3 8 1 PB

Anlisis genotxico de muestras de agua del ro Ramis
(Departamento de Puno, Per) utilizando eritrocitos

de la sangre perifrica del pez Cebra (Danio rerio)
Genotoxic analysis of water samples from the Ramis river
(department of Puno,Peru) using erythrocytes
(peripheral blood of Cebra fish (Danio rerio)
Recibido: diciembre 12 de 2012 | Revisado: febrero 15 de 2013 | Aceptado: mayo 15 de 2013
Carlos Scotto*1
Javier Alvarez*1
Carlos Llanos*1
Omar Leyva* *
Sul Sotomayor* 2
Karol Chvez* 2
Eber Justo* 2
Oliver Casso* 2
Csar Larico* 2
Wilmar Mayta* **
Wilson Sanga * ***
F acultad de C iencias N aturales y M atemtica

U niversidad N acional F ederico V illarreal
A b s t r ac t
Mine tailings release several genotoxic compounds into the environment.

Neighboring river basins are the most affected, so it is important to determine the quality of its waters. Micronucleus test (MN) quantifies the
genotoxic damage produced in erythrocytes of Cebra fish (Danio rerio)
due to genotoxic compounds present in contaminated rivers. It is because
of this that the research analyzed five points in the Ramis River Basin (Department of Puno, Peru) using zebrafish as a biomarker and the MN test;
the fish were exposed during 24, 48 and 72 hours to 3 different volumes
(1x, 1/2x and 1/4x) for each point sampled. Among the most striking results, after 24 hours of exposure, the sample taken from the Laguna Lunar
de Oro (M5) revealed fatal results for the fish (100%) at 1X, while the sample taken from La Pampilla (M4) presented a 23% of MN at 1/2X, and the
sample taken at the Taraco river (M1) showed a 12% of MN. The analysis
at 48 and 72 h of exposure showed the presence of a maximum of 5% of
MN for all samples. We can, therefore, conclude that the MN test serves
as an efficient genotoxicity indicator to determining the quality of river
water contaminated by mine tailings.
Keywords::
Danio rerio, erythrocyte micronucleus test, genotoxicity, cyclophomide,
mine dumps, minero
Resumen
** Laboratorio de Mejora Gentica y Repro-
duccin Animal, Facultad de Ciencias Naturales y Matemticas, Universidad Nacional

Federico Villarreal, Calle Ro Chepn s/n. El
Agustino. Lima -Per. Email: carlosscottoespinoza@gmail.com
*2 Facultad de Ingenieras y Ciencias Puras,
Universidad Andina Nstor Cceres Velsquez, Pasaje la Cultura, Edificio el Campin
No. 305, Tercer piso. Juliaca Per. Email:
inka_man@hotmail.com
**** Direccin General de Asuntos Ambientales Mineros del Ministerio de Energa
y Minas. Av. Las Artes Sur 260. San Borja.
Lima. Email: wsanga@hotmail.com
Los relaves mineros liberan al ambiente diversos compuestos genotxicos.

Las cuencas de los ros aledaos son los ms afectados, por ello es importante determinar la calidad de sus aguas. El test de Microncleos (MN)
cuantifica el dao genotxico producido en los eritrocitos del pez Cebra
(Danio rerio) por accin de los compuestos genotxicos presentes en las
aguas de los ros contaminados. Por lo tanto, la presente investigacin
analiz cinco puntos de la cuenca del ro Ramis (departamento de Puno,
Per) utilizando el test de MN y al pez Cebra como bioindicador, que fueron evaluados a las 24, 48 y 72 horas de exposicin a tres diferentes volmenes (1X, 1/2X y 1/4X) para cada punto muestreado. Entre los resultados ms resaltantes, a las 24 h de exposicin, tenemos la muestra tomada
de la laguna Lunar de Oro (M5) que fue mortal (100%) a 1X; mientras que
la muestra tomada de la Pampilla (M4) present hasta un 23% de MN a
1/2X; y la muestra del ro Taraco (M1) present un 12% de MN. El anlisis
a las 48 y 72 horas de exposicin mostr la presencia de un mximo de 5%
de MN para todas las muestras. Con esto podemos concluir que el test de
MN sirve como ensayo de genotoxicidad rpido y eficaz para determinar
la calidad de agua de los ros contaminados por un relave minero.
Palabras claves:
Danio rerio, eritrocitos, test de microncleos, genotoxicidad, ciclosfosfamida, relave
| Ctedra Villarreal | Lima, per | V. 1 | N. 1 | 23-36 |
enero -junio
| 2013 |
issn 2910-4767
23
Carlos Scotto, Javier Alvarez, Carlos Llanos, Omar Leyva, Sul Sotomayor, Karol Chvez, Eber Justo,
Oliver Casso, Csar Larico, Wilmar Mayta, Wilson Sanga
Introduccin
Los estudios de genotoxicidad y/o teratogenia que evalen y determinen la calidad del
agua de los ros, lagos, humedales, bofedales
u otras fuentes de agua en el Per; y que potencialmente puedan afectar a la salud humana o animal, y contaminar al medioambiente
son muy escasos o inexistentes. Actualmente,
existe la presencia de contaminantes mineros
como los metales pesados (metil mercurio,
sulfuro de plomo, arsnico, cadmio y otros) en
los ambientes acuticos. Se sospecha que sean
los factores causantes en cascada de dao a nivel gentico molecular, cromosmico, celular,
embrionario y/o fetal. Muchas veces imperceptible o de deteccin tarda cuando el dao
al organismo ya se produjo irremediablemente causando incluso la muerte del individuo o
de la poblacin.
Esta investigacin utiliz al pez Cebra (Danio rerio), el cual es un animal modelo de laboratorio universal y un vertebrado filogenticamente muy cercano al humano, por lo que
cualquier dao producido mediante diversos
contaminantes acucolas, permiten su extrapolacin probada al humano para obtener resultados confiables e inmediatos. Adems, son
peces fciles de manipular y soportan grandes
nmeros en poco espacio; y poseen ua alta capacidad reproductiva (entre 300-400 huevos
por puesta), lo cual facilita realizar diferentes
experimentos con varias repeticiones por contaminante analizado.
Un rasgo anatmico muy importante para
esta propuesta es que los peces poseen glbulos rojos con ncleo, el cual contiene el material gentico o ADN visible por simple tincin
lo que hace posible observar fcilmente cualquier efecto genotxico adverso en forma directa por microscopa y evaluar rpidamente
los efectos nocivos de un contaminante acucola de inters (Anitha,Chandra, Gopinath,
y Durairaj, 2000); Llanos, Monteza y Scotto,
2013; Scarpato, Migliore, Alfinito-Cognetti, y Barale 1990; De Flora,Vigano,DAgostini
Camoirano, Bagnasco, Bennicelli, Melodia, y
24
Arillo 1993) . A diferencia de otras tcnicas

que utilizan tcnicas moleculares de ltima
generacin para la deteccin de los mismos
efectos genotxicos, pero que son muy costosos en reactivos y equipamiento.
Los genotxicos mineros en general, penetran hasta el ncleo de las clulas humanas y
de los animales y daan su ADN (mutaciones
en los genes), lo que a su vez daa a los cromosomas y esto produce alteraciones en el embrin (teratogenia), que finalmente se traduce
en dao en el individuo adulto.
Heddle (1973) y Schmid (1975) fueron los
primeros investigadores que propusieron un
ensayo alternativo y simple para determinar el
dao nuclear y cromosmico in vivo mediante
el conteo de microncleos (MN) en diferentes
poblaciones celulares. Los peces por representar varios niveles de la cadena alimenticia
acutica son excelentes indicadores de la contaminacin del agua, puesto que pueden bioacumular y biomagnificar a travs de ella altas concentraciones de estos elementos. Un ejemplo
claro de esto es el mercurio, el cual es bioamplificado casi en su totalidad por los peces en
forma de metilmercurio sustancia altamente
txica y de fcil fijacin en los tejidos musculares y adiposos, convirtindola en elemento
clave en el transporte de este metal en las cadenas alimentarias acuticas que culminan en el
consumo humano (CEPIS, 1978; WHO, 2003;
lvarez-Len, 2009; Reish & Oshida, 1987).
El pez Cebra (Danio rerio) Hamilton,
(1822) constituye hoy en da, el modelo animal vertebrado acutico por excelencia para
la gentica, embriologa, ecologa, reproduccin y otras ramas de la ciencia. Varios rasgos
inherentes de su biologa los hacen ideales
para ser utilizados como Biosensores de la
contaminacin ambiental : viven en grandes
grupos de hasta seis individuos por litro y en
poco espacio en acuarios acondicionados a
temperaturas a 26 C. Es el pez ms resistente
y fcil de criar entre los ovparos sin muchos
requisitos estrictos en cuanto a su mantenimiento y alimentacin. Obtiene la madurez
| Ctedra Villarreal | V. 1 | No. 1 |
enero -junio
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anlisis genotxico de muestras de agua del ro ramis (departamento de puno, per) utilizando eritrocitos de la
sangre perifrica del pez cebra (danio rerio)
sexual entre los 3 y 4 meses. Son fciles de

sexar. Es sencillo hacerlos desovar y producen alrededor de 300 a 400 embriones. Sus
embriones son transparentes y se desarrollan
completamente en 72 horas (Rocha et al.,
2002). Adems, poseen glbulos rojos sanguneos nucleados (con ADN) a diferencia
de los mamferos que son anucleados (Sprague et al., 2001; Hill, 2004; McHugh, 2001). Y
un aspecto importante es que permiten realizar estudios alomtricos, es decir sus resultados al ser un vertebrado es extrapolable a
los humanos (Lo que le suceda al ncleo o al
embrin del pez Cebra, le suceder lo mismo
al del humano).
Por lo tanto, por las caractersticas biolgicas y fisiolgicas ptimas, esta investigacin
propone al pez Cebra como una especie dulceacucola para ser utilizada como bioindica-
dor en ensayos toxicolgicos de diversos contaminantes mineros del agua.

Mtodo
La presente investigacin se desarroll entre enero y noviembre del ao 2012. Los peces
fueron seleccionados del stock de Danio rerio
pertenecientes al laboratorio de Mejora Gentica y Reproduccin Animal de la Facultad de
Ciencias Naturales y Matemtica de la Universidad Nacional Federico Villarreal, ubicado en
Calle ro Chepn s/n Cuadra N 1, El Agustino, Lima, Per.
Ubicacin geogrfica y toma de muestras de
agua a lo largo de la cuenca del ro Ramis
(Puno, Per)
Las muestras colectadas fueron realizadas en:
(Figura 1):
Figura N 1: Ubicacin de las cinco zonas de muestreo a lo largo del ro Ramis en el Departamento de Puno.
Figura 1. Ubicacin de las cinco zonas de muestreo a lo largo del ro Ramis en el

departamento de Puno.
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Muestra 1 (M1): Microcuenca del ro Taraco

(distrito de Taraco puente rumbo a Chupa).
(Latitud: 153448S, Longitud: 700459O).
Muestra 2 (M2): Microcuenca del ro
San Antn (distrito San Antn). (Latitud:
143692S, Longitud: 701917O).
Muestra 3 (M3): Microcuenca del ro
Crucero (Latitud: 142044.32S, Longitud: 70057.76O).
Muestra 4 (M4): Ro Ramis (distrito de
Ananea). (Latitud: 144025.91S, Longitud: 693143.35O).
Muestra 5 (M5): laguna Lunar de Oro (distrito de Ananea). (Latitud: 14387.57S,
Longitud: 692618.91O).
Materiales
5 muestras de agua de relave (M1, M2, M3,
M4 y M5)
48 peces Cebra adulto (Danio rerio)
2 acuarios de 40 litros
2 termostatos de 40 Watts
45 envases plstico de 1 litro
Alimento seco importado de la marca SERA
Microscopio Bilocular Plan Acromtico
con cmara digital incorporada
Refrigeradora
Compresora de aire
Solucin de Giemsa al 10%
Lminas portaobjetos
Jarra Couplins
Medicamentos varios
Metanol absoluto
Agua mineral no gasificada
Agua destilada
Procesamiento de muestras
El presente estudio requiri de una muestra total de 48 peces adulto Cebra (Danio re-
rio). Estos fueron aclimatados en dos acuarios

de 40 litros a temperatura controlada de 26C
con termostatos de 40W que sirve como componente de un sistema de control simple que
abre o cierra un circuito elctrico en funcin
de la temperatura y una compresora de aire
que oxigen constantemente los acuarios.
Se les aliment ad libitum con alimento
seco importados de la marca SERA.
Cada muestra de agua fue fraccionada en
3 volmenes (1X, 1/2X y 1/4X) complementndose con agua mineral no gasificada para
obtener un volumen total de 200 mL por envase plstico, a diferentes tiempos de exposicin
(24, 48 y 72 horas) con un control de agua mineral no gasificada. Para ello, se expuso cada
muestra de agua del ro Ramis a un volumen y
tiempo de exposicin establecidos.
Del universo analizado se realiz el conteo directo de los glbulos rojos afectados
observndose diferentes tipos de MN por e
cada una de las fracciones de volmenes obtenidos por muestra. Posterior al conteo de
MN se evalu estadsticamente las muestras
de los diferentes tipos de MN presentes en los
eritrocitos de la sangre perifrica del pez Cebra (Danio rerio) ante la accin de los agentes genotxicos presentes en las muestras de
agua de la zona minera de ro Ramis (departamento de Puno) sobre los eritrocitos de la
sangre perifrica del pez Cebra (Danio rerio).
Se consider como dao genotxico positivo
la presencia de un microncleo por eritrocito (MN1), dos microncleos por eritrocitos
(MN2), ncleo en forma arrionada (MN3),
con membrana nuclear rota (MN4) o con ncleo fragmentado (MN5) (Tabla 1).
Tabla 1
Tipos de microncleos producidos por dao genotxico sobre los glbulos rojos en el pez Cebra
(Danio rerio)
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Carlos Scotto, Javier Alvarez, Carlos Llanos, Omar Leyva, Sul Sotomayor, Karol Chvez, Eber Justo, Oliver Casso, Csar Larico, Wilmar Mayta, Wilson Sanga
Obtencin de Microncleos
Con la finalidad de obtener la sangre perifrica, se sacrific cada pez Cebra (expuesto al
volumen establecido para cada tiempo de control) realizando un corte en la parte anterior
del mismo entre el oprculo y las aletas pectorales. (Figura 2).
N 4: Secadode
de lminas
con sangre
Figura Figura
4. Secado
lminas
con sangre
Figura N 4: Secado de lminas con sangre
Figura N 2: Sacrificio del pez cebra

Figura
2. Sacrificio del pez Cebra
Se colect la sangre perifrica y coloc una

gota de la misma en un extremo de la lmina e inmediatamente se realiz el frotis
extendiendo la sangre en la lmina portaobjetos (Figura 3). Se dej secar el portaobjeto con el frotis correspondiente para cada
muestra a temperatura ambiente durante 15
minutos (Figura 4). Se fijaron las muestras
sumergindolas por 15 minutos en metanol
absoluto refrigerado (4C), luego se procedi a retirarlas y dejarlas secar durante 15
minutos a temperatura
Figura
2: Sacrificio
del pezperifrica
cebra (Figura 5).
Figura
N N
3: Frotis
de laambiente
sangre
Figura3.
NFrontis
3: Frotis de
sangre perifrica
Figura
delasangre
perifrica
enero -junio
Figura N 5: Fijacin de muestras en metanol frio
Figura 5. Fijacin de muestras en metanol fro
Despus las muestras se colorearon con

GIEMSA al 10% durante ocho minutos (FiguFigura N 5: Fijacin de muestras en metanol frio
ra 6). Posteriormente, las muestras se lavaron superficialmente con agua destilada para
retirar el exceso de colorante y se dej secar
por una hora a temperatura ambiente (Figura
7 y Figura 8). Por ltimo, se procedi a la observacin microscpica de las muestras para
el conteo final, utilizando objetivos de 400X
(Figura 9) y 1000X (Figura 10). En esta ltima
observacin se le agreg aceite de inmersin a
la muestra 8.
Figura N 6: Coloracin de la muestra.
Figura 6. Coloracin de la muestra
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Figura N 6: Coloracin de la muestra.
Figura N 8: Secado de las muestras coloreadas.
Figura N 9: Eritrocitos nucleados sin MN a 400X de aumento (Control).
N 7: Lavado de las muestras con agua destilada.

Figura 7.Figura
Lavado
de las muestras con agua destilada
Figura 9. Eritrocitos nucleados sin MN a 400X de aumento

(Control)
Figura N 10: Eritrocitos nucleados sin MN a 1000X de aumento (Control)
Figura N 8: Secado de las muestras coloreadas.
Figura 8. Secado de las muestras coloreadas
Resultados
Las siguientes tablas muestran el nmero total
de MN contabilizados a diferentes tempos de
Figura 10. Eritrocitos nucleados sin MN a 1000X de aumento (Control)
exposicin de las muestras de agua procedentes del ro Ramis. La Tabla 2 muestra el nmero
total de eritrocitos con dao genotxico y los
tipos de MN presentes en ellos a las 24 horas.
Tabla 2
Tipos de MN producidos por dao genotxico sobre los eritrocitos en el
pez Cebra (Danio rerio) a las 24 horas
Figura N 11: Diagrama de cajas representando el nmero y tipo de MN por tiempo de

exposicin en muestras de agua de la M1
Figura N 9: Eritrocitos nucleados sin MN a 400X de aumento (Control).
N.N. = No hay presencia de microncleos

MN1 = 1 MN por eritrocito
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MN3 = Ncleo en forma arrionada

MN4 = Membrana nuclear rota
MN5 = Ncleo fragmentado
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La Tabla 3 muestra el nmero total de eritrocitos con dao genotxico y los tipos de MN presentes
en ellos a las 48 horas.
Tabla 3


La Tabla 4 muestra el nmero total de eritrocitos con dao genotxico y los tipos de MN presentes
en ellos a las 72 horas
Tabla 4

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Para la muestra 1, a una concentracin

normal de la muestra, de cien clulas contabilizadas con repeticin se observ hasta ocho
clulas con ncleos membrana nuclear rota
(Tipo IV), hasta 2 clulas con ncleo fragmentados (Tipo V) y 2 clulas ncleo arrionado
(Tipo III). Siendo negativo para los tipos I y II.
(Figura 11).
Figura N 10: Eritrocitos nucleados sin MN a 1000X de aumento (Control)

de 1/2 de la muestra, de cien clulas contabilizadas con repeticin se observ entre 0
a 4 clulas con 1 MN (Tipo I), de 1 a 3 clulas con ncleo arrionado (Tipo III), de 0
a 3 MN tipo III y IV. Y negativo para el tipo
II. (Figura N13). Para la muestra 4, a una
concentracin de 1/2 de la muestra, de cien
clulas contabilizadas con repeticin se observ entre 3 a 15 clulas con membrana nuclear rota (Tipo IV) y entre 0 a 8 clulas con
ncleo arrionado (Tipo III). Siendo negativos los dems tipos de MN. (Figura 14).
Figura N 12: Diagrama de cajas representando el nmero y tipo de MN por tiempo de exposicin
en muestras de agua de la M2
Figura N 11: Diagrama de cajas representando el nmero y tipo de MN por tiempo de
Figura
11. enDiagrama
dedecajas
exposicin
muestras de agua
la M1 representando el nmero y tipo de
MN por tiempo de exposicin en muestras de agua de la M1
Para la muestra 2, a una concentracin de

1/2 de la muestra, de cien clulas contabilizadas con repeticin se observ hasta dos clulas
con 1 MN (Tipo I), hasta 3 clulas con membrana nuclear rota (Tipo IV), y 2 clulas con
ncleos fragmentados (Tipo V), y solo 1 clula
con ncleo arrionado, y negativo para las clulas con 2 MN (Tipo II). (Figura 12).
Figura N 13: Diagrama de cajas representando el nmero y tipo de MN por tiempo de exposicin en
Figura
13. Diagrama de cajas representando el nmero y tipo de
muestras de agua de la M3
Figura N 14: Diagrama de cajas representando el nmero y tipo de MN por tiempo de exposicin en
Figura
14.de Diagrama
de cajas representando el nmero y tipo de
muestras
de agua
la M4
Figura
12.Diagrama
en muestras
de agua de la M2 de cajas representando el nmero y tipo de
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de 1/4 de la muestra, de cien clulas contabilizadas con repeticin se observ entre 1
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a 3 clulas con ncleos fragmentados (Tipo

V), 2 a 8 clulas con membrana nuclear rota
(Tipo IV) y entre 0 a 2 clulas con 1 MN (Tipo
I). Y ninguna clula con 2 MN (Tipo II), ni
ncleo
arrionado
(Figura
Figura
N 14: Diagrama
de cajas representando el(Tipo
nmero y tipoIII).
de MN por tiempo
de exposicin15)
en
muestras de agua de la M4
Figura
en muestras15:.Diagrama
de agua de la M5 de cajas representando el nmero y tipo de
Discusin
Las investigaciones relacionadas con el
tema de la genotoxicidad adquieren cada vez
mayor importancia a nivel local, nacional y
mundial, debido al creciente deterioro del
ambiente al que se encuentra expuesto por las
diferentes actividades del hombre moderno
(Thomann, 1982). El uso de los ensayos de genotoxicidad en el pez Cebra propuesto en esta
investigacin, constituye el primer paso que
asegure la toma de medidas de bioseguridad
apropiadas, y permita realizar los anlisis y la
gestin de riesgos a priori en el componente
biolgico ante un determinado contaminante
del agua (Agencia AUPEC, 1998; Acta Toxicolgica Argentina, 2007; ACGIH. 2010).
En el ao 2012 por Resolucin Ministerial N 225-2012- MINAM el Ministerio del
Ambiente aprob el nuevo Plan de Estndares de Calidad Ambiental (ECA) y Lmites
Mximos Permisibles (LMP) para el perodo 2012-2013 para el Per, donde se realiza
una corporacin o revisin de nuevos ECA
priorizados para agua en lo que respecta a los
aceites y grasas, cianuro, cloruros, nitratos,
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nitritos, nitrgeno amoniacal, slidos totales en suspensin, sulfatos, sulfuros, fosfatos,

fosforo total, antimonio, arsnico, cadmio,
manganeso, mercurio, nquel, termotolerantes y organolpticos. As mismo, incorpora
como novedad a la norma, la elaboracin del
ECA para agua subterrnea que antes solo
exista para aguas superficiales.
Para los LMP relacionados al agua, en el
sector minero se deber hacer una revisin
del LMP de las emisiones de las actividades mineras y metalrgicas. Para el sector
industrial se deber elaborar los LMP de
los efluentes y emisiones para industria petroqumica intermedia y avanzada; para la
industria de la imprenta, para las actividades del subsector industria y para la industria siderrgica. Para el sector agricultura
se deber elaborar los LMP de los efluentes de las actividades agroindustriales, tales como camales y plantas de beneficio.
Y para el sector vivienda se ha incorporado
la elaboracin de LMP de efluentes de plantas
desalinizadoras. De este modo, actualmente
la legislacin y normatividad peruana actual
estn siendo revisadas y actualizadas en sus
Estndares de Calidad Ambiental (ECA) y sus
Lmites Mximos Permisibles (LMP) para que
estn acorde a los estndares internacionales y
se evale primero la seguridad biolgica de todo
tipo de producto potencialmente peligroso.
Por lo expuesto, la implementacin de
la nueva normatividad apunta a muy corto
plazo al uso de nuevos bioindicadores ambientales, tanto en animales como en plantas,
para la determinacin de los contaminantes del agua en territorio peruano los cuales sern utilizados como una nueva herramienta de biomonitoreo para complementar
los nuevos ECAs y LMPs a implementarse
transversalmente en los estudios de impacto
ambiental en diferentes sectores de inters.
Estos bioindicadores debern ser elegidos por su rpida reproduccin en pequeos
espacios que permita tener grandes stock de
31
organismos para diversos ensayos y repeticiones, y que no representen varias semanas

o meses de anlisis, que sean econmicos en
su crianza, y que se posea un amplio conocimiento de su biologa para su facilidad de
manejo laboratorial y ser adaptables a diversos laboratorios para lograr su replicacin. A
nivel de bioensayos laboratoriales en el Per,
se ha recomendado el uso de los siguientes
organismos invertebrados: los crustceos
Artemia sp. y Daphnia magna, el insecto
Chironomus calligraphus y el anlido Paragrellus redivivus. Y el uso de los siguientes
organismos vertebrados: el pez Cebra (Danio
rerio), la trucha Arcoiris (Oncorhynchus mykiss) y el ratn (Mus musculus). Y en vegetales el uso de la cebolla (Allium cepa), la haba
(Phaseolus sp.) y la microalga Chrollela sp.
La aplicacin del ensayo de microncleos
est siendo utilizada para el monitoreo de la
contaminacin de los ambientes acuticos
junto con un biocontrol para la deteccin de
la genotoxicidad. Teniendo como material
biolgico a los eritrocitos nucleados (presencia de ADN nuclear) de la sangre perifrica
del pez Cebra (Danio rerio) se detect el dao
celular en forma directa por microscopia permitiendo evaluar rpidamente (24 a 72 horas)
los efectos nocivos de un contaminante acucola de inters que otros ensayos no pueden
hacerlo. Es un primer paso para alertar con
el tiempo el padecer mutaciones, alteraciones
cromosmicas, desarrollar malformaciones
embrionarias o fetales y causar finalmente la
mortalidad en un ambiente acutico contaminado con metales pesados.
Conclusiones
Para la muestra del ro Taraco (M1) se observ el mayor efecto genotxico (12%)
sobre los glbulos rojos del pez Cebra
(Danio rerio) en el volumen de X a una ex-
32
posicin de 24 horas. Las mediciones a las

48 y 72 horas revelaron ndices de MN de
2% y hasta 5%, respectivamente.
Para la muestra del ro San Antn (M2) se
observ el mayor efecto genotxico (8%)
(Danio rerio) en el volumen de X a una
exposicin de 24 horas. Las mediciones a
las 48 y 72 horas revelaron ndices de MN
de hasta 3%, en ambos casos.
Para la muestra del ro Crucero (M3) se observ el mayor efecto genotxico (6%) sobre los glbulos rojos del pez Cebra (Danio
rerio) en el volumen de 1/2 X a una exposicin de 24 horas. Las mediciones a las 48 y
72 horas revelaron ndices de MN de 4% y
hasta 2%, respectivamente.
Para la muestra de Pampilla (M4) se observ el mayor efecto genotxico (23%)
(Danio rerio) en el volumen de 1/2X a una
exposicin de 24 horas. Las mediciones a
las 48 y 72 horas revelaron ndices de MN
hasta 3%, en ambos casos.
Para la muestra de la laguna Lunar de Oro
(M5) se observ el mayor efecto genotxico (11%) sobre los glbulos rojos del pez
Cebra (Danio renio) en el volumen de X a
una exposicin de 24 horas. Las mediciones a las 48 y 72 horas revelaron ndices de
MN de 3% y hasta 2%, respectivamente.
A exposiciones de 24 o 48 horas el
dao genotxico sobre los glbulos rojos del pez Cebra sigui el siguiente orden creciente: M5>M4>M3>M2>M1.
Por lo que la tendencia en el ro Ramis
es de presentar ms dao genotxico
a medida que se avanza ro arriba hacia la zona de minera informal presente a lo largo de la cuenca estudiada.
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Referencias
lvarez-Len, R. (2009). Efectos del aprovechamiento de metales preciosos en Colombia: Los metales
pesados en las aguas continentales, estuarinas y marinas. Simposio efectuado en el Segundo
Congreso Internacional sobre geologa y minera en la ordenacin del territorio y en el desarrollo, Colombia.
American Conference of Governmental Industrial Hygienists [ACGIH]. (2010) Recuperado de
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Anitha, B., Chandra, Gopinath, P y Durairaj, G. (2000). Genotoxicity evaluation of heat shock in
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CEPIS. (2001). (Centro Panamericano de Ingeniera Sanitaria y Ciencias del Ambiente). Manual
de evaluacin y manejo de sustancias txicas en aguas superficiales. Seccin 1: Perspectiva Centro Panamericano de Ingeniera Sanitaria y Ciencias del Ambiente. OPS/CEPIS/
PUB/01.65;2001.
De Flora, S., Vigano, F., DAgostini, A., Camoirano, M., Bagnasco, C., Bennicelli, F., Melodia, F. y
Arillo, A. (1993). Multiple genotoxicity biomarkers in fish exposed in situ to polluted river
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Anlisis genotxico de muestras de agua del ro Ramis

(Departamento de Puno, Per) utilizando eritrocitos

F acultad de C iencias N aturales y M atemtica

Mine tailings release several genotoxic compounds into the environment.

** Laboratorio de Mejora Gentica y Repro-

duccin Animal, Facultad de Ciencias Naturales y Matemticas, Universidad Nacional

Los relaves mineros liberan al ambiente diversos compuestos genotxicos.

| Ctedra Villarreal | Lima, per | V. 1 | N. 1 | 23-36 |

Arillo 1993) . A diferencia de otras tcnicas

| Ctedra Villarreal | V. 1 | No. 1 |

sexual entre los 3 y 4 meses. Son fciles de

dor en ensayos toxicolgicos de diversos contaminantes mineros del agua.

Figura 1. Ubicacin de las cinco zonas de muestreo a lo largo del ro Ramis en el

| Ctedra Villarreal | V. 1 | No. 1 |

Muestra 1 (M1): Microcuenca del ro Taraco

rio). Estos fueron aclimatados en dos acuarios

| Ctedra Villarreal | V. 1 | No. 1 |

Figura N 2: Sacrificio del pez cebra

Se colect la sangre perifrica y coloc una

| Ctedra Villarreal | V. 1 | No. 1 |

Figura N 5: Fijacin de muestras en metanol frio

Figura 5. Fijacin de muestras en metanol fro

Despus las muestras se colorearon con

Figura N 6: Coloracin de la muestra.

Figura 6. Coloracin de la muestra

Figura N 8: Secado de las muestras coloreadas.

Figura N 9: Eritrocitos nucleados sin MN a 400X de aumento (Control).

N 7: Lavado de las muestras con agua destilada.

Figura 9. Eritrocitos nucleados sin MN a 400X de aumento

Figura N 10: Eritrocitos nucleados sin MN a 1000X de aumento (Control)

Figura N 8: Secado de las muestras coloreadas.

Figura 8. Secado de las muestras coloreadas

Figura 10. Eritrocitos nucleados sin MN a 1000X de aumento (Control)

Figura N 11: Diagrama de cajas representando el nmero y tipo de MN por tiempo de

Figura N 9: Eritrocitos nucleados sin MN a 400X de aumento (Control).

N.N. = No hay presencia de microncleos

MN3 = Ncleo en forma arrionada

| Ctedra Villarreal | V. 1 | No. 1 |

N.N. = No hay presencia de microncleos

MN3 = Ncleo en forma arrionada

N.N. = No hay presencia de microncleos

| Ctedra Villarreal | V. 1 | No. 1 |

MN3 = Ncleo en forma arrionada

Para la muestra 1, a una concentracin

Para la muestra 3, a una concentracin

Figura N 11: Diagrama de cajas representando el nmero y tipo de MN por tiempo de

Para la muestra 2, a una concentracin de

MN por tiempo de exposicin en muestras de agua de la M4

MN por tiempo de exposicin en muestras de agua de la M2

Para la muestra 5, a una concentracin

| Ctedra Villarreal | V. 1 | No. 1 |

a 3 clulas con ncleos fragmentados (Tipo

| Ctedra Villarreal | V. 1 | No. 1 |

nitritos, nitrgeno amoniacal, slidos totales en suspensin, sulfatos, sulfuros, fosfatos,

organismos para diversos ensayos y repeticiones, y que no representen varias semanas

posicin de 24 horas. Las mediciones a las

| Ctedra Villarreal | V. 1 | No. 1 |

| Ctedra Villarreal | V. 1 | No. 1 |

| Ctedra Villarreal | V. 1 | No. 1 |

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