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Objetivos Preparación de medios de cultivo Curso: “Métodos en fitopatología” „ Conocer a que denominamos medio de cultivo en el laboratorio de Fitopatología. „ Reconocer la existencia de diferentes tipos de medio. „ Reconocer la utilidad de los diferentes medios de cultivo en el trabajo con patógenos de plantas. Dr. Pedro Mondino 24 de abril de 2009 Objetivos „ El alumno debe: 1) ser capaz de elaborar medios de cultivo con el fin de ser utilizados posteriormente para el aislamiento de hongos, bacterias o microorganismos epifíticos. „ 2) Desenvolverse con soltura en la utilización de protocolos. „ Condiciones que debe reunir un Medio de cultivo Medios de cultivo „ Los medios de cultivo de microorganismos (hongos, bacterias, levaduras) son esenciales en el Laboratorio de Fitopatología por lo que a diario se preparan y utilizan. „ Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Disponibilidad de nutrientes en los Medios de cultivo. „ Para que los microorganismos crezcan adecuadamente, un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones: „ contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios disponer de oxígeno „ temperatura adecuada „ humedad „ pH. „ exento de microorganismos contaminantes. „ „ Un medio de cultivo para que permita el crecimiento adecuado de microorganismos debe contener como mínimo: „ Carbono „ Nitrógeno „ Azufre „ Fósforo „ Sales inorgánicas que suplan iones (K, Mg, Fe, Ca, etc.). 1 Disponibilidad de nutrientes en los Medios de cultivo Medios de cultivo según su composición „ Medios Naturales. Consisten únicamente en un „ Estos nutrientes generalmente se aportan con Extracto de malta, Peptona, Papa, extracto de levadura, etc. Medios de cultivo según su composición „ Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una „ „ „ „ „ „ „ „ composición química definida cuali y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación. Ej: Medio Czapek. Nitrato de Sodio 2 g/l Fosfato bipotásico 1 g/l Cloruro de potasio 0,5 g/l Sulfato de magnesio heptahidratado 0,5 g/l Sulfato de hierro heptahidratado 0,01 g/l Sacarosa 30 g/l Agar-agar 15 g/l Medios complejos „ Agar Papa Dextrosa: „ Medio para el cultivo y conteo de levaduras y „ „ „ „ hongos en general. Agar -15g Dextrosa - 20g Infusión papa - 4g Agua destilada 1L material vegetal. Ejemplos: un trozo de papa. Agar jugo de manzana, Agar durazno, Agar y jugo de vegetales. Medios de cultivo según su composición „ Medios complejos o de composición indefinida: Son medios cuya composición no se conoce con exactitud. „ contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes. „ Ej: Agar Papa; Agar Malta; Medios de cultivo según su estado físico „ Los medios de cultivo utilizados pueden ser de diferentes tipos: „ Medios sólidos. „ Medio semisólidos. „ Medios líquidos. 2 Medios de cultivo Medios sólidos de cultivo „ Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar „ El agar es un polisacárido extraído de algas. „ En los medios sólidos la proporción de Agar es siempre por encima del 15% Medios de cultivo „ El agar es el elemento solidificante más empleado en la preparación de medios de cultivo. „ Sus características principales son: Medios semi-sólidos de cultivo „ En los medios semi-sólidos la proporción de Agar es de alrededor del 5% „ Se licua completamente a temperaturas de 80 –100 ºC y se solidifica al enfriarse a 40 grados. „ No afecta el crecimiento de hongos ni bacterias. „ No es utilizado por los microorganismos que crecen en él. Medio Agar Agua Medios de cultivo „ En ocasiones se añaden al medio de cultivo sustancias „ Se trata de un medio sin el agregado de nutriente alguno. „ Utilidad indicadoras de actividades metabólicas. „ También se pueden añadir sustancias que ejercen acción inhibitoria selectiva de ciertos microorganismos. „ Aislamiento de hongos a partir de tejido vegetal. Se logra que el crecimiento sea el resultado de la nutrición que posee el tejido vegetal. „ Ensayos de evaluación de actividad antifúngica. 3 Medios de cultivo Medios de cultivo según su utilidad práctica „ Generales: Sirven para el cultivo de una gran variedad „ La exactitud en los procedimientos de fabricación, preparación, conservación y uso, de los medios de cultivo asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos en los ensayos o experimentos. Medios de cultivo según su utilidad práctica „ Medios diferenciales: Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Temperaturas de incubación „ En general los microorganismos patógenos de plantas crecen a temperaturas en el entorno de 24 a 28 ºC. „ En ocasiones incubamos a temperaturas diferentes: A 37 ºC cuando queremos descartar el crecimiento de agentes de control biológico a la temperatura del cuerpo humano. „ A 5ºC o menos cuando buscamos microorganismos adaptados a crecer en la cámara frigorífica. „ Venturia inaequalis debe incubarse a temperaturas de entre 16 y 20 ºC „ de microorganismos. „ Ej: Agar Papa destrosado (PDA); Agar Nutriente (NA) „ Selectivos: Son medios a los que se les agregan sustancias para inhibir el crecimiento de otros microorganismos. „ Ej: Agar Malta acidificado y con antibiótico para inhibir el crecimiento de bacterias. „ Diferenciales: Medios de cultivo según su utilidad práctica „ Medios selectivos: Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un microorganismo particular o grupo de microorganismos. Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta Condiciones adecuadas de humedad „ Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas de los cultivos microbianos. „ En las estufas de cultivo se debe proporcionar una fuente adecuada de humedad para evitar así que se deseque el medio. 4 Presencia de oxígeno „ Los microorganismos aerobios necesitan que el oxígeno llegue en forma adecuada al medio. „ En los medios líquidos se recurre a la agitación, de lo contrario solamente habrá crecimiento en la parte superior. Preparación de medio Agar Malta con antibiótico Presencia de oxígeno „ Los microorganismos aerobios necesitan que el oxígeno llegue en forma adecuada al medio. Los anaerobios por el contrario crecen en ausencia de oxígeno. Ej. Erwinia Preparación de medio Agar Nutriente „ Receta del agar malta „ Extracto de malta 20 g/L. 20 g/L „ pH = 5,4 „ Sulfato de estreptomicina al 0,02% „ (0,1 ml de la solución stock/100 ml de medio). „ Agar Preparación de medio Agar Nutriente „ 3 g de extracto de Carne de buey „ 5 g de peptona trípsica de gelatina „ 15 g de agar „ de cloruro sódico y glucosa „ agua destilada hasta 1000 ml „ Receta NAD (Nutriente agar destrosa) „ Agar nutriente 23g 5g „ Agua destilada 1000 ml. „ Destrosa Esterilidad de los Medios de cultivo „ Los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar otros microorganismos puedan interferir con el crecimiento del que queremos cultivar. „ Los medios de cultivo se esterilizan en el autoclave. 5 Medios de cultivo „ En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de vidrio planas „ Hoy existen de plástico. „ Procedimiento seguido para dispensar el medio en placas de Petri Medios de cultivo „ Los medios se pueden utilizar en frascos, placas de Petri o tubos. 6