y un lavado con propilenglicol al 100% durante 3 minutos, seguido de una incubacin con sudan
negrodurante5minutos,despusserealizunlavadoconpropilenglicolal85%por2minutosy
con agua destilada y luego se realiz una incubacin con rojoneutro 1%durante 2 minutos yun
lavado con agua destilada, despus de este procedimiento se observaron las clulas en el
microscopioinvertidoidentificandolasvacuolaslipdicasteidasdeazuldentrodelasclulas.
5.3.2 Diferenciacincondrognica
La diferenciacin condrognica se realiz cultivando 10.000 CEM en un pozo de 2 cm2 con un
volumende1mldemediodecultivo,STEMPROChondrogenesisDifferentiationKitRef.A1007101,
(InvitroGen,2008)(ANEXO3),serealizaroncambiosdemediocada3dashastacompletar14das
endiferenciacincelular,luegoserealizunaevaluacindeladiferenciacinmediantelatincinde
Safranina O un colorante catinico que se une a los grupos carboxilo y sulfato de los
glucosaminoglicanos,loscualessonestructurasterminalesdelosproteoglicanoscomoelagrecano
uncomponenteesencialdelcartlago.ParaelprocedimientodelatincindeSafraninaOlasCEM
20

sefijaronconformalinaal10%durante5minutosseguidodetreslavadosconPhosphateBuffered
Saline(PBS1X),seincubaronconsafraninaOal1%durante3minutosyfinalmenteserealiztres
lavadosconPBS1X,seretirelexceso.Despusdeesteprocedimientoseobservaronlasclulasal
microscopioinvertidoidentificandolosproteoglicanosdecolorrojointenso.
5.3.3 Diferenciacinosteognica
La diferenciacin osteognica se realiz cultivando 10.000 CEM en un pozo de 2 cm2 con un
volumende 1 mL de medio de cultivoSTEMPRO OsteogenesisDifferentiation KitRef. A1007201
(InvitroGen,2008)(ANEXO4),serealizaroncambiosdemediocada4dashastacompletar21das
endiferenciacincelular,luegoserealizunaevaluacindeladiferenciacinmediantelatincinde
Von Kossa en la que hay una sustitucin del calcio por plata, ya que el nitrato de plata brinda
fosfato de plata o carbonato de plata los que se unen a la parte aninica de las sales de calcio
(fosfatosocarbonatos)formandocompuestosdecoloramarilloqueenpresenciadeluzadquieren
colornegroporreduccindelaplata.ParaelprocedimientodelatincindeVonKossalasCEMse
incubaron connitratodepataal1%durante20 minutosenluzultravioleta seguidodeunlavado
conaguadestilada,luegoserealizunaincubacincontiosulfatosdico5%durante5minutosyun
lavadoconaguadestiladayfinalmenteunaincubacinconnuclearfastred0,1%durante5minutos
y un lavado con agua destilada. Despus de este procedimiento se observaron las clulas en el
microscopioinvertidoidentificandolosdepsitosdecalciodecoloramarillo.
5.4 Aislamientodeexosomasdelasclulasestromalesmesenquimales
ElaislamientodeexosomasserealizapartirdeCEMencultivo,utilizandomedioparaproduccin
de exosomas que fue previamente depletado de los exosomas presentes en el SFB por
centrifugacina100.000gravedadesdurante15horas.LasCEMselavarontresvecesconmediode
cultivoIMDMsinSFBydespusselesadicionelmedioparaproduccindeexosomas.Luegode48
horasdecultivo,serecuperaronlossobrenadantesparaelaislamientodeexosomasqueserealiz
a partir de una centrifugacin diferencial. Primero se centrifugo a 1.200 gravedades durante 10
minutos para remover las clulas desprendidas, luego se realizaron centrifugaciones diferenciales
de los sobrenadantes a 4.000 gravedades por 20 minutos para eliminar cuerpos apoptticos y
10.000 gravedades por 40 minutos para eliminar microvesculas. Los sobrenadantes finales se
ultracentrifugarn a 100.000 gravedades por 100 minutos (rotor 70Ti, BeckmanCoulter) para
obtenerpequeasvesculasquecorrespondeaexosomas.ElprecipitadoseresuspendienPBS1X
para realizar el lavado por ultracentrifugacin a 100.000 gravedades durante 100 minutos. El
precipitadofinalsereconstituypararealizarcuantificacindeprotenaspormtododeBradfordy
caracterizacinporexpresindemarcadoresasociadosaexosomasyactividaddeAchE.Tambinse
almacenaronlosprecipitadosde4000gravedadesy10.000gravedadesparasucaracterizacinpor
WesternBlotconmarcadoresdeexosomas.

21

5.5 Caracterizacindeexosomasaisladosdelasclulasestromalesmesenquimales
5.5.1 CuantificacindeprotenaspormtododeBradford
LacuantificacindeprotenasserealizutilizandoelmtododeBradford,unatcnicaquemideel
cambioenelespectrovisibledelcoloranteazuldeCoomasieG250(Cat5000006,BioradProtein
Assay) cuando interacciona con aminocidos bsicos y aromticos de las protenas, a travs de
gruposionizados.Paraladeterminacindelcontenidoproteico,serealizunacurvapatrnconun
stockdealbmina5%yladilucindelasmuestrasacuantificar,finalmenteseadicionelreactivo
de Bradford, se incub durante 5 minutos y se realiz la lectura de absorbancia a 595 nm en el
espectofotmetro(MultiskanFC,ThermoScientific).
5.5.2 Determinacindeacetilcolinesterasa
La determinacin de la actividad de la AChE se realiz con el kit Amplex Red Acetylcholine/
AcetylcholinesteraseAssayKit(A12217),queproporcionaunmtodoultrasensibleparamonitorear
continuamente la actividad de AChE indirectamente, usando 10 acetil 3,7dihidroxifenoxazina
(Reactivo Amplex Red) una sonda fluorognica para perxido de hidrgeno (H2O2). El ensayo se
basa en la capacidad de la AChE para convertir el sustrato de acetilcolina en colina, que ser
oxidadoporlacolinaoxidasaabetanayH2O2,elcualenpresenciadeHorseradichPeroxidase(HRP)
reaccionaconelreactivoAmplexRedenunaestequiometra1:1parageneraruncompuestofinal
resorufin,unproductoconaltafluorescencia.Elprocedimientosellevacabosegnelprotocolo
delacasacomercial(ANEXO5),seutilizarondilucionesseriadasdelstockdeacetilcolina100mM
pararealizarunacurvaestndardeconcentraciones.Lasmuestrasfueronledasenunfluormetro
(530exitacin560emisin).
5.5.3 Evaluacindeprotenasasociadasaexosomas
La caracterizacin de los exosomas aislados se realiz con la tcnica de Western Blot para la
deteccindeprotenasCMHI,Hsc70,MFGE8yCD63.Lasmuestrasfueronresuspendidasenbuffer
Laemmli reductor, 0.1 M de Dithiothreitol (DTT), excepto para la identificacin de CD63 en las
muestras,lascualesseprepararonconbufferLaemmlinoreductor(SinDTT).Seinicilaseparacin
deprotenasporelectroforesisengeldepoliacrilamidacondodecilsulfatosdico(SDSPAGE)(Geles
10%),paraelcorridoseconectlacmaraa100voltiosdurante10minutosyseaumenta200
voltiosduranteaproximadamenteunahora.
Despusdelaelectroforesisdeprotenasserealizlatransferenciaamembranasdepolifluorurode
vinilideno a 350 mA durante 2 horas. Una vez terminada la transferencia, las membranas de
polifluorurodevinildenosebloquearonenagitacinconstanteduranteunahoraconunasolucin
TrisHCl(pH7,5)quecontienelechedescremadaal5%yTween20al0,05%.Luegolasmembranas
fueron incubadas con los anticuerpos primarios apropiadamente titulados (Tabla 2: Anticuerpos
primariosutilizadosenlacaracterizacindeexosomasporWesternBlot).

22

TABLA2:AnticuerposprimariosutilizadosenlacaracterizacindeexosomasporWesternBlot
ANTICUERPO
CMHI
(IgGpoliclonaldeconejo)
Hsc70
(IgG2amonoclonalderatn)
MFGE8
(IgGpoliclonaldeconejo)
CD63
(IgG1monoclonalderatn)

CLONA

REFERENCIACOMERCIAL

H300

SantaCruzBiotechnology(SC25619)

B6

SantaCruzBiotechnology(SC7298)

H60

SantaCruzBiotechnology(SC33545)

H5C6

BDBiosciencesPharmingen(556019)

En seguida de la incubacin con los anticuerpos primarios, las membranas de polifluoruro de


vinildenoseincubaronpor50minutosconanticuerpospoliclonalescontraIgG de ratno conejo
conjugados con HRP (Tabla 3: Anticuerpos de cabra policlonales contra IgG). Finalmente, las
membranas se revelaron usando el sustrato quimioluminiscente Supersignal West Dura Extended
Duration (Pierce Biotechnology) y la seal se captur a travs de pelculas CLX Posure (Pierce
Biotechnology, Inc, Rockford, IL). Es importante resaltar que el anticuerpo monoclonal disponible
para identificar la protena CD63 solamente reconoce la forma no reducida de la protena,
produciendounabandadifuminadayalargadaverticalmente[53].
TABLA3:AnticuerposdecabrapoliclonalescontraIgG.
ANTICUERPO

CONJUGADO

REFERENCIACOMERCIAL

GoatAntiMouseIgG

HorseradishPeroxidase(HRP)

ThermoScientific(31430)

GoatAntiRabbitIgG

HorseradishPeroxidase(HRP)

SantaCruzBiotechnology(SC2004)

5.5.4 Caracterizacindeladensidaddeexosomasaislados
LaflotacindelosexosomassecretadosporCEMsobreungradientedesacarosa,sellevacabo
resuspendiendo los exosomas en 1 mL de solucin 2,5 M de sacarosa en un buffer HEPES
20mM/NaOH,pH7.2.Luegoelgradientedesacarosasecolocsobrelasuspensindeexosomasen
un tubo de ultracentrfuga. La muestra se ultracentrifug a 100.000g durante 15 horas (Rotor
SW41,BeckmanInstruments,Inc).Serecolectaronfraccionesde1mLdesdeelfondodeltubo;la
densidad de cada fraccin se determin usando un refractmetro (ausJENA, Germany). Las
fracciones se diluyeron con PBS1X y se ultracentrifugaron a 100.000 gravedades durante 100
minutos a 4C (Rotor SW41, Beckman Instrument, Inc). Los precipitados se resuspendieron en
PBS1XyluegoenbufferLaemmlinoreductorparaanlisisdeCD63porWesternBlot.
23

6. RESULTADOS
6.1 Establecimientoycaracterizacindeclulasestromalesmesenquimalesdemdulasea
humana
Con la colaboracin de los mdicosdel departamento de Ortopedia y Traumatologa del Hospital
UniversitarioSanIgnacio,enBogotDC.(Colombia),serecolectaron3muestrasdeMOhumanade
donantes voluntarios con edades entre 36 53 aos; de las muestras recolectadas dos
correspondenadonantesdesexomasculinoyunadesexofemenino,conunvolumendemuestra
derecoleccinpromediode43mLqueincluyenMOy/orimadoacetabulardefmur.Enlatabla4
sepresentanlosdatosobtenidosdelasmuestrasdeMOhumanarecolectadas.
TABLA4.CaractersticasdemuestrasrecolectadasdeMOparalaobtencindeCEM.
MDULA
MO63
MO68
MO70

EDADDE
PACIENTE(AOS)
53
38
36

SEXO
M
M
F

VOLUMENTOTALDE
MUESTRA(mL)
54mL
50mL
25mL

RECUENTODECLULAS
MONONUCLEARES
179X103/mm3
43.200X103/mm3
45.875X103/mm3

6.1.1 EvaluacinmorfolgicadeCEM
Se establecieron cultivos primarios de CEM aisladas de MO humana, observando clulas con
morfologafibroblastoidequesecaracterizanportenercitoplasmadeformairregularcongrandes
prolongaciones citoplasmticas observadas por microscopio invertido Olympus, no se observ la
formacindeUFCF.TambinseencontrporlatcnicacitolgicaCytospinquelasCEMposeenun
ncleoredondoexcntrico,concromatinaparcialmentecondensada,elcitoplasmaesligeramente
basfiloyagranular(Figura3:MorfologadeCEMdeMO).

24


FIGURA 3. Morfologa de CEM de MO. Se realiz la caracterizacin de las CEM con morfologa
fibroblastoide. (A) CEM en cultivo con 30% de confluencia (Objetivo 10x, microscopio invertido
Olympus).(B)CEMencultivocon80%deconfluencia(Objetivo5x,microscopioinvertidoOlympus).
(CD)CEMencultivo(Cytospin,TincinconWrightObjetivo100x).
6.1.2 InmunofenotipodeCEM
Adems de la caracterizacin morfolgica de las CEM, se estableci el inmunofenotipo de los
cultivos. Se observ la expresin positiva para los antgenos CD105 y CD73, en ausencia de los
antgenos hematopoyticos CD34 y CD45 acorde con lo sugerido por la SITC. (Figura 4:
InmunofenotipodeCEMdeMO)

25

6.1.3 Diferenciacinosteognica,adipognicaycondrognicadeCEM
La caracterizacin biolgica de las CEM en clulas de linaje adipognico, condrognico y
osteognico, se realiz en segundo pase para MO63 y MO68 y en tercer pase para MO70. La
diferenciacin adipognica se evalu transcurrido 14 das mediante la coloracin de vacuolas
lipdicas con Sudan Negro, las clulas presentan el ncleo central rodeado de vacuolas lipdicas
teidas de color azul lo que indica que la coloracin Sudan Negro fue positiva. (Figura 5:
Diferenciacinadipognica,condrognicayosteognica)
La diferenciacin condrognica se evalu luego de 14 das mediante el reconocimiento de
proteoglicanos por medio de la tincin de Safranina O, las clulas presentaron cambios
morfolgicos observando clulas completamente redondas y disminuidas de tamao, estas se
tieron de color rojo indicando la produccin de matriz extracelular. (Figura 5: Diferenciacin
adipognica,condrognicayosteognica)
La diferenciacin osteognica se evalu transcurrido 21 das mediante la determinacin de
depsitosdecalciopormediodelatincindeVonKossa,dondeseobservcambiosmorfolgicos
presentando una forma celular estrellada con prolongaciones y de menor tamao. (Figura 5:
Diferenciacinadipognica,condrognicayosteognica)
ElcontrolnegativodelascoloracionesserealizconCEMnodiferenciadas(CultivadasenIMDM+
SFB 10%), las coloraciones para las CEM no diferenciadas fueron negativas; ya que las clulas no
presentaronvacuolaslipdicasintracelulares,matrizextracelular,nidepsitosdecalcio.

26

6.2 AislamientoycaracterizacindeexosomasdeCEM
Los exosomas derivados de CEM de MO fueron aislados usando el mtodo de centrifugacin
diferencial; luego del aislamiento se realiz cuantificacin de protenas, medicin de actividad de
AChE,ydeterminacindeprotenasasociadasaexosomas.
LacuantificacindeprotenasserealizpormtododeBradfordobteniendoentre18,46y90gde
protenatotalenunpromediode46,7x106CEM,tambinseestablecilaactividaddeAChEque
tenanlosexosomasaisladosdelasCEMdeMOconunpromediode14,82mUdeAChE.(Tabla5:
CuantificacindeprotenaynivelesdeacetilcolinesterasaenexosomasaisladosdeCEMdeMO)
TABLA5.CuantificacindeprotenaynivelesdeacetilcolinesterasaenexosomasaisladosdeCEM
deMO.
MDULA
MO63
MO68
MO70

CEMx
106
47
46.5
14.4

PROTENA AchETOTAL
TOTAL(g) (mUdeAchE)
18,46
21,9
90
21,15
28
1,41

PROTENA
(g)/106CEM
0,392
1,935
1,944

mUAchE/
mUAchE/106
CEM
PROTENA(g)
0,465
1,18
0,454
0,235
0,097
0,050

En el anlisis de Western Blot se detecto en los precipitados de 4.000 y 10.000 gravedades la


expresindeMFGE8yausenciaenlasprotenasHsc70yCD63.EnlosexosomasdeCEMdeMOse
detectaronprotenasasociadasaexosomascomoHsc70,MFGE8yCD63;expresandoaltosniveles
de CD63 y MFGE8, aunque en esta se expresa una banda proteica de menor peso molecular.
(Figura6:AnlisisporWesternBlotdeprotenasasociadasaexosomas)

27


FIGURA 6. Anlisis por Western Blot de protenas asociadas a exosomas. Se colectaron los
sobrenadantes de CEM 48 horas despus de adicionar el medio depletado, para realizar el
aislamientodeexosomasporultracentrifugacindiferencial.LasCEMfueronlisadasconbufferde
lisis(TritonX100,1%)(ControlLisado).Durantelascentrifugacionesdelaislamientodeexosomas,
secolectaronlospelletde4000g,10.000gy100.000g(Exosomas).Enlasdiferentesfraccionesse
analizlapresenciadeHsc70,MFGE8(Lactaderina,mostrandounabandaproteicademenorpeso
molecularenlosexosomas),yCD63.Imagenrepresentativadetresmuestrasindependientes.

Paracumplirconotrodeloscriteriosparacaracterizarlosexosomasseanalizlaflotacindeestos
sobre un gradiente de sacarosa, donde se encontr que el marcador de exosomas (CD63), se
expresenlasfraccionesentre1.121.30g/mL.(Figura7:Flotacinengradientedesacarosade
exosomasdeCEM)

28


FIGURA7:FlotacinengradientedesacarosadeexosomasdeCEM.LosexosomasdeCEMfueron
ultracentrifugadossobreungradientedesacarosa(2.00.5M)a100.000gdurante15horas.Se
recuperaronfraccionesde1mLyseprecipitaronporultracentrifugacin.Losprecipitadosfueron
evaluadosparaCD63porWesternBlot.Ladensidaddeflotacinsobreelgradientedesacarosade
exosomasdeCEMseencontrenfraccionesdealtadensidad(1.121.30g/mL).ElCD63esms
abundanteenlafraccinde1.28g/mL.

29

DISCUSIN

Desde la dcada de los 70 las CEM han sido ampliamente estudiadas, por sus propiedades
regenerativas y capacidad de modular la respuesta inmune. Para esto ha sido indispensable su
aislamiento y caracterizacin in vitro. Con el fin de facilitar un enfoque ms unificado para el
estudio de la biologa de CEM, la SITC estableci tres criterios para identificar CEM, primero, la
adhesin de las clulas aisladas en cultivo al plstico, segundo, la expresin de marcadores de
diferenciacin tales como CD105, CD73, y CD90, mayor a 95% en las clulas del cultivo, con
ausenciaenlaexpresindemarcadorescomoCD34,CD45CD14oCD11b,CD19yCD79Aoantgeno
leucocitariohumanoDR(HLADR),mayora95%enlasclulasdelcultivo,ytercero,lacapacidad
para diferenciarse en adipocitos, condrocitos y osteocitos [7]. Trabajos de Harichandan et al y
AkiyamaetalhandemostradoquelasCEMdeMOsonclulasmultipotentes,quesoncapacesde
formar UFCF; y cumplir con los criterios de identificacin de CEM despus de la expansin en
cultivo[82,83].
Ennuestroestudio,hemoslogradoaislarCEMdeMOcaracterizadassegnloscriteriosdelaSITC.
Observamos que las clulas aisladas eran clulas adherentes con morfologa fibroblastoide y su
inmunofenotipocorrespondaalaexpresindeantgenosCD105yCD73positivos,enausenciade
antgenosCD34yCD45,enmsdel95%delasclulasencultivo.LasCEMsehancaracterizadopor
sucapacidaddediferenciacinenadipocitos,condrocitosyosteoblastos.Hastaelmomentonoes
claro cul esla jerarqua de las CEM, sin embargo Minguell et al propone que la jerarqua puede
estarbasadaensupotencialdediferenciacinmultipotente,tripotente,bipotenteounipotente;
indicandoqueelprogenitormultipotentetienelacapacidaddediferenciacinhacialostreslinajes
principales (Adipocitos, Condrocitos y Osteoblastos), el estroma de soporte hematopoytico y
tenocitos.Elprogenitortripotenteconcapacidaddediferenciacinhaciacondrocitos,osteoblastos
ytenocitos;elprogenitorbipotenteconcapacidaddediferenciacinencondrocitosyosteoblastos,
y el progenitor unipotente con capacidad de diferenciacin hacia un solo linaje [84]. En
comparacinanuestrosresultados,dondevimosquetodaslasCEMdelasmdulasseasaunque
hacen diferenciacin a los tres linajes, unas poseen ms capacidad de diferenciacin adipognica
que otras (MO68). Otros autores describen que la poblacin de CEM no es homognea,
encontrando diferentes subpoblaciones que tienen la capacidad de coexpresar marcadores
neuronales, como tubulina III y el marcador progenitor neuronal nestin, lo que sugiere la
existenciadesubpoblacionesmaduraseinmadurasdeCEM[85].
Posterior a la caracterizacin de las CEM, se realiz un escalonamiento celular para lograr una
produccin ptima de exosomas, que fueron aislados por ultracentrifugacin diferencial. Aunque
YangetalmencionaquelasCEMembrionariasensumorfologaredondatienenundimetrode10
m y en su forma adherenteundimetrode 20 m [86]. Ennuestrosresultadosde CEM de MO
humanaevaluadasporla tcnicaCytospinseobservquelasCEMtienenundimetrosuperiora
tresveceseldeunlinfocito,quetienenundimetroaproximadode12m.Debidoaldimetrode
las CEM fue indispensable realizar el escalonamiento celular, encontrando que la proliferacin
celularencajasdeT175cm2esmximodeaproximadamente4,5x106clulas/CajaT175cm2.
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Aunqueactualmentenosehalogradodefinirunsistemaparacuantificarexosomas,sehanusado
otros criterios para identificar y caracterizar los exosomas aislados, estos incluyen microscopa
electrnica,expresindeprotenasasociadasaexosomasyflotacinengradientedesacarosa.En
nuestro estudio caracterizamos exosomas por medicin de la cantidad de protena aislada,
actividaddeacetilcolinesterasa,expresindeprotenasporWesternBlotyflotacinengradiente
desacarosa.
La medicin de la cantidad total de protena presente en las preparaciones de exosomas da una
ideade la cantidaddeexosomassecretadospor las clulas. Thery etal indica queusualmentese
obtiene0,5gexosomasporcada106CDsinmadurasen24horas,cantidadquepuedeservariable
con algunas lneas celulares [1]. Nuestros resultados indican que en promedio de un cultivo
primario de CEM de MO humana se obtienen 1,42 g exosomas/106 CEM. Tambin se identific
que la actividad de AChE en exosomas aislados de CEM no depende de la cantidad de protenas
aislada,porlotantoesprobablequelaAChEseaunfactorquevareentrelosdistintosdonantesde
MO. En resultados no publicados del grupo de inmunologa y biologa celular de la Universidad
Javeriana con exosomas de clulas Caco2 se encontr un promedio de 2,65 mUAChE/g con un
rangode(1,913,8mUAChE/g)(Barretoetal,2012)yenexosomasdeCEMunpromediode1,46
mUAChE/g con un rango de (0,5 1,18 mUAChE/g), sugiriendo que los exosomas de clulas
Caco2tienenunamayorcantidaddemUAChE,respectoalosexosomasdeCEM.
Losexosomassehancaracterizadoporcontenerunconjuntodeprotenascitoslicas,involucradas
enlafuncinybiognesisdeexosomas;protenasdemembranainvolucradasensuasociacincon
otrasclulas;protenasdeexosomascomoMFGE8queseuneaintegrinasexpresadasenCDsy
macrfagos,yotrasprotenascomomiembrosdelafamiliadelasHsp70[75].Ademsdeincluiren
sus superficie abundantes molculas de tetraspaninas como CD9, CD63, CD81 y CD82[16]. En
nuestro estudio realizamos un anlisis del perfil de protenas de exosomas de CEM, con la
identificacindeprotenascomoHsc70,MFGE8,CD63yCMHI.
Bobrieetalencontrqueenelpelletde10.000gusualmentellamadomicrovesculas,seexpresan
marcadores usados para caracterizar exosomas como CD9 y MFGE8. El CD63 estaba presente
algunasvecesenbajosniveles,mientrasqueHsc70,Tsg101yAlixnofuedetectable[87].Ennuestro
anlisis proteico por Western Blot identificamos la expresin de MFGE8 en la fraccin de
microvesculas y exosomas, encontrando en esta ltima fraccin la expresin de una banda de
menor peso molecular. Tambin encontramos la expresin de Hsc70 y CD63 en la fraccin de
exosomasyausenteenmicrovesculas,loquenospuedeindicarqueelCD63esposiblementeesel
mejormarcadorparalaidentificacindeexosomasenCEM.
CMHIesunaprotenaidentificadaenmuchosexosomasdediferentestiposcelulares,sinembargo
en las CEM de nuestro estudio no se observ la expresin del antgeno CMHI, por lo que se
proponequeestadisminucinpodraestarasociadaconsupapelinmunoregulador[88],aunquees
necesariomsinvestigacindebidoaltamaodemuestradenuestroestudio.

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Theryetaldefineelgradientedesacarosacomoelmtodoparamedirladensidaddeexosomas,
encontrandoqueestosflotanaunrangodedensidadentre1,15a1,19g/mL[1];enotroestudio
logridentificarquelaflotacinsobreelgradientedesacarosamuestradiferentesproporcionesde
CD63,CD9yMFGE8nosoloenlafraccindedensidadclsicadescritoparaexosomas(alrededor
de 1,15 g/mL), sino tambin en fracciones de alta densidad mayores a 1,20 g/mL, indicando la
presenciadepoblacindevesculasheterogneas[87].Nosotroshemosobservadolaexpresinde
CD63enlasfraccionesdealtadensidadensacarosa(1,121,30g/mL),indicandoquelosexosomas
deCEMpuedentenerunamayordensidadquelosreportadosparaotrotipodeclulas[55].
En resumen, los resultados de nuestro estudio demuestran que las CEM aisladas de MO humana
cumplenconloscriteriosdeidentificacinestablecidosporelSITC.Paralograrunaislamientode
exosomas del cultivo primario de CEM, es necesario realizar un escalonamiento celular. Los
exosomasdeCEMseaslanporultracentrifugacindiferencial,ydeloscriteriosestablecidosporla
literaturaparacaracterizarexosomas,nosotroslogramosidentificarparmetroscomoactividadde
AChE,expresindeprotenasasociadasaexosomas,comoporejemploexpresindeHsc70,MFG
E8conunabandademenorpesomolecularyCD63,ademsdeflotacinengradientedesacarosa
loquenosconfirmaqueelaislamientodeexosomasdeCEMfueexitoso.

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CONCLUSIONES

LasCEMaisladasdeMOhumanacumplenlostrescriteriosestablecidosporlasISCT.
El inmunofenotipo de CEM aisladas de MO fue CD105 y CD73 positivas, y CD45 y CD34
negativas.
Las CEM pueden diferenciarse en adipocitos, condrocitos y osteoblastos en medios de
induccindediferenciacinespecficos.
El aislamiento de exosomas de CEM por ultracentrifugacin diferencial dependen de la
cantidaddeclulasaisladas.
Los exosomas de CEM de MO expresan protenas especficas de exosomas como Hsc70,
MFGE8yCD63.
LosexosomasdeCEMdeMOnopresentanexpresindelaprotenaCMHI.
Los exosomas de CEM de MO flotan sobre gradiente de sacarosa en fracciones de alta
densidad(1,121,30g/mL).

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38

10 ANEXOS
ANEXO1.Consentimientoinformadoparaladonacinvoluntariademdulasea.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA


FACULTAD DE CIENCIAS- LABORATORIO DE HEMATOLOGA
GRUPO DE INMUNOBIOLOGA Y BIOLOGA CELULAR

CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA DONACIN VOLUNTARIA DE


MEDULA SEA

Hoja 1 de 3
INFORMACIN GENERAL
En la actualidad usted puede encontrar informacin sobre clulas madre en
diversos medios de comunicacin, sin embargo, es muy importante que este tema
sea investigado en detalle. En la mdula sea se pueden encontrar diversos tipos
de clulas madre, entre ellas las denominadas clulas madre mesenquimales.
Las clulas madre mesenquimales han sido estudiadas especialmente por su
propiedad de mejorar los trasplantes de las clulas madre que forman las clulas
sanguneas, sin embargo, an es necesario seguir explorando las funciones de
stas clulas.
Por este motivo le solicitamos su colaboracin para recolectar una muestra de su
mdula sea durante el procedimiento quirrgico que le ser practicado por el
mdico ortopedista. Este procedimiento no comporta ningn riesgo para su salud
y la muestra ser recolectada por personal especializado.
CONFIDENCIALIDAD: Los registros mdicos permanecern archivados, en el
Laboratorio de Hematologa de la Facultad de Ciencias de la Pontificia
Universidad Javeriana. Las historias mdicas, los resultados de exmenes y la
informacin que usted nos ha dado son de carcter absolutamente confidencial,
de manera que, solamente usted y el equipo de atencin clnica tendr acceso a
estos datos. Por ningn motivo se divulgar esta informacin sin su
consentimiento.
Cualquier informacin adicional usted puede obtenerla de los
encuestadores, o directamente con Viviana Rodrguez en el Laboratorio de
Hematologa de la Facultad de Ciencias de la Universidad Javeriana al
Telfono 3208320 extensin 4025.
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA


FACULTAD DE CIENCIAS- LABORATORIO DE HEMATOLOGA
GRUPO DE INMUNOBIOLOGA Y BIOLOGA CELULAR
Hoja 2 de 3
PROCEDIMIENTO:
Se realizar una entrevista previa (Consentimiento informado) y se proceder a
tomar una muestra de mdula sea de aproximadamente 10 mL durante el
procedimiento quirrgico. Estas muestras sern manejadas nicamente por
personal involucrado en el equipo de atencin clnica y de investigacin.

APROBACIN ESCRITA DONACIN VOLUNTARIA


Yo ____________________________________ identificado(a) con nmero de
cdulas de ciudadana _____________________ declaro que:
1. Entiendo que la muestra de mdula sea ser utilizada con fines de
investigacin y ser manejada bajo las normas ticas pertinentes.
2. Entiendo que la informacin referente a mi ser manejada de forma
confidencial para proteger mi identidad.
3. Entiendo que no recibir ninguna compensacin econmica ni de ningn
otro tipo por la donacin.
4. Entiendo que la donacin de mdula sea NO representa ningn peligro
para m.
5. He ledo y comprendido toda la informacin entregada, estoy satisfecho(a)
con la informacin recibida, he podido formular todas las preguntas que he
credo convenientes y me han aclarado todas las dudas planteadas.

En consecuencia, doy mi consentimiento para la donacin voluntaria de mdula


sea durante el procedimiento quirrgico que me ser practicado por el mdico
ortopedista:

Nombre:_________________________________
c.c. : ____________________________________
Telfono: ________________________________
Fecha:___________________________________
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA


FACULTAD DE CIENCIAS- LABORATORIO DE HEMATOLOGA
GRUPO DE INMUNOBIOLOGA Y BIOLOGA CELULAR
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BENEFICIOS ADICIONALES:
La utilizacin de la muestra en estudios posteriores nos podra ayudar en el futuro a
entender las causas y/o el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente
mencionada(s). Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien
directamente de estos estudio, pero otros individuos afectados podran
beneficiarse. Por lo tanto, por favor marque su decisin con respecto al
almacenamiento de la muestra y su utilizacin en estudios de investigacin
posteriores:
Deseo que la muestra que me fue extrada sea DESECHADA una vez
completado el estudio.
Autorizo conservar la muestra que me fue extrada con la posibilidad de
emplearla junto con el resultado del estudio, en las situaciones
sealadas a continuacin:
SI

o En estudios complementarios de diagnstico para m o algn


miembro de mi familia.
o En estudios de investigacin especficos para la(s)
entidad(es), objeto de esta toma de muestra, siempre y
cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacin.
o En estudios de investigacin de entidades distintas a la(s)
Entidad (es) objeto de esta toma de muestra, siempre y
cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacin.
o En estudios de investigacin colaborativos con otras
Instituciones Nacionales y/o internacionales, siempre y
cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacin.

41

NO

ANEXO2.STEMPROAdipogenesisDifferentiationKitRef.A1007001

42

43

ANEXO3.STEMPROChondrogenesisDifferentiationKitRef.A1007101

44

45


ANEXO4.STEMPROOsteogenesisDifferentiationKitRef.A1007201

46

47

ANEXO5.AmplexRedAcetylcholine/AcetylcholinesteraseAssayKit(A12217)

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