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Pontificia Universidad Católica de Chile Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal Departamento de Fruticultura y Enología

Efecto Alelopático de Glucósidos Cianogénicos sobre Plántulas de Nemaguard

Residencia presentada como parte de los requisitos para optar al Título de Ingeniero Agrónomo

Edgardo Antonio González Leiva

Profesor Guía: Carlos Sotomayor Sercka, Ing. Agr. M.Sc.

Junio, 2003

Este Proyecto de Título fue parcialmente financiado por el Proyecto FDI – CORFO 00C7AT – 12 “Introducción, Caracterización y Evaluación Productiva de Nuevos Portainjertos de Duraznero y Nectarino para Chile”

AGRADECIMIENTOS Quiero agradecer a mis padres y a mi hermano por su comprensión, entendimiento y apoyo al desarrollo de este trabajo de Residencia y al profesor Carlos Sotomayor por su cooperación en el desarrollo de este tema.

INDICE Página 1. RESUMEN………………………………………………………………………...... 1 2. INTRODUCCIÓN...................................................................................................... 2 3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA................................................................................. 4 3.1. Definición del mecanismo de interferencia................................................... 4 3.2. Significado de Alelopatía.............................................................................. 5 3.3. Otros compuestos con acción alelopática en frutales……………………… 6 3.4. Cianogénesis................................................................................................. 8

3.5. Glucósidos cianogénicos……………........................................................... 8 3.6. Biosíntesis, catabolismo y transporte de CGs............................................... 11

3.6.1. Biosíntesis....................................................................................... 11 3.6.2. Catabolismo.................................................................................... 12

3.6.3. Transporte....................................................................................... 14 3.7. Comportamiento de los CGs a través del desarrollo vegetal......................... 15 3.7.1. Conducta en plántulas en desarrollo............................................... 15 3.7.2. Conducta durante el crecimiento de frutos..................................... 17 3.8. Distribución de enzimas catabolizantes de CGs…………............................ 16 3.9. Aspectos genéticos (control genético de CGs).............................................. 19 3.10. Rol en los procesos fisiológicos de plantas................................................. 20 3.10.1. Ruta metabólica del cianuro en la síntesis de asparragina............ 21 3.10.2. Metabolismo del cianuro en plantas............................................. 22 3.10.3. El cianuro como subproducto de la biosíntesis de etileno............ 22 3.10.4. Cianuro como inductor de la formación de auxinas..................... 23 3.10.5. Respiración resistente a cianuro................................................... 3.11. Mecanismo de acción de inhibidores.......................................................... 3.11.1. Respiración celular....................................................................... 3.11.2. Inhibición de la división y elongación celulares.......................... 25 26 26 26

3.11.3. Inhibición de giberelinas y/o ácido indol acético......................... 27

Página 3.11.4. Efecto sobre la absorción mineral................................................ 28

3.11.5. Retraso de la fotosíntesis.............................................................. 28 3.11.6. Metabolismo de la glucosa…………........................................... 3.11.7. Inhibición del crecimiento general............................................... 29 29

3.12. Mecanismo de liberación de cianoglucósidos............................................. 29 3.12.1. Exudaciones radicales.................................................................. 30

3.13. Efecto de factores edafoclimáticos sobre cianoglucósidos……………….. 30 3.13.1. Factores climáticos……………………………………………... 3.13.2. Suelo: efectos sobre la acción alelopática…………………….... 30 31

3.14. Biodegradación……………………………………………………..…….. 33 3.15. Ciclo del nitrógeno y cianuro……………………………………………… 35 3.16. Concentraciones relativas de CGs y HCN en Prunus.................................. 35 3.16.1. Damasco........................................................................................ 35 3.16.2. Almendro....................................................................................... 36 3.16.3. Cerezo…………………………………………………………… 36 3.16.4. Duraznero...................................................................................... 37 4. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………...……………… 38 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………………. 40 5.1. Altura de plántulas……………………………………………..…………… 40 5.2. Diámetro de plántulas………………………………………………………. 43 5.3. Materia seca total…………………………………………………………… 46 5.4. Largo radicular……………………………………………………………… 50 5.4. Concentración de cianuro final……………………………………………… 52

6. CONCLUSIONES………………………………………………...……………..….. 46 7. BIBLIOGRAFÍA…………………………………..………………………………… 47 8. ANEXO......................................................................................................................... 63

INDICE DE TABLAS Página Tabla 3.1 Algunos mecanismos postulados para la biodegradación de compuestos del cianuro ………………………………………………… Tabla 5.1. Análisis de varianza de altura de plántulas (cms)…………………………. Tabla 5.2. Comparación múltiple de medias de alturas de plántulas (cms) a través de la Prueba de t de Student………………….….. Tabla 5.3. Análisis de varianza de diámetro de plántulas (mm)……………………… Tabla 5.4. Comparación múltiple de medias de diámetros de plántulas (mm) a través de la Prueba de t de Student…………………..….. Tabla 5.5. Análisis de varianza de materia seca de hojas en plántulas (grs)……….… Tabla 5.6. Comparación múltiple de medias de materia seca de hojas de plántulas (grs) a través de la Prueba de t de Student……….... Tabla 5.7. Análisis de varianza de materia seca de tallos en plántulas (grs)………… Tabla 5.8. Comparación múltiple de medias de materia seca de tallos de plántulas (grs) a través de la Prueba de t de Student………………..…. Tabla 5.9. Análisis de varianza de materia seca de raíces en plántulas (grs)…….…... Tabla 5.10. Comparación múltiple de medias de materia seca de raíces de plántulas (grs) a través de la Prueba de t de Student……………….... Tabla 5.11. Análisis de varianza de materia seca total de plántulas (grs)……………. Tabla 5.12. Comparación múltiple de medias de materia seca total de plántulas (grs) a través de la Prueba de t de Student……………..….. Tabla 5.13. Análisis de varianza de largo de raíces de plántulas (cms)……………… Tabla 5.14. Comparación múltiple de medias de largo radicular de plántulas (cms) a través de la Prueba de t de Student……………...… Tabla 5.15. Análisis de varianza de concentración de cianuro en el suelo (ppm)…… Tabla 5.16. Comparación múltiple de medias de concentración final de cianuro (CN-) en el suelo (ppm) a través de la Prueba de t de Student………..…

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INDICE DE FIGURAS Página Figura 3.1. Ruta general de biosíntesis de compuestos alelopáticos…………………… 65 Figura 3.2. Esquema general de biosíntesis de glucósidos cianogénicos desde un á - aminoácido……………………..……………..... 66 Figura 3.3 Biosíntesis de los glucósidos cianogénicos Amigdalina y Prunasina desde el aminoácido Fenilalanina….…………..… 67 Figura 3.4. Ruta simplificada de catabolismo de glucósidos cianogénicos en Prunus………………………………………………………………..…. Figura 3.5. Esquema particular de reutilización y catabolismo de cianoglucósidos en Prunus………………………………………….….. Figura 3.6. Niveles de los cianoglucósidos amigdalina y prunasina en plántulas en desarrollo de Prunus serotina…………………….………. Figura 3.7. Niveles de Amigdalina Hidrolasa (AH), Prunasina Hidrolasa (PH) y Mandelonitrilo Liasa (MDL)………….…….. Figura 3.8. Contenido de glucósidos cianogénicos en frutos enteros (A), semillas (B) y pericarpio (C) de frutos de Prunus serotina………………. Figura 3.9. Niveles de actividad relativa de hormonas catabólicas (AH, PH y MDL) en frutos de Prunus serotina…………………………... Figura 3.10. Vista general de los procesos intervenidos y afectados por la acción de aleloquímicos……………………………..……………. Figura 3.11. Esquema representativo de los principales mecanismos de liberación de compuestos alelopáticos desde las plantas………......… Figura 3.12. El ciclo del nitrógeno incorpora cianuro como HCN………………..….. Figura 5.1. Expresión del crecimiento de plántulas en altura (cms) en el tiempo para los tratamientos T0, T2, T3 y T4……………..…….…. Figura 5.2. Expresión del crecimiento de plántulas en altura (cms) en el tiempo para los tratamientos T0, T5, T6 y T7………………………. Figura 5.3. Expresión del crecimiento en diámetro (mm) en el tiempo para los tratamientos T0, T2, T3 y T4……………………….

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Figura 5.4. Expresión del crecimiento de plántulas en diámetro (mm) en el tiempo para los tratamientos T0, T5, T6 y T7…………………….…. Figura 5.5. Efecto de la concentración sobre el peso de la materia seca final (grs) en hojas, tallos, raíces y total………………….…..

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Figura 5.6. Expresión del crecimiento en longitud radicular final (cms) para los distintos tratamientos…………………………….…… 52 Figura 5.7. Dosis de amigdalina (ppm) aplicada inicialmente a cada tratamiento y la concentración de cianuro residual en el suelo (ppm)……... 55

1 1. RESUMEN DEL PROYECTO DE TITULO DE Edgardo Antonio González Leiva para el grado de Ingeniero Agrónomo presentado el 27 de Junio de 2003. Título: Efecto Alelopático de Glucósidos Cianogénicos sobre Plántulas de Nemagua rd. Resumen aprobado: Sr. Carlos Sotomayor S. Dentro de los problemas del replante, la acción de los residuos y exudados vegetales sobre el desarrollo de la nueva plantación, lo que se conoce como Alelopatía, juega un rol clave. En especies de Prunus la alelopatía es desencadenada principalmente por los glucósidos cianogénicos amigdalina y prunasina y los productos de su degradación en el suelo, el cianuro y el benzaldehído. Las teorías que fundamentan su origen establecen un importante potencial de defensa vegetal contra herbívoros. Debido a la escasa información local específica, la posibilidad de emplear este mecanismo para la selección de portainjertos resistentes y disminuir algunos de los costos de aplicación de compuestos con efecto pesticida, se implementó un ensayo inicial con siete tratamientos más un testigo para probar la acción del cianoglucósido amigdalina, su producto derivado el cianuro, extractos de semillas de almendro amargo y raíces de Nemaguard y un suelo de replante de duraznero sobre el crecimiento de plántulas del portainjerto Nemaguard (híbrido Prunus persica x Prunus davidiana) (20 plántulas por tratamiento). Por espacio de cinco meses se midió altura y diámetro en plántulas, además de la materia seca en hojas, tallos y raíces y la longitud radicular al término del periodo estipulado. La inhibición en el incremento de estos parámetros presentó una ordenación decreciente, siendo el testigo el de mayor tasa de crecimiento y secuencialmente los demás tratamientos de acuerdo a concentración de amigdalina pura y conjugada, composición de compuestos alelopáticos adicionales a la amigdalina en los distintos extractos y finalmente el suelo con antecedentes de alelopatía. Los resultados fueron concluyentes y demostraron idénticos efectos por de acuerdo al tratamiento. Adjuntamente se midió la concentración de cianuro residual de los suelos que contenían las plántulas y se determinó cantidades proporcionales del compuesto, dependiendo de la dosis de amigdalina adicionada al tratamiento y de los porcentajes de absorción vegetal y pérdidas por lixiviación y toxicidad de las concentraciones extremas menores y mayores, respectivamente comparado con las medias.

2 2. INTRODUCCION

Son múltiples los mecanismos y factores causales asociados al conocido “Problema del Replante” (llamado también Cansancio o Fatiga del suelo). Estos tienen como punto de partida, por lo general, la sucesión de un cultivo frutal por otro, y más cuando este segundo es de la misma especie que el precedente (Durán, 1976; Melakeberhan et al., 1993). Se ha descrito un sindrome característico de las especies aquejadas por dicho trastorno; este está representado por manifestaciones al follaje (clorosis intervenal, necrosis, hojas más pequeñas, etc.), al sistema radical (mínima expresión y extensivo decaimiento de pelos radicales, muerte de meristemas bajo la caliptra, disminución en la absorción, pardeamiento y acortamiento de raíces gruesas, etc.) y al desarrollo (enanismo, entrenudos más cortos, menor ramificación y generación de brotes, etc.) (Costante et al., 1991; Dullhide et al., 1994; Mai y Abawi, 1981). Como mecanismos causales se han indicado agentes bióticos y abióticos (Inderjit, 1997; Mazzola, 1998; Rabie et al., 2001); entre los bióticos cabe destacar principalmente microorganismos del suelo como actinomicetes, bacterias, hongos y nematodos, mientras que los abióticos incluyen desbalance nutricional, cambios en el pH del suelo, deterioro de las condiciones físicas edáficas, residuos de pesticidas, y elementos fitotóxicos en el suelo (Inderjit y Dakshini, 1995). Respecto a este último factor biótico incidente, Rice (1974) e Inderjit et al. (2001) establecen que la mayoría de los ensayos emprendidos con el fin de alcanzar una aproximación certera hacia los fundamentos del fenómeno de replante, descartan o simplemente no tienen noción acerca de la importancia de la emisión o liberación desde una planta (o microorganismo) de compuestos con acción depresora o estimuladora sobre la estructura o funcionamiento de la especie receptora y del suelo (Sampietro, 2001). Según la literatura (Inderjit, 1996; Putnam y Tang, 1986; Seigler, 1996), este particular mecanismo de interferencia conocido como Alelopatía, tiene estrecha relación con los factores ambientales y las poblaciones vegetales y animales que conviven con la planta (donor), productora de sustancias con acción alelopática (aleloquímicos), ya que modifican, seleccionan, estimulan, reprimen o inducen que se exprese la dinámica de producción de estos compuestos en vegetales (Vetter, 2000). Por ello, es que habitualmente se confunde con la

3 competencia por recursos, a pesar que la alelopatía no interviene en la disponibilidad de recursos del medio (Internacional Allelopathy Society, 2002). Las plantas producen una infinidad de sustancias con acción alelopática provenientes del metabolismo secundario que desarrollan. Entre ellas encontramos fenoles, alcaloides, taninos, quinonas, terpenos, esteroides, glucósidos cianogénicos, etc (Hulme, 1970; Kingsbury, 1964; Rice 1974). Los glucósidos cianogénicos son un grupo clásico y conocido porque se presentan en las especies del género Prunus, es decir almendros, damascos, durazneros, nectarinos, cerezos, entre otros (Hulme, 1970; Rice, 1974). No obstante, es variada la gama de glucósidos que se conocen en la actualidad, es aún más amplio el acervo de especies que generan tales aleloquímicos (Li et al., 1992; Swain et al., 1992a, b; Swain y Poulton, 1994). En estos últimos compuestos, su efecto alelopático radica en que a su degradación desprenden ácido cianhídrico (HCN), un compuesto tóxico que actúa a nivel respiratorio en los organismos receptores (Stumpf y Conn, 1980). En el caso de Prunus esta liberación se produce principalmente por daños a nivel radical o porque la toxina exuda desde carozos de fruta (Sampietro, 2001). Ello ha motivado gran parte del interés por el estudio de la fisiología y estructura de esta llamada “bomba de cianuro” en el extranjero (principalmente EE.UU.) (Dicenta et al., 2002, Frehner et al., 1990). Respecto a lo anterior, en cumplimiento de los requisitos para optar al Título de Ingeniero Agrónomo, en el Departamento de Fruticultura y Enología de la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Chile, se llevaron a cabo ensayos con plántulas de Nemaguard (híbrido de P. insititia x P. davidiana) con distintos tratamientos de amigdalina, de modo de apreciar los efectos sobre el crecimiento de las plántulas establecidas. Ello nace como una experiencia innovadora en nuestro país que se espera dé pie al interés por reconocer la importancia de la ciencia de la Alelopatía en el ámbito agronómico. Como objetivo general de este trabajo, se pretende un entendimiento preliminar de cómo opera el fenómeno de la alelopatía en las plantas, entregando nociones del funcionamiento de estos procesos y afinando la idea de un mecanismo vegetal con enormes proyecciones agronómicas. En forma particular, con los resultados del ensayo se espera dar a conocer quizás por primera vez en nuestro país indicios y datos iniciales sobre como operan los glucósidos cianogénicos en la interacción alelopática en Prunus.

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3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

3.1. Definición del mecanismo de interferencia Una planta para ser exitosa debe tener la capacidad de interactuar con otros organismos a su alrededor. Para ello debiera ser capaz de crear condiciones en las cuales su potencial de interferencia resalte enormemente sobre otras plantas, cuya sobrevivencia es afectada. Por ende, se podría establecer que en la naturaleza están operando muchos mecanismos de interferencia y no es posible separar muchos de estos mecanismos debido a que ellos actúan secuencial y/o simultáneamente, e identificar a uno solo como el origen del comportamiento observado puede ser inconsecuente (Harborne, 1977; citado por Inderjit et al., 1999). De acuerdo a Muller (1969), citado por Rice (1974), el término interferencia puede ser usado para referirse al total de los efectos deletéreos de una planta sobre otra, abarcando así competencia, alelopatía y facilitación. Los intermediarios involucrados en la competición y la facilitación son los recursos del hábitat y los enemigos naturales, respectivamente. En la alelopatía, sin embargo, el medio de interferencia es aleloquímico (Sampietro, 2001). En forma específica, muchas especies en las comunidades bióticas se regulan unas a otras tan sólo por medio de la producción y liberación de repelentes, atrayentes, estimulantes e inhibidores químicos. Precisamente la Alelopatía es la ciencia que se ocupa de tales interacciones químicas entre: planta – vertebrado, planta – planta, planta – insecto y planta – microorganismo, ya sean éstas perjudiciales o benéficas (Putnam y Tang, 1986). Desafortunadamente muchos biólogos consideran a la alelopatía como parte de la competencia o, peor aún, están completamente ajenos a la existencia del fenómeno de la alelopatía (Inderjit et al., 1999). Prácticamente ninguno de los artículos leídos, los cuales proponen demostrar algunos aspectos de la competencia, ha virtualmente separado de alguna forma la alelopatía como una posible causa de los resultados observados (Inderjit y Del Moral, 1997).

5 3.2. Significado de Alelopatía Varios investigadores en forma reciente han usado el término alelopatía para referirse a los efectos deletéreos que una planta superior ejerce sobre otra planta (plaga o enfermedad) a través de la producción de fitoquímicos que escapan hacia el medio ambiente (Inderjit y Dakshini, 1995; Inderjit et al., 2001; Szabo y Wittenmayer, 2000). Molosch (1937), citado por Rice (1974), acuño el término para referirse a interacciones bioquímicas entre todo tipo de plantas, incluidos los microorganismos. Estos últimos eran contemplados dentro de estos efectos debido a que en esos años (fines década del 30´) se incluía a los microorganismos dentro del reino vegetal (Sampietro, 2001). La discusión general indicaba que el significado del término cubre interacciones bioquímicas recíprocas, tanto benéficas como detrimentales; sin embargo, se deriva de dos palabras griegas que significan “daño mutuo” (Putnam y Tang, 1986; Rice, 1964). El término alelopatía debiera incluir cualquier efecto dañino directo o indirecto de una planta (incluidos microorganismos) sobre otra, a través de la producción de compuestos químicos que escapan al medio ambiente como agentes alelopáticos (Inderjit et al., 1999; Putnam y Tang, 1986). El efecto alelopático de una planta sobre otro organismo no es benéfico o dañino del todo. Los efectos de estos productos naturales son múltiples, ya que van desde la alteración o estimulación del crecimiento de plantas vecinas, hasta la inhibición de la germinación de semillas, o bien evitan la acción de herbívoros, así como los efectos dañinos de bacterias, hongos y posiblemente virus (Díaz et al., 1985). También pueden ser compuestos que actúan como señales o como mensajeros de disuasión, produciendo efectos repulsivos, antialimentarios, tóxicos, alteradores de la fisiología, etc. (Femenia et al., 1995; Fiorino y Mattii, 1992). Dichas relaciones se hacen especialmente importantes a medida que las plantas adultas sintetizan compuestos, esencias y aromas característicos. Algunas plantas segregan sustancias tóxicas, que no les permiten ser cultivadas en asociación (Durán, 1976; Fiorino y Mattii, 1992; Kingsbury, 1974; Oh y Carlson, 1976). Una variedad de compuestos producidos o absorbidos por las plantas pueden causar reacciones tóxicas cuando son adquiridos por la especie receptora. Los principios naturales tóxicos reconocidos comúnmente incluyen: alcaloides, polipéptidos, aminas, flavonoides, compuestos fenólicos, glicósidos y glucósidos cianogénicos, sustancias goitrogénicas, aceites

6 irritantes, glicósidos cumáricos, glicósidos esteroides y terpenoides, glicósidos cardiacos, saponinas, oxalatos, resinas o resinoides, fitotóxinas (toxalbúminas), tóxinas minerales, cobre, cadmio, flúor, manganeso, nitrógeno, nitritos, nitratos, óxidos gaseosos del nitrógeno, selenio, molibdeno, compuestos que causan fotosensibilidad, sensibilización hepatogénica, etc. (Figura 3.1) (Inderjit et al., 1999; Kingsbury, 1964).

3.3. Otros compuestos con acción alelopática en frutales Como se indicó anteriormente, son muchas las sustancias químicas involucradas en los mecanismos alelopáticos vegetales. A pesar de ello, es relevante dar a conocer algunos de los más importantes agentes de interferencia pertenecientes a las especies frutales de mayor reconocimiento comercial. Al respecto está bien documentada la presencia y función de monofenoles en cultivos comerciales. Por ejemplo Lavee et al. (1994), citados por Inderjit et al. (1999), encontraron que el crecimiento de callos de olivo es promovido por el ácido cianhídrico, resultante del catabolismo de ciertos monofenoles presentes en el frutal. También fue demostrado que la propelargonina dimérica y su derivado afzelequina presentes en duraznero, podrían ser responsables por la restricción del crecimiento de raíces. Este efecto negativo de la secreción de propelargonina, la cual es un monofenol, puede contribuir al problema de replante en duraznero (Oigáis et al., 1982; citado por Inderjit et al., 1999). Las procianidinas, un grupo de difenoles, fueron identificadas como componentes promotores del crecimiento (Shantz y Steward, 1955, citado por Inderjit et al., 1999); por ejemplo, la catequina fue capaz de estimular el crecimiento de callos sobre dos veces los valores del control en cultivos frutales: Prunus avium, Prunus domestica, Prunus cerasus y Vitis vinifera, etc. (Feucht y Treutter, 1995; Feucht et al., 1993, 1996a; citados por Inderjit et al., 1999). Borner (1959), citado por Rice (1974), realizó una serie de investigaciones conducentes a evaluar los efectos de residuos de raíces de manzano sobre el crecimiento de plántulas jóvenes de la misma especie e identificar las toxinas involucradas. Estudios preliminares indicaron que eran compuestos fenólicos los que estaban presentes y fueron los siguientes: florizina, floretina, floroglucinol y los ácidos p – hidroxibenzoico y p –

7 hidroxicinámico. Concluyó que sólo el primer compuesto, la florizina se halla naturalmente en raíces sanas de manzano, mientras que los otros se originan tras actividad microbiológica y en su conjunto generan problemas alelopáticos en plántulas (Kogan, 1988). Por otro lado, en la mayoría de las especies de Citrus, el amargor está adscrito principalmente a la presencia de limonoides (triterpenos) y glicósidos flavanonas (flavonoides), llamados limonina y naringina, respectivamente (María et al., 1998). Particularmente, el jugo de limón se caracteriza por un alto contenido (130 µg /ml) de hesperidina y eriocitrina, principales glicósidos flavonoides presentes, mientras otros menores componentes son flavanonas y C – glicosilflavonas. Los glicósidos flavonoides se aglutinan mayormente en la piel y en las estructuras sólidas de la fruta, donde la hesperidina está presente en concentraciones tres veces más altas que las de eriocitrina. No obstante en los contenidos líquidos, la eriocitrina es el principal flavonoide (Coll et al,. 1998). A este

conjunto de compuestos se les asocian diversas características alelopáticas (Rice, 1974). Gur (1957), citado por Hartmann y Kester (1980), investigó combinaciones incompatibles de algunas variedades de peral sobre portainjertos de membrillero, y determinó que cuando determinadas variedades de peral son injertadas sobre membrillero, de éste último se transporta prunasina al floema del peral y los tejidos de este la descomponen en la región del injerto. El grado de incompatibilidad entre peral y membrillero es

proporcional a la actividad de las â – glucosidasas en los tejidos del peral, siendo esta actividad un excelente indicador del grado de incompatibilidad (Gur et al., 1968; citado por Hartmann y Kester, 1980). Además diversas variedades de peral presentan un inhibidor de la enzima â – glucosidasa y difieren en el contenido de ese inhibidor. Esto puede explicar porqué ciertas variedades son compatibles y otras no sobre portainjertos de membrillero (Gur et al., 1968; citado por Hartmann y Kester, 1980). Por último, el ácido cianhídrico, desprendido de tal hidrólisis, lleva a la falta de actividad cambial e induce necrosis en la interfase celular en la región de unión del injerto, resultando en marcadas alteraciones en el floema y xilema de esa región del injerto (Hartmann y Kester, 1980).

8 3.4. Cianogénesis La cianogénesis es el mecanismo biológico de producción del inhibidor respiratorio HCN, y es sólo uno de los muchos sistemas químicos de defensa usados por las plantas superiores contra herbívoros. Reconocida en millares de especies, este fenómeno ha causado numerosos casos de severo y crónico envenenamiento por cianuro (radical CN–, proveniente de la disociación de HCN) tanto al medioambiente como a plantas y animales, incluyendo al hombre (Ormeño y Pérez, 1993; Poulton, 1990; Santamour Jr., 1998). Esta habilidad de las plantas y otros organismos vivos de eliminar ácido cianhídrico, es conocida desde hace siglos. Desde su primera descripción en plantas en 1803, el fenómeno de la cianogénesis se reconoce en más de 3000 especies de plantas superiores distribuidas a través de 110 diferentes familias de helechos, gimnospermas y angiospermas (monocotiledóneas y dicotiledóneas). Sin embargo, sólo en aproximadamente 300 especies de plantas ha sido identificada la fuente de HCN (Frehner et al., 1990; Jones, 1988; Laurens, 2000; Zheng y Poulton, 1995). La cianogénesis es también conocida en animales, pero se restringe a los artrópodos, notablemente a ciertos centípedos, milípedos e insectos (Poulton, 1990). En hongos y bacterias, el HCN puede originarse por descarboxilación oxidativa de la glicina (Hulme, 1970; Stumpf y Conn, 1980). Los glicósidos que generan ácido cianhídrico (HCN) bajo hidrólisis son llamados cianogénicos o cianofóricos (Selmar et al., 1988). En ciertas semillas de Sapind aceas, el HCN puede desprenderse de la hidrólisis de cianolípidos, pero más frecuentemente, la producción de HCN en las plantas superiores resulta del catabolismo de glucósidos cianogénicos, ya que cuando los tejidos se dañan, estos son degradados a HCN por la acción de enzimas endógenas que quedan expuestas (Selmar et al., 1988). Los aproximadamente 75 cianoglicósidos documentados hasta hoy, son todos derivados O – â – glicosídicos de á – hidroxinitrilos (Laurens, 2000; Swain et al., 1992a). La cianogénesis no es exclusiva de las especies de plantas que acumulan cianolípidos y cianoglicósidos. Todas las plantas superiores probablemente forman niveles, aunque bajos, de HCN como un subproducto de la biosíntesis de etileno. Esto podría explicar el porque las plantas no cianogénicas contienen niveles significativos de la enzima detoxificante de cianuro, â – cianoalanina sintasa (Yip y Yang, 1998).

9 Entre los tejidos vegetales más altamente cianogénicos conocidos están las semillas de las rosáceas de carozo (Poulton, 1983; citado por Swain et al., 1992b). Varias especies de Prunus han sido demostradas como productoras de niveles peligrosos de glucósidos cianogénicos en hojas y carozos. Las especies de este género incluyen damasco, almendro amargo, ciruelo, duraznero, y varios cerezos cultivados y silvestres (Gómez et al., 1998; Kingsbury, 1964; Szabo y Wittenmayer, 2000). Los glucósidos cianogénicos en varias de ellas son la Amigdalina y la Prunasina. Mientras que la Prulaurasina, otro glucósido cianogénico relacionado cercanamente a la amigdalina, ha sido detectado preferentemente en P. laurocerasus y P. serotina (especies de cerezo silvestres) (Dicenta et al., 2002; Laurens, 2000; Santamour Jr., 1998). Una visión general de las especies cianogénicas, es que requieren de un daño o una infección en sus tejidos para iniciar un catabolismo de gran escala de estos glucósidos a HCN, glucosa y benzaldehído. Por el contrario, se acepta que plantas sin lesiones escapan de una cianogénesis espontánea por medio de una compartamentalización crítica a nivel de tejidos y subcelular de los cianoglucósidos y sus enzimas catabólicas (Kojima et al., 1979; Pancoro y Hughes, 1992; Poulton, 1988; citados por Swain et al., 1994). Las investigaciones futuras debieran considerar el hecho de que no sólo el HCN, sino que los cianoglucósidos por sí mismos y otros productos de degradación (por ejemplo, compuestos carboxílicos y cianoalanina) pueden actuar también como aleloquímicos activos (Jones, 1988; Nahrstedt, 1985).

3.5. Glucósidos cianogénicos Los glucósidos son á – hidroxinitrilos â – glicosilados que generan, cuando son hidrolizados in vitro por ácidos minerales diluidos o in vivo por enzimas, uno o más azúcares y uno o más de otros compuestos (agliconas). En muchos taxa, el HCN proviene del catabolismo de cianoglicósidos por parte de â – glucosidasas y á – hidroxinitrilo liasas, que son enzimas específicas de degradación para el compuesto particular (Kingsbury, 1964). El término glucósido ha sido usado frecuentemente como sinónimo de glicósido, y esta práctica continúa. Un uso crítico, reserva el término glucósido para ese tipo particular de glicósido en el cual el azúcar componente es la glucosa (Hulme, 1970). Los azúcares glicósidos incluyen un amplio número de pentosas y hexosas; la glucosa es encontrada

10 frecuentemente. Los glicósidos purificados son usualmente amargos, sin color y sólidos cristalinos. Muchos no son tóxicos (por ejemplo, varios de los pigmentos no fotosintéticos comunes en vegetales) (Kingsbury, 1964; Laurens, 2000; Stumpf y Conn, 1980). La toxicidad es una función del componente aglicona, o de parte de él. Una gran variedad de compuestos sirven como agliconas en los glicósidos. Los glicósidos tóxicos incluyen glicósidos cianogénicos, sustancias goitrogénicas, aceites irritantes, glicósidos cumarilados, y glicósidos esteroides (cardiacos y saponificados) (Kingsbury, 1964; Sampietro, 2001). Algunos CGs son más conocidos que otros porque las especies vegetales (grupos) que los poseen tienen mayor importancia práctica. Además varias plantas económicamente importantes son altamente cianogénicas (la linamarina en Manihot esculenta, Linum usitatissimum y Trifolium repens, durrina en especies de sorgo, amigdalina en rosáceas, lotaustralina en Lotus corniculatus, etc.) (Vetter, 2000). La linamarina y la lotaustralina, las que tienen una distribución relativamente amplia en el reino vegetal, han sido demostradas en las siguientes familias de plantas: Compositae, Euphorbiaceae, Linaceae, Papaveraceae y Fabaceae (Leguminosae). Una representación similarmente vasta ha sido observada para la prunasina en seis familias (Polypodiaceae, Myrtaceae, Rosaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae y Myoporaceae). La sambunigrina, la vicianina y la amigdalina, las cuales se relacionan cercanamente con la prunasina, han sido encontradas en tres (Caprifoliaceae, Mimosaceae, Oleaceae), en dos (Polypodiaceae, Fabaceae), y sólo en una (Rosaceae) familias, respectivamente. La conducta más común de distribución es que un compuesto cianogénico particular aparecerá a lo menos en una o dos familias y tienen o pueden tener un carácter quimiotaxonómico. La mayoría de estas familias pertenecen a las Angiospermatophytas, pero hay algunas excepciones (Vetter, 2000). Como se indicaba previamente, las especies de Prunus explotadas comercialmente poseen cantidades variables de glucósidos cianogénicos en sus distintos órganos. Estos corresponden principalmente a amigdalina (D (–) – mandelonitrilo – gentibiósido, un diglucósido), prunasina (D (–) – mandelonitrilo – glucósido, un monoglucósido), y en algunos casos, prulaurasina (D – mandelonitrilo – D – glucósido, un monoglucósido) (Laurens, 2000).

11 3.6. Biosíntesis, catabolismo y transporte de CGs

3.6.1. Biosíntesis Los precursores de la aglicona (mandelonitrilo en Rosaceas) en los cianoglucósidos, según se ha demostrado, son aminoácidos donde los átomos de carbono á y â, y el átomo de N se mantienen intactos (Hulme, 1970). Hay ahora evidencia de que los pasos son como sigue:

á – aminoácido

aldoxima

nitrilo

á – hidroxinitrilo

El último compuesto mencionado es entonces glucosilado con UDP – D – glucosa. El esquema sugerido para la formación de la amigdalina, la cual requiere una segunda molécula de UDP – D – glucosa, se expone en la Figura 3.2 y Figura 3.3. En el caso particular de los glucósidos cianogénicos en Prunus, se ha postulado que la conversión de mandelonitrilo a prunasina y desde esta a amigdalina, es catalizada por dos enzimas secuenciales, la GT – I (mandelonitrilo glicosiltransferasa I) que interviene en el primer paso y la GT – II (prunasina glicosiltransferasa II), que lo hace en el segundo (Figura 3.5) (Swain y Poulton, 1994). Dependiendo de su aminoácido precursor, los glucósidos cianogénicos en la naturaleza pueden ser aromáticos, alifáticos o ciclopentenoides. Muchos son monosacáridos cianogénicos (por ejemplo, (R) – prunasina), en los cuales el inestable radical cianuro es neutralizado por unión glicosídica a un residuo simple de azúcar. Alternativamente, en los disacáridos

cianogénicos (por ejemplo, (R) – amigdalina, (R) – vicianina, y linustatina) o trisacáridos (por ejemplo, xeratina), dos o tres radicales azúcar, respectivamente, están involucrados en tal estabilización (Poulton, 1990). Muchos cianoglicósidos se derivan de cinco aminoácidos hidrofóbicos: tirosina, fenilalanina, valina, leucina e isoleucina. Los ciclopentenoides cianógenos se originan presumiblemente de la ciclopentenilglicina. Ha sido confirmada una vía biosintética propuesta sobre la base de experimentos in vivo con sistemas de células libres. La naturaleza altamente interconectada de esa vía de intermediarios explica la falla de estudios previos para detectarlas. El paso final en la biosíntesis de glicósidos es la glicosilación de á hidroxinitrilos por O – glicosiltransferasas solubles (Poulton, 1990). –

12 En el caso particular de los glucósidos cianogénicos, amigdalina y prunasina, su biosíntesis se deriva del aminoácido aromático Fenilalanina a través de una hidrólisis enzimática secuencial, como se establece en la Figura 3.3. No obstante, no se ha documentado particularmente la biosíntesis de CGs en Prunus, el estudio más elaborado sobre esta se enfoca en la acumulación de durrina en plántulas de sorgo. La distribución de la durrina y su síntesis en la porción superior de los brotes, muestra que los sitios de producción y almacenamiento están localizados dentro de las mismas células (Poulton, 1990). La medición de la utilización de tirosina (precursor de dur rina), del consumo de O2 y de la oxidación de NADPH, revela que son tres los pasos de hidroxilación que requieren O2 están involucrados en la conversión in vitro de tirosina a p – hidroximandelonitrilo (precursor de cianoglicósidos). Luego, fue identificado que una monooxigenasa cataliza la N – hidroxilación de tirosina y la conversión de p – hidroxifenilacetonitrilo a p – hidroximandelonitrilo. Ambas enzimas requieren NADPH y O2 , pero sólo la última reacción es dependiente del Citocromo P450. La naturaleza del tercer paso de hidroxilación permanece desconocida (Poulton, 1990).

3.6.2. Catabolismo Reconocidas largamente como de gran cianogénesis, las semillas de las especies de Prunus (Rosaceae) son magníficos recursos del diglucósido cianogénico (R) – amigdalina y sus enzimas catabólicas (Gleadow, 2002). En semillas maceradas de cerezo negro (Prunus serotina), tres glicoproteínas cooperan en la cianogénesis (Poulton, 1993). La AH (Amigdalina Hidrolasa) divide el enlace glicosídico â (1 6) de la amigdalina, generando el monoglucósido (R) – prunasina, la cual es más tarde

hidrolizada a (R) – mandelonitrilo por la PH (Prunasina Hidrolasa). La disociación del mandelonitrilo, a benzaldehído, glucosa y HCN, puede proceder no enzimáticamente, pero esta reacción es acelerada enormemente por la MDL (Mandelonitrilo Liasa), la cual constituye aproximadamente 10% de la proteína soluble de las semillas de cerezo negro (Swain et al, 1992a).

13 En tejidos bajo daño, estas reacciones ocurren rápida y secuencialmente debido a la puesta en contacto de las enzimas y metabolitos (Poulton, 1993; citado por Swain et al., 1992b). Se ha descrito ampliamente en la literatura la acumulación del diglucósido cianogénico amigdalina en semillas en desarrollo de cerezo negro (Swain et al. 1992a). Tras esos estudios, el éxito radicó en confirmar que la amigdalina es catabolizada con la germinación, para proveer el desarrollo de plántulas con nitrógeno reducido y compuestos carbonados. La dramática declinación observada en los niveles de amigdalina desde temprano en el desarrollo de plántulas, sustenta esta afirmación. Además, en forma similar a la movilización de cianoglucósidos y cianolípidos en plántulas en germinación de H. brasiliensis y Ungnadia speciosa, respectivamente, este evento ocurre sin pérdida de HCN a la atmósfera (Selmar et al., 1988, 1990). Un mecanismo alternativo para la degradación de la amigdalina, que ha sido hipotetizado recientemente, es su hidrólisis a mandelonitrilo y â – gentibiosa por una supuesta amigdalina diglucosidasa (Figura 3.5). Sin embargo, esta ruta catabólica fue excluida luego de numerosos intentos fallidos por demostrar la presencia de esta enzima en extractos de órganos de plántulas (Selmar et al., 1988). El catabolismo de la amigdalina a HCN, benzaldehído y glucosa durante el desarrollo normal de plántulas podría demandar algún mecanismo de detoxificación de HCN dentro de la planta. Muchas plantas son capaces de asimilar niveles extremadamente bajos de HCN, producidos durante la biosíntesis de etileno, usando â – CAS (â – cianoalanina sintasa). Esta enzima cataliza la reacción entre HCN y L – cisteína para formar cianoalanina y H S. En 2 forma consistente con la observación de que las plantas cianogénicas en general tienen niveles significativamente más altos de â – CAS que las especies que no lo son, las plántulas en desarrollo de P. serotina exhiben enorme actividad de â – CAS. Más aún, la excelente correlación entre los cursos temporales de los niveles de PH y â – CAS sugieren que la enzima más tarde juega un rol significativo en la detoxificación del HCN derivado de la degradación de cianoglucósidos. Es interesante notar que L – asparragina, la cual es derivada de la hidrólisis de â – cianoalanina con ayuda de la enzima â – CAH (â – cianoalanina hidrolasa), es una forma de transporte mayor de nitrógeno en determinadas especies de rosáceas (Figura 3.4 y Figura 3.5) (Selmar et al., 1988).

14 3.6.3. Transporte Selmar et al. (1988) propusieron en casava (Hevea brasiliensis) que la linamarina es transportada vía apoplasto desde el endosperma de semillas a los tejidos jóvenes de plántulas en crecimiento para posterior catabolismo, esto debido a que los más altos niveles de la enzima detoxificante de cianuro, â – cianoalanina sintasa, se hallan en dichos tejidos. Lo lábil de estos glicósidos a la linamarasa apoplástica e intracelular, hace imperioso a la planta contar con un transporte protegido que los haga resistentes a linamarasa hasta llegar a su destino. Un candidato conveniente podría ser el disacárido linustatina, derivado de linamarina por glicosilación. Moviéndose seguramente vía apoplasto y sistema vascular a sus tejidos blanco, la linustatina podría ser degradada allí a HCN, por una disacaridasa distinta. La detoxificación del HCN como asparragina por la â – cianoalanina sintasa podría permitir a este nitrógeno reinsertarse en los pools metabólicos generales. La movilización y utilización de linamarina en otras especies cianogénicas, vía el denominado “mecanismo metabólico de linustatina”, está aún bajo investigación (Mkpong et al., 1990; Selmar et al., 1988). Como la linustatina, el radical azúcar en la amigdalina de los Prunus es la gentibiosa. La amigdalina puede ser considerada como una prunasina glucosidada. Esta es almacenada en frutos de variedades amargas de almendro y damasco, durazneros, ciruelos y cerezos cultivados y silvestres, mientras que su correspondiente monoglucósido prunasina es observado en las hojas (Selmar et al., 1988). A primera vista, este almacenaje de diglusidasas en semillas es una contradicción al “esquema de transporte de diglucósidos”. Sin embargo, puede ser notado que los órganos de almacenaje en almendros y damascos son los cotiledones, no el endosperma (Femenia et al., 1995; Dicenta et al., 2002). En las plantas el endosperma es el tejido de almacenamiento primario, mientras que los cotiledones órganos de almacenamiento derivados secundarios. De este modo, la ocurrencia del diglucósido amigdalina en los cotiledones, que funcionan como órganos de almacenamiento, es totalmente consistente con la existencia de un proceso de modificación de monoglucósidos cianogénicos en esas plantas que contienen amigdalina y prunasina, respectivamente. Análogo a la vía de la linustatina encontrada en Hevea, en estas plantas el monoglucósido prunasina puede ser sintetizado en el endosperma en desarrollo. Por su

15 transporte apoplástico a los cotiledones y su “intermediario de almacenamiento” prunasina puede ser transformado a amigdalina (Selmar et al., 1988).

3.7. Comportamiento de los CGs a través del desarrollo vegetal

3.7.1. Conducta en plántulas en desarrollo En un ensayo particular se monitoreó el desarrollo del potencial de cianogénesis en frutos maduros de cerezo negro (Prunus serotina) (Swain et al., 1992a). Los niveles de amigdalina, su correspondiente monoglucósido (R) – prunasina, y las enzimas AH (amigdalina hidrolasa), PH (Prunasina hidrolasa), y MDL (Mandelonitrilo liasa), fueron determinados desde plena floración hasta la madurez. En la madurez, cada semilla contiene aproximadamente 3 µmol de amigdalina (Poulton y Li, 1994). Para facilitar el análisis bioquímico, el desarrollo de las plántulas fue arbitrariamente dividido en cuatro etapas basadas en el siguiente criterio, como lo indica Swain y Poulton (1994): “etapa 1, semillas maduras con endocarpio intacto post almacenaje; etapa 2, semillas maduras cuyo endocarpio se partió debido a una imbibición en agua destilada al aire por uno a dos días; etapa 3, plántulas aproximadamente una semana después de la imbibición de las semillas, en las cuales el hipocotilo (la radícula), pero no el epicotilo, ha emergido desde la semilla y tiene aproximadamente dos cms de altura (cotiledones amarillos); etapa 4, plántulas aproximadamente dos semanas después de la imbibición de las semillas, cuyos epicotilos han emergido y el primer par de hojas verdaderas se ha expandido (presenta cotiledones verdes)”. Las semillas de cerezo negro, no germinadas pero hidratadas, contienen aproximadamente 3,2 µmol de amigdalina por semilla, pero el monoglucósido prunasina se presenta en muy menor concentración (Swain y Poulton, 1994). Durante la germinación los niveles de amigdalina declinaron ampliamente, y hacia la etapa 4, fueron sólo 5 a 25 % de los que se observan en semillas no germinadas. Nunca el potencial cianogénico de las plántulas germinadas permanece constante durante el periodo completo, porque depende de la aparición progresiva de prunasina en los cotiledones, epicotilos, y, con una menor extensión, en hipocotilos (Zheng y Poulton, 1995) (Figura 3.6). En teoría, la declinación observada en los niveles de amigdalina podría resultar de la actividad de AH y/o de una supuesta enzima amigdalina glucosidasa (Selmar et al., 1988).

16 Para evaluar esa posibilidad, los niveles de AH, tanto como las de PH y MDL, fueron determinadas al inicio del desarrollo de las plántulas. Los niveles cotiledonares de AH y PH decrecen durante este periodo y hacia la etapa 4 correspondieron a aproximadamente 30% y 20% de los niveles observados en semillas no germinadas, respectivamente (Poulton y Li, 1994; Zhou et al., 2002). Sin embargo, dada la baja concentración de MDL libre y su gran acumulación en cuerpos proteicos, es que se sospecha que MDL juega un rol adicional como proteína de almacenaje, esperando a ser movilizada durante la germinación (Swain et al., 1992b). Sin embargo, esta movilización ocurre aparentemente después del periodo de medición, y desde aquí los niveles de MDL cotiledonares (distintos a los niveles de AH y PH) permanecen esencialmente sin cambios a través de las etapas 1 a 4. La particular conducta mostrada por la MDL podría reflejar restricciones adicionales impuestas sobre esta enzima dada su multifuncionalidad. No obstante, las preparaciones de epicotilos e hipocotilos exhiben actividad de PH y MDL, denotando que ellas inhiben la actividad de la AH (Swain y Poulton, 1994). La posibilidad de que la MDL exista verdaderamente en tejidos axilares, como la forma proteica de mayor masa molecular, está bajo investigación. A pesar de repetidos esfuerzos, una amigdalina diglucosidasa capaz de hidrolizar amigdalina a mandelonitrilo y â – gentibiosa, no fue detectada en los ensayos de homogenizados de órganos de plántulas, en distintos estados de desarrollo (Figuras 3.5, 3.6 y 3.7) (Zheng y Poulton, 1995). A primera vista, la explicación más simple para la aparición de prunasina dentro de los cotiledones, epicotilos e hipocotilos durante las etapas 3 a 4 es la hidrólisis de la amigdalina a prunasina, mediada por la AH dentro de los cotiledones. Este monoglucósido podría secuencialmente sufrir traslocación a los puntos de crecimiento. La amigdalina es restringida a la base de células parenquimáticas de los cotiledones, mientras que AH y PH son enzimas procambiales (Poulton y Li, 1994). Finalmente es probable que exista un degradación completa a HCN por parte de las enzimas del procambium la cual ocurre concomitantemente con la biosíntesis de novo de la prunasina desde L – Phe, lo cual fue comprobado paralelamente (Figura 3.5) (Swain y Poulton, 1994).

17 3.7.2. Conducta durante el crecimiento de frutos Se analizaron los cambios bioquímicos relativos a la cianogénesis durante la maduración en el árbol de frutos de cerezo negro (Swain et al., 1992a, b; Swain y Poulton, 1994). Fue demostrado que, en forma análoga al desarrollo del cotiledón en la fase II, las semillas continúan acumulando amigdalina y las enzimas catabólicas AH, PH y MDL, y desde este periodo en adelante, se hacen altamente cianogénicas cuando son dañadas (Swain et al., 1992a, b; Swain y Poulton, 1994). En contraste, el pericarpio (exocarpio, mesocarpio y endocarpio) permanece acianogénico a través del proceso de maduración porque carece de enzimas catabólicas. Considerando que el mesocarpio en frutos de rosáceas de carozo (por ejemplo ciruelo japonés, duraznero, cerezo) es acianogénico, son sólo sus semillas las responsabilizadas por el alto suministro de cianuro (Figura 3.8) (Putnam y Tang, 1986). Del mismo modo, se propuso examinar la expresión temporal de los transcriptos AH1 y MDL1 (que biosintetizan las enzimas correspondientes) en frutos maduros y para ello se analizó el RNA total al aislarlo en intervalos semanales desde semillas maduras (29 – 82 DDPF). El mRNA fue detectable durante la fase I de la madurez de frutos. Sin embargo, sólo cuando el embrión fue visible a ojo desnudo al inicio de la fase II (40 DDPF), ambos transcriptos llegaron a ser evidenciables, incrementándose hasta alcanzar un máximo aproximadamente 49 DDPF. Como consecuencia, los niveles de transcriptos disminuyeron y fueron indetectables en frutos en plena madurez (82 DDPF). Pudo notarse que los mRNAs de AH1 y MDL1, detectados por las pruebas, fueron aproximadamente de 1,8 y 1,9 KDa de largo, respectivamente (Zheng y Poulton, 1995). Los niveles de proteínas enzimáticas AH y MDL también fueron medidos durante la madurez de los frutos. Se encontró que la actividad no era detectable sino hasta 44 DDPF. Ellas se incrementaron entonces rápidamente durante la mitad de la fase II, alcanzando esencialmente un nivel cercano al 100% hacia la plena madurez (82 DDPF). Comparando los respectivos comportamientos temporales de acumulación de mRNA y proteínas durante la maduración del fruto, se sugiere que la expresión de AH y MDL puede ser regulada a nivel transcripcional (Zheng y Poulton, 1995) (Figura 3.9).

18 3.8. Distribución de enzimas catabolizantes de CGs Se asume generalmente que los glicósidos y sus enzimas catabólicas están separadas en una planta intacta por compartamentalización a nivel de tejido y subcelular, de modo de evitar cianogénesis espontánea (Poulton, 1990). En un trabajo particular con casava los autores demostraron que el sustrato y sus enzimas catabólicas se localizaban dentro de diferentes tejidos (Swain y Poulton, 1994). Estudios recientes involucran a un amplio rango de especies de plantas y órganos cianofóricos, pero no se ha revelado todavía una estrategia de compartamentalización común (Frehner et al., 1990; Mkpong et al., 1990; Poulton, 1990). En casava se comprobó, a través de una sección transversal completa de la raíz, que las células poseen ambos cianógenos linamarina y linamarasa. Pero los mayores niveles de glicósidos también son encontrados en las capas celulares más externas, por ello de nuevo se postula el protagonismo de los cianógenos en la defensa contra herbívoros o patógenos (Selmar et al., 1988). En forma reciente, se hizo experimentos de aislamiento de protoplastos e infiltración de tejidos de endosperma de Hevea que muestran que la linamarina y la hidroxinitrilo liasa eran intracelulares, pero que la linamarasa era intra y extracelular (Selmar et al., 1988). La distribución apoplástica de muchas linamarasas contrasta con la ubicación intracelular de la durrina del sorgo, un hecho quizás relacionado al carácter no glicoproteico de la última (Poulton, 1990; Vetter, 2000). Por otro lado, las tres enzimas catabólicas de cianoglucósidos en Prunus (AH, PH y MDL), las cuales hacen su aparición dentro de las semillas en desarrollo seis meses después de la floración, fueron localizadas a nivel subcelular y de tejido (Swain et al., 1992a). La AH y la PH son restringidas a cuerpos proteínicos del procambium, mientras que la MDL, se halla primariamente dentro de masas de proteínas pertenecientes a células del parénquima cotiledonar (Swain et al., 1992b). En forma posterior, se localizó amigdalina en las células parenquimáticas del cotiledón, lo que aclara que una cianogénesis previa en semillas intactas de cerezo negro y ciruelo europeo (Prunus domestica) es impedida por la separación de la AH y la amigdalina en diferentes tejidos (Poulton y Li, 1994). Esto último sería un claro antecedente de apoyo a la idea de compartamentalización en este género. La prunasina hasta el momento nunca ha sido detectada en semillas maduras, pero si durante el desarrollo del fruto, a diferencia de lo que ocurre con la amigdalina. Estudios bioquímicos revelan que esas enzimas catabólicas tienen intrincadas distribuciones a nivel de

19 tejido y celulares (Swain et al., 1992b). Las â – glicosidasas (AH y PH) están restringidas a cuerpos proteínicos de células procambiales específicas, que se ramifican a través del parénquima cotiledonar de almacenaje. En contraste, la MDL muestra más altos niveles dentro de cuerpos proteínicos de células del parénquima cotiledonar. Las tres enzimas se encuentran ausentes del tejido del endosperma y de la capa de la vaina del haz que rodea al procambium (Zheng y Poulton, 1995) (Figura 3.6 y 3.7). Es interesante que, no obstante la AH aparece dentro de muchas células procambiales, la PH es confinada a las capas periféricas de este tejido. En contraste, los más altos niveles de MDL son observados en cuerpos proteínicos de células parenquimáticas cotiledonares, y sólo una cantidad menor se halla en células del procambium (Zheng y Poulton, 1995). La capa de la vaina del haz que rodea al procambium y el endosperma aparentemente tiene menor concentración de las tres enzimas catabólicas. Como fue establecido previamente (Swain et al., 1992b), la ausencia de las enzimas hidrolíticas en la vaina del haz, y en células del parénquima cotiledonar y del endosperma, da a esos tejidos un atractivo particular como lugar de alojamiento de amigdalina (Figura 3.7) (Swain et al., 1992b). En ciruelo europeo se encontró que la AH y la PH poseen una distribución celular específica dentro del procambium. No se halló ninguna enzima en las células procambiales más pequeñas, debido a que por su falta de cuerpos proteínicos prominentes son consideradas más altamente diferenciadas. No obstante, la AH si se localizó en varias de las células procambiales remanentes, mientras que la PH apareció confinada a células periféricas de mayor tamaño. En conclusión, la AH y la PH en ciruelo exhiben distribuciones específicas en el tejido y en la célula que son idénticas a esas previamente descritas para las hidrolasas del cerezo (Swain et al., 1992b).

3.9. Aspectos genéticos (Control genético de CGs) Usai y D´hallewin (1976), citado por Mulas (1994), compararon el contenido de amigdalina de semillas de cultivares de almendro seleccionados, con los contenidos de prunasina en brotes o raíces de las plántulas de esos cultivares obtenidos por polinización abierta. Determinaron con ello que aún cuando los polinizantes no afectan el amargor de la semilla (Dicenta et al. 2002), las plántulas resultantes de la libre polinización de almendros amargos pueden ser dulces (Ss) o amargas (ss), dependiendo del polinizante. Genéticamente,

20 el almendro dulce heterocigoto (Ss), puede dar plántulas de variedad dulce (SS o Ss) o de variedad amarga (ss), tal como ocurre con el cultivar Texas ( s), utilizado por S D´hallewin (1976) en sus ensayos. Los resultados obtenidos al análisis de especies y variedades de almendro, indican que la producción de prunasina y amigdalina ocurre por diversos procesos. La prunasina está presente en las partes vegetativas de muchos genotipos de almendro, sin embargo sólo algunos genotipos son capaces de almacenarla en la semilla (Dicenta et al., 2000). Por ende, los individuos que se consideran de genotipo amargo, pueden ser aquellos que han sido tradicionalmente considerados homocigotos recesivos (ss), de este modo el sabor podría estar relacionado a la posibilidad de transformar la prunasina a amigdalina en la semilla (Dicenta et al., 2001). Frehner et al. (1990) observó la acumulación de amigdalina en frutos desarrollados de almendro, probablemente provenientes de prunasina, pero no encontró una enzima específica que hiciese tal conversión. Con ello, la concentración de prunasina en las partes vegetativas parece tener un origen poligénico, mientras que la presencia de amigdalina en las semillas es monogénica. Si el amargor de semilla fuese regulado por esta enzima, debido al genotipo recesivo (ss) de los individuos amargos, los genes regulatorios podrían estar involucrados en el control del amargor (Dicenta et al., 2002; Dicenta et al., 2000; Mulas, 1994). Usai y

3.10. Rol en los procesos fisiológicos de plantas La importancia fisiológica de los compuestos cianogénicos en el metabolismo de las plantas, está recibiendo hoy en día renovado interés. Como con otros productos secundarios, los cianógenos fueron vistos originalmente como sustancias de excreción (Robinson, 1930; citado por Poulton, 1990), pero su transformación (estacional e incluso diaria) argumenta fuertemente contra esta hipótesis. Dada la bien documentada toxicidad del HCN, se apela a su rol en la protección de plantas contra herbívoros, patógenos y competidores. Mucha evidencia, de hecho, favorece una función de defensa de los cianogénicos contra animales, incluyendo insectos (Jones, 1988; Nahrstedt, 1985). En adición a su conocido rol como aleloquímicos, hay considerable evidencia de que los cianoglicósidos y los cianolípidos podrían servir como formas de almacenaje alternativas para reducir el nitrógeno en las plantas (Selmar et al., 1988, 1990). La prunasina de este modo,

21 parece ser la forma de glucósido cianogénico transportada en la planta, mientras que la amigdalina es empleada para almacenaje, tal como fue sugerido por Frehner et al. (1990). En vista de su amplia distribución en las plantas, se plantea la pregunta de si los cianoglucósidos podrían jugar un rol primario no sólo en plantas no infectadas o sin daño. Experimentos recientes nuevamente han abrasado la posibilidad de que los glucósidos cianogé nicos y los cianolípidos podrían servir como compuestos almacenadores de nitrógeno (Selmar et al., 1988, 1990). Los cianolípidos pueden funcionar como compuestos de almacenaje para reducir el nitrógeno, sin embargo se demostró durante el desarrollo de plántulas de Ungnadia speciosa (Sapindaceae) que los cianolípidos son completamente metabolizados, sin liberación de HCN a la atmósfera. Paralelamente, son sintetizados los glucósidos cianogénicos, pero sólo alcanzan niveles iguales a un cuarto del contenido de cianolípidos originales (Selmar et al., 1990).

3.10.1. Ruta metabólica del cianuro en la síntesis de asparragina. La incorporación de cianuro[14 C] en la asparragina fue demostrada por primera vez en plantas por Blumenthal – Goldschmidt et al. (1963) y Tschiersch (1963), citados por Hulme (1970), pero este resultado ha sido confirmado en un gran número de trabajos (Blumenthal et al., 1968; Floss et al., 1965; Fowden y Bell, 1965; Lees et al., 1968; Lever y Butler, 1971; Ressler et al., 1969; Oaks y Johnson, 1973; Streeter, 1973; citados por Hulme, 1970); además la vía también opera en bacterias y hongos. Se demostró que los iones cianuro forman el carbón de la amida en la asparragina, e inicialmente se pensaba que el fragmento C3 era suplementado por cisteína o serina, pero evidencia más reciente sugiere que la cisteína es el mayor precursor (Poulton, 1990; Seigler, 1996). La L – â – cianoalanina es el primer precursor formado después de la incorporación de cianuro y en muchas plantas el aminoácido es hidrolizado a asparragina (Peiser et al., 1984). Por mucho tiempo, la vía biosintética del cianuro fue considerada una ruta única de formación de asparragina en plantas. Sin embargo, la mayor desventaja de la hipótesis es la falta de una producción adecuada de cianuro en la mayoría de las especies vegetales. Oaks y Johnson (1972), citado por Stumpf y Conn (1980), demostraron que la císteina no actuaba como precursor en ausencia de cianuro, pero tras la adición de 10-6 M de KCN hubo rápida incorporación a asparragina. Confirmando lo anterior, se descubrió que en Acacia georginae

22 había una enzima que convertía cisteína a piruvato, pero en la presencia de cianuro se forma L – â – cianoalanina (Millar y Conn, 1980). La mayor fuente de cianuro proviene de la hidrólisis de los glicósidos cianogénicos, pero éstos sólo se forman en un número limitado de plantas (Swain et al., 1992a, b). En conclusión, existe poca duda de que el cianuro pueda ser convertido a asparragina, y ello puede asumirse como un mecanismo evolucionado de defensa para prevenir la acumulación de cianuro, incluso en muy bajas concentraciones. Si la ubicación de la L – â – cianoalanina sintasa en la mitocondria es correcta, entonces se refuerza la idea de un mecanismo de protección a la sensibilidad de la cadena transportadora de electrones (Yip y Yang, 1998).

3.10.2. Metabolismo del cianuro en plantas Debido a que no se ha encontrado HCN libre, incluso en tejidos de plantas que producen etileno en muy altas proporciones, Peiser et al. (1984) sugirieron que las plantas deben tener amplia capacidad para metabolizar el HCN que se origina del ACC. En plantas superiores la enzima clave para detoxificar HCN es la L – â – cianoalanina sintasa que cataliza la siguiente reacción:

HS-CH2-CH(NH2)-COOH + HCN
(L – cisteína)

NC-CH2-CH(NH2)-COOH + H2S
(L –

â – cianoalanina)

La L – â – cianoalanina sintasa está extensamente distribuida en las plantas superiores. Esta enzima puede ser inhibida por ácido 2 – amino oxiacético (AOA) o ácido 3-amino oxipropiónico (Miller y Conn, 1980). La L – â – cianoalanina formada es posteriormente metabolizada a asparragina o a ã – glutamil – L – â – cianoalanina (Peiser et al., 1984; Pirrung, 1985).

3.10.3. El cianuro como subproducto de la biosíntesis del etileno La biosíntesis del etileno en las plantas superiores se lleva a cabo a través de la ruta metabólica mostrada a continuación:

Metionina (ACC) C 2 H4

S -Adenosilmetionina

ácido 1 -Aminociclopropano-1-carboxílico

23

Al emplear C14 marcado en diferentes posiciones de ACC, se demostró durante la oxidación in vivo del ACC a etileno que los carbonos carboxilos C-1 y C-2,3 del ACC son metabolizados a etileno, derivados de L – â cianoalanina, y CO2 , respectivamente, (Peiser et al., 1984; Pirrung, 1985; citados por Yip y Yang, 1988). Aunque no se identificó HCN libre, se afirma que el C-1 del ACC es inicialmente liberado como HCN, pero es rápidamente conjugado en los derivados de L – â – cianoalanina cuando se libera. Esta noción se basa en la observación de que el destino metabólico del C-1 del ACC durante su conversión a etileno era idéntico al de HCN adicionado y que la cantidad formada de HCN conjugado era equivalente a la de etileno (Peiser et al., 1984). Así, la degradación de ACC a etileno puede representarse por la siguiente ecuación:

ACC + 1/2 O2

C 2 H4 + HCN + CO2 + H2 O

Esta reacción fue más tarde confirmada in vitro, usando la ACC oxidasa purificada de manzana. Durante la reacción catalítica, se demostró claramente una producción estequiométrica de etileno y HCN desde ACC, qué también requirió ácido ascórbico, CO2 y Fe+2 como cofactores (Montaldi, 1995).

3.10.4. Cianuro como inductor de la formación de auxinas Se ha encontrado que las Auxinas, las más abundantes hormonas de las plantas, inducen la producción del etileno gracias a la ruta de la ACC en los tejidos de la planta. Sin embargo, muchos efectos fisiológicos que se creían, en forma original, inducidos por auxinas, son realmente debidos a la acción de etileno (Yip y Yang, 1988). Los ejemplos incluyen por un lado, la iniciación de raíces y de pelos radicales, y por otro, epinastias, abscisión, y dehiscencia de hojas. Se documentan bien los estudios acerca de la inducción de etileno por las auxinas en el campo de la investigación hormonal. Mucho énfasis se ha dado a ello en variedades de tomate. En ellas, se han identificado nueve diferentes genes de ACC sintasa. Tres de ellos, LE-ACS2, LE-ACS3, y LE-ACS5, son en alguna magnitud inducidos por auxinas (Salisbury y Ross, 1994; Yip y Yang, 1998).

24 En tomate, las auxinas y citoquininas son conocidas por tener efectos sinérgicos en la producción del etileno vía la inducción de la ACC sintasa. No obstante, se ha encontrado más de un gen de ACC sintasa relacionado con la elevada producción de etileno. Debido a que generalmente la ACC oxidasa no es el paso limitante en la ruta de biosíntesis de etileno, la aplicación exógena de auxinas y ACC normalmente aumenta la producción del etileno y por ende, la producción de HCN en los tejidos de la planta (Montaldi, 1995; Yip y Yang, 1998). Se demostró que cuando se incuban hipocotilos de poroto con ACC exógeno (más el AOA, que actúa como un inhibidor metabólico del cianuro) pueden hacerse cianogénicos, por ello se pretendió probar que si se trataban con auxinas, también inducirían ACC y con ello la producción de HCN; sin embargo, los resultados indicaron que realmente no se puede generar cianogé nesis en poroto agregándole auxinas (más AOA), debido a que la AOA también puede inhibir la actividad de la ACC sintasa (Yang y Hoffman, 1984; citado por Yip y Yang, 1998). Evidencia más completa sugiere que algunos herbicidas auxínicos como el quinclorac, 2,4 – D, picloram o clopiralid, ejercerían su efecto vía la inducción de cianuro (de la ruta del ACC). El quinclorac es un herbicida que controla eficazmente la proliferación de maleza (monocotiledónea y dicotiledónea). La chépica (monocotiledónea) y el tomate (dicotiledónea) son sumamente susceptibles a este químico. La aplicación de quinclorac a la raíz de chépica causó inhibición en el crecimiento de brotes, acompañado por clorosis y necrosis. Además se demostró que el quinclorac induce la biosíntesis de etileno vía la ruta del ACC y eleva la concentración de cianuro en el tejido de brotes de chépica a un máximo de 40 µM. Ellos también observaron un aumento en el contenido de MACC y la actividad L – 3 – cianoalanina sintasa en el mismo tejido (Yip y Yang, 1998). Además, la adición exógena de HCN pudo reproducir los efectos fitotóxicos del quinclorac, pero no lo logró la aplicación a la raíz del ácido 2 – cloroetilfosfónico (un compuesto que libera etileno); la AVG (un inhibidor de la ACC sintasa) usada antes de la aplicación de quinclorac, inhibe la acción de herbicidas inductores de la formación del etileno y el efecto fitotóxico en los brotes. Todos estos datos indican que los efectos fitotóxicos de quinclorac en la chépica probablemente proceden vía la inducción de la ACC dependiente de cianuro. El quinclorac también causó reducción de crecimiento de brotes, epinastia de hojas, y clorosis en plantas jóvenes de tomate cuando se trataron hidropónicamente (Yip y Yang, 1998).

25

3.10.5. Respiración resistente a cianuro En muchos tejidos vegetales, la pérdida de funcionalidad de la citocromo oxidasa por inhibidores de la respiración, como el cianuro, no pueden disminuir la tasa respiratoria. Esto se debe al funcionamiento de una ruta alternativa de transporte electrónico conocida como respiración resistente a cianuro. La ruta alternativa permite el transporte de electrones desde la ubiquinona a una flavoproteina y desde ahí a una oxidasa, que tiene más baja afinidad al O2 . Debido a que esta respiración resistente a cianuro no se acopla a la formación de ATP, se cree que sirve generalmente como un mecanismo de descarga para remover electrones, cuando la ruta del citocromo se satura por la rápida actividad de la glicólisis y del ciclo de Krebs (Stumpf y Conn, 1980; Yip y Yang, 1998). En la maduración de frutas como manzanas, paltas y tomates, el alza en la biosíntesis del etileno es acompañada por un aumento en la respiración en el tejido (Salisbury y Ross, 1994). Esta alza climactérica puede acelerarse en la fase preclimactérica por el etileno y el HCN. Debido a esta coincidencia, se ha aludido a la posibilidad de que el aumento en la respiración puede ser debido al subproducto cianuro, que resulta del aumento en la biosíntesis del etileno, y que el alza en la respiración es probablemente consecuencia del funcionamiento del transporte electrónico resistente a cianuro (Montaldi, 1995). Sin embargo, ninguno de estas especulaciones se apoya en resultados experimentales. Yip y Yang (1998) reportaron que durante el proceso de maduración de manzanas y paltas, la concentración promedio de cianuro en los tejidos nunca pudo exceder 1 µM, lo que constituye una cantidad insuficiente para activar cualquier cambio fisiológico de los tejidos. Theologis y Laties (1978), citados por Yip y Yang, 1988, examinaron el grado de compromiso de la respiración alternativa en frutas intactas, tales como paltas y plátanos, comprobando que no es requerido el camino alternativo para mantener la elevada tasa respiratoria que caracteriza la fase climactérica en estas frutas. Laties y asociados (Theologis y Laties, 1978; Tucker y Laties, 1985; citados por Yip y Yang, 1988) también han revelado que la respiración preclimactérica o climactérica de la palta es mediada por la vía respiratoria del citocromo y que no hay compromiso con la vía resistente a cianuro.

26 3.11. Mecanismo de acción de inhibidores Es complicado establecer los mecanismos por los cuales los diferentes tipos de compuestos alelopáticos ejercen su acción inhibitoria al medioambiente. Una razón de esto radica en la dificultad de separar los efectos secundarios de las causas directas (Seigler, 1996). Es más, puede ser distinto aislar un sistema bioquímico y analizar su funcionamiento, que este se comporte de igual forma en una estructura más compleja y dependiente de múltiples factores como es el caso de una planta intacta (Inderjit y Dakshini, 1995). Sin embargo, se han determinado algunos procesos afectados en cierta forma por aleloquímicos, estos son:

3.11.1. Respiración celular El ácido cianhídrico actúa por inhibición de la acción de las porfirinas que componen la enzima citocromo oxidasa (citocromo aa3). Esta enzima es un catalizador terminal de la cadena transportadora de electrones mitocondrial, que une el oxígeno atmosférico con la respiración metabólica. Otros componentes de la cadena mitocondrial tienen relativamente baja afinidad al cianuro (Solomonson, 1981). La citocromo oxidasa es un complejo enzimático multimérico que contiene dos componentes fierro y dos iones cobre centrales para óxido - reducción (Hartzell et al., 1978; citado por Solomonson, 1981). Un mol de cianuro se une estrechamente a un mol de la citocromo oxidasa (citocromo aa3). En forma específica, el cianuro no tiene efecto sobre el cobre de la proteína oxidada, mientras que si sobre el fierro; esto último da con mayor certeza la formación de cianuro de ferrocitocromo aa3 estable, que inactiva su funcionamiento (Solomonson, 1981). De este modo, la intoxicación con cianuro constituye un mecanismo de asfixia a nivel celular (Kingsbury, 1964; Montaldi, 1995; Salisbury y Ross, 1994; Stumpf y Conn, 1980).

3.11.2. Inhibición de la división y elongación celulares El criterio usado para determinar la presencia o relativa efectividad de los agentes alelopáticos son el incremento en tamaño y peso de los organismos evaluados. Un aumento apreciable en cualquiera de ellos requiere de división y elongación celulares (Inderjit y Dakshini, 1995).

27 Se ha reportado que la consecuencia de los fenoles a nivel celular es generar bloqueo de la mitosis en el tejido radicular; ello se presentaría tras la destrucción del huso mitótico, interrupción de la anafase y acumulación de metafases (Sampietro, 2001). Además en ciertas especies podría ejercer una detención de la entrada de las células a mitosis (Cornman, 1946; citado por Rice, 1974). Schmidt (1988) encontró un marcado decremento en el número de células radiculares de distintas especies en mitosis, cuatro y ocho horas después del tratamiento con extractos acuosos de frutos de Juglans nigra. Por otro lado, el efecto directo de las sustancias

alelopáticas sobre la elongación de las células fue establecido por Yip y Yang (1998), quienes indicaron diferencias notables en el tamaño celular entre raíces e hipocotilos de plántulas de tomate en tratamiento comparado con el control.

3.11.3. Inhibición de giberelinas y/o ácido indol acético Andreae (1952), citado por Rice (1964), estableció que algunos compuestos del metabolismo secundario inhiben la oxidación del AIA. Por otro lado, también se ha comprobado que el producto de hidrólisis de estos compuestos, vale decir el ácido cianhídrico, tendría un rol fundamental en la disminución de la actividad de la AIA oxidasa (Yip y Yang, 1988). Lee y Skoog (1965), citados por Putnam y Tang ( 986), encontraron que el ácido 1 hidroxibenzoicos es estimulatorio e inhibitorio de la acción del AIA. Además, se sugiere una suerte de sinergización de los efectos inductores del crecimiento del AIA, dado que estos ácidos neutralizan la descarboxilación de la hormona (Inderjit et al., 1999). No obstante lo anterior, se ha hipotetizado que el mayor rol de estos compuestos secundarios es la de ejercer control sobre el balance hormonal, debido a que la hidrólisis o preservación del compuesto podría cambiar su acción hacia degradación y/o preservación de auxinas (Feucht y Treutter, 1999). Durán (1976) reportó que la florizina (manzano) y algunos glicósidos flavonoides relacionados, tal como la naringenina (mandarino), son fuertes estimuladores de la AIA oxidasa. Feucht y Treutter (1999) reportaron que los inhibidores fenólicos del crecimiento en manzanos suprimen la actividad de giberelinas y AIA.

28 3.11.4. Efecto sobre la absorción mineral La absorción de iones es ciertamente de importancia básica en el crecimiento y reproducción de vegetales de cualquier nivel de complejidad; la evidencia indica que la acumulación de varios tipos de agentes alelopáticos afectan la tasa de absorción de iones (Northup et al., 1999). Desde la experiencia obtenida a la luz de un g número de ensayos (Inderjit et al., ran 1999; Inderjit y Del Moral, 1997; Kogan, 1983; Mai et al., 1981), se puede indicar que plántulas de distintas especies en ambientes controlados, por factores causales distintos a la competencia por recursos, expresan disminución en la absorción de macro y micronutrientes cuando son establecidas en conjunto. En cultivos de células de rosa en medios nutritivos adecuados, a los que se adiciona cantidades óptimas de nutrientes, se obtuvo diferencias notables en la tasa de crecimiento cuando el tratamiento correspondió además con la aplicación de ácido cianhídrico, en comparación con los que no lo contenían (Rice, 1974). Las secreciones vegetales tienen el potencial de influenciar los nutrientes del suelo y el nivel de absorción de los mismos, la cual interviene finalmente en la conducta de crecimiento (Lyu y Blum, 1990; Schlesinger, 1991; citados por Inderjit, 2001); estos pueden afectar la acumulación y disponibilidad de fosfatos, ya que ellos compiten por los sitios de absorción de aniones en arcillas y humus. Este resultado se debe a su unión a Al, Fe, y Mn, los cuales pudiesen haberse ligado a fosfato, afectando su disponibilidad (Inderjit, 1996). Northup et al. (1995), citado por Inderjit et al. (1999), reportaron que los polifenoles segregados desde residuos de hojas de Pinus muricata influenciaban la disponibilidad de nitrógeno orgánico disuelto y nitrógeno mineral, y modificaban la dinámica de los nutrientes del suelo.

3.11.5. Retraso de la fotosíntesis Se demostró que ciertos compuestos alelopáticos de tipo fenólico presentes en plantas de tabaco y maravilla generan fuerte inhibición de la fotosíntesis neta (Rice, 1974). Esta manifestación, según ensayos de comprobación, radicaría supuestamente en una reducción de la fijación del CO2 de las plántulas en tratamiento respecto al control. Además, se comprobó

29 que el grado de reducción está fuertemente correlacionado con la concentración del compuesto fenólico utilizado y el área foliar en expansión (Feucht y Treutter, 1999).

3.11.6. Metabolismo de la glucosa Isom et al., (1975), citados por Solomonson (1981), estudiaron el efecto de dosis sub letales de cianuro sobre el catabolismo de la glucosa. El cianuro causa aproximadamente un 100% de incremento en el catabolismo de la glucosa vía la ruta de las pentosas fosfato y aproximadamente un 50% de disminución en el catabolismo de la glucosa vía ruta glicolítica. Dosis sub letales de cianuro causan disminución en la relación ATP/ ADP, resultando en un cambio de metabolismo aeróbico a uno anaeróbico (Albaum et al., 1946; Handler, 1945; Olsen y Klein, 1947; citados Solomonson). Además, se comprobó que la producción de glucosa y la actividad fosforilasa se incrementan con cianuro y, por ende, se activa la glucogenólisis (Jakob y Diem, 1974; citados por Solomonson, 1981).

3.11.7. Inhibición del crecimiento general Inderjit (2001) cree que la inhibición del crecimiento observada en algunos cultivos puede deberse a un agotamiento temporal del nitrógeno como consecuencia de una altísima actividad microbial, cuya transformación es resultado de la lixiviación de compuestos orgánicos vegetales. Sin embargo, aún sea este el caso, la etapa inicial de esta cadena de eventos (Moléculas orgánicas Alta actividad microbial Agotamiento temporal de nitrógeno Pobre

crecimiento) comienza sólo después de la segregación de compuestos orgánicos hacia el suelo. Además, si es adoptada la aproximación multifactorial (por ejemplo, el efecto de compue stos alelopáticos en las plantas, microbios del suelo, nutrientes, etc.), las interacciones alelopáticas podrían ser bien entendidas (Sampietro, 2001). Es consecuente con la revisión previa del mecanismo de acción alelopático sobre algunos procesos en plantas, establecer en forma esquemática las alteraciones sobre las células vegetales y ello se presenta en la Figura 3.10.

3.12. Mecanismo de liberación de cianoglucósidos Son cuatro los principales mecanismos de liberación de compuestos alelopáticos: volatilización, lixiviación, descomposición de residuos vegetales y exudaciones radiculares,

30 pero sólo este último está directamente relacionado a la conducta que presentan los cianoglucósidos (Figura 3.11).

3.12.1. Exudaciones radiculares La reducción en r ndimiento observada en algunos cultivos en varios casos se ha e atribuido a toxinas liberadas por otros cultivos y malezas adyacentes. Se conocen sustancias exudadas por las raíces que reducen la germinación de las semillas, el crecimiento de raíces y brotes, la incorporación de nutrientes y la nodulación (Selmar et al., 1988). La mayoría de los agentes alelopáticos conocidos, entre ellos los cianoglucósidos, son exudados radiculares (Durán, 1976). Factores tales como la edad del vegetal, nutrición, luz y humedad influencian cualitativa y cuantitativamente la liberación de sustancias por las raíces (Kingsbury, 1964).

3.13. Efecto de factores climáticos y del suelo sobre la producción y liberación de CGs Son múltiples los factores que deben estar asociados a nivel medioambiental con la producción, transformación y liberación de glucósidos cianogénicos (Poulton, 1990); como se sabe estos compuestos forman parte del metabolismo secundario de plantas, por ende cualquier alteración sobre las estructuras vegetales implicará modificaciones hacia el comportamiento metabólico general y hacia los productos que se generan de él (Inderjit et al., 1999). Sin embargo, se enuncian como más representativos, y con mayor implicancia en la dinámica de cianoglucósidos, los factores climáticos y edáficos.

3.13.1. Factores climáticos Los factores climáticos influencian la producción y secreción de aleloquímicos; Jonasson et al. (1986), citados por Inderjit et al. (1999), sugieren que las fluctuaciones en los niveles de aleloquímicos podrían ser debidos a las variaciones climáticas. Ellos establecen, “. . . el balance de la nutrición carbonada podría ser alterado por influencia climática, la que modifica la producción de carbohidratos. Cuando los carbohidratos son producidos en exceso respecto de la demanda del crecimiento, los fotosintatos sobrantes podrían ser usados para la generación de compuestos del metabolismo secundario. Recíprocamente, cuando la fotosíntesis es más limitante que la asimilación de nutrientes, las

31 concentraciones de carbohidratos en las plantas declinan, tanto como los metabolitos secundarios, haciendo a las plantas más susceptibles a herbívoros o patógenos.” La influencia de la radiación, deficiencias minerales, estrés hídrico y temperatura sobre la producció n de compuestos alelopáticos ha sido discutida frecuentemente (Inderjit y Del Moral, 1997; Putnam y Tang, 1986; Rice, 1984). También, se ha comprobado en forma efectiva la acción del hábitat sobre la persistencia y destino de los aleloquímicos. Del Moral y Muller (1970), citados por Inderjit et al. (1999), reportaron que la degradación y descomposición de aleloquímicos sufre un retardo en climas áridos – semiáridos comparados con los de condiciones húmedas.

3.13.2. Suelo, efectos sobre la actividad alelopática Las plantas pueden hacer disponibles los aleloquímicos al suelo a través de residuos, extractos, incorporación de materia vegetal, secreción natural, descomposición de materia vegetal, degradación de lignina, etc. (Inderjit et al., 1999; Putnam y Ta ng, 1986; Rice, 1974). En muchos casos, estos aleloquímicos se mueven a través del suelo y pueden ser transformados durante este movimiento, metabolizados por microorganismos del suelo, o unirse a materia orgánica. Los microbios pueden toxificar o detoxificar aleloquímicos después de su entrada al suelo. Debido a que los aleloquímicos están presentes en muchas plantas, su presencia per se no necesariamente demuestra la ocurrencia de interferencia alelopática en la naturaleza (Seigler, 1996). Los factores abióticos y bióticos del suelo pueden transformar aleloquímicos a polímeros de naturaleza no tóxica (Szabo y Wittenmayer, 2000). Los exudados radicales juegan un importante rol en la estructura de la comunidad por influenciar: (a) el crecimiento y establecimiento de especies de plantas (alelopatía), (b) disponibilidad de iones inorgánicos, y (c) ecología de microorganismos del suelo (Szabo y Wittenmayer, 2000). Numerosos pelos radicales finos, presentes sobre la raíz principal, se recubren en el suelo con mucílago (un polisacárido compuesto por azúcares hexosas y pentosas, y ácido urónico) y modifican el suelo a su alrededor (Inderjit, 2001). En muchas situaciones, los exudados de la raíz pueden pasar hacia la rizósfera (interfase raíz – suelo) y entonces viajar hacia el suelo para alcanzar las raíces de plantas objetivo. En el proceso de transporte

32 aleloquímico, numerosas barreras biológicas, físicas y químicas en el suelo podrían limitar la fitotoxicidad de los aleloquímicos en muchas situaciones (Sampietro, 2001). Debido a la exudación radicular de aminoácidos y carbohidratos, y la descortificación de la raíz, la rizósfera tiene más alta actividad microbial comparada con la masa del suelo (Cunningham et al., 1996). Sin embargo, los efectos de la rizósfera dependen de la difusión de exudados radicales fuera de las raíces, sus propiedades de difusión y los niveles de humedad del suelo (Bowen y Rovira, 1999). Se ha examinado la influencia de la textura del suelo sobre los efectos fitotóxicos (Inderjit y Dakshini, 1995; Putnam y Tang, 1986). Northup et al. (1999) reportó que los compuestos alelopáticos varían con el tipo y horizonte del suelo, y la estructura conformacional y funcional del compuesto. Por ejemplo, los silicatos de la superficie arcillosa también juegan un muy importante rol en la polimerización oxidativa de compuestos orgánicos (Huang et al., 1999). Con el fin de conocer la capacidad de transformación de compuestos fenólicos de los minerales primarios, Huang et al. (1999) listaron la secuencia de habilidad catalítica de estos como sigue: tefroita > actinolita > haloisita > fayalita > augita > biotita > muscovita albita ortoclasa microclina cuarzo, por lo tanto la mineralogía de la

arcilla puede jugar una función vital en la expresión de la actividad aleloquímica. Luego de penetrar el suelo, los aleloquímicos se ponen en contacto con millones de microorganismos; debido a ello todos sufren inevitablemente procesos tales como retención, transporte y transformación, que influencian su estructura o sus niveles fitotóxicos. También la flora microbiana benéfica podría degradar estos compuestos para utilizarlos como fuente de carbono (Mazzola, 1998). La acumulación de químicos en niveles fitotóxicos y su destino y persistencia en el suelo son importantes factores determinantes de la interferencia aleloquímica. El potencial alelopático de un determinado compuesto depende de su disponibilidad estática (o sea, la concentración existente en la suspensión del suelo) y dinámica (es decir, la tasa de renovación). Por consiguiente, aun cuando el aleloquímico se degrade durante un determinado período de tiempo, su acumulación en el suelo a un nivel fitotóxico se mantiene debido a su reemplazo (Inderjit, 2001). Schmidt (1988) sugirió que la oportunidad de una interacción alelopática es más alta cuando los químicos son liberados en cercana proximidad de las plantas blanco, pero existen aleloquímicos que persisten por largo tiempo en el suelo.

33 Debido a estas interacciones el cianuro contenido en los cianoglucósidos puede ser liberado al medio y en solución puede oxidarse en la presencia de oxígeno a hidrocianato, iones cianato, ácido fórmico y formato de amonio por medio de agentes químicos oxidantes o por biodegradación (Smith y Mudder, 1991; citados por Meehan, 2000). El pH del suelo contenedor dicta la forma en la que más probablemente encontraremos al cianuro, ya que con pH bajo 7 más del 99% se halla como ácido cianhídrico, a pH 9,36 existe 50% de ión cianuro (CN-) y 50% de ácido cianhídrico (HCN), y sobre pH 11 casi la totalidad del cianuro se encuentra como ión cianuro (Tomoko, 1997). Por otro lado, el cianuro puede unirse a iones en el suelo y formar complejos relativamente estables y mantenerse como sedimento en el suelo. Estos complejos de cianuro pueden ser adsorbidos por el suelo, dependiendo de la Capacidad de Intercambio Aniónico (CIA) del mismo (Alesii y Fuller, 1976; citados por Meehan, 2000). Los suelos con alta CIA contienen arcillas como caolinita, clorita, gibsita y óxidos de hierro y aluminio. Los cianuros complejados como Fe(CN)6 3-, Zn(CN)4 2-, Cu(CN)4 3- y Ni(CN)4 - pueden ser adsorbidos por los sedimentos, sin embargo el cianuro en estado libre no (Theis y West, 1986; citados por Meehan, 2000).

3.14. Biodegradación El cianuro puede ser producido, degradado o utilizado por microorganismos en condiciones aeróbicas y anaeróbicas, pero también es conocido como un inhibidor metabólico para algunos microorganismos (Chapatwala et al., 1995; Watanabe et al., 1998; citados por Meehan, 2000). El cianuro es degradado por microorganismos como fuente de nitrógeno y carbono, los cuales son requeridos para supervivencia (Raybuck, 1992; citado por Meehan, 2000). En condiciones aeróbicas, el cianuro puede ser detoxificado por la interacción de microorganismos, donde es convertido a formato y entonces a dióxido de carbono (por la formato deshidrogenasa) (Meehan, 2000). La conversión es directa (por una nitrilasa) o indirecta (vía formamida, por la cianuro hidratasa y la formamidasa) para producir formato. Bajo esas condiciones el cianuro es convertido a compuestos menos tóxicos como amonio y dióxido de carbono. Las reacciones enzimáticas pueden ser resumidas a reacciones de

34 sustitución y adición, hidrólisis, y óxido – reducción (Watanabe et al., 1998; citados por Gleadow, 2002). Numerosas bacterias (Acinetobacter, Corynebacterium, Arthrobacter, Pseudomonas, Klebsiella, Nocardia, Rhodococcus, etc.) son conocidas por metabolizar cianoglucósidos (Banerjee et al., 2002; citados por Gleadow, 2002). Los mecanismos por los cuales se lleva a cabo la degradación bacteriana del cianuro junto con los microorganismos involucrados se presentan en la Tabla 3.1. En relación con la acción de hongos, Barclay et al. (1998), citados por Lynch (2002), demostraron que Fusarium solani y F. oxysporum tienen la capacidad de biodegradar complejos del cianuro, especialmente metalocianuros. Desafortunadamente muchos strains de Fusarium pueden ser patogénicos en la rizósfera. Dartnell y Burns (1987), citado por Lynch (2002), postularon por su parte que concentraciones de cianuro libre de alrededor de 10 mM pueden ser rápidamente catabolizadas por selectos strains de Trichoderma en el suelo de la rizósfera (Lynch, 2002). Los hongos Mucor circinelloides LU M40 y Penicillium aurantiogriseum P 35 producen â – glucosidasas extracelulares que son activas sobre la amigdalina. El estudio del mecanismo de hidrólisis, con enzimas purificadas desde ambos microorganismos, indica una posible reacción secuencial (en dos pasos). El primer paso de hidrólisis desde amigdalina a prunasina es muy rápido, mientras que el segundo desde prunasina a cianohidrina fue mucho más lento. Finalmente, no hubo actividad de ninguna cianohidrina liasa en las placas de cultivo de ambos hongos (Brimer et al., 1998). Microorganismos con actividades enzimáticas capaces de degradar nitrilos (precursores de cianoglucósidos) son poco frecuentes en la naturaleza. La existencia de esta actividad en un número limitado de géneros de hongos ( usarium, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, F etc.) indica la relativa rareza de este mecanismo fisiológico (Harper, 1977a; citado por

Banerjee et al., 2002). Tales actividades están relacionadas con el metabolismo de nutrientes, particularmente en la degradación de cianoglucósidos y glucosino latos y en la síntesis de ácido indol acético (Bestwick et al. 1993; Bartel y Fink, 1994; citados por Sampietro, 2001). En algunas plantas superiores, las actividades nitrilo – degradante son también requeridas para la detoxificación de cianuro (Piotrowski et al. 2001; citados por Banerjee et al., 2002).

35 3.15 Ciclo del nitrógeno y cianuro El ciclo del nitrógeno proporciona una buena representación de las posibles vías que podría seguir el nitrógeno después de la degradación del cianuro (Figura 3.12). El ciclo del nitrógeno incorpora cianuro como HCN. El ácido cianhídrico es degradado a la forma más reducida de nitrógeno, amonio, el cual es entonces susceptible a cambios en el potencial redox de la solución (Meehan, 2000). La oxidación y reducción de las especies de nitrógeno es acompañada típicamente por microorganismos. Las formas comunes del nitrógeno en soluciones acuosas, como las del suelo, son nitrato (NO3 -), nitrito (NO2 -), amonio (NH4 +) y cianuro (CN-); no obstante, sólo como nitrato penetra a la planta (Fetter, 1993; citado por Meehan, 2000).

3.16. Concentraciones de CGs y HCN en órganos de especies del género Prunus

3.16.1. Damasco Femenia et al. (1995) analizaron los contenidos de amigdalina de semillas de 16 cultivares de damasco amargo y encontraron rangos desde 4,5 a 6,5 g de cianuro / 100 g de materia seca de semilla. Estos valores son similares a los encontrados en la literatura para las concentraciones más altas de amigdalina en semillas de damasco (Voldrich et al., 1989; citados por Femenia et al., 1995), y más altos que los contenidos reportados por Briggs y Yuen (1978), Mandenius et al. (1983), Stoewsand et al. (1983) y Stosic et al. (1987); citados por Gómez et al. (1998). Tuncel et al. (1990), citados por Gómez et al. (1998), reportaron que 70 g / 100 g de cianuro total fueron removidos por los procesos de alza temperatura desde carozos de damasco. Se ha demostrado que el amargor es debido a cantidades relativamente altas de amigdalina. El contenido de amigdalina encontrado en cultivares amargos, es equivalente al de cianuro, con alrededor de 240 – 350 mg /100 g de materia seca (Gómez et al., 1998). A damascos enlatados enteros se les ha determinado una concentración de 0,13 ppm de HCN. Sobre 33 ppm de HCN han sido reportados en damascos descarozados y enlatados (Gierschner y Baumann, 1969; citados por Kingsbury, 1964).

36

3.16.2. Almendro Hay considerable variabilidad en las concentraciones de compuestos cianogénicos en los distintos genotipos de almendro. Se observó una distribución específica de cada compuesto (amigdalina y prunasina) en semillas, hojas y raíces. La prunasina sólo fue encontrada en las partes vegetativas, mientras que la amigdalina fue localizada principalmente en semillas de almendro amargo (Dicenta et al., 2002). Dicenta et al. (2002) determinaron que las concentraciones de CN– para variedades dulces, semi amargas y amargas variaron desde 0 hasta 411 mg de CN– / 100 g de materia seca. El coeficiente de correlación entre amigdalina y cianuro total fue de 0,99. En las hojas se encontró menor diferencia entre variedades, pero en este caso el compuesto representado fue prunasina con concentraciones desde 6 a 36 mg de CN– / 100 g de materia seca. En las raíces el único compuesto cianogénico identificado fue la prunasina, la que mostró amplia variabilidad (desde 41 a 202 mg de CN– / 100 g de materia seca) y una media de 112 (Dicenta et al., 2002). Usai y D´hallewin (1990), estudiaron tres cultivares de almendro dulce y uno de almendro amargo, y hallaron tanto amigdalina como prunasina en las semillas. Mulas (1994) determinó un coeficiente de correlación de 0,97 entre el contenido de prunasina en brotes y raíces de plántulas de varias especies de Prunus (plántulas de almendro amargo y dulce incluidas), pero no estudió las semillas. Este alto coeficiente de correlación es muy diferente del encontrado en el trabajo de Dicenta et al. (2000) entre hojas y raíces, no obstante ellos analizaron órganos diferentes (brotes en lugar de hojas) y las plantas fueron de una muy disímil edad (18 meses en vez de 10 años).

3.16.3. Cerezo Luh y Pinochet (1959), citados por Kingsbury (1964), sostuvieron que en variedades de cerezo enlatadas enteras se ha encontrado contenidos de 0,048 ppm de HCN, considerando que el jugo de cerezo enla tado contiene 0,44 ppm y que las muestras de jugo comercial poseen alrededor de 14,7 mg de HCN/ L.

37 3.16.4. Duraznero Todas las estructuras de la planta contienen cianuro, pero los carozos son particularmente ricos en él. Kingsbury (1964) cita una concentración de 164 mg de cianuro por 100 g de materia seca en EE.UU., mientras que en Australia se determinó que las hojas de duraznero contienen alrededor de 66 mg de cianuro por 100 g de materia seca. Según Ward y Durkee (1956), citados por Rice (1974), las concentraciones de amigdalina en hojas fueron de alrededor de 7,1 a 18,3 mg/g de materia seca; en tallos, brotes y ramillas, fueron de 4,7 a 9,3 mg/g de materia seca; en pelos radicales y raíces gruesas se encontraron concentraciones aproximadas de entre 15,5 a 37,8 mg/g de materia seca.

38 4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Materiales Se utilizó para el montaje de los tratamientos del ensayo: • • • • • • • • 160 plántulas de duraznero Nemaguard. 5 grs de amigdalina (D-amigdalina = D-Mandelonitrilo 6-O-â–glucósido – â–glucósido), aproximadamente 99% pureza química, de semillas de damasco. Sigma Chemical Co. Semillas de almendro amargo (Prunus amygdalus). Raíces de duraznero Nemaguard. Suelo proveniente de un huerto de avanzada edad de durazneros (Alto Jahuel). Suelo del mismo huerto, pero de un lugar sin plantación previa de durazneros (Alto Jahuel). Spectroquant MERCK S.A. kit para determinación de cianuro. 5 grs de cianuro de potasio 1M (patrón).

4.2 Montaje El ensayo se montó con plántulas de Nemaguard en bolsas llenas con un volumen de suelo de aproximadamente 4,5 lts, proveniente de un huerto localizado en la zona de Alto Jahuel. De este huerto se extrajo suelo plantado con duraznero por muchos años para uno de los tratamientos y sue lo de iguales características, pero sin plantación previa, de modo de tener un sustrato para el tratamiento testigo y la adición de las soluciones de todos los demás tratamientos. Se estructuraron 7 tratamientos más un tratamiento control, aplicándoles distintas soluciones disueltas en agua destilada. El diseño estadístico fue “Completamente al Azar”, cada tratamiento contó con 20 repeticiones y fueron designados con la siguiente nomenclatura:

1. Tratamiento (T0): 20 plántulas establecidas en un suelo sano, sin cultivo previo de durazneros. 2. Tratamiento (T1): 20 plántulas establecidas en un suelo de replante y con una concentración residual de 258,6 ppm de cianuro.

39 3. Tratamiento (T2): 20 plántulas dispuestas en un suelo sano al que se adicionó una dosis de 500 ppm de amigdalina. 4. Tratamiento (T3): plántulas establecidas en un suelo sano al que se adicionó una dosis de 1000 ppm de amigdalina. 5. Tratamiento (T4): plántulas establecidas en un suelo sano al que se adicionó una dosis de 2000 ppm de amigdalina. 6. Tratamiento (T5): plántulas establecidas en un suelo sano al que se agregó una solución con extracto de 25 grs de semillas de almendro amargo. 7. Tratamiento (T6): plántulas establecidas en un suelo sano al que se agregó una solución con extracto de 50 grs de raíces de Nemaguard. 8. Tratamiento (T7): plántulas establecidas en un suelo sano al que se agregó una solución con extracto de 25 grs de raíces de Nemaguard y 12,5 grs de semillas de almendro amargo.

Se midió mensualmente, desde octubre a febrero, altura y diáme tro de plántulas a todos los tratamientos desde la plantación hasta el arranque de las mismas. En este momento se midió materia seca en hojas, tallos, raíces y total, a través del secado de las estructuras vegetales en estufa a 105°C, hasta que el peso de las mismas no experimentara variaciones (en promedio 3 hrs). Además se determinó el largo aproximado de las raíces. Se midió las concentraciones relativas de cianuro en extractos de semillas de almendro amargo y raíces de Nemaguard, esto tras el secado a 65°C y posterior molienda de dichos elementos y se determinó empíricamente una concentración de 72,4 mg de amigdalina/g de m.s. y de 31,9 mg amigdalina/g de m.s., respectivamente y con ello la composición en el contenido aplicado en los tratamientos 5, 6 y 7. Los suelos que quedaron tras el retiro de las plántulas fueron procesados y filtrados a alta presión de modo de obtener extractos de pasta de saturación (45% p/v) y determinar por espectrofotometría la cantidad de cianuro, subproducto resultante de la degradación en el suelo de cianoglucósidos. Esto se llevó a cabo con los reactivos del kit Spectroquant de Merck y el uso de un espectrofotómetro UV visible a 585 nm. Finalmente, todos los datos obtenidos fueron trabajados con el programa estadístico SAS para realizar análisis de varianza y comparación múltiple entre las medias de los resultados por parámetro de los distintos tratamientos.

40 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1. Altura de plántulas De acuerdo a lo que se desprende del análisis de varianza practicado a los resultados, se puede establecer que este parámetro presentó diferencias significativas a un nivel de confidencia de un 99% (Tabla 5.1), lo que indica que las distintas dosis de amigdalina aplicadas, de acuerdo al tratamiento, ejercen algún grado de acción sobre el incremento en altura de las plántulas. Tabla 5.1. Análisis de varianza de altura de plántulas (cms). Fuente de Variación Entre tratamientos Dentro de tratamientos Total corregido g.l. 7 792 799 Suma de cuadrados 2.986,62 103.275,57 106.262,19 Cuadrado medio 426,66 130,39 Valor de F 3,72 Significativo al 1%

Conforme ello y tras la aplicación de la prueba estadística t de Student (Tabla 5.2) como método de comparación múltiple de medias, se comprobó que el tratamiento control (T0) con suelo sano mostró los valores más altos de crecimiento en altura, mientras que el tratamiento más detrimental fue el de suelo con cultivo previo de duraznero (T1). Tabla 5.2. Comparación múltiple de medias de alturas de plántulas (cms) a través de la Prueba de t de Student (medias derivadas de 20 plántulas y 5 fechas de medición). Tratamiento T0 T2 T6 T3 T4 T7 T5 T1 Dosis Suelo sano Suelo 500 ppm amigdalina Suelo extracto de raíces Suelo 1000 ppm amigdalina Suelo 2000 ppm amigdalina Suelo extracto raíces y semillas Suelo extracto de semillas Suelo de replante Medias* 36,86 a 34,87 a b 34,07 a b c 33,66 b c 33,19 b c d 32,27 b c d 31,36 c d 30,27 d

* Medias con la misma letra no son estadísticamente significativas al 0,5 % de significancia.

41 Lo anterior, puede asociarse a las condiciones derivadas de replante del suelo (T0) y posiblemente otros factores desencadenantes de alelopatía que no fueron determinados en este ensayo, pero que son ampliamente establecidos en la literatura (Mai y Abawi, 1981; Melakeberhan et al., 1993). Estos factores bióticos y abióticos preexistentes (por ejemplo microorganismos, plagas y estado del suelo), cuya presencia es favorecida por las condiciones indicadas, tendrían directa incidencia en el comportamiento resultante (Melakeberhan et al., 1993). Por otro lado, los tratamientos con 2000 ppm de amigdalina pura (T4), extracto de semillas (T5) y extracto de semillas y raíces (T7), presentaron idéntica posición a la mostrada aquí, ordenados en forma decreciente, en la tasa de incremento de altura en el tiempo debido probablemente a las altas concentraciones potenciales de cianuro que pudieron desprender, como a la posibilidad de que los dos últimos contuviesen además otros principios activos con acción alelopática sobre plántulas (Figuras 5.1 y 5.2). Ello concordaría con lo establecido por Inderjit et al. (1999) que establece la existencia de ciertos compuestos, distintos a los cianoglucósidos, involucrados también en lo problemas de replante, ellos son monofenoles preferentemente. El tratamiento con 500 ppm de amigdalina pura mostró resultados parecidos al tratamiento testigo probablemente por su menor concentración y porque las plántulas a este nivel aún fueran capaces de absorber y neutralizar el cianuro o los compuestos asociados en su metabolismo. Del mismo modo, en los tratamientos con 1000 ppm de amigdalina pura y extractos de raíces se obtuvo tasas de crecimiento en altura menores que los tratamientos T0 y T2 a causa de su mayor concentración del cianoglucósido (Figura 5.1). Al respecto, Oh y Carlson (1976) llegaron a conclusiones similares a las encontradas en este ensayo producto de la aplicación de amigdalina pura y extractos de elementos de plantas de Prunus. Por otro lado, Kogan (1983) determinó, en ensayos con plantas de almendro, manzano, ciruelo y duraznero sometidas a lixiviados de duraznero, una inhibición marcada en el crecimiento de las especies sometidas, en especial duraznero, producto de la acció n alelopática de los compuestos segregados. Díaz et al. (1985) indicaron también interferencia evidente de los restos vegetales sobre el desarrollo de especies de Prunus.

42

60.0

50.0

Altura (cms)

40.0 Lineal (Trat.0) 30.0 Lineal (Trat.2) Lineal (Trat.3) 20.0 Lineal (Trat.4)

10.0

0.0 01-Oct

21-Oct

10-Nov

30-Nov

20-Dic

09-Ene

29-Ene

18-Feb

Fecha

Figura 5.1. Expresión del crecimiento de plántulas en altura (cms) en el tiempo para los tratamientos testigo, con aplicación de 500 ppm de amigdalina (T2), de 1000 ppm de amigdalina (T3) y 2000 ppm de amigdalina (T4).

60.0 50.0

Altura (cms)

40.0 30.0 20.0

Lineal (Trat.0) Lineal (Trat.6) Lineal (Trat.5 ) Lineal (Trat.7)

10.0 0.0 01-Oct

21-Oct

10-Nov 30-Nov

20-Dic

09-Ene 29-Ene 18-Feb

Fecha

Figura 5.2. Expresión del crecimiento de plántulas en altura (cms) en el tiempo para los tratamientos testigo, con aplicación de extracto de raíces (T6), de extracto de semillas y raíces (T7) y extracto de semillas (T5).

43

El comportamiento experimentado por la altura en los distintos tratamientos entregó medias más significativas al ser planteadas desde un análisis del total del periodo, que tomándolas por fecha (los cinco meses en conjunto).

5.2. Diámetro de plántulas Para este parámetro el análisis de varianza mostró diferencias significativas entre medias a un nivel de confianza del 90%, menor que el utilizado para el análisis de las alturas, según lo entregado por el programa estadístico SAS (Tabla 5.3): Tabla 5.3. Análisis de varianza de diámetro de plántulas (mm).

Fuente de Variación Entre tratamientos Dentro de tratamientos Total corregido

g.l. 7 792 799

Suma de cuadrados 8,3242 504,8329 513,1571

Cuadrado medio 1,1891 0,6374 -

Valor de F 1,87 Significativo al 10%

En el caso del diámetro de plántulas se presentó con menores diferencias significativas razón por la cual el programa estadístico tomó el análisis de varianza a un nivel de confianza menor (90%). Tras emplear la Prueba de t para comparación múltiple de medias (Tabla 5.4) se obtuvo la mayor expresión de este parámetro en el tratamiento testigo y la meno r en el suelo con antecedentes de cultivo anterior (Figura 5.3 y Figura 5.4). Ello obedece a las mismas causas establecidas para el caso de la altura: un suelo degradado y con múltiples factores asociados a la condición de replante. En relación con los tratamientos restantes, en líneas generales su comportamiento también es parecido al observado en las curvas de incremento en altura. Las concentraciones más altas de amigdalina pura y desde extractos ejercen una marcada reducción en la tasa de crecimiento final, ello por la posible existencia de otros compuestos alelopáticos diferentes a la amigdalina (prunasina, monofenoles u otros), etc. Esto es acorde con lo establecido por Swain y Poulton (1994) e Inderjit et al. (1999) que citan a la prunasina y la azlequina respectivamente, como importantes inhibidores alternativos a la amigdalina.

44

Tabla 5.4. Comparación múltiple de medias de diámetros de plántulas (mm) a través de la Prueba de t de Student (medias derivadas de 20 plántulas y 5 fechas de medición).

Tratamiento T0 T6 T2 T3 T4 T7 T5 T1

Dosis Suelo sano Suelo extracto de raíces Suelo 500 ppm amigdalina Suelo 1000 ppm amigdalina Suelo 2000 ppm amigdalina Suelo extracto de raíces y semillas Suelo extracto de semillas Suelo de replante

Medias* 2,93 2,85 2,80 2,79 2,69 2,65 2,65 2,63 a ab ab ab b b b b

*Medias con la misma letra no son estadísticamente significativas al 0,5% de significancia.

De acuerdo a esto, el tratamiento 6 resultó en un incremento de la altura mayor que el experimentado por el tratamiento inmediatamente siguiente, el T2, le siguen en orden decreciente T3, T4, T7 y T5. Si bien la ubicación del tratamiento T6 por sobre el T2 en este caso es diferente de la manifestada por el análisis de altura anterior, esto puede sustentarse en que no existen diferencias significativas entre estos tratamientos, del mismo modo que con el tratamiento 3, por lo tanto no podría argumentarse fehacientemente acerca de la real implicancia de cada tratamiento en el comportamiento del diámetro de plántulas. Por el contrario, los diámetros de los tratamientos T5 y T7 exhibieron idéntico ordenamiento al indicado en la altura, vale decir el extracto de raíces y semillas se posicionó por sobre el tratamiento que contenía sólo semillas. Esto puede deberse a la existencia en el tratamiento 5 por sí sólo de una mayor concentración de semillas, en cuyo composición se postula contendría otros principios alelopáticos distintos a la amigdalina y que pudieran tener acción inhibidora del crecimiento. Esto está apoyado por los resultados del análisis entregado respecto de la concentración de amigdalina en raíces y semillas, en el cual se determinó cantidades mayores del cianoglucósido en los extractos de semillas que en los de raíces. Lo anterior indica que ante concentraciones iguales de ambos extractos tendría supuestamente un mayor efecto el de semillas por su cantidad mayor de amigdalina por gramo de materia seca.

45

4.0

Diámetro (mm)

3.0

2.0

Lineal (Trat.0) Lineal (Trat.3) Lineal (Trat.2)

1.0

Lineal (Trat.4)

0.0 01-Oct

21-Oct 10-Nov 30-Nov

20-Dic

09-Ene 29-Ene 18-Feb

Fecha

Figura 5.3. Expresión del crecimiento de plántulas en diámetro (mm) en el tiempo para los tratamientos testigo, con aplicación de 500 ppm de amigdalina (T2), de 1000 ppm de amigdalina (T3) y 2000 ppm de amigdalina (T4).

5,0

4,0 Diámetro (mm)

3,0 Lineal (Trat.0) 2,0 Lineal (Trat.6) Lineal (Trat.5) 1,0 Lineal (Trat.7)

0,0 01-Oct

21-Oct

10-Nov

30-Nov 20-Dic Fecha

09-Ene

29-Ene

18-Feb

Figura 5.4. Expresión del crecimiento de plántulas en diámetro (mm) en el tiempo para los tratamientos testigo, con aplicación de extracto de raíces (T6), de extracto de semillas y raíces (T7) y extracto de semillas (T5).

46

5.3. Materia seca final en plántulas La materia seca mostró diferencias más sustanciales al ser evaluada como total, en el análisis de varianza de diferencias de medias, que en forma separada (hojas, tallos y raíces) a un nivel de confianza de 99% (Tabla 5.5, Tabla 5.7, Tabla 5.9 y Tabla 5.11), no obstante el análisis de raíces fue más indicativo que los de tallos y hojas por separado. Al observar los resultados arrojados por el índice materia seca en hojas, se obtuvo diferencias significativas al 95% con la prueba de t (Tabla 5.6) para tres agrupaciones de tratamientos claras; T2, T4, T0 y T3 por un lado como los de mayor incidencia en el aumento de materia seca, seguidos inmediatamente por T6, T5 y T7 con una tasa menor y finalmente T1, por sí sólo, influyendo negativamente sobre este parámetro.

Tabla 5.5. Análisis de varianza de materia seca de hojas en plá ntulas (grs).

Fuente de Variación Entre tratamientos Dentro de tratamientos Total corregido

g.l. 7 72 79

Suma de cuadrados 2,5493 13,8713 16,4206

Cuadrado medio 0,3641 0,1926 -

Valor de F 1,89 Significativo al 10%

Tabla 5.6. Comparación múltiple de medias de materia seca de hojas de plántulas (grs) a través de la Prueba de t de Student (medias derivadas de 10 plántulas por tratamiento).

Tratamiento T2 T4 T0 T3 T6 T5 T7 T1

Dosis Suelo 500 ppm amigdalina Suelo 2000 ppm amigdalina Suelo sano Suelo 1000 ppm amigdalina Suelo extracto de raíces Suelo extracto de semillas Suelo extracto de raíces y semillas Suelo de replante

Medias* 0,710 0,700 0,603 0,590 0,455 0,435 0,320 0,163 a a a a ab ab ab b

*Medias con la misma letra no son estadísticamente significativas al 0,5% de significancia.

47 En tallos las diferencias se presentaron diferencias significativas entre las agrupaciones T6, T3, T4 y T2, como la de mayor expresión, luego T0, posteriormente T5 y T7 y finalmente T1 (Tabla 5.8).

Tabla 5.7. Análisis de varianza de materia seca de tallos en plántulas (grs).

Fuente de Variación Entre tratamientos Dentro de tratamientos Total corregido

g.l. 7 72 79

Suma de cuadrados 8,2778 18,8870 27,1648

Cuadrado medio 1,1825 0,2623 -

Valor de F 4,51 Significativo al 1%

Tabla 5.8. Comparación múltiple de medias de materia seca de tallos de plántulas (grs) a través de la Prueba de t de Student (medias derivadas de 10 plántulas por tratamiento).

Tratamiento T6 T3 T4 T2 T0 T5 T7 T1

Dosis Suelo extracto raíces Suelo 1000 ppm amigdalina Suelo 2000 ppm amigdalina Suelo 500 ppm amigdalina Suelo sano Suelo extracto de semillas Suelo extracto de raíces y semillas Suelo de replante

Media 1,97 1,67 1,66 1,62 1,55 1,16 1,10 0,98 a a a a a b b c b c c

*Medias con la misma letra no son estadísticamente significativas al 0,5 % de significancia.

Como fue establecido previamente, la materia seca en raíces (Tabla 5.10) mostró efectos más diferenciados conforme varió la concentración de amigdalina aplicada que su similar en hojas y tallos. Consistentemente con esto, el tratamiento de mayor influencia en el incremento de este índice como era esperable fue T0, alcanzado cercanamente por T2. Por su lado T3, T6 y T4 no presentan diferencias significativas entre sí y siguen a los tratamientos anteriores, mientras que T7 y T5 en un mismo grupo constituyen dosis con menor

48 efecto sobre este parámetro. Finalmente, el suelo de replante es el con menores tasas de aumento de materia seca radicular.

Tabla 5.9. Análisis de varianza de materia seca de raíces en plántulas (grs).

Fuente de Variación Entre tratamientos Dentro de tratamientos Total corregido

g.l. 7 72 79

Suma de cuadrados 49,6895 100,1180 149,8075

Cuadrado medio 7,0985 1,3905 -

Valor de F 5,10 Significativo al 1%

Tabla 5.10. Comparación múltiple de medias de materia seca de raíces de plántulas (grs) a través de la Prueba de t de Student (medias desde 10 plántulas).

Tratamiento T0 T2 T3 T6 T4 T7 T5 T1

Dosis Suelo sano Suelo 500 ppm amigdalina Suelo 1000 ppm amigdalina Suelo extracto de raíces Suelo 2000 ppm amigdalina Suelo extracto de raíces y semillas Suelo extracto de semillas Suelo de replante

Media* 3,87 a 3,24 a b 2,71 b c 2,39 b c 2,27 b c 2,06 c d 1,79 c d 1,17 d

*Medias con la misma letra no son estadísticamente significativas al 0,5% de significancia.

Los tratamientos se presentaron, en forma decreciente de acción sobre el aumento la materia seca total, con el orden T0, T2, T3, T6, T4, T7, T5 y T1 (Tabla 5.12 y Figura 5.5). Esto principalmente como consecuencia de las concentraciones crecientes de amigdalina aplicada, la probable expresión y acción de otros compuestos con acción alelopática (sean o no cianoglucósidos) en extractos vegetales (principalmente semillas), la posible presencia de factores bióticos y abióticos prevalentes en el suelo alelopático como consecuencia de una anterior plantación, etc.

49

Esto es acorde a lo establecido por Mai y Abawi (1981) que indican que un suelo con antecedentes de antiguas plantaciones pueden tener condiciones creadas más propicias para generar inhibición en el crecimiento de una nue va plantación producto de la selección artificial aplicada al iniciar el establecimiento con monocultivos.

Tabla 5.11. Análisis de varianza de materia seca total de plántulas (grs).

Fuente de Variación Entre tratamientos Dentro de tratamientos Total corregido

g.l. 7 72 79

Suma de cuadrados 107,8522 224,1139 331,9661

Cuadrado medio 15,4074 3,1126 -

Valor de F 4,95 Significativo al 1%

Tabla 5.12. Comparación múltiple de medias de materia seca total de plántulas (grs) a través de la Prueba de t de Student (medias desde 10 plántulas).

Tratamiento T0 T2 T3 T6 T4 T7 T5 T1

Dosis Suelo sano Suelo 500 ppm amigdalina Suelo 1000 ppm amigdalina Suelo extracto de raíces Suelo 2000 ppm amigdalina Suelo extracto de semillas Suelo extracto de raíces y semillas Suelo de replante

Medias* 6,02 5,57 4,97 4,81 4,63 3,48 3,38 2,31 a a a b a b c a b c b c d c d d

*Medias con la misma letra no son estadísticamente significativas al 0,5% de significancia.

50

7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 T0 T1 T2 T3

MS hojas MS tallos MS raíces MSTotal

Materia Seca (grs)

T4

T5

T6

T7

Tratamientos

Figura 5.5. Efecto de la concentración de los distintos tratamientos sobre el peso de la materia seca final (grs) en hojas, tallos, raíces y total.

5.4 Largo radicular Conforme a lo obtenido en el análisis de varianza de las medias de largo de raíces, para cada uno de los tratamientos, se puede establecer que hubo diferencias significativas al 0,5 % de significancia (Tabla 5.13).

Tabla 5.13. Análisis de varianza de largo de raíces de plántulas (cms).

Fuente de Variación Entre tratamientos Dentro de tratamientos Total corregido

g.l. 7 72 79

Suma de cuadrados 72,07 318,14 390,21

Cuadrado medio 10,29 4,41 -

Valor de F 2,33 Significativo al 5%

Por lo tanto, a la aplicación del método de comparación múltiple de medias se comprobó que el tratamiento testigo (T0) y el con 500 ppm de amigdalina (T2) constituían los más representativos en cuanto a la expresión en longitud de raíces, mientras que el tratamiento

51 con suelo alelopático (T1) era su contraparte en la manifestación de los resultados más inhibidores al crecimiento radicular. Los tratamientos restantes T3 y T6, T4 y T7, y finalmente T5, en esta agrupación, se situaron en forma intermedia a los tratamientos previamente presentados, en relación con su efecto sobre el largo final de raíces. Esto es T3 y T6 se ubicaron en segunda posición de acuerdo con su relativa inhibición al crecimiento radicular y T5, superando estrechamente a T1 (Tabla 5.14 y Figura 5.6). La explicación a estos hechos yace en los mismos supuestos, bases y apreciaciones establecidos para los parámetros de crecimiento medidos previamente. Si bien Oh y Carlson (1976) sólo mostraron resultados respecto de la materia seca en raíces y no en relación con la longitud radicular, ellos demuestran que este parámetro se ve afectado en gran medida por los factores alelopáticos indicados. Puede postularse además, con base en lo predicho por Díaz et al. (1985), que el sistema radicular es el órgano vegetal directamente enfrentado a las condiciones impuestas por los tratamientos y por ende es esperable que manifieste evidentemente el efecto, para el caso de este ensayo, en materia seca y longitud.

Tabla 5.14. Comparación múltiple de medias de largo radicular de plántulas (cms) a través de la Prueba de t de Student (medias derivadas de 10 plántulas por tratamiento).

Tratamiento T0 T2 T3 T6 T4 T7 T5 T1

Dosis Suelo sano Suelo 500 ppm amigdalina Suelo 1000 ppm amigdalina Suelo extracto raíces Suelo 2000 ppm amigdalina Suelo extracto semillas Suelo extracto raíces y semillas Suelo de replante

Medias* 15,25 14,87 14,40 14,15 13,65 13,58 12,91 12,17 a a a a a a

b b b c b c b c c

*Medias con la misma letra no son estadísticamente significativas al 0,5% de significancia.

52

20.0

Largo radicular (cms)

18.0 16.0 14.0 12.0 10.0 Am.1000ppm Am.2000ppm Am.500ppm semillas+raíces alelopatía Testigo Raíces raíces

Tratamiento

Figura 5.6. Expresión del crecimiento en longitud radicular final (cms) para los distintos tratamientos.

Ello puede deberse a causas ya descritas anteriormente y que tienen que ver con las concentraciones relativas de amigdalina, la presencia de otros compuestos con acción alelopática sobre la materia vegetal y la existencia de factores directamente relacionados con antecedentes de replante.

5.5. Concentración de cianuro final en el suelo El cianuro desprendido desde amigdalina pura o procedente de los extractos vegetales, fue medido por métodos químicos apropiados (establecido previamente). Luego de dicha determinación, los datos evaluados por medio de análisis de varianza entregaron diferencias significativas entre medias de cianuro residual en los suelos de cada tratamiento a un nivel de confianza del 99% (Tabla 5.15).

53 Tabla 5.15. Análisis de varianza de concentración de cianuro en el suelo (ppm).

Fuente de Variación Entre tratamientos Dentro de tratamientos Total corregido

g.l. 7 792 799

Suma de cuadrados 55,6253 25,7944 81,4197

Cuadrado medio 7,9464 0,8060 -

Valor de F 9,86 Significativo al 1%

Al graficar las concentraciones de cianuro por tratamiento, los datos representaron una curva logarítmica que indica, a su confrontación con su homóloga de concentración inicial de amigdalina, que existen ciertas dosis (tratamientos) de cianoglucósidos que persisten en el suelo y no sufren lixiviación, volatilización (como ácido cianhídrico) y/o adsorción por las partículas y minerales del suelo (Figura 5.7). Además que esas concentraciones se corresponden adecuadamente con las dosis medias de cianoglucósidos aplicados, puesto que en las dosis más altas y más bajas existe gran pérdida proporcional (respecto de la dosis inicial aplicada) de cianuro desde el suelo, mientras que en las dosis medias el porcentaje de persistencia de cianuro en el suelo es mucho mayor. Esto pudiera ser debido a que la amigdalina en concentraciones menores, descontando la parte que naturalmente pueda ser absorbida por la planta, tendería a ser mayormente degradada y sus subproductos ser altamente lixiviados o percolados desde la solución del suelo. Por otro lado, las concentraciones en su rango mayor podrían causar un efecto tóxico o competitivo sobre los factores bióticos y/ó abióticos, respectivamente, que ejercen degradación sobre la amigdalina, impidiendo una activa transformación de la misma (Tabla 5.16) (Gleadow, 2002). No obstante lo anterior y conforme a los resultados obtenidos, gran parte de los subproductos derivados de la amigdalina (entre ellos el cianuro) tienen comprobada implicancia en el crecimiento de las plántulas expuestas a su efecto, dado que se han obtenido datos que confirman tal apreciación (inhibición en altura, diámetro, materia seca total y longitud radicular) y a lo establecido respecto a ello por Rice (1974) e Inderjit et al. (1999). Con respecto a este parámetro de medición, no se encontró en la literatura bases comprobatorias directas que permitiesen fundamentar de manera adecuada los resultados

54 obtenidos. Meehan (2000) realizó ciertas consideraciones acerca de la presencia de cianuro en el suelo, pero sólo respecto de la dinámica de transformación y no sobre la residualidad y persistencia en el suelo. Por otro lado, Strobel (1967), citado por Rice (1974), indica que existen ciertas concentraciones de cianuro en el suelo, preferentemente aquellas cercanas a 2000 ppm, que crearían una suerte de toxicidad en el medio para los microorganismos presentes, mientras que otras mucho menores estarían sujetas a la acción microbiana ó de factores físico – químicos del medio ambiente.

Tabla 5.16. Comparación múltiple de medias de concentración final de cianuro (CN-) en el suelo (ppm) a través de la Prueba de t de Student (promedio de 5 muestras).

Tratamiento T4 T5 T7 T3 T6 T2 T1 T0

Dosis Suelo 2000 ppm amigdalina Suelo extracto semillas Suelo extracto raíces y semillas Suelo 1000 ppm amigdalina Suelo extracto raíces Suelo 500 ppm amigdalina Suelo de replante Suelo sano

Medias* 3,56 3,16 3,04 2,76 2,71 1,55 0,62 0,16 a a a a b a b b b c c

*Medias con la misma letra no son estadísticamente significativas al 0,5% de significancia.

Para el caso de este índice, si bien la comparación múltiple de medias ind icó un ordenamiento significativo respecto de los tratamientos, o sea las menores dosis de amigdalina entregaron finalmente una menor concentración de cianuro final en el suelo y las mayores dosis determinaron concentraciones mayores, esto no se condice con la relación porcentual entre la dosis potencial de cianuro aplicada inicialmente y la concentración detectada finalmente que ha juicio de este trabajo parece más pertinente e indicativa para su examen. Debido a esto el análisis más representativo lo constituye visualizar la relación porcentual previamente establecida (Tabla 5.16).

55

2500.0 y = 1.7816Ln(x) - 0.1747

4.000

Concentración inicial de amigdalina (ppm)

2000.0

3.000 2.500

1500.0 y = 309.08x - 282.44 1000.0

2.000 1.500 1.000

500.0

Dosis Amigdalina inicial (ppm) Concentración cianuro (ppm)
T0 T1 T2 T3 T6 T7 T5 T4

0.500 0.000 -0.500 -1.000

0.0

Tratamiento

Figura 5.7. Dosis de amigdalina (ppm) aplicada inicialmente a cada tratamiento y la concentración de cianuro residual en el suelo (ppm) producto de esa aplicación.

Concentración final de CN- en el suelo (ppm)

3.500

56 6. CONCLUSIONES •

El crecimiento en

altura y diámetro en plántulas de Nemaguard, de acuerdo a los

resultados experimentales, es dependiente de las dosis de amigdalina pura que se presentan en el suelo a su establecimiento. • Si bien, la materia seca cuantificada por órganos vegetales separados (hojas, tallos y raíces) no es un parámetro lo suficientemente fehaciente para clarificar el efecto de la amigdalina y sus subproductos en las plántulas, si lo es la medición de materia seca total que muestra una relación adecuada entre el grado de inhibición obtenido en relación con la dosis y composición de los tratamientos. • Del mismo modo, la longitud radicular se presentó diferenciada de acuerdo al tipo y dosis del tratamiento aplicado, con significativa disminución en la tasa de crecimiento conforme aumenta la dosis de cianoglucósido puro o de extracto. • El grado de efecto de este cianoglucósido sobre dichos parámetros se correlaciona estrechamente tanto con el nivel de la dosis aplicada, como con la posible existencia de otros compuestos, procedentes de residuos vegetales de especies de Prunus, con similar acción alelopática a la de la amigdalina. Ello queda demostrado en la disminución proporcional de los índices de crecimiento (altura, diámetro, materia seca y longitud radicular) conforme se incrementa la dosis y composición de principios alelopáticos. El tratamiento con suelo de replante fue el que ejerció el efecto más negativo de todos por la posible presencia de factores inhibitorios adicionales. • Las concentraciones de cianuro residuales expresaron un comportamiento altamente relacionado con la dosis de amigdalina aplicada inicialmente, dado que en las dosis más altas y más bajas de este cianoglucósido la cantidad de cianuro porcentual en el suelo fue menor que las encontradas para las dosis intermedias. Ello originado supuestamente por la existencia de mecanismos de pérdida por lixiviación y volatilización de HCN y/ó por la expresión de una cierta toxicidad en el medio. • Finalmente, se puede establecer que a diferencia del tratamiento testigo (T0) que mostró tasas de crecimiento mayores, le siguieron paulatinamente en incremento de inhibición de dichas tasas el tratamiento con 500 ppm, 1000 ppm y extracto de raíces, 2000 ppm y extracto de semillas y en último lugar el suelo de replante.

57 7. BIBLIOGRAFÍA

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63

8. ANEXO

64 Tabla 3.1. Algunos mecanismos postulados para la biodegradación de compuestos del cianuro, los organismos bacterianos responsables de la degradación y las ecuaciones relevantes. Citado por Meehan (2000).
Condiciones Compuesto degradado Microbio Reacción Referencia*

NADH + H+ + O2 HCN vía HNCO P. fluorescens HCNO + H2 O

HCN + H2 O + NAD+ Raybuck, 1992

CO 2 + NH3

HCN

Stemphylium loli

HCN + H2 O

HCONH 2

Knowles, 1988

Alcalygenes HCN Aeróbicas xyloxidans Subs. denitrificans No establecida en la literatura Ingvorsen et al., 1991

NaCN

P. putida

No establecida en la literatura

Chapatwala et al., 1995

KCN

P. slutzeri AK61

No establecida en la literatura

Watanabe et al., 1998 Skowronski y Strobel, 1969; Meyers et al., 1993

KCN

Bacillus pumilis

No establecida en la literatura

Cianuros orgánicos

P. aeruginosa
Cultivos mixtos – los

No establecida en la literatura

Nawas et al., 1991

Anaeróbicas

microorganismos

HCN

anaeróbicos específicos no fueron determinados

HCN + 2H2 O

HCOO- + NH4 +

Fallon, 1992; Nagle, 1995

65 FOTOSÍNTESIS piruvato carbohidratos ácido dehidroshikímico
TANINOS HIDROLIZABLES
ÁCIDO DIGÁLICO

ÁCIDO GALICO y ÁCIDO PROTOCATECHUICO

ácido shikímico

AMINOÁCIDOS y POLIPÉPTIDOS ALCALOIDES, CIANOHIDRINAS y GLUCÓSIDOS CIANOGÉNICOS

acetato

aminoácidos
PURINAS Y NUCLEÓSIDOS SULFUROS y ACEITES GLICÓSIDOS DERIVADOS DEL ÁCIDO CINÁMICO FENOLES SIMPLES, DERIVADOS DEL ÁCIDO BENZOICO

ácido mevalónico

CUMARINAS FLAVONOIDES TANINOS CONDENSADOS
ÁCIDOS ORGÁNICOS SOLUBLES, ALCOHOLS DE CADENA SIMPLE, ALDEHÍDOS ALIFÁTICOS Y CETONAS. LACTONAS INSATURADAS SIMPLES

TERPENOIDES Y ESTEROIDES

ÁCIDOS GRASOS DE CADENA LARGA NAFTOQUINONAS, ANTRAQUINONAS Y QUINONAS COMPLEJAS

Figura 3.1. Rutas Biosintéticas Generales más probables para la producción de las varias categorías de agentes alelopáticos presentes en plantas. Extraído de Kingsbury (1964).

66

Figura 3.2. Esquema general de biosíntesis de glucósidos cianogénicos desde un á aminoácido. Tomado de Vetter (2000).

-

67

Figura 3.3. Biosíntesis de los glucósidos cianogénicos Amigdalina y Prunasina desde el aminoácido Fenilalanina. Modificado de Hulme (1970).

Figura 3.4. Ruta simplificada de catabolismo de glucósidos cianogénicos en Prunus. Modificado de Laurens (2000).

68

Figura 3.5. Esquema particular de reutilización y catabolismo de cianoglucósidos en Prunus. Extraído de Swain y Poulton (1994).

69

Figura 3.6. Niveles de los cianoglucósidos amigdalina y prunasina en plántulas en desarrollo de Prunus serotina. Los niveles de amigdalina y prunasina fueron estimados dentro de los cotiledones (C), epicotilos (E) e hipocotilos (H) de plántulas en cuatro etapas específicas (etapas 1 – 4). En cada etapa las barras izquierda y derecha representan datos obtenidos de plántulas crecidas de semillas colectadas en dos años consecutivos. Extraído de Swain y Poulton (1994).

70

Figura 3.7. Niveles de Amigdalina Hidrolasa (AH), Prunasina Hidrolasa (PH) y Mandelonitrilo Liasa (MDL) en plántulas en desarrollo de Prunus serotina. Los niveles enzimáticos son indicados dentro de los cotiledones (C), epicotilos (E) e hipocotilos (H). En cada etapa las barras izquierda y derecha representan datos obtenidos de plántulas crecidas de semillas colectadas en dos años consecutivos. Debido a que la AH se halla sólo en cotiledones, no se indican los contenidos de la enzima en otros órganos. Tomado de Swain y Poulton (1994).

71

Figura 3.8. Contenido de glucósidos cianogénicos en frutos enteros (A), semillas (B) y pericarpio (C) durante el desarrollo de frutos en árboles de Prunus serotina. La prunasina (o) y la amigdalina ( ) fueron extraídas de tejidos macerados e hidrolizados enzimáticamente. Cada punto representa la media de dos replicaciones, cuya variabilidad no excede las dimensiones del símbolo mostrado. Obtenido de Swain et al. (1992a).

72

Figura 3.9. Niveles de actividad relativa de hormonas catabólicas (AH, PH y MDL) durante la maduración de frutos en árboles de Prunus serotina. Las actividades enzimáticas son expresadas por fruto (o) ó por gramo de peso fresco ( ). Cada punto representa la media de tres replicaciones, cuya variabilidad no excede las dimensiones del símbolo mostrado. Extraído de Swain et al. (1992a).

73

Figura 3.10. Vista general de los procesos intervenidos y afectados por la acción de aleloquímicos (en especial fenoles) en plantas receptoras (de acuerdo a Sampietro, 2001).

Figura 3.11. Esquema representativo de los principales mecanismos de liberación de compuestos alelopáticos desde las plantas (De acuerdo a Inderjit et al., 2001).

74

Figura 3.12. El ciclo del nitrógeno incorpora cianuro como HCN. Este ácido es degradado a la forma más reducida de nitrógeno, amonio, la cual es entonces susceptible a cambios en el potencial redox de la solución. i: fijación de nitrógeno; ii: oxidación de amonio a nitrato; iii: oxidación de nitrito a nitrato; iv: reducción asimilatoria de nitrato a nitrito; v: reducción de nitrito a óxido nítrico; vi: reducción de óxido nítrico a óxido nitroso; vii: reducción de óxido nitroso a nitrógeno; balance de la reducción asimilatoria y la fermentación de nitrito a amonio; ix: asimilación de amonio. La desnitrificación puede ocurrir vía v, vi, vii o en a través de desnitrificación directa desde nitrato a nitrógeno Extraído de Meehan (2000).

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