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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA COORDINACION DEL PROCESO DE ADMISION CURSO PROPEDEUTICO 2011. INTRODUCCION AL ESTUDIO DE LA BIOQUIMICA DR. FELIPE DE J. DAVILA ESQUIVEL FEBRERO DEL 2011. 1 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA INTRODUCCIÓN A LA BIOQUÍMICA 1. Bioquímica: concepto y ramas. 2. Introducción a la Bioquímica estructural. Bioelementos y Biomoléculas 3. Aparición de la vida en la Tierra: la lógica molecular 1. Bioquímica: concepto y ramas. En un sentido amplio podemos decir que la Bioquímica es la ciencia que estudia la Química de los seres vivos. El objetivo último de la Bioquímica es determinar como interactúan entre sí los conjuntos de moléculas inertes que constituyen los organismos vivos a fin de mantener y perpetuar el estado vital de estos. La Bioquímica aparece como ciencia independiente desde aproximadamente los años 40 del siglo XX, cuando los químicos orgánicos observaron que numerosas reacciones de moléculas orgánicas realizadas en el laboratorio ocurrían también en la materia viva. Entre las ramas fundamentales de la Bioquímica, que son aquellas donde se recogen y estudian los conceptos básicos, podemos citar: la Bioquímica estructural, la Bioquímica metabólica, la Enzimología, la Bioenergética y la Bioquímica de la información genética o Biología molecular. Otras muchas disciplinas derivadas de la Bioquímica, como la Neuroquímica, la Fotobioquímica, la Bioquímica clínica, la Inmunoquímica, la Tecnología enzimática, la Bioquímica de alimentos, la Bioquímica Vegetal, la Bioquímica ambiental, la Ingeniería genética o la Biotecnología, tienen gran importancia en la mayor calidad de vida actual y en las acciones relacionadas con la preocupación por la conservación ambiental. 2. Bioelementos y biomoléculas El primer objetivo en el estudio de la Bioquímica es conocer los elementos químicos y moléculas que forman parte de la materia viva. La rama de la Bioquímica que aglutina el referido conocimiento se denomina Bioquímica estructural. Desde el punto de vista de la Bioquímica estructural podemos afirmar que la vida es consecuencia de las reacciones de los componentes químicos de un ser vivo. Los componentes de los seres vivos pueden clasificarse como bioelementos y biomoléculas. Bioelementos Inorgánicas (agua, gases, cationes, aniones) Biomoléculas Orgánicas Aminoácidos.........Proteínas Monosacáridos.....Polisacáridos Nucleótidos..........Ácidos nucleicos Ac. Grasos............Lípidos La composición química de los seres vivos es muy diferente de la del entorno físico en el que viven, aunque es precisamente la interacción con el medio físico la que condiciona la forma de vida e influye decisivamente en la evolución de las distintas especies que pueblan el planeta. 2 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Es curioso reseñar que sólo se conoce necesidad biológica de 27 de los 90 elementos químicos que aparecen en la naturaleza (Figura 1). Además, la distribución de estos elementos químicos en los organismos vivos no está en la misma proporción que en la corteza terrestre. Los cuatro elementos más abundantes de la corteza terrestre son el oxígeno, el silicio, el aluminio y el hierro. En contraste, los cuatro elementos más abundantes en los seres vivos son el oxígeno, el carbono, el hidrógeno y el nitrógeno, que constituyen alrededor del 99% de la masa de muchas células. El resto de elementos (Tabla 1) están presentes en cantidades muy pequeñas (trazas). Parece obvio que los compuestos de los cuatro elementos citados poseen propiedades únicas que permiten el fenómeno de la vida. Figura 1. Tabla periódica de los elementos químicos. Tan sólo 27 de los 90 elementos de la naturaleza aparecen en la materia viva. El carbono, el oxígeno, el hidrógeno y el nitrógeno poseen una propiedad común: son los elementos más ligeros capaces de formar con facilidad enlaces covalentes mediante la compartición de pares de electrones. Así, para completar sus capas electrónicas externas y formar, de este modo, enlaces covalentes estables, el hidrógeno necesita solamente un electrón, dos el oxígeno, tres el nitrógeno y cuatro el carbono. Los cuatro elementos pueden interaccionar unos con otros para formar un gran número de compuestos covalentes diferentes. Además, tres de ellos (C, N y O) pueden formar enlaces sencillos o dobles, capacidad que les dota de una gran versatilidad para la formación de gran número de estructuras químicas. Particularmente significativa es la capacidad del carbono para formar enlaces covalentes C-C muy estables (348 kJ.mol-1 ). Cada carbono puede formar enlaces covalente con otros cuatro carbonos, permitiendo la constitución de esqueletos carbonados lineales o cíclicos de gran estabilidad (Figura 2). Además, el carbono puede establecer enlaces covalentes estables con el oxígeno, hidrógeno, nitrógeno y azufre, lo que permite introducir en las biomoléculas un gran número de “grupos funcionales” (alcohol, cetona, aldehído, carboxilo, amino...), con su particular reactividad química, fundamental para las reacciones responsables del fenómeno de la vida. Así, de los 7 millones de compuestos químicos conocidos en la actualidad, casi el 90% son orgánicos. 3 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Tabla 1. Clasificación de los elementos químicos presentes en la materia viva. Dependiendo de su mayor o menor presencia, desempeñan diferentes funciones en la materia viva. Veamos por qué los demás elementos carecen de estas propiedades. Solamente cinco elementos de la tabla periódica son capaces de establecer tres o más enlaces covalentes cada uno y formar, por tanto, cadenas de átomos unidos por covalencia: B, C, N, P y Si. El boro tiene menos electrones de valencia (tres) que orbitales de valencia (cuatro), por lo que es deficitario en electrones, lo que hace poco estable el enlace B-B y limita severamente los tipos y estabilidades de los compuestos que puede formar. En el nitrógeno la repulsión que se produce entre los pares de electrones no compartidos de los átomos de N enlazados disminuye la energía de enlace N-N (171 kJ.mol-1) en relación con la de un enlace C-C (348 kJ.mol-1), de modo que las cadenas alargadas constituidas por átomos de nitrógeno son poco estables. 4 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 2. Enlaces covalentes del carbono. (a) Geometría tetraédrica de orbitales del carbono. (b) Enlace simple: rotación libre. (c) Enlace doble: más corto y de rotación limitada. Por otra parte, al hallarse C y Si en el mismo grupo de la tabla periódica podría suponérseles un comportamiento químico muy similar. Sin embargo, al ser el radio atómico del Si mucho mayor que el del C, los enlaces Si-Si son más débiles (177 kJ.mol-1) que los enlaces C-C, siendo los enlaces múltiples Si-Si raramente estables. Es pues la propia naturaleza electrónica del carbono la que lo hace digno merecedor del papel que juega en los seres vivos. Estos condicionantes químicos se cumplen independientemente de las coordenadas espacio-temporales dadas. Podemos dudar de la vida en otros planetas, pero hay certeza de la existencia de C, O, N, Fe, Ni, Ba, etc. en el resto del Universo. Luego, si la base química existe, se antoja esencial que algo más posibilita la vida en la Tierra, unas condiciones ambientales de temperatura, radiaciones, atmósfera poco reactiva que permitan la reactividad y estabilidad de las biomoléculas esenciales de la vida. Algunos organismos son capaces de vivir en condiciones extremas, lo que junto al mejor conocimiento de la vida y la historia del Universo ha desatado en las últimas décadas distintas y novedosas hipótesis sobre el origen de la vida y la posibilidad de su existencia en otros puntos del Universo (Figura 3). 5 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 3. Condiciones ambientales para la vida. Algunos organismos viven en condiciones extremas de pH, temperatura, nutrientes, salinidad o radiaciones. 3. Aparición de la vida en la Tierra: la lógica molecular ¿Cómo aparecieron las primeras biomoléculas y como se originaron a partir de estas los primeros seres vivos?. Hace 15.000 o 20.000 millones de años surgió el Universo como un cataclismo de calor y partículas subatómicas ricas en energía. En pocos segundos se formaron los elementos más simples (H, He). Según el Universo se enfriaba y se expandía, la materia condensada por la influencia de la gravedad formó las estrellas (Figura 4). Algunas estrellas crecieron mucho y entonces explotaron como una Supernova, liberando la energía necesaria para fundir los núcleos atómicos más simples y formar otros elementos más complejos. Esto ocurrió durante miles de millones de años. Durante este tiempo se formó la Tierra y todos los elementos químicos que encontramos en ella. Se cree que el sistema solar se formó hace unos 4.500 millones de años. Figura 4. Formación de núcleos pesados. Según el Universo se enfriaba y se expandía, la materia condensada por la influencia de la gravedad formó las estrellas. La atmósfera de la Tierra entonces era muy reducida, probablemente contenía N2, H2O, CO2, CO, CH4, NH3, SO2 y la temperatura era alta. Cuando las temperaturas bajaron apareció el agua sobre la Tierra. Las fuentes de energía del espacio (rayos, radiaciones electromagnéticas) propiciaron que las moléculas de esta atmósfera primitiva reducida reaccionaran en presencia de los metales de la corteza terrestre formando, supuestamente, compuestos orgánicos simples. Estas reacciones tendrían lugar durante miles de millones de años. 6 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Esto fue postulado en 1920 por Alexander Oparin y en 1953 Stanley Miler y Harold Urey lo demostraron diseñando un aparto para simular las reacciones que habrían tenido lugar en la atmósfera primitiva, sometiendo una mezcla a reflujo de H2O, CH4, NH3 e H2 a descargas eléctricas durante una semana. La mezcla resultante contenía pequeñas cantidades de una serie de compuestos orgánicos solubles en agua (aminoácidos, ácidos orgánicos, urea). Estos compuestos orgánicos simples formarían otros más complejos como los nucleótidos, que serían la base para la vida. Los restos fósiles más antiguos que se conocen son microorganismos similares a las cianobacterias datados en, aproximadamente, 3.500 millones de años (Figura 5). Aunque en algún momento debió producirse la evolución desde las entidades químicas a las entidades biológicas más simples, la pregunta que la Ciencia aún no ha sido capaz de responder es cómo se auto-organizaron las biomoléculas para configurar las entidades más simples de vida, con capacidad de autoreplicación: los microorganismos unicelulares. Figura 5. Cronología de la vida en la Tierra. En millones de años y hasta la actualidad, cronología de los hitos más relevantes en el proceso de aparición y evolución de la vida en la Tierra. Los primeros microorganismos debieron ser bacterias termófilas muy simples. Consistirían en una membrana encerrando una serie de moléculas poliméricas, que tendría al menos un metabolismo simple y un mecanismo hereditario. El metabolismo de los primeros microorganismos sería anaerobio, pues no había O2. Como tanto los fototrofos como los litotrofos requieren complejos sistemas de membrana, los primeros microorganismos serían organotrofos, que obtienen energía de sustancias orgánicas por fermentación (Figura 6). Cuando los nutrientes orgánicos empezaran a agotarse surgirían otros tipos de metabolismo más complejos, fotosíntesis anoxigénica con donadores de electrones distintos del H2O, por ejemplo el H2S (bacterias púrpuras del azufre). El siguiente paso fue la aparición de dos fotosistemas con el H2O como donador de electrones con la consecuente aparición del O2 y de la vida aerobia. Después, la formación del O3 que protege la Tierra de la radiación UV haría de ella un lugar habitable. 7 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 6. Clasificación de los organismos. Clasificación en función de la fuente de energía y de carbono utilizada para sostener el crecimiento y reproducción. Paralelamente por mecanismos de mutación irían apareciendo ciertas innovaciones evolutivas, desarrollo de la pared celular para evitar lisis, aparición de los citocromos y la creación de las cadenas electrónicas de transporte. Primitivamente el ARN tenía la información genética y la función catalítica. Progresivamente la actividad catalítica pasó a las proteínas y la información genética paso al ADN, que es más estable y solo se usa para su transcripción a ARN, que luego se traduce a proteínas. Los sistemas antiguos siguieron evolucionando, hasta la aparición de los eucariotas y posteriormente de los organismos pluricelulares. Actualmente todos los sistemas vivos (a excepción de los virus) mantienen el sistema de información genética ADN-ARN-proteína aunque conviven distintos sistemas metabólicos de obtención de energía. Y todos están incluidos en algunos de los dos grupos celulares (procariotas, eucariotas). • • Organismos eucariotas (griego eu, bueno, y kayro, núcleo) Organismos procariotas (griego pro, antes) Los primeros poseen un núcleo encerrado en una membrana que encapsula su DNA, y los segundos carecen de este orgánulo. Los procariotas, que comprenden los distintos tipos de bacterias y cianobacterias, poseen estructuras relativamente simples y son unicelulares invariablemente. Los eucariotas, que pueden ser unicelulares o multicelulares, son mucho más complejos. 8 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Los virus no se consideran en ninguna de las dos clasificaciones, de hecho algunos autores no los consideran seres vivos al carecer de sistema reproductor propio, catalogándolos como células huésped. Procariotas Son los más numerosos y extendidos sobre la tierra (Figura 7). Presentan metabolismos muy variados y altamente adaptables a diferentes hábitats. A diferencia de los eucariotas, pueden vivir en condiciones extremas, incluso a veces es una condición necesaria para su pervivencia, tales como altas temperaturas o falta de oxígeno. Tienen un tamaño menor de 10µm. Pueden ser esféricas (cocos), cilíndricas (bacilos), y arrollados helicoidalmente (espirilos). Estructuralmente, tienen membrana celular (plasmática) y una pared celular gruesa. La membrana puede replegarse y formar estructuras con capas múltiples llamadas mesosomas. El citoplasma posee un único cromosoma, una molécula de DNA de la que existen varias copias en la célula, que se encuentra formando un cuerpo conocido como nucleoide, así como numerosas especies de RNA, enzimas y ribosomas, millares de partículas donde tiene lugar la síntesis de proteína. Muchas bacterias poseen filamentos alargados denominados flagelos, que utilizan en la locomoción Figura 7. Célula procariota. Componentes estructurales y localización en la célula. Eucariotas Las células eucarióticas tienen un tamaño variable no superior, generalmente, a 100µm (Figura 8). Poseen un núcleo celular diferenciado, protegido por una membrana nuclear, y en general una estructura y función mucho más compleja que los procariotas. Poseedores de membrana plasmática y, excepto en el caso de las células animales de pared celular, contienen la información genética en moléculas de DNA que forman los cromosomas. Estos están constituidos por cromatina, complejo formado por DNA y proteína. La cantidad de información genética que portan los eucariotas es inmensa: una célula humana contiene 700 veces más DNA que la de E. Coli, unas 200 veces la información contenida en un libro de Bioquímica de 1.300 páginas, unos 700 mega. Hay gran número de eucariotas unicelulares como los protozoos, además de las células de los organismos multicelulares como hongos, plantas y animales. 9 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 8. Distribución de las biomoléculas en una célula eucariota vegetal. Composición molecular predominante de los diferentes elementos estructurales de la célula. Las principales diferencias entre células procariotas y eucariotas se recogen en la Tabla 2. Obviamente los organismos eucarióticos son mucho más complejos que los procarióticos, de hecho, mientras que en E. Coli existen alrededor de 5.000 compuestos distintos (de los que aproximadamente 3.000 son proteínas, 1.000 nucleicos, y el resto otras biomoléculas) en el hombre se podrían considerar mas de 100.000 proteínas distintas. Si se supone que existen 1,5 millones de especies distintas (muchas de las cuales aun se desconocen), puede calcularse entre 1010-1012 proteínas distintas y unos 1010 ácidos nucleicos diferentes (en nuestro Planeta). Paradójicamente, esta gran diversidad (que enriquece nuestro planeta) se reduce, en último término, a una gran simplicidad, pues las macromoléculas de las células no son más que el resultado de la combinación de pocas biomoléculas sencillas llamadas unidades estructurales o precursores. Por ejemplo, el almidón o la celulosa, están formados por cadenas largas de un monosacárido, la glucosa; las proteínas (1010-1012) se reducen a la combinación de 20 tipos distinto de aminoácidos y los ácidos nucleicos a 8 nucleótidos. Como puede observarse, tan solo 28 biomoléculas dan lugar a esa gran diversidad y además están presentes tanto en una bacteria como en nosotros mismos. Analizando la jerarquía de la organización celular se llega a la conclusión final de que los organismos se estructuran, realizan sus funciones y se replican gracias a la compleja interacción de 27 elementos químicos. Un organismo complejo (el hombre), está formado por una serie de órganos (la piel), que a su vez están formados por distintos tejidos (la epidermis), formados por células (una célula basal), formada por orgánulos (la mitocondria), resultado de una agrupación supramolecular (la membrana) la cual está formada por macromoléculas (una proteína), resultado de la interacción de unas unidades estructurales (los aminoácidos), resultado de la interacción química de C, H, N, O y S. 10 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Tabla 2. Comparación de algunas propiedades de las células procariotas y eucariotas. 11 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA UNIDAD 2 HIDRATOS DE CARBONO 1. Definición y clasificación 2. Estructura tridimensional de los monosacáridos 3. Reacciones de ciclación de los monosacáridos 4. Reacciones de oxidación-reducción 5. Reacción de formación de enlaces O-glucosídicos 6. Disacáridos 7. Polisacáridos 8. Funciones fisiológicas de los carbohidratos 1. Definición y clasificación Los carbohidratos o sacáridos (del griego: sakcharón, azúcar) son compuestos esenciales de los organismos vivos y son la clase más abundante de moléculas biológicas. El nombre carbohidratos significa literalmente hidratos de carbono y proviene de su composición química, que para muchos de ellos es (C·H2O)n, donde n ≥3. Es decir, son compuestos en los que n átomos de carbono parecen estar hidratadas con n moléculas de agua. En realidad se trata de polihidroxialdehidos y polihidrohicetonas (y algunos derivados de éstos), cadenas de carbono que contienen un grupo aldehído o cetónico y varios grupos hidroxilos (Figura 1). Figura 1. Estructura química básica de los carbohidratos. Polihidroxi-aldehído (gliceraldehido, izquierda) y polihidroxicetona (dihidroxi-acetona, derecha). Las unidades básicas de los carbohidratos son los monosacáridos, no hidrolizables en unidades más pequeñas. La glucosa es el monosacárido más abundante; tiene 6 átomos de carbono y es el combustible principal para la mayoría de los organismos. Los oligosacáridos contienen de dos a diez unidades de monosacáridos unidas covalentemente. Por su parte, los polisacáridos están constituidos por gran número de unidades de monosacáridos unidos covalentemente, alcanzando pesos moleculares de hasta 106 dalton (g/mol). Los polisacáridos desempeñan dos funciones biológicas principales: algunos almacenan energía metabólica y otros sirven de elementos estructurales a la célula. 12 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Los monosacáridos se forman en la naturaleza por reducción del carbono atmosférico gracias a la "fijación" del CO2 que realizan los organismos fotosintéticos. El ciclo del carbono se completa con la oxidación de los carbohidratos hasta CO2 realizada por el metabolismo oxidativo de plantas y animales (Figura 2). Figura 2. Ciclo del carbono en la naturaleza. Procesos de fijación fotosintética de CO2 y respiración oxidativa para liberar CO2. 2. Monosacáridos Los monosacáridos se clasifican según la naturaleza química de su grupo carbonilo y del número de átomos de carbono que poseen. Atendiendo a la naturaleza química del grupo funcional carbonílico, si éste es aldehído el monosacárido recibe el nombre genérico de aldosa, y si es cetónico el monosacárido se le designa como cetosa. Dependiendo del número de átomos de carbono de la molécula, los monosacáridos se denominan triosas, tetrosas, pentosas, hexosas, etc. cuando contienen tres, cuatro, cinco, seis, etc. átomos de carbono. Se conocen en la naturaleza monosacáridos de hasta 8 átomos de carbono. La combinación de ambas nomenclaturas anteriores permite denominar con el término aldohexosa a un azúcar (-osa) de seis átomos de carbono (-hex), cuyo carbono carbonílico es una aldosa (aldo-). Por ejemplo, la glucosa. El gliceraldehido es la aldosa más simple. Está formado por tres átomos de carbono, el primero contiene el grupo aldehído, el segundo tiene unido un hidrógeno y un grupo hidroxilo, mientras que el tercero posee dos hidrógenos y un hidroxilo. De los tres carbonos, el segundo (C-2) posee los cuatros sustituyentes distintos y por esta característica recibe el nombre de carbono asimétrico o quiral. Este hecho hace que el gliceraldehido exista en dos estructuras espaciales que se diferencian por cierta propiedad física (actividad óptica): una tiene el hidroxilo del C-2 hacia la derecha (D-gliceraldehido) y la otra posee el hidroxilo del C-2 hacia la izquierda (L-gliceradehido). 13 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 3. Estructura espacial de gliceraldehido. Proyecciones de Fischer y en perspectiva de la molécula de gliceraldehido. Las moléculas que aún teniendo la misma composición química tienen diferentes propiedades se denominan isómeros. A isómeros que se diferencian por la disposición espacial de los grupos sustituyentes de un centro quiral se les conoce con el nombre de isómeros ópticos o estereoisómeros. Dichos isómeros ópticos presentan una propiedad física denominada actividad óptica. La actividad óptica es la capacidad que tienen las moléculas quirales, en disolución, de desviar el plano de un haz de luz polarizada. Si lo hacen en el sentido de las manecillas del reloj, se designan con el símbolo (+) y si lo hacen en sentido contrario se designan con (-). Así, el enantiómero D- del gliceraldehido es (+) y el L- es (-). Esto no quiere decir que todos los monosacáridos de la serie D tengan que ser (+). Por un lado está la posición del grupo hidroxilo (OH) respecto a su carbono quiral, que es un aspecto puramente estructural, y por otro el efecto de la estructura de la molécula sobre el haz de luz polarizada, que es producido por la interacción de los rayos de luz polarizada con la red cristalina de la molécula en disolución. Por la configuración de los sustituyentes de los carbonos quirales no es posible asignar a un carbohidrato actividad óptica (+) ó (-). Cuando los isómeros ópticos son imágenes especulares no superponibles se denominan enantiómeros, como es el caso del D y L gliceraldehido (Figura 4). Aquellos isómeros ópticos que se diferencian solo en la configuración de uno de sus carbonos quirales se denominan epímeros. El resto de isómeros ópticos que no son enantiómeros ni epímeros se denominan diastereómeros. Figura 4. Enantiómero del gliceraldehido. Imágenes especulares no superponibles de la molécula de gliceraldehido. 14 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Los monosacáridos se clasifican en la serie D- o en la serie L- de acuerdo con la configuración del carbono quiral más alejado del grupo carbonilo. Así, si dicho carbono posee la misma configuración que el carbono quiral del D-gliceraldehido, pertenece a la serie D-. En la Figura 5 se recogen las aldosas de la serie D-. Como se observa podemos construirlas adicionando unidades de H-C-OH ó de HO-C-H inmediatamente por debajo del carbono carbonílico. Lógicamente existirá otra familia de la serie L- con las imágenes especulares de las aldosas de esta Figura. En total tendremos 2 aldotriosas, 4 aldotetrosas, 8 aldopentosas y 16 aldohexosas. Figura 5. D-Aldosas. Fórmulas de todas las aldosas pertenecientes a la serie D, hasta los monosacáridos de 6 átomos de carbono.. En las cetosas el grupo carbonilo ocupa la posición 2 en la cadena carbonada. La cetosa más pequeña es la dihidroxiacetona: 15 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Lo primero que salta a la vista es que esta cetosa carece de carbono quiral, luego, a diferencia de las aldosas, sólo existe una cetotriosa y carece de actividad óptica. De ella se continúa la familia con la Eritrulosa, la cual sí posee enantiómeros D- y L-, ya que el carbono 3 es quiral (posee 4 sustituyentes distintos). La Figura 6 muestra las cetosas de la serie D-. Existen 1 cetotriosa, 2 cetotetrosas, 4 cetopentosas y 8 cetohexosas. De todas ellas la cetosa más común es la D-fructosa, cuyo nombre se le asignó antes de conocer su estructura; el resto de cetosas se aislaron o sintetizaron a partir de las aldosas y se las denominan basándose en el nombre de su aldosa de origen. Así, la D-fructosa, debería llamarse D-arabinohexulosa, ya que posee el esqueleto base de la D-arabinosa. Figura 6. D-cetosas. Fórmulas de todas las cetosas pertenecientes a la serie D, hasta los monosacáridos de 6 átomos de carbono. 3. Reacciones de ciclación de los monosacáridos La presencia de cinco o de seis carbonos en la cadena proporciona a estos compuestos la posibilidad de formar estructuras de anillo muy estables mediante la formación de un enlace hemiacetal interno, en el caso de las aldosas, o un hemicetal interno si son cetosas.. La formación de la estructura cíclica se produce de la misma manera que los alcoholes reaccionan con los grupos carbonilo de aldehídos o las cetonas. Figura 7. Formación de estructuras cíclicas de los monosacáridos. Se producen por la formación de hemiacetales y hemicetales, reacciones intramoleculares de un hidroxilo con el grupo carbonilo de la propia aldosa o cetosa, respectivamente. 16 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA El grupo hidroxilo de un monosacárido puede reaccionar con su correspondiente grupo carbonilo (aldo- o ceto-) para dar lugar a hemiacetales o hemicetales cíclicos. Este tipo de procesos se puede representar mediante las fórmulas de proyección de Haworth. Las proyecciones derivadas de aldosas de seis carbonos dan lugar a anillos derivados de pirano y las derivadas de cetosas de seis carbonos originan anillos derivados de furano (Figura 8). Figura 8. Formación de estructuras cíclicas de los monosacáridos. Las aldohexosas generan anillos de pirano y las cetohexosas anillos de furano. Así, por ejemplo, la D-Glucosa se cicla por reacción del hidroxilo del carbono 5 (C-5) con el grupo carbonilo del aldehído, dando lugar a un anillo hexagonal de piranosa, por similitud con el anillo de pirano (Figura 9). Figura 9. Ciclación de la glucosa. La glucosa se cicla en un anillo de piranosa. 17 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Un aspecto importante del proceso es que al formarse el correspondiente hemiacetal, el C-1 de la glucosa (que inicialmente era no quiral) se transforma en un carbono quiral (con 4 sustituyentes distintos). Este nuevo carbono quiral recibe el nombre de anomérico (*), y da lugar a dos estructuras denominadas anómeros, uno con el grupo hidroxilo del C-1 por debajo del anillo, anómeroα α, y el otro con el grupo hidroxilo por encima del anillo, anómero ß. Así, por ciclación de la D-glucosa obtenemos los hemiacetales α-D-glucopiranosa y la ß-D-glucopiranosa. CHO CH2OH CH2OH OH O O OH HO OH OH OH CH2OH α-D-glucopiranosa β-D-glucopiranosa D-glucosa De la misma manera la D-fructosa se cicla por reacción del hidroxilo del carbono 5, con el carbonilo que ocupa la posición 2, dando lugar, en este caso, a un anillo de furanosa (por similitud con el anillo de furano), con dos anómeros; uno sería la α-D-fructofuranosa y el otro la ß-D-fructofuranosa. CH2OH O CH2OH O CH2OH O CH2OH O OH OH OH OH CH2OH OH CH2OH Anillo de furano α-D-fructofuranosa D-fructosa ß-D-fructofuranosa. En general, las hexosas y las pentosas pueden adoptar la forma de pirano o furano dependiendo de la naturaleza del azúcar. Es importante indicar que en disolución acuosa existe un equilibrio entre la forma abierta y los anillos ciclados. De tal manera que la D-glucosa se presentaría en equilibrio entre su anómeros α y β. 4. Reacciones de oxidación-reducción La oxidación de los monosacáridos puede producirse de diversas formas, según el agente oxidante utilizado. Así, la oxidación suave de una aldosa con Cu (II) produce los ácidos aldónicos, como en el ejemplo recogido en la Figura 10. 18 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 10. Oxidación y reducción de la glucosa. La glucosa se oxida en condiciones suaves para producir ácido glucónico. Su reducción da lugar al sorbitol (glucitol). La reducción de aldosas en atmósfera de hidrógeno produce alditoles (polialcoholes). Así, la reducción de la glucosa conlleva la reducción del grupo carbonilo de naturaleza aldehídica para rendir un polialcohol conocido como sorbitol. 5. Reacción de formación de enlaces O-glucosídicos Una de las reacciones más importantes de los monosacáridos es la reacción del carbono anomérico (del anillo de piranosa o furanosa) con un alcohol para producir un glucósido. El nuevo enlace que se forma recibe el nombre de enlace glucosídico. Así, la ß-D-glucopiranosa puede reaccionar con el etanol para dar el siguiente glucósido: CH2OH H2O O OH CH2OH O + CH3 CH2OH O CH2CH3 Que recibe el nombre de ß-D-metil-glucopiranósido (se cambia la terminación -osa por -ósido). La importancia de este proceso radica en que el enlace glucosídico se forma también por reacción del hidroxilo del carbono anomérico de un monosacárido con un grupo hidroxilo de otro monosacárido, dando lugar a un disacárido. Los oligosacáridos y los polisacáridos son el resultado de la unión de monosacáridos mediante este tipo de enlace. En general este tipo de compuestos se conocen con el nombre de O-glucósidos (el oxigeno hace de puente en el enlace). Además existen otros glucósidos, de gran importancia en la naturaleza: se trata de los N-glucósidos, en los que el C anomérico reacciona con una amina. Tiene gran importancia en la formación de nucleósidos, entre ellos la adenosina es el más abundante, que forma parte del trifosfato de adenosina (ATP), y de los ácidos ribonucleicos. 19 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA 6. Los Disacáridos Son dímeros formados por dos moléculas de monosacáridos, iguales o diferentes, unidas mediante enlace glucosídico. Este enlace puede realizarse de dos formas distintas; tomemos como ejemplo la glucosa. CH2 OH CH2 OH O CH2 OH O 1* 4 CH2 OH O * O 1* 1* O O Enlace α(1,4) Enlace α(1,1)α i) ii) En el primer caso, i), los dos monosacáridos están unidos mediante enlace O-glucosídico del tipo α(1-4); como se puede apreciar, el disacárido formado presenta un carbono anomérico (*) libre (en el anillo segundo). En el caso ii) la unión se establece a través de los carbonos anoméricos de ambos monosacáridos; en este caso, el enlace glucosídico es del tipo α(1-1), bloqueando los dos carbonos anoméricos (*). La Figura 11 muestra algunos disacáridos abundantes, la sacarosa, la lactosa, la maltosa y la trealosa. Vamos a analizar químicamente la lactosa y la sacarosa. La lactosa es el ß-Dgalactopioranosil-(1-4)-ß-D-glucopiranosido, y la sacarosa es el α-D-glucopiranosil-(1-2)-ß-Dfructofuranosido. La lactosa posee un enlace glucosídico ß-(1-4), mientras que en la sacarosa es del tipo α(1-2)ß. Este aspecto es muy importante si se analizan sus propiedades químicas. Así, la lactosa al poseer un carbono anomérico libre (el C-1 de la glucosa), en disolución, puede abrirse y poner de manifiesto la naturaleza reductora de este disacárido. Por su parte la sacarosa, no posee carbono anomérico libre, los dos están formando parte del enlace glucosídico, ninguno de los anillos puede abrirse y pierde su capacidad reductora. Por esta razón se dice que la lactosa es un azúcar reductor y la sacarosa no. Figura 11. 7. Polisacáridos Disacáridos abundantes en la naturaleza. Estructuras de la lactosa, sacarosa, maltosa y trealosa. 20 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Son polímeros de monosacáridos unidos por enlace O-glucosídico. Entre los polímeros naturales, algunos de los más abundantes y de mayor significativo biológico son el almidón, el glucógeno y la celulosa. Los tres están formados por moléculas de D-glucosa y sólo se diferencian en el tipo de enlace glucosídico, constituyendo estructuras espaciales diferentes. • El almidón Es la principal reserva de hidratos de carbono que sintetizan las plantas y es también la principal fuente de glucosa para la alimentación de los animales. Está formado por una mezcla de dos polisacáridos, la amilosa (en un 20 %) y la amilopectina (en un 80 %). La amilosa es un polímero lineal de D-glucosa con uniones α-(1-4) glucosídicas (Figura 12), que le permite adoptar una disposición tridimensional de tipo helicoidal (Figura 13). Figura 12. Estructura de la amilosa. Polisacárido formado por monómeros de glucosa en enlaces α(1-4). Figura 13. Estructura tridimensional de la amilosa. El enlace α(1-4) produce el curvamiento helicoidal del polímero. Por su parte, la amilopectina está constituida por restos de D-glucosa unidos por enlace α-(1-4), pero presenta también ramificaciones cada 24-30 unidades de glucosa, mediante enlaces α-(1-6) (Figura 13). Figura 14. Estructura tridimensional de la amilopectina El enlace α(1-6) produce ramificaciones responsables de la estructura abierta de la hélice de almidón. 21 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA • El Glucógeno El glucógeno es el polisacárido de reserva de glucosa en los animales y constituye el equivalente al almidón en las células vegetales. Se halla presente en todas las células, aunque preferentemente se acumula en los músculos esqueléticos y especialmente en el hígado (10 % en peso), en cuyas células el glucógeno aparece en forma de grandes gránulos. La estructura principal del glucógeno se parece a la amilopectina, posee una cadena líneal con uniones α-(1-4) y ramificaciones α-(1-6), aunque en este caso aparecen cada 8 ó 12 unidades de glucosa (Figura 15). El glucógeno (al igual que el almidón) se hidroliza con facilidad por la acción de las α-amilasas (proteínas especializadas en la rotura del enlace α-glucosídico). Figura 15. • Estructura La celulosa del glucógeno. El enlace α(1-6) produce ramificaciones cada 8-12 restos de monosacárido. La celulosa, componente estructural primario de las paredes de las células vegetales, es un polímero lineal de glucosa unido por enlaces ß-(1-4) glucosídicos (Figura 16). A diferencia de la amilosa (helicoidal y con uniones α), el enlace ß impide que la molécula se enrolle, de forma que las cadenas de celulosa pueden adoptan una conformación plenamente extendida permitiendo que se empaqueten con facilidad mediante puentes de hidrógeno, lo que explica su resistencia y su insolubilidad en agua. A diferencia de los casos anteriores, los vertebrados no poseen enzimas capaces de hidrolizar el enlace ß-(1-4), sólo los herbívoros poseen microorganismos simbióticos con una enzima (celulasa) que permite hidrolizar los enlaces ß-(1-4) glucosídicos. Figura 16. Estructura lineal de la celulosa y estabilidad por puentes de hidrógeno entre cadenas paralelas. 22 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Otro polisacárido de gran abundancia en la naturaleza es la quitina, que es el principal componente estructural de los esqueletos de los invertebrados. La quitina es un polímero constituido por restos N-acetil-D-glucosamina unidos por enlace ß-(1-4). Se diferencia de la celulosa sólo en el sustituyente del C-2, que posee, en lugar de un -OH, una acetamida. De relevancia son también otros polisacáridos como la heparina, polisacárido heterogéneo natural compuesto por D-iduronato2-sulfato unidos por enlace glucosídico (1-4) a N-sulfo-D-glucosamina-6-sulfato (Figura 17). Se utiliza en medicina por su poder anticoagulante. El ácido hialurónico es otro heteropolímero constituido por dímeros de ácido glucurónico y N-acetilglucosamina (Figura 18). Está presente en los fluidos sinoviales de las articulaciones donde desempeña su función protectora contra golpes, basada en su valor lubrificante y su alta viscosidad. Figura 17. Estructura de la unidad dimérica básica constituyente de la heparina. Figura 18. Estructura de la unidad dimérica básica constituyente del ácido hialurónico. 8. Funciones fisiológicas de los carbohidratos Algunos monosacáridos como la glucosa y sus derivados, son piezas fundamentales de muchas rutas metabólicas esenciales para la obtención de energía. La glucosa actúa en el organismo como combustible energético de uso rápido, mientras polisacáridos o grasas son reservas energéticas que deben ser procesadas antes de su utilización. Algunos monosacáridos y disacáridos como la fructosa o la sacarosa son responsables del sabor dulce de muchos frutos, con lo que se hacen más atractivos a los agentes dispersantes de las semillas. Los oligosacáridos, pequeñas cadenas poliméricas conteniendo entre 2 y 10 monosacáridos, aparecen normalmente formando parte de las glicoproteínas que ejercen importantes funciones reguladoras o de reconocimiento celular. Los polisacáridos como almidón o glucógeno tienen funciones de reserva energética en plantas y animales, respectivamente. Otros polisacáridos tienen funciones estructurales. Ya hemos citado el caso de la celulosa, principal componente de las paredes celulares vegetales, que supone la mayor parte de la masa de la madera y el algodón en casi pura celulosa; y la quitina, principal componente del exoesqueleto de muchos artrópodos. También tienen gran importancia estructural el heteropolímero de residuos alternados de N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico unidos por enlaces 1-4), que constituyen el componente principal de las paredes celulares bacterianas; estos heteropolímeros se unen a proteínas formando peptidoglucanos. 23 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA UNIDAD 3 LÍPIDOS 1. Introducción y clasificación 2. Ácidos grasos 3. Ceras 4. Triacilglicéridos 5. Fosfoglicéridos 6. Esfigolípidos 7. Lípidos insaponificables 1. Definición y clasificación A diferencia de los carbohidratos, que se clasificaban en función de los grupos funcionales que poseían, los lípidos no pueden clasificarse de esta manera porque no poseen un grupo funcional característico. En este sentido, los lípidos son sustancias de origen biológico, solubles en disolventes orgánicos (cloroformo, benceno, etc.), y muy poco o nada solubles en agua. Como consecuencia de ello, el término lípido abarca a un gran número de compuestos orgánicos con estructuras muy diversas; no obstante, poseen algo en común, la porción principal de su estructura es de naturaleza hidrocarbonada y ésta es la razón de su escasa o nula solubilidad en agua. Los lípidos desempeñan diversas funciones biológicas de gran importancia, ya que: • Constituyen las principales reservas energéticas de los seres vivos • Forman parte de las membranas celulares, • Regulan la actividad de las células y los tejidos Así, las grasas, aceites, ciertas vitaminas y hormonas y la mayor parte de los componentes no proteicos de las membranas son lípidos. En este tema, discutiremos las estructuras y propiedades de las clases principales de lípidos. Una forma de clasificar los lípidos es la que se basa en su comportamiento frente a la reacción de hidrólisis en medio alcalino (SAPONIFICACIÓN). Los lípidos saponificables son los que se hidrolizan en medio alcalino produciendo ácidos grasos, que están presentes en su estructura; en este grupo se incluyen las ceras, los triacilglicéridos, los fosfoglicéridos y los esfingolípidos. Los lípidos no saponificables son los que no experimentan esta reacción (terpenos, esteroides y prostaglandinas, en este último grupo también estarían incluidos los ácidos grasos). 24 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA 2. Ácidos grasos Se conocen más de 100 ácidos grasos naturales. Se trata de ácidos carboxílicos, cuyo grupo funcional (-COOH) está unido a una larga cadena hidrocarbonada normalmente no ramificada (Figura 1). Figura 1. Estructura química de un ácido graso saturado. Se diferencian entre sí en la longitud de la cadena y el número y las posiciones de los dobles enlaces que puedan tener. Los que no poseen dobles enlaces se denominan ácidos grasos saturados (“de hidrógeno”) y los que poseen uno o más dobles enlaces se denominan ácidos grasos insaturados. Los ácidos grasos en estado libre se encuentran en muy bajas cantidades, ya que en su mayoría se encuentran formando parte de la estructura de otros lípidos. La Tabla 1 recoge algunos ácidos grasos de interés. La mayoría de los ácidos grasos son compuestos de cadena lineal y numero par de átomos de carbono, comprendido entre 12 y 22. Así, el ácido palmítico (C16H32O2) y el ácido esteárico (C18H34O2), son dos ácidos grasos saturados bastante abundantes, mientras que el ácido oleico (C18H34O2), junto con el linoléico (C18H32O2), son los ácidos grasos insaturados más comunes. Obsérvese que todos los ácidos grasos insaturados naturales presentan isomeria cis. El isómero cis- posee los dos hidrógenos hacia el mismo lado, mientras que en el isómero trans- se encuentran alternados. R1 R2 C H C R1 H C H Isómero Cis C H R2 Isómero Trans La presencia de dobles enlaces con isomería cis-, en los ácidos grasos insaturados, hace que la cadena hidrocarbonada se doble en el espacio lo cuál, a su vez, dificulta su empaquetamiento con otras moléculas próximas y asegura que los lípidos que contienen estos ácidos grasos tengan bajos puntos de fusión y, por consiguiente, sean fluidos a temperaturas fisiológicas, lo que facilita, entre otras cosas, su transporte en nuestro organismo. Tabla 1 Principales ácidos grasos saturados e insaturados. 25 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA La Figura 2 muestra las diferencias existentes entre las estructuras espaciales de dos ácidos grasos, uno saturado y otro insaturado. Saturado Insaturado Figura 2. Estructura tridimensional de dos ácidos grasos. Se observa cómo la presencia de la insaturación de configuración CIS torsiona la estructura espacial de la molécula, a diferencia de la estructura lineal del ácido graso saturado. 3. Ceras Las ceras son lípidos saponificables, formados por la esterificación de un ácido graso y un monoalcohol de cadena larga. O R1 C + R2 OH OH Ácido graso O Reacción de esterificación R1 C O Monoalcohol R2 Cera Los alcoholes constituyentes de las ceras también tienen un número par de átomos de carbono, que oscila entre 16 y 34 (Figura 3). Dos de las ceras más comunes son la de carnauba, de origen vegetal, que se utiliza como cera para suelos y automóviles; y la lanolina (en la que el componente alcohólico es un esteroide) que se utiliza en la fabricación de cosméticos y cremas. Las ceras son blandas y moldeables en caliente, pero duras en frío. En las plantas se encuentran en la superficie de los tallos y de las hojas protegiéndolas de la pérdida de humedad y de los ataques de los insectos. En los animales también actúan como cubiertas protectoras y se encuentran en la superficie de las plumas, del pelo y de la piel. Figura 3. Ejemplo de cera. Esterificación del ácido palmítico (16 átomos de carbono) con un monoalcohol de cadena larga (30 átomos de carbono). 26 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA 4. Triacilglicéridos Aunque tradicionalmente se ha empleado el nombre de triglicéridos, las normas actuales de formulación recomiendan que este término deje de utilizarse y se cambie por el indicado. El nombre de Triacilglicéridos (TAGs) describe adecuadamente la estructura de estos compuestos, pues poseen el esqueleto del glicerol unido a (esterificado con) tres ácidos grasos (grupos acilos). Se trata, pues, de triésteres formados por tres moléculas de ácidos grasos y una molécula de glicerol (Figura 4). El punto de fusión de los TAGs viene determinado por la naturaleza de los ácidos grasos que lo forman. Los TAGs que son sólidos a temperatura ambiente reciben el nombre de grasas (poseen mayor número de grupos acilos saturados), mientras que los que son líquidos a esta temperatura reciben el nombre de aceites (poseen mayor número de acilos insaturados). La presencia mayor o menor presencia de ácidos grasos saturados es responsable de un empaquetamiento más compacto o más débil, dando lugar a grasas o aceites, respectivamente (Figura 5). Figura 4. Ejemplo de triacilglicérido. Esterificación de tres ácidos grasos con los tres hidroxilos de las moléculas de glicerol. Figura 5. Empaquetamiento de los ácidos grasos. Empaquetamiento compacto (saturados) y débil (insaturados). 27 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA No obstante las grasas y aceites naturales no son puros, sino una mezcla de TAGs. Entre las grasas y aceites más comunes destaca, como TAG más puro, el aceite de oliva (84 % de ácido oléico). La Figura 6 compara de forma sencilla la diferente composición en ácidos grasos de algunas grasas y aceites naturales. Figura 6. Composición de ácidos grasos en sustancias naturales. Porcentaje de ácidos grasos saturados e insaturados en aceite de oliva, mantequilla y carne de vacuno. Las grasas constituyen una forma eficiente de almacenamiento de energía metabólica. Esto se debe a que las grasas están menos oxidadas (más hidrogenadas) que los glúcidos (glucógeno) de ahí que su rendimiento de energía en la oxidación sea significativamente mayor. Las grasas proporcionan alrededor de seis veces más energía metabólica que un peso igual de glucógeno. El contenido en grasa de las personas normales (21 % en hombres, 26 % en mujeres) les permite sobrevivir en ayuno de dos a tres meses; por el contrario, el suministro corporal de glucógeno, puede cubrir las necesidades metabólicas durante menos de un día (ojo con las dietas, posibilidad de nivel cero de glucosa). Además la apolaridad de las grasas facilita mucho su almacenamiento en forma anhidra (cosa que no ocurre con el glucógeno, que se moviliza más fácilmente). En los animales, los adipocitos son células especializadas en la síntesis y almacenamiento de TAGs, concentrándose en el tejido adiposo (Figura 7). Figura 7. Micrografía de tejido adiposo. Acumulación de grasa en los adipocitos. 28 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Los TAGs experimentan las mismas reacciones que los ésteres. Una de las reacciones más importantes es su hidrólisis, que puede ser alcalina (bajo el punto de vista industrial) o enzimática (por lipasas, en el organismo). La hidrólisis alcalina o saponificación, es el proceso base para la fabricación de los jabones (Figura 8), mientras que la hidrólisis enzimática se produce en la degradación de las grasas ingeridas como alimentos. Figura 8. Reacción de saponificación. Figura 9. Micela y emulsión. Los jabones se obtienen calentando grasas naturales con una disolución alcalina (de carbonato sódico o hidróxido sódico). Tras la hidrólisis, el jabón (sales sódicas de ácidos grasos) se separa del resto mediante precipitación al añadir sal a la mezcla de reacción, tras lo cuál se lava y purifica. El jabón así obtenido es el de tipo industrial. Estos, al igual que otros lípidos polares, forman micelas (Figura 9) en contacto con el agua. Esta propiedad explica su capacidad limpiadora, pues actúan disgregando la mancha de grasa o aceite formando pequeñas micelas en las que las partes hidrofóbicas (apolares) rodean la grasa y las partes hidrofílicas (polares, debido al grupo carboxilato) quedan expuestas hacia el agua. De esta manera, se forma una emulsión (gotas cargadas negativamente) que son arrastradas por el agua en forma de diminutas partículas. Otra reacción importante de los TAG es la hidrogenación catalítica de los grupos acilo insaturados existentes en los aceites vegetales. Mediante este proceso los TAGs con grupos acilos insaturados se transforman en TAGs saturados. Esta reacción se vienen realizando en la industria desde hace muchos años para la producción de margarinas de uso culinario, a partir de aceites vegetales abundantes y baratos (como el de soja y el de maíz). 29 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA R1 R2 C H2, Pt C H H Doble enlace insaturado R1 CH2 CH2 R2 Doble enlace saturado 5. Fosfoglicéridos Los fosfoglicéridos (FFGs) son componentes esenciales de las membranas biológicas. Se trata también de ésteres del glicerol, pero sólo poseen dos grupos acilo unidos a los átomos de oxígeno de los carbonos 1 y 2 del glicerol, mientras que el tercer hidroxilo está esterificado con el ácido fosfórico, el cuál a su vez se encuentra unido a un resto X de distinta naturaleza, resto que da nombre al FFG (Figura 10). Figura 10. Estructura de fosfoglicéridos. Esterificación de dos ácidos grasos y una molécula de ácido fosfórico con los tres hidroxilos de las moléculas de glicerol. Los diferentes FFGs difieren en el tamaño, forma y carga eléctrica de los grupos (X) de la cabeza polar. A su vez, cada tipo de FFG puede existir en muchas especies químicas distintas que se diferencian en sus grupos acilos (parte apolar). Habitualmente hay un grupo acilo saturado y otro insaturado. Los FFG más abundantes en las membranas de las células de animales y de plantas superiores son la fosfatidil-etanolamina y la fosfatidil-colina, mientras que el fosfatidil-glicerol y el difosfatidil-glicerol son más frecuentes en membranas bacterianas (Figura 10). Como se puede apreciar en la fosfatidilcolina ó la cardiolipina, los FFGs poseen una cabeza polar (grupo X) y una cola apolar (cadena hidrocarbonada); este tipo de compuestos reciben el nombre de anfipáticos (también lo son los ácidos grasos). Esta característica estructural posee una gran importancia, pues gracias a ello los FFGs pueden agruparse al interaccionar las partes apolares, dando lugar a estructuras más complejas como las membranas biológicas celulares (Figura 11). 30 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 11. Pared celular y liposoma. Estructura en bicapa lipídica que da lugar a formaciones biológicas o artificiales (liposomas). 6. Esfingolípidos Los esfingolípidos (EFLs), son lípidos complejos cuyo esqueleto está constituido por la esfingosina o la dihidroesfingosina, en lugar de glicerol. Son también componentes importantes de las membranas celulares, debido a su naturaleza anfipática. Bajo el punto de vista estructural, todos los EFLs contienen tres componentes básicos: un grupo acilo (procedente de un ácido graso), una molécula de esfingosina (o su derivado hidrogenado) y una cabeza polar (Figura 12). La zona polar puede estar formada por un grupo fosfato unido a un resto X (de similar naturaleza que el presente en los fosfoglicéridos), dando lugar a los fosfoesfingolípidos, ó a una molécula de azúcar, dando lugar a los glicoesfingolípidos. Figura 12. Estructura de los esfingolípidos. Esterificación de la molécula de esfingosina con un ácido graso y un grupo polar responsable del carácter anfipático de la molécula. Principales esfingolípidos. 31 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Los FELs se encuentran presentes en cantidades importantes en el tejido nervioso y cerebral. En ellos, un grupo hidroxilo del fosfórico está esterificado con colina o etanolamina y se conocen con el nombre general de esfingomielinas, el FEL más abundante en las vainas membranosas que envuelven y aíslan eléctricamente los axones de las neuronas (Figura 13). En los glicoesfingolípidos, la cabeza polar la forma un carbohidrato. Así, los denominados galactocerebrósidos son los más abundantes en las membranas de las células neuronales del cerebro y tienen un grupo de cabeza polar que es la ß-D-galactosa. Figura 13. Estructura de la esfingomielina. 7. Lípidos insaponificables • Terpenos Los terpenos, son lípidos insaponificables, formados por dos o más unidades de isopreno (2-metil1,3-butadieno). Los terpenos pueden ser moléculas lineales o cíclicas, y algunos de ellos contienen estructuras de ambos tipos. Las sucesivas unidades de isopreno se hallan enlazadas por lo común mediante enlaces cabeza-cola, aunque también existen enlaces tipo cola-cola. Los terpenos que contienen dos unidades de isopreno, se llaman monoterpenos; los que contienen tres unidades, sesquiterpenos y los que contienen cuatro, seis, y ocho unidades reciben el nombre de diterpenos, triperpenos y tetraterpenos. En los vegetales se han identificado un gran número de terpenos, muchos de los cuales poseen olores o sabores característicos, y son componentes principales de los aceites esenciales obtenidos de las plantas (limoneno, geraniol, mentol o alcanfor). Por su parte el fitol (diterpeno) es un componente esencial de la clorofila, molécula esencial en la fotosíntesis y, por tanto, situada en la base química de la vida (Figura 14). 32 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 14. Estructuras de fitol y clorofilas a y b. Entre los terpenos superiores más importantes figuran el escualeno (triterpeno, encontrado en grandes cantidades en los escualos), precursor del colesterol (que es un esteroide) y el ß-caroteno, que junto a otros carotenos es el responsable del color amarillo-anaranjado asociado a determinadas membranas celulares (zanahoria, tomate, etc) y también actúa como precursor de la Vitamina A o retinol (Figura 15). Figura 15. Estructuras de β-caroteno, vitamina A (retinol) y cis-retinal. El β-caroteno es precursor de la vitamina A. La vitamina A y el retinal están implicados en el ciclo químico responsable de la visión. El retinal se produce por oxidación de la vitamina A 33 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA • Esteroides Los esteroides son otro tipo de lípidos no saponificables, que poseen un núcleo común formado por cuatro anillos condensados, tres de los cuales poseen seis átomos de carbono y el cuarto únicamente cinco. El nombre de dicha estructura común es ciclopentanoperhidrofenantreno. Aunque los distintos tipos de esteroides se diferencian en la naturaleza y la posición de los sustituyentes. La mayoría de los esteroides se generan (en los seres vivos) a partir de la ciclación del escualeno (un triterpeno lineal); así, el primer esteroide formado en este proceso es el lanosterol que posteriormente se transforma en otros muchos esteroides de interés. Uno de ellos es el colesterol (Figura 16). Figura 16. Estructura del colesterol. El colesterol es el esteroide mejor conocido y más abundante en el cuerpo humano. Forma parte de las membranas biológicas y es precursor de ácidos biliares, de las hormonas esteroides y de la Vitamina D. Es también muy abundante en lipoproteínas del plasma sanguíneo, entre ellas la LDL, en las que alrededor del 70 % se encuentra esterificado con ácidos grasos de cadena larga (Figura 17). Por desgracia, es también conocido por su nivel en la sangre y ciertos tipos de enfermedades cardiacas, como la arterosclerosis. Esta enfermedad se debe a un exceso de LDL (provocado por varias causas) que se deposita en la superficie interna de las arterias, disminuyendo así su diámetro, produciendo un aumento de la presión sanguínea y, por tanto, un mayor riesgo a sufrir la formación de ateromas, causantes en último término de los problemas cardiovasculares que determinan los infartos de miocardio. Como se ha indicado antes, el colesterol es también el precursor de otros muchos esteroides, algunos de los cuales se muestran en la Figura 18. La vitamina D, cuya ausencia produce el raquitismo (enfermedad en el crecimiento de los huesos), se sintetiza a partir de un derivado del colesterol (7-dehidrocolesterol) mediante una reacción que requiere irradiación de la piel por la luz solar. Los ácidos biliares son compuestos, sintetizados a partir del colesterol, que a modo de detergente ayudan a la emulsión de los lípidos y a su absorción intestinal. 34 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Por su parte, los andrógenos son hormonas sexuales masculinas y los estrógenos hormonas sexuales femeninas, también derivados del colesterol. Figura 17. Estructura de una lipoproteína. Contiene moléculas de colesterol libres y esterificadas con ácidos grasos. Figura 18. Algunos esteroides derivados del colesterol. 35 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA • Prostaglandinas Las prostaglandinas son lípidos insaponificables que poseen una gran variedad de actividades biológicas de naturaleza hormonal y reguladora, así median en: · La respuesta antiinflamatoria · La producción de dolor y fiebre · La regulación de la presión sanguínea · La inducción de la coagulación de la sangre · La inducción al parto · La regulación del ciclo sueño/vigilia La prostaglandinas, se encuentran en cantidades muy pequeñas en tejidos y fluidos corporales, entre ellos los fluidos menstruales y seminales. Todas las prostaglandinas son derivados hipotéticos de la ciclación de ácidos grasos insaturados de 20 carbonos. Las prostaglandinas E2 y E2a pueden utilizarse terapéuticamente para provocar el aborto o bien para acelerar el parto. También se investiga sobre ellas para la obtención de derivados estables, para su utilización como anticonceptivos. 36 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA UNIDAD 4 AMINOÁCIDOS, PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS 1. Estructura y clasificación de los aminoácidos. 2. Propiedades ácido-base de los aminoácidos y péptidos 3. El enlace peptídico 4. Péptidos: hidrólisis y secuenciación 5. Clasificación y función biológica de las proteínas 6. Niveles estructurales de las proteínas 1. Estructura y clasificación de los aminoácidos. Como su nombre indica los aminoácidos son compuestos que poseen un grupo amino (-NH2) y un grupo ácido (carboxílico -COOH) en su estructura. Los aminoácidos son los precursores de los péptidos y las proteínas, y en ellos el grupo amino y el grupo carboxilo, se encuentran unidos al mismo átomo de carbono, conocido como carbono-α α (α α-aminoácidos). La estructura general de los α-aminoácidos (a excepción de la prolina, que es cíclica) se muestra en la Figura 1. Figura 1. Estructura química de un aminoácido. Estructura química en el plano y estructura espacial. Enantiómeros del aminoácido alanina. Como se puede apreciar, el carbono-α α (a excepción de la glicina) es un carbono quiral y como tal presenta dos enantiómeros (L- y D-). Los 20 α-aminoácidos presentes en las proteínas son de la serie L- y en su representación de Fischer poseen el grupo amino hacia la izquierda. La diferencia entre los aminoácidos viene dada por el resto -R, o cadena lateral, unida al carbono-α. Atendiendo a la naturaleza del grupo -R los aas pueden clasificarse en: · Neutros o apolares · · · Polares sin carga Polares con carga negativa Polares con carga positiva La Figura 2 recoge las estructuras de los 20 L-α-aminoácidos a pH fisiológico. 37 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Neutros o Apolares. Son 8 los aminoácidos que se clasifican como poseedores de cadenas laterales no polares. La alanina, valina, leucina e isoleucina, poseen cadenas laterales de hidrocarburos alifáticos. La metionina posee una cadena lateral de éter tiólico (C-S-C). La prolina es el único aminoácido cíclico, pues el grupo -R se cierra sobre el N del grupo α-amino (realmente es un amina secundaria). Por su parte, la fenilalanina y el triptófano contienen grupos aromáticos. Polares sin carga. Siete son los α-aminoácidos cuyo resto -R es polar pero sin carga. La glicina posee la cadena más simple, un átomo de hidrógeno. La serina y la treonina son portadores de un grupo hidroxilo (-OH). La asparragina y la glutamina, poseen cadenas laterales portadoras de un grupo amida, y por hidrólisis dan lugar, respectivamente, a aspartato y glutamato, dos aminoácidos con carga negativa. La tirosina posee un grupo fenólico y la cisteína debe su polaridad a la presencia de un grupo tiólico (-SH). Polares con carga negativa. Existen dos α-aminoácidos cuyo resto polar posee carga negativa a pH fisiológico, debida a la presencia de un grupo carboxilo (-COOH) , el ácido glutámico y el ácido aspártico. Polares con carga positiva. Tres son los α-aminoácidos que poseen restos -R cargados positivamente a pH fisiológico. La lisina posee una cadena lateral de butilamonio, la arginina presenta un grupo -R de guanidina y la histidina es portadora de un grupo -R de imidazolio. 38 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 2. Estructura química de los L-aminoácidos. Esta clasificación se ha realizado en base al grupo -R, pero es importante indicar que a pH fisiológico (pH 7,3), el grupo α-amino se encuentra cargado positivamente y el grupo α-carboxilo lo está negativamente, por esta razón en la Figura 2 estos grupos aparecen siempre cargados. Dentro del conjunto de los aminoácidos naturales, existen unos que pueden ser sintetizados por las células humanas a partir de otras sustancias, pero también hay aminoácidos que debemos tomarlos en la dieta, ya que nuestras células no pueden sintetizarlos o, cuando menos, no en cantidad suficiente para satisfacer la demanda del organismo; se conocen con el nombre de aminoácidos esenciales y son valina, leucina, isoleucina, treonina, metionina, fenilalanina, triptófano y lisina. 2. Propiedades ácido-base de los aminoácidos y los péptidos El pH del medio en el que se encuentre el aminoácido es esencial para determinar sus propiedades ácido-base, aspecto importante pues de ello dependen las propiedades químicas y la funcionalidad biológica de los péptidos y proteínas que forman. Las propiedades ácido-base de un aminoácido vienen determinadas por los grupos protonables que posea. Un aminoácido puede actuar bien como ácido o como base (sustancias anfóteras), pudiendo tener hasta tres grupos con carácter ácido-base: el α-amino, el α-carboxilo y, en algunos casos, el resto -R. Lo importante es que estos grupos poseen un carácter ácido-base débil, lo que hace que, dependiendo del pH, el correspondiente equilibrio pueda desplazarse en un sentido o en otro (hacia la forma protonada o hacia la desprotonada, Figura 3). Figura 3: Ionización de un L-aminoácido. 39 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA En función del pH, la proporción de forma protonada (carga 0) o forma desprotonada (carga -1) variará, respetando siempre la constante de ionización del grupo en cuestión si la temperatura se mantiene constante. 3. El enlace peptídico Los aminoácidos se encuentran unidos en los péptidos y las proteínas mediante un enlace amida (-CO-NH-): Este enlace se forma por reacción entre el grupo α-COOH de un aminoácido y el α-amino del siguiente (con pérdida de una molécula de agua) y recibe el nombre de enlace peptídico. Figura 4. Estructura espacial del enlace peptídico. (a) Ilustración del carácter parcialmente doble del enlace peptídico. (b) Configuración del plano que conforman el enlace peptídico y los carbonos α extremos. 40 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Entre los años 1930-1940, Pauling y Corey, mediante el estudio de Rayos X de cristales de aminoácidos, dipéptidos y tripétidos, dilucidaron la estructura tridimensional del enlace peptídico (Figura 4). Así, descubrieron que la unión C-N del enlace peptídico era más corta que en la mayor parte de los demás enlaces C-N y llegaron a la conclusión de que el enlace debía tener algún carácter de doble enlace, por la aparición de dos formas resonantes: Luego dedujeron que los 4 átomos que rodeaban al enlace peptídico C-N (O, Cα, Cα, H) estaban situados en el mismo plano, de tal manera que el oxígeno del grupo carbonilo y el hidrógeno del N-H estarían en posición trans. Esta ordenación es rígida, y es el resultado de la estabilización por resonancia de las formas anteriormente citadas. Partiendo de estos dos hechos, puede describirse el armazón de una cadena polipeptídica como constituido por una serie de planos, con posibilidad de giro en los Cα. De esta forma podemos escribir la estructura de un péptido como una sucesión de planos en la que los grupos -R se van alternando (Figura 5). Figura 5. Estructura espacial de un péptido. Secuencia ordenada de los planos de enlace peptídico en el espacio. Los grupos R se alternan por encima y debajo del plano general de la molécula. 4. Secuenciación de un péptido La secuencia de un péptido tiene gran importancia porque entre otras cosas condiciona los siguientes niveles estructurales. La insulina bovina fue la primera proteína que se secuenció completamente por Sanger en 1953, lo que le valió el premio Nobel. La determinación de la secuencia de la insulina fue el resultado del trabajo de muchos científicos durante 10 años, desde entonces se han secuenciado miles de proteínas. 41 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA La secuencia de un péptido, si conocemos el gen del que proviene, puede secuenciarse indirectamente, secuenciando dicho gen. Pero también puede hacerse la secuenciación química directa. La secuenciación. Entre los distintos métodos existentes, podemos citar la degradación de Edman, cuyo fundamento hemos visto en la determinación del extremo N-terminal. La aplicación continuada de varios ciclos de la degradación de Edman me permite la secuenciación de todo el péptido, siempre que este no tenga más de 20 o 30 aminoácidos. No obstante los actúales requerimientos de secuenciación de gran cantidad de péptidos en poco tiempo, han dado origen al desarrollo de nuevos métodos de secuenciación de péptidos, desarrollados principalmente para afrontar proyectos como el del proteoma humano. Entre estos métodos podemos citar el MALDI MS y el ESI MS, ambos basados en la espectrometría de masas. 5. Clasificación y función biológica de las proteínas Las proteínas son cadenas polipéptidicas que se diferencian de los oligopéptidos en el número de aminoácidos que contienen, en su carácter funcional y sobre todo en que son el resultado del proceso de traducción genética. La conformación de una proteína hace referencia a la disposición espacial de la misma, aspecto de vital importancia, pues va a estar directamente relacionado con la función que desempeñan. Según la conformación las proteínas pueden clasificarse en fibrosas y globulares. Las fibrosas poseen las cadenas polipeptídicas ordenadas de modo paralelo a lo largo de un eje. Forman materiales físicamente resistentes e insolubles en agua, siendo elementos básicamente estructurales como por ejemplo la α-queratina del pelo, la fibroina de la seda o el colágeno de los tendones. Por su parte, las proteínas globulares, están constituidas por una o varias cadenas polipeptídicas plegadas de modo que puedan adoptar una conformación esférica o globular, desempeñando diferentes funciones de tipo metabólico (proteínas transportadoras, enzimas, anticuerpos,...). Algunas proteínas incluso pueden situarse entre estas dos conformaciones como sería el caso de la miosina de los músculos o el fibrinógeno de la sangre. 6. Niveles estructurales de las proteínas La conformación que presenta una proteína va a depender directamente de los distintos niveles estructurales (hasta cuatro, esquema en Figura 7) que posee, niveles que a continuación se detallan. Figura 7. Esquema de los cuatro niveles de estructura de las proteínas. 42 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA a) Estructura primaria: hace referencia a la posición que ocupa cada aminoácido en la cadena polipeptídica, es decir nos da idea de la secuencia de la proteína. La importancia de este nivel radica en que la posición que ocupa cada aminoácido dentro de la cadena va a condicionar enormemente el resto de los niveles estructurales y en último término la función que desempeña la proteína. b) Estructura secundaria: hace referencia a la ordenación regular y periódica de la cadena polipeptídica en una dirección determinada. Básicamente, podemos encontrar dos tipos de estructura secundaria, la hélice-α α y la conformación-ß. • En la Hélice-α α (Fig.8) la cadena polipeptídica adopta una conformación helicoidal. Las estructuras helicoidales se caracterizan por el numero de aminoácidos por vuelta (n) (3,6 restos en la Hélice-) y por su paso de rosca (p), o distancia entre vueltas (5,4 Å para la Hélice). Esta conformación se estabiliza por puentes de hidrógeno (R-C=O ····· H-N-R) intracatenarios (dentro de la hélice). Además, los restos -R de los aminoácidos se disponen hacia fuera de la hélice evitando las interacciones estéricas (por grupos voluminosos) y estabilizando la conformación. Por otro lado, la hélice- se distorsiona o pierde la conformación cuando en la secuencia aparece una prolina, único aminoácido ciclado por su grupo -amino. Figura 8. Esquema de la hélice-α α • En la conformación-ß (Fig.9) la cadena adopta una ordenación lineal en la que los restos -R, de los aminoácidos, se van alternando por encima y por debajo (zig-zag) del plano del enlace peptídico. Esta conformación se estabiliza con puentes de hidrógeno entre varias cadenas de proteínas con conformación-ß. El resultado de estas interacciones es la hoja plegada ß, que puede presentar un plegamiento paralelo, (en el que las cadenas vecinas se desarrollan en la misma dirección), o bien un plegamiento antiparalelo con cadenas vecinas en direcciones opuestas. Figura 9. Esquema de la hoja plegada-β. β. En conformación antiparalela (a) y paralela (b) 43 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Aunque las dos conformaciones (hélice- y hoja plegada- son posibles dentro de una misma proteína (como veremos en la estructura terciaria), existen también proteínas que presentan sólo una de las dos. La α-queratina es una proteína que aparece Fig.10 en todos los vertebrados superiores y es el α-queratina del pelo componente principal del pelo, la lana, las uñas o los cuernos. El pelo está construido por células muertas, cada una de las cuales contiene macrofibrillas empaquetadas que se orientan paralelamente a la fibra del pelo. Éstas están formadas por microfifrillas, que es una asociación de protofibrillas que continúen dos cadenas de hélice- que se retuercen en un arrollamiento hacia la izquierda. Las αqueratinas poseen un alto contenido de Cys (R= -CH2-SH) de tal manera que las interacciones entre las hebras se producen a través de puentes disulfuro (-S-S-) dando una gran resistencia e insolubilidad al conjunto. Aunque la insolubilidad de las  queratinas impide que la mayor parte de los animales la puedan digerir, la polilla, posee una concentración elevada de mercaptanos, que rompen los puentes disulfuro, en su tracto digestivo, y por lo tanto pueden digerir la lana. Por su parte, la fibroína (Fig.11) de la seda es una agrupación de ß-queratinas en conformación hoja plegada-ß antiparalela unidas por enlaces de hidrógeno intracatenarios. La fibroina y otras ß-queratinas son muy ricas en aminoácidos poco voluminosos (gly y ala), lo que facilita que las hojas se apilen unas sobre otras, de tal modo que se alternan zonas de contacto entre glicinas y zonas de contacto entre alaninas, interaccionando mediante fuerzas débiles de van der Waals. Este hecho hace posible que la seda pueda extenderse en fibras fácilmente separables (separando hojas) pero relativamente difíciles de romper (implicaría romper los enlaces peptídicos). Figura 11. Hoja plegada-β β de la fibroina de la seda. 44 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Por otro lado, existe la posibilidad de transformar la α-queratina en ß-queratina. Así, cuando el pelo o la lana se someten a la acción del vapor (calor + humedad) pueden incluso duplicar su longitud. Lo que ocurre es que se rompen los puentes de hidrógeno de la hélice-α y las cadenas polipeptídicas adoptan una conformación-ß; no obstante los grupos -R de las α-queratinas son muy voluminosos, lo que hace que la conformación-ß se desestabilice y al poco tiempo adopte de nuevo la conformación en α-hélice con lo que el pelo o la lana recuperan su longitud original. c) Estructura terciaria: hace referencia al modo en que se curvan o pliegan en el espacio los segmentos de hélice-α y/o conformación-ß, que presenta una cadena polipeptídica de los proteínas globulares. La conformación espacial de las proteínas depende lógicamente de su estructura primaria, así las cadenas laterales de los aminoácidos en las proteínas globulares se hallan distribuidas espacialmente de acuerdo con sus polaridades, de tal forma que: • Los restos no polares aparecen, casi siempre, en el interior de la proteína, para no entrar en contacto con el disolvente acuoso que la envuelve, creando un ambiente hidrofóbico. • Los residuos polares con carga se hallan situados, normalmente en la zona externa, interaccionando con el medio acuoso. A veces, se requiere de estos centros en la parte interna de la proteína y en estos casos también ocurre que están directamente implicados en alguna funcionalidad de la proteína, bien a nivel estructural o bien a nivel catalítico. • Los grupos polares sin carga, aparecen distribuidos por la totalidad de la cadena, si bien mayoritariamente, también aparecen en las partes externas, en contacto con la disolución acuosa. Como consecuencia de esta distribución de restos, las proteínas globulares son muy compactas, hay poco espacio en el interior, de modo que el agua difícilmente accede a dicho espacio. Algunas proteínas, como le ocurre a la mioglobina (Fig.12) están constituidas solo por hélicesα. La estructura terciaria de la mioglobina, se trata de una proteína globular que contiene una sola cadena polipeptídica, constituida por ocho segmentos de hélice-α . La mioglobina se halla, principalmente, en las células de los músculos esqueléticos y es especialmente abundante en los mamíferos buceadores, en los que no sólo actúa almacenando oxígeno, sino también contribuyendo al aumento de la velocidad de difusión del oxígeno. La proteína, además, contiene un componente no proteico, el grupo hemo que permite la oxigenación y desoxigenación de forma reversible. Fig.12. Estructura de la Mioglobina, donde se aprecia el grupo hemo (en rojo) y los 8 segmentos en hélice-α α Mioglobina 45 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Otras proteínas globulares, como la concanavalina A (Fig.13a) (lecitina de soja) mayoritariamente está formada por regiones extensas de hoja plegada-ß. Por otro lado, también nos podemos encontrar con proteínas que poseen cantidades significativas de ambos tipos de estructura secundaria, como puede ser la anhidrasa carbónica (Fig.13 b). a b Fig.13. Estructura de la concanavalina A (a) y la anhidrasa carbónica (b) d) Estructura cuaternaria: Muchas proteínas globulares son oligoméricas, es decir están formadas por más de una subunidad polipeptídica. La posición espacial que ocupa cada una de estas subunidades respecto a las otras queda determinada por la estructura cuaternaria. La estructura cuaternaria de la hemoglobina (Hb) estaría formada por cuatro subunidades (iguales dos a dos) cada una con su grupo hemo, necesario para el transporte de oxígeno. Fig.14 Estructura cuaternaria de la hemoglobina 46 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA En la figura 7 se mostraban los cuatro niveles estructurales presentes en la hemoglobina. Así, se puede apreciar como la estructura primaria condiciona el resto de niveles estructurales de la Hb. De hecho, existen varias mutaciones de las moléculas de Hb, en las que la secuencia de aminoácidos difiere un poco de la secuencia de la Hb normal (conocida como HbA). La mayoría de estas mutaciones son inofensivas, pero algunas causan graves enfermedades, como es el caso de la Hb de las células falciformes (HbS). Fig.15a Glóbulos rojos con HbA La diferencia entre la HbA y la HbS (Fig.15a y 15b) radica sólo en que en la secuencia una molécula de ac. Glutámico (polar con carga) es sustituida por una Val (apolar). Este pequeño cambio (1 de los 146 aas de las cadenas- ß) tiene un profundo efecto sobre el resto de niveles estructurales, pues la apolaridad de la Val (situada en un extremo exterior) interacciona de modo hidrofóbico con partes apolares de las subunidades a de otras HbS. Esto hace que las moléculas se agreguen y precipiten en las células. Como consecuencia, los glóbulos rojos (normalmente con forma de disco) adoptan una forma de media luna, obstruyendo los capilares más delgados, restringiendo el flujo sanguíneo y provocando entre otras complicaciones dolores severos y sudoración. Fig.15b Glóbulos rojos con HbS 47 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA UNIDAD 5 ENZIMAS 1. Introducción 2. Las enzimas como catalizadores 3. Nomenclatura y clasificación de enzimas 4. Cofactores enzimáticos 5. Modelos de actuación de las enzimas 6. Cinética enzimática 7. Inhibición enzimática 8. Reacciones multisustrato 9. Regulación enzimática 1. Introducción La vida depende de la existencia de unos catalizadores muy potentes y altamente específicos denominados enzimas. De hecho, todos los pasos de todos los procesos metabólicos están catalizados por enzimas y la capacidad catalítica se considera, junto con la capacidad de autorreplicación, una de las características fundamentales de la vida. Con la excepción de un pequeño grupo de moléculas de RNA catalítico (los ribozimas), todas las enzimas conocidas son proteínas. El nombre de enzima ("en la levadura") no se empleó hasta 1877, pero mucho antes ya se sospechaba que ciertos catalizadores biológicos intervenían en muchos procesos. Así en 1850, Louis Pasteur concluyó que la fermentación de azúcar en alcohol por levaduras estaba catalizada por lo que llamó “fermentos”, que él consideraba inseparable de las células de levadura vivas. En 1897, Büchner, consiguió extraer las enzimas que catalizaban la fermentación alcohólica de las células de levadura, terminando así con la teoría vitalista. No obstante hubo que esperar hasta 1926, cuando Sumner consiguió purificar y cristalizar por primera vez una enzima, la ureasa, para demostrar su naturaleza proteica. En la actualidad se conocen más de 2000 enzimas diferentes, muchas de las cuales se han aislado en forma pura. Se utilizan potentes técnicas de purificación y secuenciación, técnicas de difracción de rayos X, RMN, etc., para conocer su estructura, y técnicas de mutagénesis dirigida para conocer más sobre su funcionalidad y sus mecanismos de actuación. 2. Las enzimas como catalizadores La función principal de las enzimas es actuar como catalizadores de las reacciones de los seres vivos; como tales catalizadores tienen ciertas características que vamos a estudiar a continuación. Todas las reacciones químicas tienen lugar porque cierta fracción de la población de moléculas reactantes poseen la suficiente energía como para alcanzar un estado activado, llamado estado de transición, en el que es muy elevada la probabilidad de que se rompan o se establezcan enlaces para formar los productos. Este estado de transición reside en la cima de la barrera energética que separa los reactantes de los productos, como muestra la Figura 1. En ella se observa el diagrama de energía para una reacción química, no catalizada y catalizada, donde la energía libre de activación es la cantidad de energía necesaria para llevar todas las moléculas de un mol de sustancia, a una temperatura determinada, al estado de transición. 48 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA . Figura 1. Evolución energética de una reacción química. Se observa la diferencia energética entre los estados de transición de las reacciones catalizada y no catalizada. Existen dos métodos generales mediante los cuales puede acelerarse la velocidad de una reacción química. Uno de ellos es la elevación de la temperatura (ya que provoca un incremento en la velocidad de las moléculas); el otro consiste en utilizar un catalizador. El catalizador se combina con los reactantes de modo transitorio activándolos, produciendo un estado de transición de menor energía que en la reacción no catalizada. Una vez formados los productos el catalizador queda libre, y puede ser de nuevo utilizado. La Tabla 1 muestra una comparación de las energías de activación para la descomposición del peróxido de hidrógeno, en ausencia o presencia de un catalizador. En ella se puede apreciar cómo el catalizador enzimático baja aún más la barrera energética que ha de superarse desde el nivel de reactivos para alcanzar el estado de transición. Esta es una característica común de las enzimas. Su alto poder catalítico se debe en parte a su alta especificidad por los sustratos, la cuál puede ser absoluta para un único sustrato o relativa, cuando permite la reacción de compuestos diferentes pero con una estructura similar. Tabla 1 Descomposición enzimática del agua oxigenada. Comparación de las energías de activación para la descomposición del peróxido de hidrógeno, en ausencia o presencia de un catalizador Reacción Catalizador Descomposición de H2O2 Ninguno 20 18 Fe2+ 22 10 Catalasa 22 1,7 Temperatura (ºC) Energía (Kcal/mol) 49 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA La especificidad de las enzimas es muy importante para los seres vivos. Cada célula contiene varios cientos de miles de compuestos diferentes, y existen muchas combinaciones posibles entre las reacciones químicas que estos compuestos pueden experimentar. Las enzimas cuidan de que tengan lugar, de manera específica, aquellas reacciones que son esenciales e indispensables para que la célula viva. Además de la especificidad y la alta eficiencia, otras dos características que diferencian a las enzimas de los catalizadores químicos, son que las enzimas pueden saturarse por sustrato y tienen capacidad para regular su actividad. 3. Nomenclatura y clasificación de las enzimas Muchas enzimas han sido designadas añadiendo el sufijo -asa al nombre del sustrato, es decir, la molécula sobre la cuál ejerce su actividad catalítica. Por ejemplo la ureasa cataliza la hidrólisis de la urea, y la arginasa cataliza la hidrólisis de la arginina (a urea y ornitina). Otras enzimas han recibido su nombre en función del tipo de reacción que catalizan; así la Gliceraldehído-3Pdeshidrogenasa cataliza la oxidación del la Gliceraldehído-3P. Incluso algunas se conocen de hace mucho tiempo y mantienen su nombre, sin dar información alguna del sustrato o la reacción que catalizan (tripsina). No obstante existe una clasificación sistemática de las enzimas que las divide en 6 grandes grupos, cada uno de los cuales se divide a su vez en subclases: 1: Oxido-reductasas (reacciones de oxido-reducción) 2: Transferasas (transfieren grupos funcionales) 3: Hidrolasas (reacciones de hidrólisis), 4: Liasas (reacciones de adición a los dobles enlaces) 5: Isomerasas (reacciones de isomerización) 6: Ligasas (formación de enlaces con consumo de ATP). A cada enzima se le asigna un número con cuatro componentes. Los tres primeros indican la clase, subclase y sub-subclase, respectivamente, y el último es un número de orden. Así, por ejemplo, la enzima alcohol deshidrogenasa, que cataliza la oxidación de etanol a acetaldehído, y por lo tanto pertenece al grupo 1, se designa como EC 1.1.1.1. La Tabla 2 muestra la clasificación internacional de las enzimas en los seis grupos antes citados. Tabla 2 Clasificación internacional de enzimas. 50 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA 4. Cofactores enzimáticos La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como proteína, mientras que otras necesitan, además, uno o más componentes no proteicos, llamados cofactores. El cofactor puede ser un ion metálico o bien una molécula orgánica, llamada coenzima, aunque algunos enzimas necesitan de ambos. El cofactor puede estar fuertemente unido a la proteína (suele ser el ión metálico, aunque puede igualmente ser un coenzima) y recibe entonces el nombre de grupo prostético, o débilmente unido, por lo que en realidad actúa como un sustrato específico de la enzima (co-sustrato; suele ser una molécula orgánica, coenzima). La Tabla 3 muestra una relación de iones metálicos que actúan como cofactores de enzimas. Tabla 3 Iones metálicos como cofactores. La Tabla 4 muestra algunos de las coenzimas más habituales en la catálisis enzimática. Tabla 4 Algunos coenzimas mayoritarios en catálisis 51 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA El complejo enzima-cofactor catalíticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la proteína restante, que por sí misma es inactiva catalíticamente, se designa con el nombre de apoenzima. Holoenzima = Apoenzima + Cofactor Centro activo Apoenzima Holoenzima Cofactor En las enzimas el cofactor puede actuar como centro catalítico primario, grupo puente para reunir el sustrato y la enzima ó agente estabilizante de la actividad enzimática (conformación). Por su parte cada uno de los coenzimas catalogados suele contener en su estructura, alguna vitamina (sustancias orgánicas que, en cantidades mínimas, son vitales para el funcionamiento de todas las células, y deben figurar en la dieta de algunas especies) o molécula derivada de ella. Las coenzimas actúan por lo general como transportadores intermedios de átomos específicos o de electrones. 5. Modelos de actuación de las enzimas Para explicar la actividad catalítica de las enzimas, se ha propuesto un mecanismo general, en dos etapas: S + E ES P + E En la primera etapa, la enzima (E) se une a la molécula de sustrato (S), para formar el complejo enzima-sustrato (ES). En una segunda etapa, el complejo se fragmenta dando lugar al producto (P) y a la enzima (E), que vuelve a estar disponible para reaccionar con otra molécula de sustrato. Por lo general, la molécula de enzima es mucho mayor que la del sustrato por lo que sólo una pequeña parte de la enzima está implicada en la formación del complejo; esta región que interacciona con el sustrato y en la que tiene lugar la reacción, se denomina sitio activo de la enzima. El sitio activo es una región tridimensional de la enzima con una distribución de los grupos única para posibilitar la unión a su sustrato específico. Dichos grupos del enzima no tienen por qué ser necesariamente consecutivos en la secuencia de la proteína y reciben el nombre de centros catalíticos. El modelo más conocido sobre el mecanismo de reacción de las enzimas es el de Fischer, quien propuso que la molécula de sustrato se adapta al centro activo de la enzima del mismo modo que lo haría una llave al encajar en una cerradura, es decir, que tienen una relación estructural complementaria (Figura 2). No obstante, esta hipótesis tiene ciertas limitaciones: si el centro activo posee una estructura prediseñada para el sustrato, en caso de que sea reversible 52 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA el proceso dicho debería estar perfectamente diseñado para que también encaje el producto de la reacción. De la misma forma, la teoría de la llave-cerradura tampoco explica bien el fenómeno de la inhibición enzimática. Figura 2. Modelos de acción enzimática. Modelo llave-cerradura de Fischer. Otra hipótesis más aceptada actualmente es la del enzima flexible o de ajuste inducido (modelo de Koshland), que sugiere que el sitio activo no necesita ser una cavidad geométricamente rígida y preexistente, sino que dicho sitio activo debe tener una disposición espacial, precisa y específica, de ciertos grupos de la enzima que en presencia del sustrato se adaptan a su estructura cuando interaccionan con él (Figura 3). Figura 3. Modelos de acción enzimática. Modelo de ajuste inducido de Koshland. Independientemente del modelo, una vez formado el complejo enzima sustrato, mediante un mecanismo de distorsión, se activan los enlaces que hay que romper y se aproximan los grupos que hay que enlazar, favoreciendo la formación del producto resultante de la reacción catalizada y quedando la enzima libre para comenzar de nuevo el proceso catalítico. La Figura 4 muestra el caso de una enzima (carboxipeptidasa) que nos sirve para ilustrar el modelo de Koshland, en ella se puede ver como en el sitio activo, en el que se encuentran los centros catalíticos (Arg-145, Glu-270, tyr-248) y el cofactor (Zn), posee una conformación inicial que se modifica al interaccionar con el sustrato y formal el complejo [ES]. 53 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 4. Modelo de ajuste inducido de Koshland. Carboxipeptidasa. 6. Cinética enzimática. Los principios generales de la cinética de las reacciones químicas son aplicables a las reacciones catalizadas por las enzimas, en los seres vivos. No obstante, estas muestran (además del fenómeno de la especificidad, antes comentado) un rasgo característico que no se observa en los catalizadores no enzimáticos, se trata de la saturación por el sustrato, entendida en términos de ocupación de los centros activos de todas las moléculas de enzima. Existen sustancias que pueden impedir que la enzima desarrolle su actividad catalítica, ralentizando o paralizando la reacción enzimática. A estas sustancias se las denomina inhibidores enzimáticos. Teniendo en cuenta que las reacciones químicas en la célula están catalizadas por enzimas, es fácil intuir el papel de muchos inhibidores enzimáticos que actúan como fármacos, antibióticos o conservantes; otros pueden ser tóxicos, potentes venenos. Por ejemplo, la aspirina (acetilsalicilato) inhibe la enzima que cataliza el primer paso en la síntesis de prostaglandinas, implicadas en la producción del dolor. Se conocen dos tipos principales de inhibición: la reversible y a la irreversible. La primera implica una unión “no covalente” del inhibidor y, por lo tanto, siempre puede revertirse. En la inhibición irreversible, el inhibidor se une al enzima de forma “covalente” y permanente. Inhibición reversible: los distintos modelos de inhibición reversible implican todos, la unión no covalente del inhibidor con la enzima, pero difieren en los mecanismos por medio de los cuales reducen la actividad enzimática y en la forma en que afectan a la cinética de la reacción. Entre ellos están la inhibición competitiva, la acompetitiva y la no competitiva. En la inhibición irreversible, el inhibidor se une covalentemente a la enzima y la inactiva de manera irreversible. Casi todos los inhibidores irreversibles son sustancias tóxicas naturales o sintéticas. Se trata de sustancias que reaccionan con algún grupo funcional importante para la catálisis, bloqueándolo e impidiendo que la enzima desarrolle su actividad. En muchos casos la interacción se produce a través del sitio activo, impidiendo de manera irreversible que el sustrato ocupe su lugar; tal es el caso del gas Sarín, que inhibe irreversiblemente enzimas implicadas en la transmisión del impulso nervioso y su inhalación causa parálisis rápida de las funciones vitales. 54 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA 8. Reacciones multisustrato En este capítulo hemos estudiado reacciones del tipo S-P, un mecanismo relativamente simple con un solo sustrato que podría ajustarse a reacciones catalizadas por algunas enzimas (isomerasas, hidrolasas, algunas liasas) pero es importante tener en cuenta que la gran mayoría de las reacciones son multisustrato y suelen dar varios productos. Cuando una enzima une dos o más sustratos y libera múltiples productos, el orden de los pasos para a ser una característica importante del mecanismo de reacción. Hay distintos mecanismos que explican este tipo de reacciones, veamos varios casos en los que se utilicen dos sustratos S1 y S2 y se obtengan dos productos P1 y P2. a) Unión ordenada de los sustratos: en este caso un sustrato debe unirse antes de que el segundo sustrato pueda unirse. b) Unión aleatoria de los sustratos: en este caso cualquiera de los dos sustratos puede ser el primero en unirse a la enzima. c) Mecanismo “ping-pong”: en este caso primero se une un sustrato, se libera el primer producto, y a continuación se une el segundo sustrato para así liberar el segundo producto. 9. Regulación enzimática Una característica que diferencia las enzimas de los catalizadores químicos convencionales es su capacidad para regular su propia actividad. Una enzima puede ser más o menos activa gracias a la existencia de distintos niveles de regulación: • Nivel de síntesis: que haya más o menos moléculas de la enzima (ya lo veremos). • Nivel de actividad: que las moléculas de enzima existentes estén más o menos activas. Puede llevarse a cabo por factores extrínsecos a la enzima, pH, Tª, [S], [I], o por factores intrínsecos a la propia enzima; en este caso hablamos de enzimas reguladoras, enzimas que por su propia naturaleza tienen mecanismos especiales de regulación. Están especializadas en regularse respondiendo de forma muy sensible a señales externas. En la célula las enzimas operan en grupo, en rutas constituidas por varios pasos enzimáticos. En cada ruta hay al menos una enzima reguladora que determina la velocidad de toda la ruta. La modulación de las enzimas reguladoras ocurre mediante diferentes mecanismos: • Enzimas alostéricas. Funcionan mediante la unión reversible no covalente de compuestos regulatorios llamados moduladores. El modulador puede ser una activador (modulación positiva) o un inhibidor (modulador negativo) y ser el propio sustrato de la reacción (alosterismo homotrópico) o ser otra sustancia (alsoterismos heterotrópico). Normalmente se trata de enzimas multiméricas y normalmente el sito activo y el regulatorio se encuentran en distintas subunidades. • Enzimas interconvertibles Por modificación covalente reversible, como por ejemplo por fosforilación/defosforilación o modificación redox. • • Mediante proteínas reguladoras que se unen a la enzima. Mediante la eliminación proteolítica de pequeños segmentos peptídicos (esto es irreversible). 55 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA UNIDAD 6 ÁCIDOS NUCLEICOS 1. Composición de los ácidos nucleicos 2. Estructura de los nucleósidos y nucleótidos 3. Estructura del ADN y de los ARNs 1. Composición de los ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos son polinucleótidos, es decir, polímeros resultantes de la unión mediante enlace fosfodiéster de un número variable de unidades monoméricas básicas, denominadas nucleótidos. Un nucleótido está formado por tres componentes. Una pentosa, un compuesto heterocíclico nitrogenado (base nitrogenada) que junto con la pentosa forma un nucleósido, y una molécula de ácido fosfórico. Los nucleótidos tienen papeles muy variados dentro del metabolismo celular. Son la moneda energética en el metabolismo (ej: ATP), son mensajeros químicos secundarios en la respuesta celular a los estímulos inducidos por hormonas o agentes externos (ej.: AMPc), constituyen una serie de importantes cofactores enzimáticos y, por supuesto, son los constituyentes de los ácidos nucleicos: ribonucleicos (ARN) y desoxiribonucleicos (ADN). Pentosas La ribosa o -D-ribofuranosa es la pentosa característica de los ARN (ácidos ribonucleicos) y la desoxirribosa o 2`-desoxi--D-ribofuranosa la de los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) (Figura 1). HOCH 2 O Figura 1. Pentosas componentes de los ácidos nucleicos. OH ribose OH OH HOCH 2 O OH OH (no O) deoxyribose Bases nitrogenadas púricas y pirimidínicas En la Figura 2 se representan las estructuras y los nombres de los compuestos nitrogenados aislados en la hidrólisis de los ácidos nucleicos. Tres de ellos derivan de la pirimidina y son la citosina, uracilo y timina, y los otros dos derivan de la purina y son la adenina y la guanina. Cuando estos compuestos se disuelven en agua originan una disolución de carácter básico, por lo que se conocen con el nombre de bases nitrogenadas. Fig.2 Estructura de las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos. Bases púricas y pirimidínicas 56 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Los átomos de los anillos de estas cinco bases se numeran de la misma manera que los anillos de pirimidina y purina. Esta numeración es importante y se hará referencia a ella más adelante. Tanto el ADN como el ARN contienen adenina, guanina y citosina, si bien el uracilo sólo está presente en el ARN, mientras que la timina lo está únicamente en el ADN. Es importante destacar el carácter aromático de las bases nitrogenadas, que hace que los ácidos nucleicos absorban en el UV a unos 260 nm. Son estructuras casi planas y tienen la peculiaridad de que pueden presentar diferentes formas tautómeras. Por ejemplo, la citosina puede estar en forma lactámica (normal) y entonces se empareja con la guanina, pero puede también adoptar forma lactímica y entonces es más estable su unión a la adenina, lo que facilita las mutaciones espontáneas y por tanto la evolución. Además de estas cinco bases mayoritarias los ácidos nucleicos pueden contener pequeñas proporciones de otras bases, normalmente derivados metilados o hidroximetilados de las bases principales. 2. Estructura de los nucleósidos y nucleótidos Nucleósidos Los nucleósidos son los compuestos resultantes de la unión de las pentosas y de una base nitrogenada. Estos compuestos se unen con pérdida de una molécula de agua, a través del átomo de carbono 1' del azúcar y el átomo de nitrógeno 1 de la base pirimidínica o el átomo de nitrógeno 9 de la base púrica, como se indica en la Figura 3. Obsérvese que el enlace Nglucosídico es siempre ß. H 2N H2N N N HOCH2 OH Figura 3. Estructura nucleósidos. O de dos N OH Adenosina N N N HOCH2 OH N O N H Desoxiadenosina Los nombres de los nucleósidos indican su estructura. Así, si el nucleósido está formado por una ribosa y una base púrica, se nombra cambiando la terminación -ina de la base por -osina (por ejemplo, de la guanina y la ribosa obtenemos la guanosina), mientras que si se trata de una base pirimidínica la terminación cambia a -idina (de timina y ribosa obtenemos el nucleósido timidina). Por su parte, si el nucleósido se forma con desoxirribosa, delante del nombre obtenido habrá que colocar el prefijo desoxi- (de adenina y desoxirribosa se obtiene el nucleósido desoxiadenosina). La Tabla 1 recoge el nombre de todas las combinaciones posibles (si bien la timidina y la desoxiuridina no existen en los ácidos nucleicos naturales). 57 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Tabla 1: Nomenclatura de los nucleósidos. Bases púricas Nucleósido Desoxinucleósido Adenina Adenosina Desoxiadenosina Guanina Guanosina Desoxiguanosina C Citosina Citidina Desoxicitidina U Uracilo Uridina (Desoxiuridina) T Timina (Timidina) Desoxitimidina A G Bases pirimidinicas Nucleótidos Los nucleótidos son ésteres fosfóricos de los nucleósidos. Todos los nucleótidos naturales poseen el grupo fosfato unido al átomo de carbono 5' de la pentosa. En la Figura 4 se indica cómo se une el ácido fosfórico con dos nucleósidos diferentes para formar los correspondientes nucleótidos, en una reacción que también implica pérdida de una molécula de agua. NH2 N O - O P O CH 2 - O N O OH Figura 4. Estructura nucleótido. O de un deoxyctyidine monophosphate (dCMP) Los nucleótidos se denominan combinando el nombre del nucleósido del que proceden con la palabra monofosfato. Así, el éster fosfórico de adenosina se denomina 5'-monofosfato de adenosina (Tabla 2). 58 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Tabla 2.: Nomenclatura de los nucleótidos monofosfato. Bases púricas A G Adenina Nucleótido Desoxinucleósido Monofosfato de adenosina Monofosfato de desoxiadenosina Guanina Monofosfato de guanosina Monofosfato de desoxiguanosina Bases pirimidinicas C Citosina Monofosfato de citidina U Uracilo Monofosfato de uridina T Timina Monofosfato de desoxicitidina Monofosfato de desoxitimidina Por otro lado, los ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos corrientes aparecen en las células no solamente en forma monofosfato, sino que también pueden aparecer en forma de 5'-difosfatos (con dos moléculas de fosfórico) o bien 5'-trifosfatos (con tres moléculas). Así los derivados de la adenosina, serían: AMP: 5'-monofosfato de adenosina ADP : 5'-difosfato de adenosina ATP : 5'-trifosfato de adenosina. Los nucleótidos trifosfato (NTPs) desempeñan diversas funciones en las células. Así, el ATP, es un transportador de fosfato y de pirofosfato en numerosas reacciones enzimáticas en las que se requiere aporte energético (aunque también pueden realizar esta función el GTP, el UTP y el CTP). Por otro lado, algunos NTPs, pueden actuar como transportadores de restos de azúcares (energetizados) en la biosíntesis de polisacáridos. Por supuesto, la función principal de los NTPs, es la de actuar como precursores en la biosíntesis enzimática de los ácidos nucleicos. 3. Estructura del ADN y de los ARNs El ácido desoxirribonucleico (ADN) está constituido por cadenas de desoxirribonucleótidos y el ácido ribonucleico (ARN) por cadenas de ribonucleótidos (ambas monofosfato). Las uniones entre nucleótidos se realizan mediante enlaces fosfodiéster (Figura 5). NH 2 N O P O CH 2 O- N N O N NH 2 N O O P OH O CH 2 O- N N O N NH 2 N O O OH O CH 2 O- Figura 5. Enlace fosfodiéster nucleótidos. P entre O O N N N OH 59 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Entre el ADN y el ARN, existen tres diferencias claras: • El azúcar integrante del ARN es la ribosa • El ARN contiene uracilo en lugar de timina • El ARN está formado por una única cadena Además, existen tres tipos diferentes de ARN, cada uno de los cuales desempeña una función diferente, el mensajero (ARNm), el transferente (ARNr) y el ribosómico (ARNr). Podemos distinguir varios niveles estructurales en los ácidos nucleicos. La estructura primaria o secuencia indica el orden en que se encuentran los nucleótidos. La ordenación regular y estable que adopten los nucleótidos puede denominarse estructura secundaria, la más conocida es la estructura de la doble hélice del ADN, descubierta por Watson and Crick en 1953. Estructura primaria. Secuenciación de ácidos nucleicos Una vez definido si el ácido nucleico es un ADN o un ARN, la secuencia de nucleótidos o estructura primaria solo varía según las bases. Por eso un ácido nucleico puede representarse por la secuencia de bases, cada base representa al nucleótido que la porta. Figura 6. Secuenciación de ácidos nucleicos. Método de Sanger. 60 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Secuenciación automática. El proyecto genoma humano que acaba de ser completado (Febrero 2001) por la empresa Celera es el más ambicioso de los proyectos de secuenciación que ha secuenciado 35000 genes y unos 3000 millones de pares de bases con esta tecnología. Estructura secundaria de los ácidos nucleicos Los diagramas de rayos X realizados a principios de los 50 por Rosalind Franklin y Wilkins, indican que las moléculas de ADN son largas cadenas helicoidales con dos periodicidades a lo largo de su eje. Su análisis químico pone de manifiesto diversos aspectos. La composición en bases nitrogenadas es la misma para todas las células de una especie. En los ADN, la proporción molar de adenina es siempre igual a la de timina, y análogamente la proporción molar de citosina es equimolar con la de guanina. Por lo tanto el número total de bases púricas es igual al de bases pirimidínicas (Regla de Chargaff). Basándose en estos datos, J. Watson y F. Crick propusieron un modelo estructural para el ADN. La principal característica de este modelo es que una molécula de ADN consta de dos cadenas helicoidales de polinucleótidos, que a su vez se hallan enrolladas alrededor de un mismo eje, formando una doble hélice dextrógira de cadenas antiparalelas, como muestra la Figura 7. Las unidades de desoxirribosa y los grupos fosfato, que forman el esqueleto de las cadenas polinucleotídicas, constituyen la parte externa de su estructura, mientras que las bases (parte hidrófoba) se sitúan de forma perpendicular al esqueleto carbonado y se encuentran situadas en su interior. Figura 7. Estructura del DNA. Doble hélice y disposición espacial de los componentes moleculares del DNA. Las dos cadenas, que forman la doble hélice, están unidas entre sí por puentes de hidrógeno, entre bases específicas de cada cadena. Así, la guanina de una cadena está siempre unida a la citosina de la otra (a través de tres puentes de hidrógeno), y la adenina a la de timina (por dos puentes de hidrógeno), como se muestra en la Figura 8. Esto explicaría el que moléculas de ADN con mayor % G+C son más difíciles de separar en hebras. Debido a la gran longitud de la molécula de ADN, existen numerosos enlaces por puente de hidrógeno entre las dos cadenas, y 61 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA aunque este enlace es débil, hacen que en conjunto el ADN sea una molécula muy estable. La disposición de parte hidrófoba hacia el interior y los fosfatos y ribosas hidrófilos hacia el exterior también contribuye a estabilizar la estructura. Las dos cadenas son antiparalelas. Una en el sentido 5`→ 3`y la otra en el sentido 3`→ 5`. Figura 8. Enlaces entre las bases del ADN. Puentes de hidrógeno T-A y G-C. Las medidas de la doble hélice son muy concretas y pueden estudiarse por difracción de rayos X. La distancia entre las cadenas es constante e igual a 1.9 nm. Hay 10.5 nucleótidos por vuelta y el paso de rosca son 3.4 nm. Se aprecia un surco mayor y uno menor. Este modelo explica bien los procesos de replicación y transcripción, y se ha comprobado experimentalmente su validez, la estructura de Watson and Crick del DNA se conoce también con el nombre de B-DNA y es la estructura más estable, pero también se han caracterizado otras variantes. Algunas secuencias del ADN adoptan ciertas estructuras inusuales como los palíndromes o regiones o simetría rotacional. Figura 9. Modelos del ADN. Diferentes conformaciones espaciales. 62 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Por su parte, las moléculas de ARN son monocatenarias y con un nivel de estructura inferior al ADN. Químicamente se caracterizan por una menor estabilidad que el ADN debido al hidroxilo reactivo del C-2´ , capaz de esterificar un hidroxilo de la molécula próxima de fosfato y producir la ruptura de la cadena. La menor estabilidad se justifica en base a la función del ARN, que es una copia de la información contenida en las moléculas de ADN, de menor tamaño y mayor movilidad y tiene vida limitada dependiendo del requerimiento de su presencia. Las estructuras más definidas corresponden a los ARN transferentes y los ARN ribosómicos. Los ARNt pueden representarse esquemáticamente en forma de hoja de trébol (Figura 10). Comenzando por el extremo 5´, los ARNt comparten las siguientes características: • Un grupo fosfato 5´ terminal. • Un brazo de 7 pares de bases que incluye el nucleótido 5´ terminal y que contiene emparejamientos de bases que no son del tipo Watson-Crick, como G-U. Esta estructura se conoce como brazo aceptor o brazo del aminoácido. • Una horquilla de 3 ó 4 bases apareadas que acaba en un lazo de cadena sencilla que contiene frecuentemente la base modificada dihidrouridina (D). La estructura completa recibe el nombre de brazo D. • Una horquilla de 5 bases apareadas con un lazo que contiene el anticodón, el triplete de bases que es complementario al codón del ARNm. Esta estructura recibe el nombre de brazo anticodón. • Una horquilla de 5 bases apareadas en un lazo monocatenario que contiene por lo general una secuencia T-pseuouridina-C. La estructura se denomina brazo T. • Todos los ARNt acaban en la secuencia CCA con un grupo 3´-OH libre. Figura 10. Estructura secundaria de los ARNt. Los ARNr son las moléculas de nucleicos que constituyen la estructura de los ribosomas. Todos los ribosomas contienen dos subunidades (Figura 11). Por razones históricas, los ribosomas intactos y las subunidades se designan por unos números que describen la velocidad a la que sedimentan cuando se centrifugan 63 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 11. Estructura secundaria de los ARNr. 64 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA UNIDAD 7 REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN 1. Herencia y replicación del ADN 2. Transcripción y ARN 3. Código genético y traducción 1. Herencia y replicación del ADN El ADN posee la información necesaria para transmitir los caracteres de una especie de generación en generación y conseguir la supervivencia de la especie. Por lo tanto la molécula de ADN constituye la base química de la herencia. La mayoría de las moléculas de ADN se encuentran en los cromosomas del núcleo de las células. El número de cromosomas depende de la especie, así por ejemplo, las bacterias poseen un único cromosoma, mientras que las células humanas poseen 46 (23 de cada progenitor). La información genética en forma de ADN se organiza estructuralmente dentro del cromosoma arrollándose alrededor de ciertas proteínas (histonas) constituyendo asociaciones ADN-proteína denominadas nucleosomas (Figura 1). Las cadenas de ADN de cada especie difieren en longitud y en la secuencia de las bases nitrogenadas, de tal manera que esta secuencia contiene la información genética característica de cada especie. La información genética debe reproducirse exactamente cada vez que la célula se divide. El proceso por el que las moléculas de ADN se copian a si mismas en el núcleo de las células recibe el nombre de replicación del ADN. La replicación pretende a partir de una cadena de ADN obtener dos iguales. Esta replicación es semiconservativa, cada una de las hebras progenitoras actúa como molde para la síntesis de una hebra nueva o hija. Figura 1. Organización estructural del ADN en el cromosoma. La replicación se lleva a cabo gracias a la ADN polimerasa III, esta enzima cataliza la unión de los desoxinucleótidos trifosfato que son abundantes en el fluido del núcleo celular. Estos 65 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA desoxinucleótidos trifosfato se desplazan hacia la parte desenrollada de la molécula de ADN y se colocan por complementariedad enfrente de la base que les corresponde (A=T; C=G) de la cadena que actúa como molde, y una vez que están en el sitio adecuado se unen entre si por acción de la polimerasa III. La adición de dos unidades nucleótidicas consecutivas tiene lugar mediante la unión del grupo hidroxilo del carbono 3`de un nucleótido con el grupo fosfato del extremo 5`del siguiente. El mecanismo por el que se produce esta unión es un ataque nucleofílico del grupo 3`-OH de un nucleótido al 5`-trifosfato del nucleótido adyacente, eliminándose el pirofosfato y formándose un enlace fosfodiéster. La polimerasa lee la hebra que hace de molde en el sentido 3`→ 5` y sintetiza la nueva hebra en el sentido 5`→ 3`. Esta enzima necesita para iniciar la síntesis un pequeño fragmento de nucleótidos que denominamos cebador. En la síntesis del cebador interviene un tipo de ARN polimerasa denominado primasa. Durante el proceso de replicación, una de las cadenas madre se lee “bien” (en sentido 3`→ 5`) y, por lo tanto, la nueva cadena se sintetiza de corrido (hebra conductora), pero la otra está dispuesta en sentido contrario al que la polimerasa puede leer (hebra retardada). La solución a este problema es sintetizar la cadena en pequeños fragmentos en el sentido 5`→ 3`. Los cebadores son luego eliminados por la acción exonucleasa de la ADN polimerasa tipo I y los nuevos fragmentos resultantes son unidos por la acción de la ligasa, que elimina las mellas que quedan entre fragmentos. La secuencia de pasos implicados la replicación del ADN puede resumirse como sigue (Figura 2): - - Apertura de la doble hélice del ADN por acción de las helicasas. Síntesis de los cebadores para que la ADN polimerasa pueda actuar. Las enzimas implicadas denominan primasas. Se inicia la polimerización por acción de la ADN polimerasa III Cuando se alcanza el cebador del fragmento sintetizado anteriormente la Polimerasa I sustituye a la Pol III y, haciendo uso simultáneo de sus actividades exonucleasa (degradadadora de nucleótidos) y polimerasa, va sustituyendo los cebadores por el ADN correspondiente. Las ligasas cierran las mellas que hay entre cada dos fragmentos. Figura 2. Visión general del proceso de replicación del ADN. 66 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA 2. Transcripción y ARN Consiste en la “copia” del ADN a tres formas distintas de ARN con diferentes funciones, ARNr (constituyente de los ribosomas), el ARNt (que transporta los aminoácidos a los ribosomas durante el proceso de traducción) y ARNm (secuencia que se traducirá en proteínas). Durante la replicación el cromosoma entero se replica; en la transcripción normalmente solo unos pocos genes o grupos de genes se transcriben. El proceso empieza cuando una parte de la doble hélice del ADN se desenrolla formado el bucle de transcripción (unos 17 nucleótidos) para servir de molde para la síntesis del ARN, de tal manera que solamente una de las dos cadenas es la que transcribe la información al ARN. La cadena de ADN que sirve de molde se denomina”cadena molde”, mientras que la complementaria se llama “cadena codificante”, idéntica en secuencia de bases al ARN transcrito excepto que la timina es sustituida por uracilo. Los ribonucleótidos trifosfato existentes en el fluido celular (ATP, GTP, CTP y UTP) se desplazan hacia la parte desenrollada de la doble hélice del ADN y se sitúan complementando la cadena (T=A; A=U; C=G). Cuando estos nucleótidos se encuentran adecuadamente situados se unen entre si por acción de la enzima ARN-polimerasa (en el sentido 5`→ 3`). Finalmente, el ARN se separa y el ADN recupera la estructura de doble hélice. El ARNm así formado sufre pocas modificaciones en el caso de los procariotas, pero sufre importantes modificaciones postranscripcionales en el caso de los eucariotas, eliminándose los intrones (secuencias del genoma que no codifican nada), formando así el ARNm maduro que se traducirá en proteínas. El ADN se utiliza también como molde para la síntesis de los otros dos tipos de ARN, el transferente y el ribosómico. Las principales diferencias entre el proceso de trancripción en procariotas y eucariotas pueden resumirse como sigue: - En procariotas no hay separación física entre transcripción y traducción, mientras que en los eucariotas la transcripción tiene lugar en el núcleo, donde está el ADN, y la traducción en el citoplasma donde están los ribosomas. - En procariotas los ARNm son policistrónicos (llevan varios genes) y en eucariotas por lo general son monocistrónicos. - En procariotas hay un solo tipo de ARN polimerasa, mientras que en eucariotas hay al menos 3 tipos de ARN polimeras distintas (una para cada tipo de ARN). - En Procariotas los ARNm sufren pocas modificaciones postranscripcionales, mientras que en eucariotas sufren muchas, entre ellas la eliminación de intrones. La ARN polimerasa necesita al igual que la ADN polimerasa los cuatro nucleótidos trifosfato (ATP, GTP, CTP, UTP), Mg2+ y la cadena patrón de ADN cuya secuencia determinará la del ARN, pero a diferencia de la ADN polimerasa no necesita cebador para iniciar la síntesis de la cadena (Figura 3). La ARN polimerasa al igual que la ADN polimerasa sólo lee en el sentido 3`→ 5` y sintetiza la nueva hebra en el sentido 5`→ 3`. La primera etapa del proceso de transcripción es la unión de la ARN polimerasa a la molécula de ADN; esta unión se produce por unas zonas específicas del ADN denominadas promotores, que indican a la enzima que tiene que empezar a transcribir. También la terminación obedece a ciertas secuencias específicas denominadas secuencias de terminación. 67 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 3. Visión general del proceso de transcripción del ADN. Los promotores son zonas específicas del ADN donde se une la ARN polimerasa para empezar la transcripción, y dirigen la transcripción de los genes adyacentes. Las secuencias de los promotores no son idénticas pero se han encontrado en muchas bacterias ciertas secuencias que son particularmente comunes en ciertas posiciones (secuencia consenso). Se sitúan unos 10 y 35 nucleótidos a la izquierda de donde se inicia la transcripción y se llaman secuencia –35 o caja de entrada y secuencia –10 o caja TATA (Figura 4). Figura 4. Visión de la región del promotor en el ADN. • Tipos de ARN p ribosómico son bastantes estables, pero el mensajero es extremamente inestable, tiene una vida media de segundos. ARN Ribosómico. Los ribosomas son orgánulos intracelulares donde tiene lugar la síntesis de proteínas. Están formados por tres tipos de ARN y varias proteínas diferentes, incluyendo todas las enzimas necesarias para la traducción. Los ARNr son componentes estructurales de los ribosomas y también hay una serie RNA ribosómicos con funciones especiales incluyendo actividad catalítica (ribozimas). ARN Transferente. Los aminoácidos se alinean frente al molde de RNAm durante la síntesis de proteínas gracias a los tRNA que son capaces de leer los codones del ARNm y colocar el aminoácido correspondiente en el polipéptido. Estructuralmente tiene forma de trebol. 68 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA ARN Mensajero. Es el único que puede usarse como molde para la traducción a proteínas. Ni el rRNA ni el t RNA sirven para este fin. Son poco estables, tienen una vida media muy corta, sería “antieconómico” para la célula tener muchos. 3. Código genético y traducción La traducción se realiza utilizando una secuencia específica de tres bases del ARNm llamada triplete de bases o codón. Cada aminoácido está codificado por, al menos un triplete, que constituyen en código genético y que se recogen en la Figura 5. Este código es universal (válido para todas las especies) y degenerado (un aminoácido puede estar codificado por varios codones), pero no imperfecto (un codón codifica uno y sólo un aminoácido). La traducción del ARNm tiene lugar en los ribosomas y sigue los mismos pasos en procariotas y eucariotas. Cada triplete de nucleótidos o codón del ARNm determina un aminoácido específico. Cada molécula de ARNt porta el aminoácido correspondiente a un codón. El reconocimiento entre el ARNt y el codón tiene lugar gracias al anticodón. Entre los dos aminoácidos consecutivos debe formarse el enlace peptídico, este paso está catalizado por la enzima peptidil transferasa. Luego el ribosoma se transloca, desplazandose a lo largo de la cadena peptídica que se está formando y dejando un sitio vacante para un nuevo ARNt-aminoácido. La traducción continúa hasta que aparece un codón de terminación. Figura 5. El código genético. 69 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA En este proceso el reconocimiento del aminoácido por su correspondiente RNAt es fundamental. Este reconocimiento se debe a una enzima la aminoacil-ARNt sintetasa que tiene dos sitios específicos, uno presenta afinidad por el aminoácido y otro por el ARNt. De forma, que gracias a la especificidad de esta enzima es posible la especificidad de un ARNt por su aminoácido. Figura 6. Visión general del proceso de traducción del ARNm 70 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA UNIDAD 8 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA 1. Introducción regulación. 2. El operón lactosa 1. Introducción. La cantidad de proteínas que produce un gen activo por unidad de tiempo varía para poder satisfacer las necesidades de la célula. De hecho de todos los genes que posee un organismos solo unos pocos se expresan en un momento dado. El nivel de expresión de los genes variará según las condiciones ambientales, el nivel de diferenciación de la célula etc. Dado el alto coste energético que conlleva la síntesis de proteínas parece lógico que este proceso esté finamente regulado. Esta regulación se puede dar a nivel de transcripción o de traducción Los sistemas de regulación difieren entre procariotas y eucariotas, especialmente si las células eucariotas pertenecen a organismos pluricelulares que están organizados en tejidos. En procariotas es usual que varios enzimas de una ruta metabólica sencilla sean codificadas por un único RNAm policistrónico y que por tanto su expresión sea regulada conjuntamente (regulación coordinada), esto no ocurre en eucariotas donde los RNAm son generalmente monocistrónicos. Existen dos categorías mayoritarias de regulación, negativa y positiva. En un sistema de regulación negativa existe un inhibidor o represor celular que evita la transcripción y para iniciar la transcripción se necesita un antagonista del inhibidor que generalmente se llama inductor. En un sistema de regulación positiva una molécula efectora activa un promotor (no se tiene que anular ningún inhibidor). La regulación positiva y negativa no son excluyentes, muchos sistemas están regulados tanto positiva como negativamente. Un sistema degradativo puede estar regulado tanto positiva como negativamente. En una ruta biosintética el producto final normalmente regula negativamente su propia síntesis. 2. Sistema del operón lac. Un ejemplo claro de regulación de la expresión genética en procariotas, es el que ocurre en el operón lac. En E. Coli se requieren dos enzimas para la metabolización de la lactosa, la lactosa permeasa, una enzima de membrana que permite el transporte de la lactosa al interior celular y la -Galactosidasa, que cataliza la ruptura del enlace -1,4 entre la galactosa y la glucosa. La lactosa se degrada mediante rutas catabólicas para la obtención de energía, pero si en el medio no hay lactosa estas dos enzimas no son necesarias. 71 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA UNIDAD 9 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA Introducción Las enzimas de restricción. Aislamiento del ADN foráneo Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Hospedadores. Introducción del vector/ADN foráneo Métodos de selección Obtención de genotecas Electroforesis en geles de azarosa PCR (polymerase chain reaction) 1. Introducción La ingeniería genética o clonación molecular o tecnología del DNA recombinante son términos acuñados para describir un amplio número de técnicas que tienen por objeto la manipulación de los genes que componen un organismo que puede ser desde una bacteria hasta una planta o un ser humano. Se considera que los padres de la ingeniería genética son dos investigadores americanos en cuyos laboratorios se estudiaban durante los años 70 los plásmidos bacterianos (Stanley Cohen, U. Stanford) y las enzimas de restricción-modificación (Herbert Boyer, U Columbia, San Francisco). Estos científicos colaboraron estrechamente y sentaron las bases del DNA recombinante. La clonación molecular consiste básicamente en insertar un segmento de DNA que nos interesa en una molécula con capacidad autónoma de replicación, que llamamos vector. Este vector artificial se introduce en el organismo hospedador adecuado, lo que se traduce en la síntesis de grandes cantidades del DNA deseado. Cada colonia que proviene de una sola célula se denomina clon. Los principales pasos de la estrategia general de la clonación son: 1. 2. 3. 4. 5. Aislamiento del DNA foráneo que queremos clonar Unión del fragmento al vector o vehículo de clonación Introducción del vector con el DNA foráneo en la célula hospedadora Selección de la célula hospedadora con el DNA foráneo Determinar si la información genética se mantiene de forma estable. Algunos de estos pasos son más o menos comunes a todos los organismos, otros como la introducción del vector con el DNA foráneo en la célula hospedadora o la selección de la célula transformada pueden variar mucho según el organismo en cuestión. 2. Las enzimas de restricción. Aislamiento del ADN foráneo El aislamiento del DNA foráneo puede efectuarse utilizando una de las dos estrategias siguiente: selección desde el genoma que lo contiene o síntesis directa a partir de RNA mensajero. Cortes Endonucleasas de restricción o restrictasas Fragmentación mecánica Síntesis Síntesis de DNA a partir de RNA mensajero Aislamiento Síntesis química directa 72 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA • Endonucleasas de restricción Son enzimas capaces de cortar el DNA. Podemos agruparlas en tres tipos: Tipo I y Tipo III. Son enzimas multifuncionales con las actividades de restricción y modificación. Necesitan Mg2+ y ATP y S-adenosil-metionina. Reconocen la secuencia de reconocimiento, después recorren un cierto número de bases, unas 1000 en el caso de endonucleasas tipo I y unas 25 en el caso de las tipo III, por lo que rompen el DNA por secuencias más o menos al azar. Tipo II. Rompen el DNA por la secuencia de reconocimiento por lo que dan lugar a fragmentos de longitud y secuencia definidas. Necesitan Mg2+ pero no ATP. La utilidad práctica de las endonucleasas tipo II es incalculable. Se han aislado miles de enzimas de restricción tipo II en diferentes especies bacterianas y se emplean como herramientas para cortar el DNA artificialmente. Generalmente reconocen secuencias palindrómicas con entre 4 y 7 pares de bases. Las secuencias palindrómicas son aquellas que se leen igual en sentido 5´-3´ en ambas cadenas complementarias. En la Figura 1 se muestran algunas endonucleasas de restricción con sus secuencias de reconocimiento. La Figura 2 muestra algunos palíndromes. Figura 1. : Secuencias de reconocimiento de algunas enzimas de restricción. 73 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 2. Palíndromes. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Todos los vehículos de clonación tienen como propiedad indispensable que pueden replicarse autónomamente. Además es necesario que puedan separarse fácilmente del resto del genoma y que contengan regiones no esenciales para su propagación y estabilidad. • Plásmidos. Son replicones de DNA circular que se replican independientemente, aparecen de forma natural en las bacterias pueden tener entre 5.000 y 400.000 pares de base. La organización de la información genética en bacterias responde en general a un cromosoma circular y una serie de fragmentos de DNA circular con capacidad autónoma de replicación denominados plásmidos. Pueden introducirse en las células bacterianas por un proceso llamado transformación. Las propiedades deseables en un plásmido para que sea un buen portador genético son: • Bajo peso molecular, así puede incorporar más información. • Control relajado (muchas copias por célula que se replican de forma no asociada al cromosoma). • Amplio rango de hospedadores. • Fenotipo seleccionable, es decir, que posea marcadores genéticos como resistencia a antibióticos. • Buen mapa de restricción. 74 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Los plásmidos usados en ingeniería genética son relativamente pequeños, se replican bajo control relajado y llevan genes de resistencia específicos a uno o más antibióticos. Contienen además un cierto número de sitos de restricción para endonucleasas en los que el DNA que queremos clonar puede insertarse. • Virus. Se emplean para introducir DNA foráneo en una célula hospedadora. • Cosmidos. Es un artificio de laboratorio, un plásmido que posee el sito cos del fago , un origen de replicación igual que otros plásmidos, marcadores genéticos y puntos únicos de corte para ciertas restrictasas. • Vectores YACs (yeast artificial cromosomas). . Los YACs son segmentos lineales de DNA de levaduras que contienen todos los elementos necesarios para la replicación autónoma en una levadura (origen de replicación, centrómeros y telómeros). El uso de vectores capaces de incorporar segmentos de DNA mayores se hace necesario cuando vamos a clonar genomas muy grandes, como el genoma humano con un millón de pares de bases. Esto reduce el número de clones necesarios para tener una librería genómica completa (Figura 6). (A) Figura 6. Cósmido (A) y YAC (B). (B) 75 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA La unión del fragmento de DNA al vector o vehículo de clonación se produce por la acción de la DNA ligasa. Sella mellas existentes entre nucleótidos adyacentes. Cuando se unen fragmentos creados por una endonucleasa de restricción quedan mellas. La DNA ligasa repara estas mellas. Al producir la unión entre el inserto y el vehículo de clonación se debe evitar la recirculación de plásmidos. Para esto se aumenta la concentración de DNA, favoreciendo las reacciones intermoleculares. La reacción del plásmido con fosfatasa alcalina elimina los grupos 5`-P e impide también la recircularización. La Figura 7 muestra esquemáticamente el proceso de inserción del fragmento de DNA en el vector. Figura 7. Esquema de la inserción de un fragmento de DNA en un vector. 4. Hospedadores. Introducción del vector/ADN foráneo La introducción en la célula hospedadora del vector con el fragmento de DNA que se desea clonar difiere dependiendo del tipo de vector utilizado. Los métodos utilizados se describen a continuación. Transformación. Se introduce el DNA plasmídico o desnudo en una célula hospedadora. Esto ocurre normalmente en la naturaleza, pero se favorece con ciertos tratamientos que modifican la permeabilidad de la membrana al DNA como CaCl2 (obtención de células competentes). 76 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA La transformación con plásmidos de hasta 10Kb es bastante eficiente, más de 20Kb es casi imposible. Transducción. El DNA entra por infección con un bacteriófago. Transfección. Introducción del DNA procedente de un virus sin la cápsida; es menos eficaz. Conjugación. Paso del DNA de una célula a otra por pili. Fusión de protoplastos. Se elimina la pared celular de dos células microbianas, los protoplastos se unen temporalmente, pasa la información de uno a otro, luego se separan y se regeneran las paredes celulares. Microinyección. Se usa para células de mayor tamaño, generalmente eucariotas; se requiere un micromanipulador, aparato con microscopio, sistema de TV y micropipeta. Otros. Pistola o bombardeo de partículas se usa principalmente para la trasformación de vegetales. Hay que tener en cuenta que cualquier combinación no es posible. Hay ciertas limitaciones, por ejemplo: • Los plásmidos con más de 20Kb difícilmente pueden introducirse por transformación, por lo que si el inserto es muy grande debe recurrirse a un cósmido. • Los  derivados, de sito cos a sitio cos pueden tener entre 38-53 Kb pues se les elimina hasta 22Kb inútiles: lo máximo posible a encapsidar será la diferencia. • La trasfección tiene un rendimiento mucho menor. 5. Métodos de selección En el proceso de clonación, y específicamente durante la introducción de la asociación vectorDNA foráneo en la célula hospedadora, pueden ocurrir diferentes posibilidades: que entre en la célula hospedadora el DNA foráneo recircularizado, el vector sólo (ambas situaciones indeseables) o el portador genético completo (vector+DNA foráneo). Debe disponerse de un método sencillo que permita distinguir estas células diferentes de forma sencilla. Normalmente, además del marcador correspondiente los plásmidos llevan genes de resistencia a antibióticos, que permiten una primera selección. • Resistencia a antibiótico Por ejemplo, supongamos un DNA foráneo que introducimos en un vector que lleva genes de resistencia a ampicilina. Se prepara un medio de cultivo con ampicilina. Las células que no han sido transformadas o han sido transformadas con el inserto solo recircularizado, no crecerán (Figura 8). Solo crecerán aquellas que tengan el plásmido, pues contendrán así el gen de resistencia al antibiótico, aunque todavía habrá de buscarse un mecanismo que permita distinguir si las células tienen el plásmido solo o con el inserto (DNA foráneo) correspondiente. Figura 8. Resistencia ampicilina Esquema del método de selección de células transformadas (I). Resistencia a antibióticos. 77 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA • Selección genética. Inactivación insercional. Consiste en introducir el DNA foráneo en un gen marcador del vector, de forma que este gen se inactive. Inserción génica positiva. Al DNA foráneo le pego un marcador de forma que las colonias con el inserto tienen las características del marcador. Hibridación de colonias. Consiste en detectar secuencias de DNA en colonias transformadas mediante hibridación “in situ” con sondas marcadas radioactivamente o con otros marcajes. Se basa en la interacción de las bases de dos cadenas de DNA complementarias. Es la misma técnica que se usa para el southernblot. Técnicas genéticas. Supongamos que quiero clonar el gen que codifica la nitrito reductasa. Utilizo como hospedador una cepa de E.coli mutante que carece de nitrito reductasa. Si clono la nitrito, la cepa tendrá la nitrito reductasa podrá degradar nitrito. La causa de esto sólo puede ser que la mutación ha revertido o que se ha conseguido introducir el gen de la nitrito reductasa en E. coli. 6. Obtención de genotecas Si partimos de cDNA o DNA sintetizando químicamente del gen que nos interesa, conocemos muy bien lo que deseamos clonar. Pero si sólo tenemos una cierta función génica, por ejemplo el gen que codifica una proteína, y no conocemos la localización de dicho gen en el genoma correspondiente, entonces tendremos que obtener una genoteca o banco de genes para realizar una búsqueda del gen de interés. 7. Electroforesis en gel de agarosa Las moléculas de ácidos nucleicos pueden separase por electroforesis, porque sus movilidades electroforéticas al igual que ocurría con las proteínas varían de forma inversa a su tamaño. Se usa agarosa en vez de poliacrilamida porque los DNAs con varios miles de pb no pueden penetrar por la red de acrilamida. El uso de geles de agarosa nos permite por ejemplo separar los plásmidos del cromosoma bacteriano de mayor tamaño. 8. PCR (polymerase chain reaction) La reacción en cadena de la DNA-polimerasa fue descubierta en 1985 por Kary B. Mullis de la empresa Cetus y le valió el premio Nóbel de Química en 1993. Permite, partiendo de un pequeño fragmento de DNA, obtener un gran número de copias en tan sólo unas horas. La PCR se ha convertido en una técnica indispensable en una gran variedad de aplicaciones. Como método de diagnóstico en clínica, en medicina forense para determinar si una muestra de pelo o esperma pertenece o no a un individuo, para mutagénesis dirigida, o en paleontología molecular. Secuencias de organismos extinguidos cuyo DNA se ha conservado pueden amplificarse, secuenciarse y compararse con especies contemporáneas. También se ha conseguido amplificar el DNA de momias egipcias. 78 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. UNIDAD 10 INTRODUCCIÓN AL METABOLISMO Introducción al metabolismo Concepto de anabolismo y catabolismo Métodos de estudio de las rutas metabólicas Clasificación de los organismos atendiendo a su metabolismo Ciclo energético en las células El flujo de C, O, N y energía en la biosfera Regulación de las rutas metabólicas 1.- Introducción al metabolismo El metabolismo es el conjunto de reacciones químicas que se dan en un organismo, cada una de ellas está catalizada por un sistema enzimático y su finalidad es el intercambio de materia y energía entre la célula y el entorno. Las enzimas son claves para que se den los procesos metabólicos y para su regulación. Las finalidades del metabolismo son cuatro: 1. Obtención de energía química de moléculas combustibles o de la luz solar absorbida (esto último en organismos fotosintéticos). 2. Conversión de principios nutritivos exógenos en precursores de los componentes macromoleculares. 3. Ensamblaje de estos materiales para formar proteínas, ácidos nucleicos y otros componentes celulares. 4. Formación y degradación de las biomoléculas necesarias para las funciones especializadas de la célula. El metabolismo intermediario comprende mapas enzimáticos aparentemente muy complejos (Figura 1), pero la forma y función de las rutas metabólicas centrales no resultan de difícil comprensión. Además, las rutas centrales del metabolismo son muy parecidas en la mayoría de las formas de vida. Consideraremos en este capítulo la procedencia de los principios nutritivos y de la energía necesaria para la vida celular, las principales rutas por las que se sintetizan y degradan los componentes celulares y la ruta de transferencia de la energía celular. 79 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 1. Esquema de las rutas metabólicas centrales. 2. Rutas anabólicas, catabólicas y anfibólicas El metabolismo consta de dos grandes bloques de rutas: anabolismo y catabolismo. El catabolismo es la fase degradativa del metabolismo, en el cuál moléculas complejas y relativamente grandes (glúcidos, lípidos y proteínas) que provienen bien del entorno o de los propios depósitos celulares de reserva se degradan para producir moléculas más sencillas como ácido láctico, ácido acético, dióxido de carbono, amoníaco o urea. El catabolismo va acompañado de la liberación de la energía química inherente a la estructura de las moléculas orgánicas nutritivas y a su conservación en forma de ATP. El anabolismo constituye la fase biosintética del metabolismo, por la que tiene lugar la biosíntesis enzimática de los componentes moleculares de las células, tales como nucleicos, proteínas, polisacáridos o lípidos, a partir de sus precursores. La biosíntesis de estas macromoléculas orgánicas, necesita del consumo de energía química aportada por el ATP generado durante el catabolismo. La separación entre catabolismo y anabolismo es puramente formal, fisiológicamente ambas se desarrollan simultáneamente en el tiempo y en el espacio, pero lógicamente se regulan de manera independiente. Los productos intermedios del metabolismo se denominan metabolitos. Cada ruta anabólica o catabólica está constituida por numerosas etapas enzimáticamente catalizadas, a veces hasta 20 de ellas. La razón fundamental de esto es que la naturaleza adapta sus procesos a la moneda energética; una ruta de 20 etapas requeriría, entre gasto y consumo, el movimiento de una cantidad de energía muy superior a la que una molécula de ATP 80 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA puede mover. Estudiando las rutas metabólicas puede concluirse que la naturaleza se ha adaptado para producir la transformación de un precursor en otra molécula producto en tanto pasos como sean necesarios en función de los “quantum” o movimientos de energía libre inherente al grupo fosfato del ATP. Es decir, dicho de manera sencilla, las transformaciones metabólicas de un compuesto en otro implicarán un movimiento de energía que sea múltiplo de la “moneda energética”, el enlace entre el segundo y tercer fosfato en el ATP. La degradación enzimática de cada uno de los elementos nutritivos mayoritarios de las células, a saber, polisacáridos, lípidos y proteínas, tiene lugar por medio de cierto número de reacciones enzimáticas consecutivas organizadas en tres fases principales (no se incluyen nucleicos al no ser utilizados como fuente de energía por la mayor parte de los organismos). En la Fase I del catabolismo (Figura 2) las grandes moléculas nutritivas se degradan, liberando los sillares químicos sobre las que fueron construidas. Así, los polisacáridos se degradan rindiendo hexosas o pentosas, los lípidos producen ácidos grasos, glicerina y otros componentes, y las proteínas se desintegran en sus componentes aminoácidos. En la Fase II del catabolismo, todos los productos anteriores se convierten en un número menor de intermediarios más sencillos. Así, las hexosas, pentosas y glicerina, se degradan pasando por el ácido pirúvico, intermediario de tres carbonos, para rendir una especie más sencilla, de dos carbonos, el grupo acetilo del acetil-CoA. De igual forma, los diversos ácidos grasos y aminoácidos se escinden para formar acetil-CoA y unos pocos productos finales diferentes. Finalmente, el grupo acetilo del acetil-CoA, así como los productos de la Fase II se canalizan hacia la Fase III, ruta catabólica final común, en la que en último término pueden ser oxidados a dióxido de carbono y agua. En este sentido, el catabolismo es convergente. Figura 2. Fases del metabolismo. 81 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA La biosíntesis tiene igualmente lugar en tres etapas (Figura 2). En la Fase III se generan moléculas precursoras que en la Fase II se convierten en moléculas sillares. Estas, a su vez, se ensamblan en la Fase I para constituir macromoléculas. Por ejemplo, la biosíntesis de proteínas comienza en la Fase III con la formación de ciertos oxoácidos, que son los precursores de los aminoácidos, por aminación de los primeros. Finalmente, en la Fase I se ensamblan los aminoácidos para constituir las cadenas polipeptídicas. Las rutas biosintéticas o anabólicas son por tanto divergentes. Las rutas catabólicas y anabólicas no son inversas, aunque pueden tener algún paso común. Aunque la existencia de dos conjuntos de rutas metabólicas, una para el catabolismo y otra para el anabolismo, pueda parecer un despilfarro, esta ordenación posee ventajas importantes. La regulación de ambos tipos de rutas es independiente, puesto que enzimáticamente están controladas por catalizadores enzimáticos diferentes, y así mismo pueden estar ocurriendo en localizaciones distintas dentro de células eucariotas. Aunque las correspondientes rutas del catabolismo y anabolismo no son idénticas, la Fase III constituye un punto de cita central o de ruta asequible al catabolismo y al anabolismo. Esta ruta central común, designada a veces como ruta anfibólica, posee una doble función; así, la ruta puede utilizarse catabólicamente para producir la degradación completa de pequeñas moléculas que se derivan de la Fase II del catabolismo, o bien anabólicamente para suministrar a las reacciones biosintéticas moléculas pequeñas utilizables como precursores. 3. Métodos de estudio de las rutas metabólicas. Cuando se estudia el metabolismo es necesario conocer los intermediarios metabólicos, las enzimas implicadas en la ruta y su regulación. Hay tres formas clásicas para estudiar el metabolismo: • • • Aislamiento y caracterización de las enzimas y los intermediarios implicados en la ruta. Uso de mutantes auxótrofos (mutantes que necesitan la presencia de un nutriente en el medio para sobrevivir). Esto permite determinar el orden en que se suceden los precursores de la ruta. Uso de precursores isotópicamente marcados (isótopos son elementos con el mismo número atómico pero distinta masa atómico). Por ejemplo, los isótopos radiactivos son fácilmente detectables porque son inestables y emiten partículas subatómicas (32P, 14C y 3H). La resonancia magnética nuclear (RMN) detecta isótopos específicos por las características de su spín nuclear (1H, 13C, 31P). 4. Clasificación de organismos según su metabolismo Hay muchos tipos de metabolismo, adaptados a los distintos hábitats de la tierra. Podemos clasificar a los organismos según su metabolismo de acuerdo a los siguientes criterios: a) En función del aceptor de electrones de la cadena respiratoria: • Aerobios. Tienen como aceptor de e- en la cadena respiratoria el O2 (formando agua). • Anaerobios. Tienen como aceptor de e- en la cadena respiratoria nitrato (formando N2), sulfato (formando H2S) ó CO2 (formando metano). b) En función de la fuente de carbono: • • Autótrofos. Utilizan el CO2 como fuente de carbono (plantas, algas, cianobacterias). Heterótrofos. Utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono. 82 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA c) En función de la fuente de energía: • Fototrofos o fotoergónicos. Obtienen la energía de la luz (las plantas, algas y cianobacterias). • Quimiotrofos o quimioergónicos. Obtienen la energía de las sustancias químicas. Dentro de estos podemos distinguir: Litotrofos. La energía proviene de la oxidación de sustancias químicas inorgánicas. Organotrofos. La energía proviene de sustancias químicas orgánicas. 5. Ciclo energético en las células Cuando una molécula orgánica relativamente compleja como la glucosa se oxida con oxígeno molecular para formar 6 moléculas de dióxido de carbono y 6 de agua, sus átomos de carbono experimentan un incremento en el grado de libertad, se separan unos de otros en forma de CO2 y pueden adoptar así muchas posiciones diferentes unos con relación a otros. Como resultado de esta transformación, la molécula de glucosa experimenta una pérdida de energía libre, es decir, de la forma de energía capaz de realizar trabajo bajo temperatura y presión constantes (que es, a fin de cuentas, energía contenida en los enlaces). Dicha energía perdida es parcialmente capturada por las células en forma de energía de enlace (en la molécula de ATP) ó energía redox (en NADH / FADH2). Las oxidaciones biológicas son esencialmente combustiones sin llama, a baja temperatura. La energía libre de los combustibles celulares se conserva en forma de energía química inherente a los enlaces covalentes de los grupos fosfato terminales del trifosfato de adenosina, ATP, que se produce enzimáticamente a partir de difosfato de adenosina (ADP) y de fosfato inorgánico (Pi) mediante reacciones enzimáticas de transferencia del grupo fosfato, que están químicamente acopladas a etapas de oxidación específicas del catabolismo. El ATP así formado puede difundirse entonces hacia aquellos lugares de la célula en los que se necesita energía, constituyendo una forma de transporte de la energía libre. Cierta cantidad de la energía química transportada por el ATP es transferida, junto con el grupo fosfato terminal del ATP, a ciertas moléculas específicas aceptoras, las cuales adquieren un mayor contenido en energía y resultan “energetizadas”, pudiendo entonces actuar como precursores de biomoléculas mayores en cuya síntesis intervienen como “donadores” de energía. Los electrones son otro vehículo importante para la transferencia de energía química procedente de las reacciones que liberan energía del catabolismo a las reacciones biosintéticas que precisan de tal energía. En la biosíntesis de algunas moléculas ricas en hidrógeno, por ejemplo, colesterol y ácidos grasos, se necesitan electrones (o átomos de hidrógeno) para la reducción de los dobles enlaces a enlaces sencillos. Los electrones son enzimáticamente transportados desde las oxidaciones liberadoras de electrones del catabolismo hasta los grupos que requieren electrones, tales como los dobles enlaces carbono-carbono o carbono oxígeno. Esto se consigue normalmente mediante coenzimas transportadoras de electrones. El coenzima más importante es el nicotinamida adeníndinucleótido fosfato (NADP). Esta coenzima actúa por tanto como transportador de electrones (en forma de NADPH) desde las reacciones catabólicas hasta las reacciones anabólicas que precisan de electrones. 6. Ciclos del carbono, oxígeno, nitrógeno y energía en la biosfera Los organismos vivos son interdependientes en el aspecto nutritivo, debido principalmente a la existencia de ciclos de elementos básicos en la biosfera como son los del carbono, nitrógeno y oxígeno, gracias a los cuales las células fotosintéticas y las heterótrofas se alimentan literalmente unas a otras, relación conocida con el nombre de sintropía. 83 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Las células fotosintéticas producen compuestos orgánicos tales como glucosa, a partir del CO2 y del agua, y a expensas de la energía solar. Las células heterótrofas utilizan compuestos orgánicos producidos por las células fotosintéticas, como la glucosa, oxidándolos y produciendo dióxido de carbono que puede nuevamente ser utilizado por las células fotosintéticas. Acompaña al ciclo del carbono el intercambio de oxígeno entre los organismos fotosintéticos y heterótrofos (Figura 3). La mayor parte de los organismos fotosintéticos producen oxígeno, que es utilizado a su vez por los heterótrofos para oxidar los combustibles. Figura 3. Ciclo del oxígeno en la biosfera. Figura 4. Ciclo del nitrógeno en la biosfera. 84 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA El nitrógeno, componente elemental de las proteínas, los ácidos nucleicos y otras biomoléculas importantes, se cicla también a través de los organismos vivos en la biosfera (Figura 4). Aunque el nitrógeno molecular (N2 ) se halla en gran cantidad en la atmósfera, no puede ser utilizado por la mayor parte de las formas vivas. La gran mayoría de organismos lo obtienen de una forma combinada, como nitrato, amoniaco o formas más complejas como aminoácidos. Estas formas son muy escasas en aguas superficiales y experimentan un intercambio continuo. La mayor parte de los vegetales obtienen su nitrógeno del suelo en forma de nitrato, al que reducen para formar amoníaco, aminoácidos y otros productos reducidos. Todos estos productos son elaborados para formar los componentes nitrogenados de la célula, tales como las proteínas. Los organismos heterótrofos utilizan a continuación las proteínas de las plantas como elementos nutritivos y devuelven el nitrógeno al suelo en forma de productos finales de excreción o como productos de la putrefacción después de su muerte, generalmente en forma de amoníaco. Los microorganismos del suelo, a su vez, oxidan el amoniaco para formar nitrito (bacterias nitrificantes como Nitrosomonas) y nitrato (bacterias nitrificantes como Nitrobacter), que pueden ser utilizados de nuevo por los vegetales. Solamente algunas formas de vida pueden reducir el nitrógeno atmosférico y utilizarlo así como suministro biológico de nitrógeno (bacterias fijadoras de nitrógeno como Klebsiella, Rizobium o Azotobacter y cianobacterias). En la biosfera existe un flujo masivo de energía que está muy emparejado con el ciclo del carbono. Los organismos fotosintéticos capturan la energía solar, convirtiéndola en la energía química de la glucosa y otros compuestos orgánicos. Los organismos heterótrofos utilizan estos productos como precursores de sus biomoléculas estructurales y como combustibles ricos en energía para ejecutar sus actividades que precisan energía. La energía solar es, por lo tanto, la fuente única de energía para casi todos los organismos, ya sean autótrofos o heterótrofos. Sin embargo, es importante observar que la energía no se cicla en la biosfera, sino que fluye en una sola dirección. El flujo comienza con la energía solar, capturada por las células fotosintéticas y convertida en la energía química de los productos fotosintéticos. Estos productos son empleados después por los heterótrofos para desempeñar las diversas formas de trabajo celular. En el curso de estos procesos, la energía química se degrada hasta formas de energía biológicamente inútiles, tales como el calor, que se disipa hacia el entorno. El flujo energético en la biosfera es de proporciones enormes. Se emplean anualmente unas 1019 kcal de energía solar para convertir el dióxido de carbono en biomasa por medio de los organismos fotosintéticos de la biosfera, unas 20 veces más que toda la energía empleada por todas las máquinas manufacturadas por el hombre sobre la tierra. Todo esto lo consiguen con una eficiencia fotosintética del 0,3 %. Del 100 % de energía que llega a la tierra, solo un 0,3 % queda fijada por los fotosintéticos como energía química de enlace, el resto son perdidas. 7. Regulación de las rutas metabólicas La velocidad del catabolismo viene controlada por las necesidades de ATP (energía) de la célula en cada momento, y no por la concentración de sustratos. Las células sólo consumen su combustible en la medida que les es necesario para proporcionar la energía requerida para sus actividades en un instante determinado. Análogamente, la velocidad de biosíntesis de los componentes celulares se ajusta a las necesidades inmediatas. Es el principio de la máxima economía el que preside todos los aspectos del metabolismo. La regulación de cualquier ruta metabólica, es decir, los mecanismos que controlan su actividad, puede ocurrir a diversos niveles. 85 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA • Primer nivel. La velocidad de reacción de cada una de las reacciones enzimáticas de la ruta dependerá del pH y de las concentraciones intracelulares de sustratos o productos y del cofactor, que son los elementos primarios para regular la actividad enzimática y que directamente afecta a la velocidad del proceso catalizado. • Segundo nivel. Tal como se estudió en el tema de enzimología, la actividad puede regularse de forma muy sensible gracias a las enzimas reguladoras. Muchas enzimas son inhibidas por el producto final de la reacción, mientras que otras son estimuladas por algún metabolito o proteína reguladora. Ejemplo de ello son las enzimas alostéricas. • Tercer nivel. Se realiza a través del control genético de la velocidad de síntesis del enzima. Las enzimas que están siempre en cantidades casi constantes en una determinada célula reciben el nombre de enzimas constitutivas, mientras que aquellas que se sintetizan solamente en respuesta a la presencia de ciertos sustratos se llaman enzimas inducibles. Los genes que especifican la síntesis de estas últimas enzimas se encuentran generalmente bajo represión, y se desreprimen solamente en presencia de un agente inductor. Una secuencia completa de enzimas puede ser reprimida o inducida como si fuera un grupo, es decir, su síntesis está codificada por un conjunto de genes consecutivos en el ADN, llamado operón, que puede ser reprimido o desreprimido en conjunto. • Cuarto nivel. En organismos multicelulares habría que apuntar un último nivel de regulación, el hormonal, moléculas que actúan como mensajeros químicos, trasladándose por la sangre hasta ciertos tejidos, donde activan o inhiben de forma específica determinadas rutas metabólicas. 86 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA UNIDAD 11 METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS 1. 2. 3. 4. 5. Glucolisis Fermentación Transformación del piruvato en Acetil-CoA Ciclo de los ácidos tricarboxílicos Transporte electrónico y fosforilación oxidativa 1. Glucolisis La glucolisis consiste en una secuencia de 10 reacciones enzimáticas que catalizan la transformación de una molécula de glucosa a dos de piruvato, con la producción de dos moles de ATP y dos de NADH por mol de glucosa. Se trata de la ruta metabólica mejor conocida, que desempeña un papel clave en el metabolismo energético al proporcionar una parte importante de la energía utilizada por la mayoría de los organismos. Sirve en su función principal para preparar la glucosa y otros carbohidratos para su posterior degradación oxidativa. En la Figura 1 se representa una visión general de la vía glucolítica y su continuación hasta la degradación completa de la glucosa. El piruvato formado por degradación de la glucosa puede sufrir posteriormente distintas degradaciones, dependiendo de las condiciones y del organismo: a) En condiciones aerobias, el piruvato se transforma en Acetil-CoA, que se oxida aun más a través del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, y posteriormente a través de la fosforilacion oxidativa, generando CO2 y agua b) En condiciones anaerobias tiene lugar la fermentación, que es la transformación del piruvato hasta moléculas con un grado medio de oxidación, permitiendo la regeneración del NAD+. Dos de las fermentaciones más importantes son la homoláctica, en el músculo, por la que el piruvato es reducido hasta lactato, y la fermentación alcohólica, en levaduras, por la que se reduce hasta etanol y CO2 . Figura 1. Visión general de la glucolisis. 87 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA La glucosa, que inicia la vía glucolítica en animales, aparece en la sangre directamente de la degradación de polisacáridos complejos o de su síntesis a partir de distintas fuentes de carbohidratos (gluconeogénesis) y penetra en la mayor parte de las células a través de un transportador especifico que la traslada hasta el citosol. Las enzimas de la glucolisis están localizadas en el citosol. La glucolisis convierte la molécula de glucosa en dos de piruvato, en un proceso que utiliza la energía libre liberada para sintetizar ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico (Pi). Este proceso requiere de la existencia de una serie de reacciones de transferencia del grupo fosforilo acopladas químicamente. Así pues, la estrategia química de la glucolisis es la siguiente: a) Adición de grupo fosforilo a la glucosa b) Conversión química de grupos intermediarios fosforilados a compuestos con alto potencial de transferencia de grupos fosfato. c) Acoplamiento de la hidrólisis de estos compuestos para la síntesis de ATP. Las 10 reacciones enzimáticas constituyentes de la glucolisis se recogen esquemáticamente en la Figura 2 y más detalladamente en los esquemas posteriores. Al inicio de la vía se consume ATP para la generación de grupos fosforilo, pero posteriormente se regenera. Figura 2. Visión esquemática de las 10 reacciones de la glucolisis. 88 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Por tanto, la glucolisis transcurre en dos fases: FASE I. (Reacciones 1-5). Fase preparatoria en que la glucosa es fosforilada y fragmentada, dando lugar a dos moléculas de gliceraldehido-3-fosfato. Este proceso consume 2 ATPs. FASE II (Reacciones 6-10). Las dos moléculas anteriormente formadas se convierten a dos moléculas de piruvato, con la producción de 4 ATPs y 2 NADH. Por consiguiente, el rendimiento de la glucolisis es de dos ATPs formados por molécula de glucosa y la reacción global sería: Glucosa + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H2O + 4H+ El NAD+ es el principal agente oxidante de la vía glucolítica, así que el NADH formado durante el proceso debe ser continuamente reoxidado para mantener el suministro de NAD+. Las reacciones las dos fases de la glucolisis pueden desglosarse en sus 10 reacciones: 1. Consumo del primer ATP Transferencia del grupo fosforilo del ATP a la glucosa para formar glucosa-6-fosfato (G6P) en una reacción catalizada por la hexoquina. 6 CH2OH 5 H O H OH 4 OH 1 H OH 2 3 H 6 CH OPO 2− 2 3 ATP ADP H H 5 4 Mg2+ O H OH OH H 2 3 H 1 OH Hexokinase H OH glucose-6-phosphate OH glucose 2. Isomerización Conversión de G6P a fructosa-6-fosfato (F6P) catalizada por la Fosfoglucosa isomerasa. Primero debe abrirse el anillo para que ocurra la isomerización, con posterior ciclación de la fructosa. Para la apertura del anillo se requiere la presencia de un grupo ácido, probablemente el resto de butilamonio de una lisina. 6 CH OPO 2− 2 3 5 H 4 OH O H OH 3 H H 2 OH H 1 OH 6 CH OPO 2− 2 3 1 CH2OH O 5 H H 4 OH HO 2 3 OH H Phosphoglucose Isomerase glucose-6-phosphate fructose-6-phosphate 89 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA 3. Consumo del segundo ATP La fosfofructoquinasa fosforila la F6P para formar fructosa-1,6-bifosfato (FBP). Esta reacción controla la velocidad de la vía glucolítica. Esta reacción es estimulada alostéricamente por AMP e inhibida alostéricamente por ATP y citrato. Phosphofructokinase 6 CH OPO 2− 2 3 H 2 HO 3 OH 4 H 5 Mg2+ H H OH 1CH2OPO32− O ATP ADP H 5 6 CH OPO 2− 2 3 1CH2OH O HO 3 OH 4 H OH fructose-6-phosphate 2 fructose-1,6-bisphosphate 4. Rotura La aldolasa cataliza la rotura de la FBP en dos triosas, el gliceraldehido-3-fosfato (GAP) y la dihidroxíacetona fosfato (DHAP). 1 CH2OPO3 2C O HO 3 C H 4C H H 5 C 2− H Aldolase OH 2C OH 6 CH2OPO3 CH2OPO32− 3 O H 2C OH 2− 3 CH2OPO3 + 1CH2OH 2− dihydroxyacetone phosphate fructose-1,6bisphosphate O 1C glyceraldehyde-3phosphate Triosephosphate Isomerase 5. Isomerización Sólo uno de los productos de la rotura aldólica, el GAP, continua la vía glucolítica. La interconversión entre éste y la DHAP es catalizada por la triosa fosfato isomerasa. 1 CH2OPO3 2C O HO 3C H 4C H H 5 C 2− H Aldolase OH 2C OH 6 CH2OPO3 fructose-1,6bisphosphate CH2OPO32− 3 O + 1CH2OH 2− dihydroxyacetone phosphate O 1C H 2C OH 2− 3 CH2OPO3 glyceraldehyde-3phosphate Triosephosphate Isomerase 90 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA 6. Formación del primer intermediario de "alta energía" La gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa cataliza la oxidación y fosforilación del GAP, por NAD+ y fosfato inorgánico, para producir el 1,3-bifosfoglicerato (BFG). Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase H O NAD+ 1C H 2 C OPO32− + H+ O NADH 1C + Pi OH H C 2 2− OH 2− 3 CH2OPO3 3CH2OPO3 glyceraldehyde3-phosphate 1,3-bisphosphoglycerate 7. Primera producción de ATP Se forma el primer ATP por defosforilación del 1,3-bisfosfoglicerato, rindiendo además 3fosfoglicerato (3PG) en una reacción catalizada por la fosfoglicerato quinasa (PGK). Phosphoglycerate Kinase OPO32− ADP ATP O O 1C O− C 1 H 2C OH 2− 3 CH2OPO3 Mg 2+ 1,3-bisphosphoglycerate H 2C OH 2− 3 CH2OPO3 3-phosphoglycerate 8. Isomerización La fosfoglicerato mutasa cataliza la conversión de 3PG a 2-fosfoglicerato (2PG). Phosphoglycerate Mutase O− O O− O C C 1 1 H 2C OH 2− 3 CH2OPO3 H 2C OPO32− 3 CH2OH 3-phosphoglycerate 2-phosphoglycerate 9. Formación del segundo intermediario de "alta energía" 91 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA La enolasa cataliza la deshidratación del 2PG a fosfoenolpiruvato (PEP), formando un complejo activo por la presencia del catión magnesio. Enolase O O − C C 1 1 H O− O OPO32− C 2 3 CH2OH OPO32− + H2O C 2 3 CH2 2-phosphoglycerate phosphoenolpyruvate 10. Producción del segundo ATP La piruvato quinasa cataliza el acoplamiento de la energía libre de la hidrólisis del PEP a la síntesis de ATP para formar piruvato. Pyruvate Kinase O− O ADP ATP C 1 C 2 O− O C C 1 OPO32− 3 CH2 phosphoenolpyruvate C 2 O− O 1 OH 3 CH2 enolpyruvate C 2 O 3 CH3 pyruvate Entrada de otros azúcares en la glucólisis Además de la glucosa procedente de la degradación de almidón y glucógeno, hay otras hexosas de importancia, como la fructosa, que procede de la hidrólisis del azúcar de mesa y también de la fruta, la galactosa, que procede de la hidrólisis del azúcar de leche (lactosa), y la manosa, obtenida a partir de la digestión de polisacáridos y glucoproteínas. La fructosa es fosforilada en el músculo y convertida directamente a fructosa-6-fosfato, siguiendo después la vía glucolítica gracias a la acción de la hexoquinasa. No obstante, en el hígado la fructosa sigue una ruta más compleja cuyo resultado final es la producción de dos unidades de gliceraldehido-3-fosfato que se incorpora a la ruta. La galactosa se transforma en glucosa-6-fosfato, aunque este proceso parece simple las enzimas de la glucolisis no son capaces de reconocer la configuración de la galactosa, lo que hace que el proceso sea catalizado por 5 enzimas. Una de las enzimas cataliza la trasformación de la galactosa-1-fosfato a su derivado de uridina fosfato, revelando el papel que pueden jugar los nucleotidil-azúcares en el transporte activo de determinado metabolitos. La manosa es fosforilada para rendir manosa-6-fosfato y a continuación se produce una isomerización hasta fructosa-6-fosfato. 92 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Regulación de la glucólisis Desde un punto de vista global podemos decir que la glucólisis se inhibe cuando hay mucho ATP. Los puntos clave en la regulación de la glucólisis son las tres enzimas que catalizan pasos irreversibles: la hexoquinasa, la fosfofructokinasa y la piruvato kinasa. 2. Fermentación Para la continuación de la degradación de glucosa, el NAD+ (en cantidades limitadas en la célula) consumido en la glucólisis debe ser reciclado. En presencia de oxígeno, el NADH pasa a la mitocondria para ser nuevamente oxidado. En condiciones anaeróbicas, el NAD+ se recupera por reducción del piruvato, en lo que constituye una extensión de la vía glucolítica. Los procesos fermentativos permiten recuperar el NAD+. La fermentación homoláctica y la fermentación alcohólica son dos ejemplos que tienen lugar en el músculo y en la levadura, respectivamente. A. Fermentación homoláctica En el músculo, especialmente durante el ejercicio intenso, cuando la demanda de ATP es elevada y se ha consumido el oxígeno, la lactato deshidrogenasa (LDH) cataliza la oxidación del NADH por el piruvato para dar lactato. Los mamíferos poseen hasta 5 isoenzimas de la LDH (todas ellas tetraméricas) algunas de ellas están más adaptadas para la reacción directa y otras para la inversa, dependendiendo de factores estructurales referentes a las distintas estructuras terciarias que puede presentar la enzima. Lactate Dehydrogenase O− O C C NADH + H+ NAD+ O O− O C HC OH CH3 CH3 pyruvate lactate La reacción global de la degradación anaeróbica de glucosa mediante la fermentación láctica puede esquematizarse como sigue: Glucosa + 2ADP + 2Pi -------------> 2 lactato + 2ATP + 2H+ La mayor parte del lactato, producto final de la glucolisis anaeróbica, es exportado de las células musculares por la sangre hasta el hígado, donde vuelve a convertirse en glucosa. Al contrario de lo que se cree, la causa de la fatiga muscular y el dolor no es la acumulación de lactato en el músculo, sino del ácido producido durante la glucolisis (los músculos pueden mantener su carga de trabajo en presencia de concentraciones elevadas de lactato si el pH permanece constante). Los cazadores saben del sabor agrio de la carne de un animal que ha corrido hasta agotarse antes de morir. Esto es debido a la acumulación de ácido láctico en los músculos. 93 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA B. Fermentación alcohólica En levadura, el NAD+ se regenera en condiciones anaeróbicas mediante un proceso de gran importancia para la humanidad: la conversión de piruvato a etanol y dióxido de carbono. El etanol es el componente activo de vinos y licores, y el CO2 producido en la panificación es el responsable de la “subida” del pan. Pyruvate Decarboxylase Alcohol Dehydrogenase O− O CO2 C C O CH3 pyruvate H O NADH + H+ NAD+ C CH3 acetaldehyde H H C OH CH3 ethanol El etanol se produce a través de las siguientes reacciones; la primera es la descarboxilación del piruvato para formar acetaldehido y dióxido de carbono, catalizada por la piruvato descarboxilasa (ausente en animales) y que contiene la coenzima pirofosfato de tiamina (TPP) como grupo prostético. La tiamina, vitamina B1, es esencial al no ser sintetizada ni almacenada en cantidades significativas por la mayoría de vertebrados, por lo que debe ser tomada en la dieta. Su deficiencia produce importantes disfunciones, al intervenir el TPP en multitud de procesos de descarboxilación. Una consecuencia de su falta en el hombre es la enfermedad del beriberi, que puede resultar mortal y se caracteriza por alteraciones neurológicas, parálisis, atrofia muscular y/o paro cardiaco. El acetaldehido formado por descarboxilación del piruvato es reducido a etanol por el NADH, en una reacción catalizada por la alcohol deshidrogenasa (ADH). La transferencia del H del NADH al acetaldehido está favorecida por un cofactor de Zn2+, que estabiliza la carga negativa de un intermediario que se forma en el proceso. El sentido de esta reacción varía con las concentraciones relativas de acetaldehido y etanol. Así, la ADH del hígado de mamíferos metaboliza los alcoholes producidos anaeróbicamente por la flora intestinal, así como los que provienen de fuentes externas. En ambos tipos de fermentación el fin último es el mismo: regenerar NAD+ para poder continuar la glucolisis. La diferencia son los productos metabólicos generados en función de las condiciones que se den. 3. Transformación del piruvato en Acetil-CoA Los grupos acetilo entran en el ciclo en forma de acetil-CoA. Es este el producto común de la degradación de carbohidratos, ácidos grasos y aminoácidos. El grupo acetilo esta unido al grupo sulfhidrilo del CoA por un enlace tioéster. Es interesante tener en cuenta que la hidrólisis del enlace tioéster del acetil-CoA libera 31,5 kJ/mol y es, por lo tanto, un enlace rico en energía. 94 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA El acetil-CoA se forma por descarboxilación oxidativa del piruvato, por la acción del complejo enzimático piruvato deshidrogenasa (Figura 3). Este proceso, constituye, además, un punto de regulación previo al ciclo de Krebs. De hecho, el complejo multienzimático presenta dos tipos de regulación. La piruvato dehidrogenasa está regulada por dos mecanismos superpuestos. Por una parte está alostericamente inhibida cuando las proporciones de ATP/ADP y NADH/NAD+ son altas, además la enzima se inhibe cuando la disponibilidad de combustible para el ciclo, en forma de Acetil-CoA o ácidos grasos, es alta. Y se activa cuando las demandas energéticas crecen y por tanto el flujo de Acetil-CoA aumenta. Figura 3. Conversión de piruvato en acetil-CoA. Pyruvate Dehydrogenase H3C O O C C pyruvate HSCoA O− O H 3C NAD+ NADH C S CoA + CO2 acetyl-CoA Por otra parte esta regulada por un mecanismo de modificación covalente. La piruvato deshidrogenasa fosforilada es inactiva, mientras que la enzima defosforilada es activa. La interconversión entre las formas fosforilada y defosforilada está catalizada por las enzimas piruvato deshidrogenasa kinasa y la piruvato deshidrogenasa fosfatasa. La kinasa es activada por ATP (cuando la concentración de ATP es alta, mientras que la piruvato deshidrogenasa se inactiva por fosforilación) (Figura 4). Enzima - Pi Figura 4.: Regulación de la piruvato deshidrogenasa. Piruvato deshidrogenasa quinasa Inactiva Piruvato deshidrogenasa fosfatasa + ATP Enzima Activa 95 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA 4. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos Este ciclo, conocido también como de los ácidos tricarboxílicos o ciclo de Krebs, es la vía de oxidación de la mayor parte de carbohidratos, ácidos grasos y aminoácidos y genera numerosos metabolitos intermediarios de otras rutas metabólicas. Es, por lo tanto, un ciclo anfibólico, es decir, opera catabólica y anabólicamente. Una visión general del ciclo del ácido cítrico nos muestra una secuencia de reacciones que, en la mitocondria, oxidan el grupo acetilo del acetil-CoA a dos moléculas de dióxido de carbono, de forma que se conserva la energía libre producida, utilizándola en la síntesis de ATP. El ciclo fue propuesto por Hans Krebs en 1937. Las ocho enzimas del ciclo catalizan una serie de reacciones que, globalmente, oxidan un grupo acetilo a dos moléculas de dióxido de carbono, con la generación de tres moléculas de NADH, una de FADH2 y una de GTP. Tal y como se muestra en la Figura 5. Figura 5. Reacciones del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. 96 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA 1. La citrato sintetasa cataliza la condensación entre acetil-CoA y oxalacetato para rendir citrato, que da nombre al ciclo. 2. Las dos etapas siguientes conllevan la transformación del citrato en un isómero más fácilmente oxidable. Para ello, la aconitasa convierte el citrato en isocitrato mediante una deshidratación, produciéndose cis-aconitato unido al enzima, seguida de una hidratación. Así, el grupo hidroxilo del citrato es transferido a un átomo de carbono adyacente. 3. La isocitrato deshidrogenasa oxida el isocitrato a oxalosuccinato, con la reducción acoplada de NAD+ a NADH. Posteriormente, el oxalosuccinato es descarboxilado, rindiendo -oxoglutarato. Esta es la primera etapa en la que la oxidación se acopla a la producción de NADH, y también la primera en la que se genera dióxido de carbono. 4. El complejo enzimático -oxoglutarato deshidrogenasa descarboxila oxidativamente el oxoglutarato a succinil-CoA. Esta reacción conlleva la reducción de una segunda molécula de NAD+ a NADH y la generación de una segunda molécula de dióxido de carbono. Hasta aquí ya se han producido dos moléculas de dióxido de carbono, por lo que se ha completado la oxidación neta del grupo acetilo. Hay que resaltar que no son los átomos del grupo acetilo entrante los que han sido oxidados. 5. La succinil-CoA sintetasa convierte el succinil-CoA en succinato. La energía libre de la reacción se conserva aquí por la formación de GTP, a partir de GDP y Pi. 6. Las reacciones restantes suponen la preparación de otra vuelta del ciclo, y para ello completan la oxidación de succinato a oxalacetato gracias a la succinato deshidrogenasa, la cuál cataliza la oxidación del enlace sencillo situado en el centro de la molécula de succinato a un doble enlace trans, dando lugar a fumarato con la reducción simultánea de FAD a FADH2. 7. La fumarasa cataliza después la hidratación del doble enlace del fumarato para rendir malato. 8. Finalmente, la enzima malato deshidrogenasa regenera el oxalacetato, oxidando el grupo alcohol secundario del malato a la correspondiente cetona, con la reducción de una tercera molécula de NAD+ a NADH. Catalíticamente, el ciclo funciona como consecuencia de la regeneración del oxalacetato. Se pueden oxidar un número ilimitado de grupos acetilo con la mediación de una sola molécula de oxalacetato, ya que ésta se regenera en el ciclo. El NADH y el FADH2 son productos vitales del ciclo. Su reoxidación por el oxígeno, a través de la cadena de transporte electrónico y la fosforilación oxidativa, completa la degradación del combustible metabólico para la síntesis de ATP. Hay dos aspectos importantes sobre el ciclo de Krebs que deben conocerse: a) la regulación del ciclo b) la naturaleza anfibólica del ciclo a) Regulación del ciclo El flujo de carbono desde el piruvato a través del ciclo del ácido cítrico está finamente regulado mediante efectores alostéricos y/o modificación covalente de ciertas enzimas regulatorias. 97 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Además de la regulación a nivel de la piruvato deshidrogenasa, este ciclo está regulado a nivel de la entrada de acetil-CoA en el ciclo (citrato sintasa). Esto es importante pues el Acetil-CoA que se incorpora al ciclo de Krebs no llega sólo del piruvato sino también del la degradación de otras moléculas como ácidos grasos y aminoácidos. Además, también juegan un importante papel en la regulación del ciclo la IDH y la -cetoglutarato deshidrogenasa. Es decir, los tres pasos irreversibles son nuevamente los pasos de control del ciclo. Estas enzimas, en la mayoría de los casos, parecen estar controladas de tres maneras simples: a) disponibilidad de sustrato. b) inhibición por producto. c) inhibición competitiva por retroalimentación de los intermediarios que se encuentran más adelante en el ciclo. Por ejemplo, la citrato sintasa y la IDH se inhiben por ATP, y la cetoglutarato deshidrogenasa se inhibe por sus productos succinil-CoA y NADH. En condiciones normales las velocidades de la glucólisis y del ciclo del ácido cítrico están integradas de forma que sólo se metaboliza a piruvato la cantidad de glucosa necesaria para abastecer al ciclo del ácido cítrico. La velocidad de la glucolisis se acopla a la del ciclo del ácido cítrico no sólo a través de su inhibición por altos niveles de ATP y NADH, productos del ciclo, sino también por la inhibición por citrato, producto de la primera etapa del ciclo. b) Naturaleza anfibólica del ciclo Es interesante realizar unas breves apreciaciones sobre la doble naturaleza del ciclo de Krebs. Es obvia su naturaleza degradativa, con la consiguiente conservación de parte de la energía libre, siendo el ciclo un importante sistema para dicha función conservativa en la mayoría de organismos. Además, algunos de los intermediarios del ciclo de Krebs intervienen en otras rutas biosintéticas, lo que implica que continuamente tienen que ser repuestos en el ciclo del ácido cítrico para no desabastecer aquellas de sustrato. Se comentan seguidamente y de forma breve algunas de estas interconexiones metabólicas, citando ejemplos de rutas que utilizan intermediarios del ciclo de Krebs: 1. La biosíntesis de glucosa que ocurre en el citosol utiliza malato que ha sido transportado a través de la membrana mitocondrial. 2. La biosíntesis de aminoácidos utiliza de dos formas los intermediarios del ciclo; el oxoglutarato se usa en la síntesis directa de glutamato mediante una aminación reductiva; además dicho compuesto y el oxalacetato se emplean en la síntesis de glutamato y aspartato, respectivamente, mediante reacciones de transaminación, ambas con alanina, para rendir los correspondientes aminoácidos y piruvato. 3. La biosíntesis de lípidos (que incluye la de ácidos grasos o la de colesterol) son procesos que requieren acetil-CoA. Este se genera en la mitocondria y no puede ser transportado a través de la membrana mitocondrial interna, luego el acetil-CoA citosólico se genera por degradación del citrato, que puede atravesar la citada membrana en un transporte mediado por ATP. 5. Transporte electrónico y fosforilación oxidativa Lavoisier ya había demostrado que los seres vivos consumían oxígeno y producían dióxido de carbono. Pero no fue hasta principios del siglo XX, después del desarrollo de la enzimología (en parte gracias a los trabajos de Otto Warburg) cuando se demostró que las oxidaciones biológicas 98 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA se catalizan mediante enzimas intracelulares. Como hemos visto, la glucosa se oxida a CO2 mediante las reacciones de glucolisis y ciclo de Krebs. Pero, ¿cuál es el destino de los electrones que pierde la glucosa en este proceso? La respuesta la discutiremos en este apartado. En los sistemas vivos, estas reacciones de transferencia electrónica ocurren a través de una vía con múltiples etapas, que aprovechan la energía libre producida para formar ATP. Los 12 pares de electrones involucrados en la oxidación de la glucosa no pasan directamente al oxígeno, sino que se transfieren a los coenzimas NAD+ y FAD, formándose un total de 10 NADH y 2 FADH2 (Figura 6). Los electrones pasan entonces a la cadena de transporte electrónico donde participan (por la reoxidación mitocondrial del NADH y FADH2) en un proceso de oxidaciónreducción secuencial de determinados centros redox antes de reducir el oxígeno a agua. En este proceso, los protones son expulsados de la mitocondria, y la energía libre almacenada en el gradiente de pH resultante impulsa la síntesis de ATP, a partir de ADP y Pi, a través de la fosforilación oxidativa. La reoxidación de cada NADH da lugar a la síntesis de 3 ATP, y la de un FADH2 a 2 ATP. El total por molécula de glucosa oxidada es pues de 38 ATP, 30 proceden de los 10 NADH, 4 de los 2 FADH2, además en la glucolisis se producen 2 ATP por mol de glucosa y en el ciclo de Krebs 2 GTP (= 2 ATP) por cada 2 de piruvato que entra en el ciclo. La respiración celular y la fosforilación oxidativa tienen lugar en las mitocondrias de los eucariotas, cuya membrana interna es impermeable a la mayoría de las pequeñas moléculas e iones, incluyendo los protones. En los procariotas que carecen de mitocondrias las proteínas de la cadena de transporte electrónico de la respiración se encuentran en la membrana plasmática, Figura 6. Poder reductor generado por oxidación de glucosa. 99 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA La obtención de ATP a partir de la oxidación de NADH y FADH2 se realiza mediante la fosforilación oxidativa. El primer paso es la entrada de los electrones en la cadena respiratoria. La mayoría de los electrones provienen de la acción de dehidrogenasas que recogen los electrones de los distintos procesos catabólicos y los canalizan hacia los aceptores universales de electrones (NAD+, NADP+, FMN o FAD). Entonces los electrones son transferidos a una serie de transportadores asociados a membrana (Figura 7). Estos transportadores son de naturaleza proteica y tiene grupos prostéticos capaces de aceptar/donar electrones. El movimiento de electrones por los transportadores se produce desde potenciales estándar de reducción bajos a otros más elevados (Figura 8). En la cadena respiratoria intervienen tres tipos de moléculas capaces de transportar electrones. La ubiquinona o coenzima Q (una quinona hidrofóbica), los citocromos (proteinas que tienen como grupos prostéticos grupos hemo con hierro) y las proteínas con agrupaciones sulfo-férricas. • El complejo I, también llamado NADH: ubiquinona oxidorreductasa transporta los electrones del NADH a la ubiquinona. • El complejo II, es la succinato dehidrogenasa, única enzima del ciclo de Krebs unida a membrana, que pasa los electrones del FADH2 a la ubiquinona. • El complejo III, también llamado citocromo bc1 o complejo ubiquinona: citocromo c oxidorreductasa, acopla la transferencia de electrones desde la ubiquinona al citocromo c. El complejo IV, también llamado citocromo oxidasa, es la última etapa de la cadena de transporte electrónico de la respiración y conduce los electrones desde el citocromo c hasta el último aceptor de los electrones, el oxígeno que se reduce a agua. Figura 7. Cadena de transporte electrónico. 100 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 8. Cadena de transporte electrónico. Fosforilación oxidativa La síntesis de ATP a partir de ADP y Pi en las mitocondrias está catalizada por la ATP sintasa (complejo V), y está impulsada mediante el proceso de transporte electrónico anterior. Para ello, la energía liberada durante el transporte debe conservarse en una forma que pueda ser usada por la ATP-sintasa. Esto se conoce como acoplamiento de energía o transducción de energía. Para explicar tal acoplamiento, existen distintas hipótesis. La teoría más aceptada es la de Mitchell, que propone que los transportadores de electrones además de transportar electrones bombean protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana en contra de gradiente, para ser llevado a cabo este proceso endergónico es acoplado a la energía producida por el transporte de electrones a favor de gradiente, de modo que se crea un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana mitocondrial interna. El potencial electroquímico de este gradiente es aprovechado por la ATP sintasa para sintetizar ATP. La ATP sintasa transporta los protones a la matriz mitocondrial a favor de gradiente y acopla este proceso exergónico a al síntesis de ATP De esta forma, el transporte electrónico provoca que los complejos I, III y IV transporten protones a través de la membrana mitocondrial interna desde la matriz (una región de baja concentración de protones y potencial eléctrico negativo), al espacio intermembranal (una región de elevada concentración de protones y potencial eléctrico positivo). La energía libre secuestrada por el gradiente electroquímico resultante impulsa la síntesis de ATP por la acción de la ATP-sintasa. La ATP sintasa translocadora de protones es la estructura más compleja de la membrana mitocondrial, contiene dos subestructuras principales (F0 y F1 ) cada una con una Función determinada, F0 es una proteína submembranal insoluble en agua y que contiene un canal para la translocación de los protones. F1 es una proteína periférica de membrana, soluble en agua, que participa directamente en la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi,.( Figura 9.) 101 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 9. Fosforilación oxidativa. Teoría quimiosmótica y complejo ATP-sintasa. Otras respiraciones no aerobias En la respiración aerobia el aceptor final de los electrones es el oxígeno que se reduce a agua. Pero hay organismos que son capaces de respirar sin oxígeno llevando los electrones hasta otros aceptores con el mismo objetivo final, obtener mucho ATP. Hay organismos capaces de respirar: Nitrato, generando nitrógeno (bacterias denitrificantes) Sulfato, generando sulfuro (bacterias sulforeductoras) CO2, generando metano (bacterias metanogénicas) 102 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA TEMA 12 METABOLISMO DE LÍPIDOS 1. 2. 3. 4. Valor energético de los lípidos Activación de los ácidos grasos y entrada en la mitocondria -oxidación de los ácidos grasos Balance y energética 1.- Valor energético de los lípidos Los lípidos, al ser más reducidos que los carbohidratos, acumulan un mayor contenido energético que los carbohidratos. Frente a las 4 Kcal/gr de los carbohidratos, los lípidos acumulan unas 9 Kcal /gr. Esta es la razón, junto con su hidrofobicidad y su relativa poca reactividad, que facilita su almacenamiento. Constituyen la mayor reserva energética de los animales. Los lípidos se degradan por la repetición consecutiva de cuatro pasos hasta acetil-CoA mediante la ruta metabólica conocida como la -oxidación. El acetil-CoA puede seguir oxidándose mediante el ciclo de Krebs y la respiración hasta CO2 y agua o puede servir como precursor para otras rutas biosintéticas. Los lípidos suponen una media del 40% de los requerimientos energéticos de los seres humanos (aunque no se aconseja que este valor sobrepase el 30%), y muchos animales. Las plantas los utilizan como reserva energética en las semillas, pero no dependen de ellos como fuente energética. Las células pueden obtener los ácidos grasos de distintas fuentes: grasas consumidas en la dieta, grasas acumuladas en las células como gotas de grasa o grasas sintetizadas en un órgano que son transportadas a otro. Los vertebrados, por ejemplo, usan las tres fuentes: obtienen grasas de la dieta, de los depósitos en las células especializadas del tejido adiposo y el hígado convierte el exceso de carbohidratos de la dieta en grasa que se exportan a otros tejidos. Los triacilglieroles son los principales lípidos que actúan como reserva energética. Antes de ser absorbidos, las sales biliares sintetizadas en el hígado y almacenadas en la vesícula biliar, los convierten en micelas finamente dispersadas para que sean más accesibles a la acción de las lipasas, que los degradan a ácidos grasos que se degradan por la b-oxidación y glicerol, que conecta con la ruta glucolítica. 2. Activación de los ácidos grasos y entrada en la mitocondria Las enzimas de la degradación de los ácidos grasos en las células animales se encuentran localizadas en la matriz mitocondrial. Los ácidos grasos no pueden pasar directamente del citoplasma al interior de la mitocondria, para ello deben sufrir una activación: O R C O OH + ATP + CoA-SH R C SCoA + AMP + P Pi Los acil-CoA tioésteres formados no pueden atravesar la membrana interna mitocondrial. Los grupos acilos deben ser transferidos (gracias a la carnitina transfera I) a una molécula de carnitina, que facilita la difusión a través de la membrana mitocondrial utilizando el transportador acil-carnitina/carnitina que funciona como una lanzadera (Figura 1). 103 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Figura 1. Activación de los ácidos grasos y entrada en la mitocondria. Una vez en el interior de la matriz mitocondrial el grupo acilo es transferido nuevamente a una molécula de CoA-SH y se separa de la carnitina, gracias a la carnitina aciltransferasa II. El transporte mediado por carnitina de los ácidos grasos es el paso limitante de la oxidación de ácidos grasos. 3. -oxidación de los ácidos grasos La Figura 2 representa la visión general del proceso de degradación oxidativa de los ácidos grasos. Esquemáticamente, se muestra la activación y transporte al interior de la mitocondria de un ácido graso y la posterior oxidación hasta acetil-CoA con la producción acoplada de energía en forma de poder reductor. 104 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA En el proceso de oxidación mitocondrial, el ácido graso se escinde en fragmentos de dos átomos de carbono (acetil-CoA) para lo que son necesarios 4 pasos enzimáticos sucesivos que se repiten (n/2 –1) veces, siendo n el número de átomos de carbono del ácido graso. Los cuatro pasos son los siguientes (Figura 3): Figura 3. Pasos enzimáticos de la oxidación de ácidos grasos. a. Deshidrogenación ligada a FAD, catalizada por la enzima acil-CoA deshidrogenasa. Consiste en introducir un doble enlace entre los carbonos  y  del ácido graso. b. Adición de agua al doble enlace formado, catalizado por la enoil-CoA hidrolasa. c. Deshidrogenación ligada a NADH, catalizada por la hidroxiacil-CoA-deshidrogenasa. d. Tiolisis por CoA-SH, catalizada por la -ceto liasa, que introduce un nuevo grupo CoA-SH al primitivo carbono , rindiendo un acetil-CoA con dos átomos de carbono menos y una molécula de Acetil-CoA. 105 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Los ácidos grasos insaturados y de número impar de átomos de C, se degradan por este mismo mecanismo con pequeñas modificaciones. 4. Balance y energética Tomemos como ejemplo para el balance energético la degradación de ácido palmítico, ácido graso saturado que tiene 16 átomo se carbono. La degradación por -oxidación rendirá: O CH3 (CH2)14 C 7 CoA-SH 7FADH2 / 7 NADH O 8 CH3 CoA C CoA Los 8 Acetil-CoA seguirán oxidándose mediante el ciclo de Krebs, por lo que se obtendrán: 24 NADH, 8 FADH2 y 8 GTP. El poder reductor generado en la -oxidación y en el ciclo de Krebs pasará a la cadena respiratoria y se obtendrá: -oxidación Ciclo de Krebs Total Respiración NADH 7 24 31 93 ATP FADH2 7 8 15 30 ATP GTP - 8 8 8 ATP 131 ATP Si descontamos los 2 ATP que se gastan durante la activación del ácido graso (uno equivale a la rotura del enlace P-Pi), podemos concluir que la degradación total de un molécula de ácido palmítico rinde 129 ATP. 106 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA FUENTE: http://www.uhu.es/24003/apuntes.htm RECOPILACION Y EDICION: DR. FELIPE DE JESUS DAVILA ESQUIVEL. FEBRERO DEL 2010. 107