Está en la página 1de 70

Universidad Santo Tomas

Escuela Tecnologa Mdica

Gua Trabajos Prcticos

Hematologa Bsica y Clnica

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

INDICE
Toma de muestra de sangre....... ..4
Anticoagulantes en tcnicas hematolgicas....................................................................................................8
Frotis sanguneo............14
Tincin May Grnwald Gimsa.............17
Hematocrito.................................................................19
Determinacin de hemoglobina.................... 22
ndices Eritrocitarios.....................24
Recuento de Leucocitos... .... .25
Velocidad de sedimentacin................................................................27
Recuento de reticulocitos .................................................................28
Variables Pre analticas en pruebas de coagulacin.31
Recuento de plaquetas en cmara.....33
Tiempo de sangra................................................................35
Tiempo de retraccin del coagulo.........36
Tiempo de protrombina...........37
Tiempo de tromboplastina parcial activado ....40
Productos de degradacin de la fibrina dmero D.41
Tiempo de trombina...........................42
Determinacin de fibringeno.................45
Determinacin cuantitativa de factores de la coagulacin....47
Antitrombina III..................49
Glosario de trminos usados en hematologa.............52
Ferremia.......57
Resistencia osmtica de eritrocitos.......60
Electroforesis de hemoglobina...63
Hemoglobina fetal..............65
test de Screening para la deficiencia de G6PD.....67
Cuerpos Heinz............68
Tincin de hemosiderina medular...70

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

Parte I
Hematologa Bsica:
Tcnicas Bsicas de Hematologa

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

TOMA DE MUESTRA DE SANGRE


Para el estudio de la sangre debe extraerse del organismo y en ocasiones fraccionarse en
sus componentes: plasma o suero y clulas. La extraccin sangunea ms utilizada es la puncin
venosa y capilar. De la misma manera que cualquier otra prctica mdica la extraccin sangunea
debe realizarse bajo los estndares de un adecuado control de calidad ya que los resultados de los
anlisis en muchas ocasiones dependen de esta prctica ya que es una de las etapas pre analticas
ms importantes.
OBTENCIN DE MUESTRA POR PUNCIN VENOSA.
Constituye el tipo de extraccin ms comnmente empleado,
Todas las muestras deben ser tratadas como potencialmente infecciosas, por lo tanto es
indispensable aplicar todas las tcnicas de Bioseguridad.
Materiales:
Jeringa desechable estril o sistema Venoject, Agujas estriles:
o Nios: 22 G
o Adultos: 19G- 21G
Mesa Killian o sistema de extraccin con una superficie para apoyar el brazo extendido.
Ligadura o torniquete
Alcohol etlico al 70% o o clorhexidina 0.5%
Trulas de algodn, parches.
Procedimiento:
1.

Rotular la etiqueta del tubo con los datos del paciente que vienen en la Orden de Solicitud de
Examen (Nombre paciente, Nmero Ficha, Fecha etc.).
2. Ubicar al paciente siempre en una misma posicin, puede ser sentado o decbito dorsal.
3. Lavarse las manos y ponerse guantes.
4. Localizar la vena adecuada para la puncin, que sea fcilmente palpable y en lo posible visible.
Figura 1. Habitualmente se usan las ubicadas en la fosa antecubital (mediana cubital o ceflica).
Pedir al paciente que cierre la mano.
Palpar y seguir el trayecto de la vena con el dedo ndice.
En caso de fracaso, linfoedema o de tratamiento endovenoso intentar en el otro brazo.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

FIG 1. Venas superficiales del Brazo

5. Limpiar el sitio de puncin usando algodn con etanol 70%, con un movimiento circular desde el
centro a la periferia. Esperar a que la piel este se seque, porque si introduce alcohol en la guja
puede producir hemlisis.
Si se presenta dificultad en el sitio de puncin, puede palparse nuevamente con el dedo ndice,
para lo cual debe limpiarse este con alcohol.
6. Revisar que no haya filtracin de aire entre la guja y la jeringa. Con sistema Venoject se conecta la
aguja en el adaptador.
7. Aplicar un torniquete para favorecer la estasis venosa, como alternativa se usar un
esfigmomanmetro a una presin de 60 mmHg. Un torniquete por ms de un minuto produce un
aumento de hematocrito. En caso de excederse en el tiempo debe esperar un mnimo de 2
minutos antes de aplicarlo nuevamente.
El torniquete se coloca 7 10 cm ms arriba del sitio de puncin.
8. Indicar al paciente que cierre la mano
9. Sujetar el brazo del paciente usando el pulgar para estirar la piel.
10. Puncionar la piel del paciente con el bisel hacia arriba en el sitio elegido y canalizar la vena con la
guja (Fig. 2). Extraer la cantidad de sangre necesaria a un flujo continuo, sin ejercer aspiracin
excesiva para evitar hemlisis. Con sistema Venoject se conecta directamente el tubo al vaco al
sistema de extraccin.

FIG 2. Tcnica Venopuncin.

11. Indicar al paciente que abra la mano.


12. Soltar el torniquete antes de retirar la aguja
13. Colocar un algodn seco sobre el sitio de veno puncin y retirar la guja aplicando suave presin
sobre el algodn. Dejar el algodn e instruir al paciente que mantenga la presin por un par de
minutos.
14. Si se necesitan frotis sanguneos, colocar una gota sobre dos o tres portaobjetos limpios, antes de
separa la aguja de la jeringa y hacer los extendidos.
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

15. Separar la guja de la jeringa en forma segura depositando la aguja en un safebox y depositar la
sangre en los frascos en la cantidad necesaria.
16. Si los frascos contienen anticoagulante, homogeneizar suavemente por a lo menos 5 minutos
manualmente o en agitador mecnico.
17. Retrese los guantes y lvese las manos.
Recomendaciones para la extraccin de sangre:
a) La hemolisis de previene usando aguja 21G, evitando la presin de aspiracin excesiva
durante la extraccin. Evitar extraer de un sitio con equimosis, hematomas y durante la
homogenizacin de la agitacin del tubo debe ser suave
b) El hematoma se previene removiendo el torniquete antes de retira la aguja, puncionando
solo la pared anterior de la vena.
OBTENCION DE MUESTRA CAPILAR
El propsito es obtener muestras sanguneas para distintos parmetros del hemograma.
Aunque se prefiere la muestra venosa, su obtencin por esta va se justifica en pacientes peditricos
(menores de 1 ao), oncolgicos, obesos mrbidos y para determinaciones de point of care.
Materiales:
Lanceta estril
Tubos capilares
Alcohol 70% o clorhexidina 0.5%
Procedimiento:
1. Ubicar el punto de extraccin, puede ser el lbulo de la oreja, el pulpejo del dedo o la regin
lateral de la falange terminal. (Fig 3). En un lactante puede ser la planta del pie en las regiones
laterales. (Fig. 4)
2. Asegurarse que la piel este tibia e hiperhmica. En el caso de piel fra, es conveniente la
irrigacin sangunea en forma mecnica.
3. Limpiar el sitio de puncin usando algodn con etanol 70% y dejar secar espontneamente.
4. Tomando firmemente el dedo, lbulo o taln se punciona con una lanceta estril. La incisin
debe ser de 2 mm de profundidad.
5. Se elimina la primera gota de sangre con un algodn seco.
6. La sangre debe fluir libremente. En caso de ejercer presin no debe producirse cianosis del
dedo.
7. Mediante el uso de tubos capilares se saca la sangre necesaria. Las muestras para
hematocritos se toman directamente en capilares heparinizados llenado por lo menos 2/3 del
tubo. Y deben ser sellados con plasticina introduciendo el tubo unos 3 a 4 mm y girndolos
entre los dedos ndice y pulgar.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

8. Se pueden realizar preparados de extensiones sanguneas o frotis sanguneos directamente


para estudio morfolgico sobre el portaobjeto limpio y seco.
Fuentes de error:
El hematocrito puede estar falsamente aumentado por una presin exagerada o
mantenida durante un tiempo excesivo en el proceso de extraccin.
Recuento de plaquetas falsamente disminuido por la liberacin de tromboplastina
consecutiva al dao tisular por la puncin.
En el caso de edema la puncin capilar dar una falsa disminucin de todos los elementos
sanguneos.

Fig.3 Regin de puncin capilar en el dedo.

Fig 4. Regin de puncin capilar en la planta del pie de un lactante

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

ANTICOAGULANTES EN TECNICAS HEMATOLOGICAS


Para el estudio citolgico o cuantitativo de la sangre perifrica, mdula sea o citologa de
lquidos biolgicos, luego de la extraccin de la muestra es necesario mantenerla anticoagulada, esto
se realiza mediante procesos fsicos o qumicos, algunos de ellos especficos para determinadas
tcnicas, por lo que la eleccin del anticoagulante en cuanto a tipo, concentracin y su relacin
anticoagulante/sangre, es un proceso fundamental. As mediante distintos procesos podemos
obtener:
1. Sangre coagulada y desfibrinada
La coagulacin de la sangre es un proceso que aparece espontneamente pasado los 5
a 10 minutos de realizada la extraccin. En una primera etapa, la sangre se transforma en una
masa semislida de color rojo, llamada cogulo y luego aparecen dos fases bien diferenciadas:
el coagulo retrado (constituido por una red de fibrina que engloba las clulas sanguneas) y el
suero, lquido de composicin similar al plasma, pero del que se diferencia, por carecer de
fibringeno y de la mayora de los factores de la coagulacin.
El suero, se emplea en casi todos los estudios bioqumicos habituales y el cogulo en
hematologa, suele utilizarse principalmente para la determinacin de clulas LE o tambin
llamadas clulas de lupus, poco utilizado en la actualidad.
Cuando se desea obtener simultneamente suero y clulas sin contaminacin
plaquetaria la sangre debe someterse a una desfibrinacin en donde la sangre es puesta en un
matraz Erlenmeyer, que contengan perlas de vidrio, a razn de 1 perla por cada 1 ml de
sangre. Se agita por rotacin permanente hasta obtener la fibrina adherida a las perlas.
Este es un mtodo muy poco usado en la actualidad.
2. Sangre anticoagulada o sin coagular
Si se necesita obtener plasma o estudiar algunas de las propiedades de la sangre total
o de alguno de sus componentes celulares, en especial plaquetas, es necesario aadir a la
sangre recin extrada un anticoagulante. Para ello debe elegir el anticoagulante idneo y en
la concentracin adecuada, procurando que exista una proporcin adecuada entre ste y el
volumen de sangre extrada.
Excepto la heparina, que acta inhibiendo la accin de la trombina, los restantes
anticoagulantes empleados habitualmente actan fijando el calcio (Ca++) y evitando con ello la
coagulacin sangunea. En hematologa, el anticoagulante idneo debe cumplir los siguientes
requisitos:
No alterar el tamao de los glbulos rojos
No producir hemlisis
Evitar al mximo la agregacin de las plaquetas
No alterar la morfologa de los leucocitos
ANTICOAGULANTES
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

1. Anticoagulantes slidos
a) Acido Etilendiaminotetraactico (EDTA)
El mecanismo de accin es la la quelacin del Ca++ necesario para la coagulacin sangunea,
de forma tal que al fijarlo, sin llegar a producir su precipitacin impide su actuacin y en
consecuencia la coagulacin sangunea.
El EDTA existe en forma de Sal di-sdica, di-potsica y tri-potsica.
La sal tripotsica dispensado en forma lquida ha sido recomendada en los Estados Unidos por
Clinical and Laboratory Standards Institute, sin embargo, la sangre entregada en esta solucin est
ligeramente diluida, y la sal de tri-potsica produce cierta contraccin de los eritrocitos, lo que
resulta en una disminucin de 2-3% del hematocrito en las 4 primeras horas de la recogida la
muestra, seguido de una disminucin gradual en el volumen corpuscular medio (MCV). Por el
contrario, hay cambios insignificantes cuando se utiliza la sal de di-potsica. En consecuencia el
Consejo Internacional para la Normalizacin en Hematologa (ICSH) ha recomendado K2EDTA
como el anticoagulante de eleccin para la recoleccin de muestras de sangre destinadas a la
medida de la cantidad de clulas de la sangre, as como para su clasificacin segn tamao.
La sal di-sdica es menos soluble que la sal tri-potsica, pero algo ms econmica.
El EDTA constituye actualmente un anticoagulante de eleccin en hematologa debido a que:
Mantiene la morfologa eritrocitaria y leucocitaria 3 horas en la realizacin del frotis
sanguneo, despus de la extraccin.
Asegura la conservacin de los elementos formes sanguneos durante 24 horas si la
sangre se mantiene a 40 C.
Al inhibir la aglutinacin de las plaquetas, facilita el recuento de las mismas o su
apreciacin semicuantitativa a partir del frotis.
Se administra e forma seca, por lo tanto no produce hemodilucin.
La concentracin recomendada de EDTA es de 1,5 0,25 mg/ml de sangre. Esta proporcin
debe cumplirse siempre, ya que un exceso de anticoagulante 2 mg/ml de sangre, puede
producir importantes modificaciones leucocitarias o de la morfologa de los glbulos rojos
como:
cambios degenerativos
retraccin celular con disminucin del valor del hematocrito
aumento de la concentracin de hemoglobina corpuscular media
disminucin del volumen corpuscular medio
Por el contrario, un exceso de sangre en relacin con la cantidad de anticoagulante conduce a
una insuficiente coagulacin sangunea y, con ello, la eventual formacin de microcogulos,
que pueden alterar las diversas pruebas diagnsticas. En este sentido, el empleo de tubos al
vaco con una cantidad constante de EDTA para un volumen determinado de sangre, tiene hoy
en da gran utilidad prctica puesto que simplifica y normaliza la toma de muestras
hematolgicas.
En el mercado existen tubos para hemogramas, preparados con EDTA incluido, para
pacientes adultos de 3 y 5 ml, peditricos de 1,5 ml y para recin nacidos de 0,5 ml. pueden
ser identificados fcilmente por la tapa de color lila. Tambin es posible encontrar EDTA
lquido o su sal para preparar Triplex III p.a. C10H14N2Na2O8 X 2 H2O P.M. 372,24 g/mol.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

Ejercicio:
Preparar una solucin al 2% de K2EDTA. Agregar 0,2 ml en un tubo khan y secar a 60700 C.
Qu cantidad de sangre debe agregar al tubo preparado anteriormente para la
muestra de sangre se mantenga anticoagulada sin producir alteraciones en la
morfologa ni en los recuentos celulares?
b) Mezcla de oxalato amnico y potsico mezcla de Wintrobe.
Este anticoagulante fue muy empleado en hematologa hace mucho tiempo atrs,
pero en la actualidad ha sido prcticamente substituido por el EDTA. Acta, a diferencia del
EDTA, por precipitacin del Ca++ con lo que inhibe el proceso de la coagulacin sangunea. Es
fcil de preparar, pero tiene el inconveniente que altera sensiblemente la morfologa
eritrocitaria, produciendo variaciones imprevisibles del volumen corpuscular medio VCM.
Se emplea en forma seca a partir de una mezcla de oxalato de amonio y oxalato
potsico en proporcin 3:2 respectivamente. La cantidad recomendada es de 2 mg de mezcla
por cada ml de sangre.
c) Heparina
Es un anticoagulante fisiolgico heparienoide natural y, por tanto ideal para evitar la
coagulacin sangunea in vivo. El nombre heparina proviene del griego Hepar que significa
hgado, ya que fue aislada por primera vez en hepatocitos y estructuralmente es un
mucopolisacrido cido. Presenta el inconveniente que si no se agita rpida y uniformemente
con la sangre inmediatamente despus de extrada, pueden formarse micro cogulos. Aunque
tiene la ventaja de no alterar el volumen eritrocitario, causa menos hemlisis que el EDTA y no
altera la morfologa de los leucocitos, la heparina altera el recuento de leucocitos por causar
agregacin leucocitaria. Su empleo no es recomendable para la realizacin del frotis
sanguneo, porque con los colorantes habituales usados en hematologa produce una
coloracin de fondo excesivamente azul-rosada. Este fenmeno se intensifica sensiblemente
cuando en el plasma existen protenas anormales debido al consiguiente cambio de pH.
Se utiliza en la actualidad para la tcnica de fragilidad osmtica, citogentica,
gasometra sangunea y es el nico anticoagulante que adems de usarse para recolectar
sangre, se utiliza como tratamiento anticoagulante.
La sntesis de heparina se obtiene a partir de tejido bovino o porcino y corresponde a
polmetros de cido idurnico y glucosamina, altamente sustituidos por grupos N-sulfato y Osulfato. Su estructura es similar al heparn sulfato un glucosaminoglicano presente en la
superficie de las clulas endoteliales. La inhibicin de la coagulacin la realiza aumentando
significativamente la velocidad de accin de la antitrombina III, Inhibidor natural de las serino
proteasas de la coagulacin.
La heparina de sodio o de litio, puede usarse en forma seca o lquida. La proporcin
aconsejable es de 15-20 UI/ml de sangre. 1 mg de heparina en polvo equivale
aproximadamente a 125 UI. Comercialmente existen tubos de heparina al vaco que pueden
ser identificados fcilmente por la tapa de color verde.
Anticoagulantes lquidos
a) Citrato sdico
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

10

Es el anticoagulante de eleccin, para realizar las pruebas de hemostasia y la


determinacin de la velocidad de sedimentacin (VHS). Al igual que la mezcla de Wintrobe,
acta a travs de la precipitacin del Ca++. Se emplea en forma de solucin de citrato trisdico
porque preserva muy bien los factores de la coagulacin la concentracin sugerida es de 3,2%
o 109 mM de C6H5O7Na3 X 2 H2O o alternativamente C6H5O7Na3 X 11 H2O, la proporcin de
anticoagulante y sangre depende de la prueba que hay que realizar
Para pruebas de hemostasia o coagulacin, se emplea en proporcin 1/9, 1 volumen
de solucin de citrato sdico y 9 volmenes de sangre.
Para la determinacin de VHS, la proporcin utilizada es de 1/4, 1 volumen de
solucin de citrato y 4 volmenes de sangre
Debido a la gran automatizacin en los medianos y grandes laboratorios, existe en el
mercado tubos especiales para cada tipo de equipo de coagulacin y VHS, preparados y listos
para su uso, donde adems se utilizan diversos volmenes de muestras, para pacientes
adultos, peditricos y recin nacidos. Los tubos de VHS pueden ser identificados por la tapa
de color negro, mientras que los de coagulacin se identifican por su tapa color celeste. Estos
ltimos se pueden encontrar en dos concentraciones 3,2% recomendada y 3,8%.
b) Oxalato sdico
Recomendado al igual que el citrato de sodio, para pruebas de hemostasia se emplea
en forma de solucin de oxalato sdico 0.1 M. en la proporcin 1/4 1 volumen de solucin
por 4 Vol. De sangre. Pero no se utiliza mayormente en la actualidad.
c) Anticoagulantes lquidos en banco de sangre (ACD-A, ACD-B y CDP-A)
CPD es utilizado para la mantencin de clulas progenitoras hematopoyticas de
cordn umbilical, que pueden ser utilizadas para trasplante. Uno de los mtodos de obtencin
es la aspiracin de la vena umbilical mediante jeringas de 60 ml con 5 ml de CPD.
d) CTAD
Utilizado para evaluar la activacin in vivo de plaquetas, por la medida de
componentes de los grnulos de las plaquetas, tales como PF-IV, -tromboglobulina,
fibronectina y factor de crecimiento derivado de plaquetas, se debe minimizar la activacin de
las plaquetas despus de la extraccin de la sangre. Esto puede realizarse previniendo la
formacin de Tromboxano-A2 o por mantenimiento de concentraciones altas de AMPc dentro
de las plaquetas. Una mezcla aditiva utilizada para este fin esta compuesta por: 0.11 mol/L de
cido ctrico, 15 mmol/L de teofilina, 3.7 mmol/L de adenosina y 0.198 mmol/L de dipiridamol.
El pH final se ajusta a 5,0.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

11

Estabilidad de las muestras de sangre anticoagulada para estudio hematolgico


A diferencia de lo que sucede con el suero, cuyo anlisis puede realizarse mucho tiempo
despus de la extraccin debido a la posibilidad de congelacin o liofilizacin, la sangre tratada con
anticoagulante debe procesarse lo antes posible, incluso mantenida bajo refrigeracin 4-8C se
deteriora con facilidad. El tiempo mximo que puede transcurrir entre la extraccin y la realizacin de
las diferentes pruebas o tcnicas hematolgicas, depende de la naturaleza de las mismas, pero nunca
es excesivamente prolongado. Tabla 1
Tabla 1. Tiempo de conservacin mximo de la muestra de acuerdo a la temperatura, anticoagulante
y tipo de prueba.
Prueba
Recuento de Eritrocitos
Hemoglobina
Hematocrito
Indices eritrocitarios
Recuento de leucocitos
VHS
Recuento de Eosinfilos
Frmula leucocitaria
Recuento de plaquetas
Recuento de
Reticulocitos
Resistencia osmtica

Tiempo de
Estabilidad

Temperatura

Anticoagulante

24 horas

4C

EDTA

24 horas

4 C

EDTA

24 horas

4 C

EDTA

24 horas

4 C

EDTA

24 horas

4 C

EDTA

4-5 horas

25 C

Citrato

2 horas

25 C

EDTA

1-3 horas

25 C

EDTA

5 horas

25 C

EDTA

24 hrs

25 C

EDTA

48 hrs

4 C

EDTA

25 C

Heparina

1 hora

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

12

Codificacin por colores de tubos para recoleccin de muestras de laboratorio.


Para asegurar que no se genere confusin por parte del flebotomista en la identificacin del
tubo apropiado, las tapas de los tubos que contienen anticoagulante o que contienen o no aditivos
estn codificadas por colores. Estos cdigos por colores estn descritos en la norma ISO 6710.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

13

FROTIS SANGUINEO
El frotis sanguneo se emplea para el estudio morfolgico y estimacin cuantitativa de los elementos
figurados de la sangre.
Pueden ser preparados de una muestra directa (sin previo contacto con anticoagulante) o de una obtenida con
anticoagulante.
El mtodo usado para la confeccin puede ser manual o con sistema automatizado.
Materiales:
Lanceta estril
Jeringa y aguja (muestra venosa)
Cubreobjetos
Portaobjetos
PREPARACION DEL FROTIS SANGUINEO: mtodo manual.
1. Usar lminas limpias, libres de polvo y grasas de dimensin 75x25 mm
2. Se coloca una gota de sangre recin extrada (aproximadamente 8 ul) a 1cm de uno de los
extremos del portaobjetos (Fig 5) y se debe extender lo antes posible para evitar la formacin
de fibrina. Alternativamente se puede usar sangre con EDTA hasta 3 horas despus de la
extraccin.

Fig. 5 Aplicacin de la muestra


3. Sostener firmemente entre el dedo ndice y pulgar el portaobjeto con la otra mano se coloca
el cubreobjetos en un ngulo de 45 tocando la gota de sangre. (Fig 6)

Fig 6. Extensin de la muestra parte 1


Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

14

4. La sangre difunde por capilaridad entre el portaobjetos y el cubreobjetos.


5. Una vez extendida la gota en el dimetro transversal del portaobjeto se desplaza el
cubreobjetos a una velocidad uniforme sin perder el contacto con el portaobjeto. (Fig 7).

Fig 7. Extensin de la muestra parte 2


6. Luego se deja secar espontneamente.
7. Anotar los datos del paciente en la parte gruesa del extendido utilizando lpiz grafito.
Tarea:
Investigue sobre el mtodo automatizado para la confeccin de frotis sanguneo.
Caractersticas del Frotis Sanguneo.
1. El grosor de la extensin depende de la velocidad y del ngulo. Experimentar para adquirir
destreza.
2. Un buen frotis debe ser: Figura 8
a. Ms angosto y ms corto que el portaobjetos,
(longitud de 3 cm aproximadamente)
b. Sin escotaduras ni agujeros
c. De regular grosor, en frotis muy grueso los
elementos aparecen muy juntos y a menudo
alterados (extensiones muy rpidas con ngulos
mayores a 45). En frotis muy delgados los
elementos aparecen destruidos (extensiones
lentas y con ngulos menores a 45).

3. El extremo final debe ser neto, sin flecos.


4. En un buen frotis se deben distinguir 3 partes:
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

15

a. Cabeza: al comienzo del frotis donde se aplica la muestra, lugar para identificacin.
b. Cuerpo: es la zona media del frotis, las clulas se encuentran muy agrupadas, no es
posible su observacin. A medida que se acerca a la cola la celularidad es optima.
c. Cola: es la zona terminal del frotis, demasiado delgada, la celularidad est alterada. La
observacin microscpica a este nivel tampoco est recomendada.
5. Se recomienda la observacin microscpica en donde termina el cuerpo y comienza la cola, es
decir donde los glbulos rojos se encuentran uno al lado del otro, con el halo central visible
claramente

Figura 8. Frotis sanguneos bien y mal confeccionados.


A. Frotis bien hecho.
B. Frotis hecho sobre una lmina sucia.
C. Una extensin muy fina y sin continuidad.
D. Frotis realizado con una velocidad y presin de extensin irregular.
E. Frotis hecho sobre una lmina muy sucia (con grasa)

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

16

TINCION HEMATOLOGICA
Las clulas sanguneas se tien para realizar el recuento diferencial y para observar sus caractersticas
morfolgicas.
La tincin de eleccin en la mayora de los laboratorios es la tincin May-Grnwald Gimsa.
Como tcnica de rutina se usa para tincin de:
Hemograma
Mielograma
Adenograma
Frotis de lquidos orgnicos
La tincin May-Grnwald Gimsa usa 2 colorantes.
1. May-Grnwald: solucin alcohlica que precipita las protenas y fija la preparacin al
portaobjeto. Diferencia y tie las sustancias acidfilas (color rojo) y las basfilas (color
azul)
2. Gimsa: tie la cromatina y grnulos azurfilos.
Materiales:
Solucin de May-Grnwald comercial
Solucin de Gimsa comercial
Solucin de Buffer Fosfato pH 6.8 7.2
o Fosfato de K monobsico (KH2 PO4)
6,63 grs.
o Fosfato de Na dibsico (Na2 HPO4 2 H2O)
3,20 grs.
o Agua destilada c.s.p
1000 ml
a) Al momento de usar preparar una solucin de Gimsa al 10% en buffer fosfato o agua neutra
desionizada y filtrar. Ej Solucin madre de Gimsa (2 gotas y 1 ml buffer fosfato)
Ejercicio:
Preparar 1000 ml de Buffer Fosfato 66mM a pH 7, cuyo pK es 7,21, a partir de:
KH2 PO4 cuyo PM: 136,09gr/mol
Na2 HPO4 cuyo PM: 143gr/mol.
Procedimiento para la tincin May-Grnwald Gimsa
El frotis debe estar seco y rotulado conel nombre del paciente.
Cubrir o sumergir el frotis con May-Grnwald por 5 minutos
Agregar un volumen igual al anterior de Solucin buffer (o agua neutra desionizada)
por 1 minuto
Sumergir o cubrir el frotis con la solucin de Gimsa por 20 minutos
Enjuagar con agua corriente por 2 minutos
Dejar secar al aire inclinando la lmina para que escurra el agua.
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

17

Limpiar el portaobjetos por el reverso.


Tincin automatizada de Frotis sanguneo.
Actualmente existen en el mercado sistemas de tincin automatizada las cuales
permiten la tincin de un gran nmero de lminas. Pueden ser mquinas de tincin
independiente o formar parte de un contador hematolgico automatizado.
En sistemas el equipo realiza la extensin sangunea en una lmina, la fija y la tie. Los
equipos se pueden programar para que prepare una extensin por muestra o en forma
simultnea varias preparaciones de una nica muestra.
Las tinciones que utilizan estos equipos son las mismas que se usan para el mtodo de
tincin manual.
Algunos sistemas se aplican las soluciones de tincin de portaobjetos situadas
horizontalmente (flat-bed staining), mientras que otros sumergen la o las lminas en un bao
que contiene la tincin (dip-and-dunk tcnica)
Los inconvenientes de esta metodologa incluyen el aumento de la tincin de fondo de
la lmina, tincin inadecuada, de los grnulos de los neutrfilos, la de granulacin de los
basfilos y tincin de los eritrocitos con tonalidades azul o verde ms que rosada. Estos
problemas suelen estar relacionados con tinciones especficas y protocolos de tincin
utilizados ms que al tipo de instrumento. Sin embargo se puede obtener una tincin
satisfactoria si se utilizan marcas de tinciones fiables y se controle el tiempo de ciclo de tincin
cuidadosamente.

Tarea:
Investigue otras tinciones usadas en hematologa.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

18

HEMATOCRITO

El hematocrito el volumen relativo ocupado por los glbulos rojos con respecto a la sangre total, despus de
su separacin por centrifugacin, Figura 9.
Se expresa por una fraccin decimal o porcentaje. Como se trata de una relacin entre 2 magnitudes
volumtricas (L/L), la unidad es igual a 1 y se omite o se expresa en %.
El hematocrito es uno de los valores bsicos para calcular los ndices Eritrocitarios, como volumen
corpuscular medio (VCM) y en conjunto con la hemoglobina permite calcular la concentracin de hemoglobina
corpuscular media (CHCM).
Es usado como test de screenig para detectar anemia (su valor est relacionado con la concentracin de
hemoglobina) y como mtodo de referencia para calibrar equipos de recuento sanguneo automatizado en
algunos laboratorios.
El hematocrito es 3 veces el valor de la hemoglobina en condiciones de nomocroma.
Existen mtodos de determinacin de hematocrito manual y automatizado. Pero el mtodo de referencia para
para determinar el hematocrito es la centrifugacin de sangre total en un tubo capilar (micromtodo)
Mtodos Manuales
Microhematocrito
Macrohematocrito (no utilizado en la actualidad)
MICROHEMATOCRITO. Mtodo recomendado por el NCCLS.
Muestra
Capilar: recolectada directamente desde el sitio de puncin, usando tubos capilares con
heparina. Cada capilar requiere aprox. 50 ul de sangre.
Venosa: recolectada con EDTA
Materiales:
Micro centrifuga
Tubos capilares de 75 mm y 1 mm de dimetro interno. Sin anticoagulantes (borde azul) o
heparinizados (borde rojo).
Lector de microhematocrito
Plasticina u otro sellador
Procedimiento para determinacin de Microhematocrito
1) Homogeneizar la muestra. La determinacin debe hacerse en duplicado.
2) Llenar el tubo de microhematocrito por capilaridad hasta llenar el tubo en 3/4 del largo total,
limpiar superficie externa.
3) Sellar el extremo vacio, colocando el capilar en un ngulo de 90 con el sellador, rotar y retirar. El
tapn debe tener 4 a 6 mm de longitud. Fig 10
4) Centrifugar 5 minutos a 10.000 g (12.000 a 15.000 r.p.m)
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

19

5) Si el hematocrito es superior a 50% centrifugar por 5 minutos ms, para eliminar el mximo de
plasma atrapado.
6) Retirar los tubos de la centrifuga y leer en un lector de microhematocrito, colocando la base de la
columna de sangre en el 0 de la escala y el menisco del plasma en el 100. El valor del hematocrito
es el que corresponde al lmite superior de la columna de glbulos rojos. Fig 11.
7) Mantener en posicin vertical los tubos que no son ledos inmediatamente.
En el caso de no contar con un lector de microhematocrito, se puede leer con una regla milimetrada
el largo total de la columna de sangre (LT) y el de la columna de los eritrocitos (LE). Para el
hematocrito= (LE/LT) X 100.

PLASMA

BUFFY COAT

HEMATOCRITO
(Eritrocitos empaquetados)

Figura 9. Separacin de los Eritrocitos post Centrifugacin

Figura 10. Proceso de sellado del capilar.

Figura 11.Medicin de hematocrito por tcnica de Microhematocrito

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

20

Precisin del mtodo de microhematocrito.


El mtodo de micro hematocrito tiene una adecuada precisin y exactitud para su utilidad clnica, pero
se debe tener cuidado en evitar los factores que inducen a error y a obtener resultados incorrectos.
Fuentes de error en mtodo microhematocrito:
El EDTA debe tener una concentracin de 1,5 mg/ml de sangre. Si la concentracin esta
aumentada se produce una disminucin del tamao de los eritrocitos, lo que provoca un valor
de hematocrito ms bajo.
En la muestra capilar se puede producir una hemodilucin por los lquidos intersticiales si la
presin ejercida en la toma de muestra es exagerada.
Mezcla inadecuada de la muestra venosa antes de llenar los capilares
Muestra con microcogulos
Centrifuga con velocidad y tiempos inadecuados.
Aumento del nivel de plasma atrapado como en las esferocitosis, policitemias, deficiencia de
hierro.
Estasis aumentada durante la venopuncin, se puede producir un aumento de 2.5 a 5%.
En la lectura de la columna de los eritrocitos se debe excluir a los leucocitos y plaquetas
Deterioro del capilar heparinizado por malas condiciones de almacenamiento.
Lisis producida por aumento de la temperatura de la centrifuga al ser usada por un tiempo
prolongado.
INFORME
Se recomienda expresar el resultado en una fraccin decimal, en lugar de porcentaje, aunque esta
ltima es la forma de expresin ms generalizada.
Ej: Hematocrito: 0,25 o 25%
Tarea:
Investigue sobre el mtodo automatizado para determinar el Hematocrito.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

21

DETERMINACION DE HEMOGLOBINA
La medicin de la concentracin de la Hemoglobina es un examen esencial para el diagnstico
de Anemia.
El mtodo recomendado por el Comit Internacional de Estandarizacin de Hematologa es el
de Cian metahemoglobina. Y es una determinacin que puede realizarse con gran precisin y
exactitud.
Principio:
El mtodo se basa en la dilucin de la sangre en una solucin que contiene cianuro de potasio y
ferricianuro de potasio. En donde la hemoglobina y sus derivados (carboxihemoglobina,
metahemoglobina), con excepcin de sulfohemoglobina, por accin de K3Fe (CN)6 se oxida y convierte
en hemiglobina (Hi), la que en contacto con KCN se transforma en cianuro de hemoglobina.
Muestra
Sangre venosa recolectada con anticoagulante EDTA o sangre capilar
Materiales y reactivos
Espectrofotmetro o fotmetro con filtro para leer a 540 nm
Tubos de 5ml
CAlibrador de hemoglobina
Micropipetas y pipetas volumtricas de 5 ml
Dispensador o pipetas para 5 ml
Solucin de Drabkin modificada pH 7.0 7.4
K3Fe (CN)6
200 mg
KCN
50 mg
KH2PO4
140 mg
Detergente no inico *
0.5 ml
Agua destilada c.s.p
1000 ml
*Extran neutro
Caractersticas del Reactivo de Drabkin
Color amarillo
Aspecto transparente
Absorbancia cero a 540 nm contra blanco de agua
Estabilidad: varios meses a 4C y frasco oscuro, si se congela debe ser descartada.
Curva de calibracin Hemoglobina
La relacin de la intensidad de color de un soluto y su concentracin se rigen por la Ley de LambertBeer que establece una correlacin directa de de la sustancia y la intensidad de color leda como
densidad ptica.
Al graficar las intensidades pticas en funcin de las concentraciones conocidas de un soluto
(Estndar o Calibrador), obtenemos una lnea recta, lo que nos confirma el cumplimiento de la ley. Los
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

22

valores obtenidos nos permiten calcular la concentracin de muestras problemas en el grafico o a


travs del Factor de Calibracin.
Procedimiento
1) Dilucin del estndar: se recomienda preparar diluciones 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 etc.
2) Colocar 2,5 ml de rectico de Drabkin en un tubo.
3) Colocar 20 ul de estndar diluido a cada tubo con los 5 ml de reactivo
4) Dejar en reposo por 5 minutos.
5) Leer densidad ptica (DO) a 540 nm frente a un blanco de reactivo de cada solucin preparada
6) Graficar en papel milimetrado las DO obtenidas en funcin de las concentraciones de
Hemoglobina. En la abscisa se coloca la variable independiente (g/dl) y en la ordenada la variable
dependiente (DO).
7) Calculo de la concentracin de Hemoglobina
Hemoglobina (gr/dl)= DO muestra
x concentracin calibrador (g/dl) X Factor dilucin*
DO Calibrador
*Factor dilucin de la muestra =125
O sacar factor mediante ecuacin de la recta.
Anlisis de muestras
1) Coloca 2,5 ml de rectico de Drabkin en un tubo.
2) Mezclar la muestra de sangre
3) Colocar 20 ul de muestra en el tubo con los 2,5 ml de reactivo
4) Dejar en reposo por 5 minutos.
5) Leer densidad ptica a 540 nm frente a un blanco de reactivo.
6) Convertir la densidad ptica en g/dL utilizando una curva de calibracin.
INFORME:
Hemoglobina en g/dL con una cifra decimal. Unidad Internacional g/L

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

23

INDICES ERITROCITARIOS
En el ao 1930 WINTROBE dise un sistema matemtico para obtener informacin til que
relacionaba la concentracin de hemoglobina, recuento de eritrocitos y el hematocrito. Estos son los
ndices Eritrocitarios o Constantes de Wintrobe y los que ms se utilizan son CHCM, HCM, VCM y
RDW. Tienen una gran importancia en la orientacin diagnostica del tipo de anemia.
Volumen Corpuscular Medio (VCM).
Valor medio del tamao de cada eritrocito
VCM=

Hematocrito
L/L)
Nmero de eritrocitos (x1012/L)

Ejemplo: si el HTO es 0.35 y el recuento de eritrocitos 4x1012/L, el volumen ocupado por ellos ser:
VCM= 0.35 (L/L) = 87,5 x 10-15
4x1012/L

87,5 Femtolitros)

Hemoglobina Corpuscular Media (HCM)


Es el valor medio del contenido de Hemoglobina por eritrocito. Se determina mediante el cuociente
entre la concentracin de Hb en g/dL y la de eritrocitos
HCM= Hemoglobina (g/L)
Nmero de eritrocitos (x1012/L)
Ejemplo: si la Hb es 116 g/L y el recuento de eritrocitos 4x1012/L, la Hb de cada eritrocito ser:
HCM= 116 g/dl = 29 x 10-12 grs (29 picogramos)
4 x1012/L
Concentracin de Hemoglobina Corpuscular Media (CHCM)
Corresponde a la concentracin de hemoglobina por cada litro de masa eritrocitaria y se calcula a
partir de la concentracin de hemoglobina y el hematocrito.
CHCM= Hemoglobina (g/l)
Hematocrito (L/L)
Ejemplo: si la muestra de sangre tiene Hb de 116 g/L y el HTO 0,35 L/L
CHCM= 116 g/dl
= 331 g/L o 33.1gr/dl (33g %)
0,35 L/L
Tarea:
Investigue en qu consiste, forma de calcularlo y aplicacin del RDW CV y SD y VPM.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

24

RECUENTO DE LEUCOCITOS EN CAMARA DE NEUBAHUER.


Para cuantificar la cantidad de leucocitos en la sangre la muestra se diluye en una solucin
que lisa los eritrocitos, pero no los leucocitos ni los eritrocitos nucleados. El lquido diluyente contiene
un colorante que tie los ncleos de los leucocitos. Cuando hay presencia de eritrocitos nucleados el
recuento debe ser corregido.
Muestra
Sangre venosa con EDTA o sangre capilar
Materiales y Reactivos
Cmara de Neubauer (Fig 12)
Cubrecmara
Pipeta de dilucin de leucocitos/micropipeta
Agitador mecnico
Microscopio
Solucin diluyente
Hayem B
Acido Actico Glacial
Azul de metileno al 1%
Agua destilada c.s.p
Procedimiento

2 ml
3 gotas
100 ml

1. Agitar la muestra
2. Realizar una dilucin de la muestra con el reactivo Hayem B
Ej: 980 ul de Hayem B + 20ul de sangre total (factor dilucin 50)
3. Mezclar e incubar por 3 minutos.
4. Prepara la cmara de Neubahuer con el cubre-cmara en posicin.
5. Cargar la cmara de Neubahuer con 10ul de la dilucin
6. Dejar en reposo durante 2 a 3 minutos en una cmara hmeda, para que las clulas
sedimenten
7. Observar al microscopio con aumento menor (10X) (cerrar parcialmente el diafragma del
condensador para ver los leucocitos)
8. Contar los leucocitos que se encuentran en los 4 cuadrantes mayores, que forman las 4
esquinas del reticulado de la cmara.
Volumen de recuento (alto x ancho x largo del cuadrante) 1mm x1 mm x 0.1 mm =
0.1mm o 0,1uL real contado, como se debe expresar en 1uL se multiplica por 10
3

9. Calcular el nmero de leucocito por mm 3.


N de Leucocitos contados en los 4 cuadrantes/4 = N
Dilucin realizada
= 1/50
Ajuste por volumen contado (altura de la cmara) = 10
FORMULA
N de leucocitos por uL= N x factor dilucin x 10
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

25

INFORME:
Recuento de leucocitos = N de leucocitos/uL.
Unidad Internacional = N de leucocitos/ Litro.
Valores de referencia entregados por el profesor.
Nota:
Los recuentos de los 4 cuadrantes no deben diferir en ms de 20%, en caso contrario cargar la
cmara de Neubahuer y contar nuevamente.
Si el valor obtenido es menor a 2500 se practica nuevamente el recuento empleando una dilucin
1:10. Si el valor es muy elevado se emplean diluciones 1:100 o 1:200.

Recuadro
Central

Fig 12. Cmara de Neubauer

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

26

VELOCIDAD DE SEDIMENTACION ERITROCITARIA


La velocidad de sedimentacion eritrocitaria o eritro-sedimentacion mide una propiedad fsica
de la sangre,
El mtodo de referencia es el de Westergreen y mide la velocidad de sedimentacin de los
eritrocitos en el plasma en un periodo de tiempo de 60 minutos cuando la sangre anticoagulada se ha
puesto en una varilla de dimensiones preestablecidas y estandarizadas. El valor numrico informado
corresponde a la altura de la columna de plasma que se ha separado por la sedimentacin celular. La
rapidez con la que sedimentan los eritrocitos se llama Velocidad de Hemtica de Sedimentacin o
VHS.
Actualmente este proceso se encuentra automatizado y las determinaciones dependiendo del
equipo se obtienen a los 30 minutos, entregando adems la cintica de cada de los glbulos rojos.
Muestra
Sangre venosa obtenida con EDTA
O tubos especialmente preparados con citrato de sodio (4 volmenes de sangre y 1 volumen
de anticoagulante), son de tapa negra.
Estabilidad de la muestra: T ambiente (18- 25C) hasta 4 horas y a 4C hasta 12 horas.
Materiales
Pipetas de Westrgreen de una longitud suficiente (200mm) de vidrio o plstico, graduada de 0
a 140 mm cada 1 mm. Calibre 2,55mm (0.15mm)
Gradillas y copas para pipetas de Westrgreen
Cronmetro, Pipetas automticas y puntas
Procedimiento
1. Diluir la muestra, con citrato de sodio (3,8%) o con suero fisiolgico (8.5g/L) en proporcin de
4 volmenes de sangre y 1 volumen de citrato de sodio. Mezclar 10 veces.
2. Llenar la pipeta de sedimentacin hasta la marca 0 cuidando que no queden burbujas
atrapadas.
3. Colocar la columna en gradilla de sedimentacin en posicin vertical perfecta (<1 inclinacin)
a T ambiente (20 -25C), sin vibraciones ni corrientes de aire y evitando la radiacin solar
directa.
4. Dejar en reposos durante 60 minutos (1 min) y leer la distancia entre la parte superior del
menisco formado por el plasma (marca 0) y el lmite formado con la columna de clulas
sedimentadas sin incluir los leucocitos.
Control de calidad: procesar en cada corrida analtica controles comerciales para VHS.
Fuentes de error
Tubos con dimetro menor a 2,55mm dan resultados ms bajos.
Vibraciones o calor aceleran el proceso y se obtienen valores ms altos.
Falta de homogenizacin de la muestra antes de llenar la pipeta.
INFORME
El resultado de la velocidad de sedimentacin se expresa en mm/hora
Tarea: Investigue que factores tcnicos y fisiopatolgicos influyen en la VHS

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

27

RECUENTO DE RETICULOCITOS
El reticulocito es un glbulo rojo inmaduro que contiene 2 o ms partculas de cido
ribonucleico (RNA) ribosomal en el citoplasma que se tien de color azul con colorantes supravitales.
El recuento de reticulocitos es un mtodo directo y sencillo que sirve para evaluar la efectividad de la
eritropoyesis.
Segn el nmero de reticulocitos las anemias se pueden clasificar como Regenerativas o
Arregenerativas.
Muestra
Sangre venosa con EDTA o capilar
Materiales
Microscopio
Portaobjeto 25x75mm
Tubos 12x75mm
Pipetas Pasteur
Tincin azul cresil brillante
Bao termo-regulado o estufa a 37C
Reactivo
Solucin Azul Cresil Brillante
Azul cresil brillante
1gr
NaCl 0,9%
100ml
Citrato de Na (NaC6H5O7x2H2O) 0,4 gr
Disolver el azul cresil brillante en el NaCl,
agregar el Citrato de Na y filtrar. Guardar
protegido de la luz. Estable 1 ao.

Solucin Nuevo Azul de Metileno


Nuevo azul de metileno
Buffer fosfato pH 7,4

1gr
100ml

Sol. A: Na H2PO4* 2H2O (150mmol/L) 23,4 g/L


Sol. B: Na2 HPO4 (150mmol/L)
21,3 gr/L
Mezclar solucin A 18ml + solucin B 82 ml, pH 7,4
Disolver el azul de metileno en buffer fosfato y filtrar.
Guardar protegido de la luz. Estable 1 ao.

Procedimiento para Tincin Supraviral con Azul Cresil Brillante.


1. Agitar la muestra, tomar 3 gotas de sangre y colocarlas en un tubo de ensayo.
2. Agregar 3 gotas de Solucin azul cresil brillante, Mezclar e incubar 15 min a 37C
3. Preparar un frotis y secar a T ambiente
Examinar al microscopio con objetivo de inmersin. Contar los reticulocitos presentes en 1000
eritrocitos maduros en la zona en que los eritrocitos no se superponen y calcular el % de
reticulocitos observados. Figura 12.

RETICULOCITO

ERITROCITO MADURO

Figura 12. Frotis de sangre teido con Tincin Supraviral Azul Cresil Brillante.
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

28

Informe de Resultados
Informar % de reticulocitos.
Informar el recuento absoluto de reticulocitos
Calculo de resultados
Recuento Relativo de Reticulocitos: Se expresa en %
% Reticulocitos = N Reticulocitos Contados
X 100
N de Eritrocitos Contados
Recuento Absoluto de Reticulocitos: Se expresa en nmero de reticulocitos /uL de sangre
Reticulocitos/uL = % Reticulocitos x Recuento de Eritrocitos (106/ul)
100
Interpretacin de Resultados
Para que el recuento de reticulocitos sea un buen ndice de produccin de eritrocitos debe ser
corregido en relacin al hematocrito.
CORRECCIN RECUENTO RETICULOCITOS
a) Recuento de Reticulocitos Corregido
El recuento de reticulocitos puede estar aumentado porque hay ms reticulocitos en la circulacin o
porque hay un menor nmero de eritrocitos maduros. Por lo tanto el recuento observado de
reticulocitos debe ser corregido a un hematocrito normal de 0,45 (45%).
Rec. De Reticulocitos Corregido (%)= Recuento Reticulocitos observado (%) x HTO paciente%
HTO Normal (45%)
b) ndice de Produccin Reticulocitaria (IPR)
Es la correccin que se hace en relacin a tiempo de maduracin de los reticulocitos en circulacin
El Recuento Reticulocitos puede ser alterado por la entrega prematura de clulas desde medula sea.
Si se detecta policromatofilia en el frotis de sangre se debe aplicar la segunda correccin de acuerdo
al tiempo de maduracin del reticulocito en la sangre perifrica.
Tiempo de maduracin de reticulocitos en circulacin
Para Hematocrito de 45% es de 1,0 da
Para Hematocrito de 35% es de 1,5 das
Para Hematocrito de 25% es de 2,0 das
Para Hematocrito de 15% es de 2,5 das
Para el clculo se debe aplicar la frmula:
HTO paciente
(IPR) = Rec Reticulocitos (%) x
HTO Normal (45%) ___
Tiempo de maduracin en periferia (das)

Tarea: Cmo se realiza el recuento automatizado de reticulocitos y por citometra de flujo?


Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

29

Parte II
Hematologa Bsica:
Tcnicas para evaluacin de la Hemostasia

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

30

VARIABLES PREANALITICAS EN PRUEBAS DE COAGULACION


Muchos resultados alterados en las pruebas de coagulacin se deben a errores en la fase preanaltica, especialmente relacionados con la toma de muestra. Idealmente los resultados de la
pruebas de sangre deben reflejar precisamente los valores in vivo.
Cuando las muestras de sangre se toman de una vena ocurren cambios en los componentes de la
coagulacin, algunos ocurren casi inmediatamente, mientras que la activacin de las plaquetas y el
inicio de los mecanismos de activacin de la coagulacin dependen de la superficie de contacto. Por lo
tanto es necesario toma las precauciones necesarias para minimizar al mximo los cambios in vitro
que ocurren durante la toma de muestra y el almacenamiento.
La Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) ha establecido los criterios de toma y
almacenamiento de las muestras para estudios de coagulacin.
Toma de muestra
La muestra de eleccin es la venosa, incluso en recin nacidos y deben ser colectadas por personal
capacitado y entrenado en la tcnica.
Los pacientes deben estar relajados y en un ambiente acogedor, el estrs y el ejercicio fsico causa
cambios en los niveles de fibringeno y factores de la coagulacin
Si se usan tubos venoject, el tubo de coagulacin se debe dejara en segundo o tercer lugar.
El tubo se debe identificar con el nombre del paciente
El momento del da en que se tome la muestra tambin es importante para la interpretacin de los
resultados, la actividad fibrinoltica tiene ritmo circadiano y disminuye alrededor de las 6 de la
maana.
Tambin se debe registrar si el paciente est siendo medicado con algn tratamiento anticoagulante y
si el paciente fue medicado con concentrado de factores se debe esperar a lo menos 30 minutos.
Anticoagulante
El anticoagulante internacionalmente recomendado es el citrato de sodio al 3.2%, usando 1 parte de
anticoagulante y 9 partes de sangre total. Cuando el hematocrito esta alterado (anemias severas o
Policitemias) la cantidad de anticoagulante: sangre debe ser ajustado. Para 5 ml de muestra la
cantidad de citrato recomendada es la siguiente:
HEMATOCRITO (%)
20
25
30
55
60
65
70

VOLUMEN DE CITRATO (ml)


0.70
0.65
0.61
0.39
0.36
0.31
0.27

Centrifugacin de las muestras


Para el anlisis se requiere un plasma pobre en plaquetas (recuento de plaquetas <10x103/ul),
esto se obtiene centrifugando la muestra a 1500 g (3500r.p.m) por 15 minutos a T ambiente.
La muestra se debe mantener a T ambiente si se va a realizar Tiempo de Protrombina, Anticoagulante
Lpico o ensayos de determinacin de Factor VII y se debe mantener a 4C para otros ensayos.
Se recomienda realizar las pruebas antes de 4 hrs post extraccin. Ver tabla 2
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

31

Tabla 2. Tiempo de estabilidad de muestras para pruebas de coagulacin

Fuente: Sterling T. Bennett, M.D. M.S; Laboratory Hemostasis a Practical Guide for Pathologists; 2007; Springer Science

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

32

RECUENTO DE PLAQUETAS EN CAMARA


Al mezclar la sangre con un diluyente se produce la lisis de los eritrocitos, lo que permite
contar las plaquetas en un microscopio ptico, de preferencia de contraste de fases.
Muestra
Sangre venosa recolectada con anticoagulante EDTA.
Materiales y reactivos
Cmara de Neubauer y Cubre-cmara
Agitador mecnico
Microscopio
Pipetas y puntas
Solucin diluyente oxalato de amonio 1% (en agua destilada), guardar refrigerada.
Procedimiento
1. Contar plaquetas que se encuentran en el cuadrante central de 1mm2 (0,1uL)
2.

Calcular el nmero de plaquetas por mm2


N plaquetas contadas : N
Superficie contada
: 1mm2
Dilucin
: 1 /100
Profundidad de la cmara: 1/10 mm
FORMULA
N plaquetas por mm3 = N x 100 x 10
N plaquetas por mm3 = N x 1000
METODO DE DILUCION EN TUBO PARA RECUENTO DE PLAQUETAS

1.
2.
3.
4.

Realizar una dilucin 1/100 de la muestra en Oxalato de amonio 1% en un tubo 75x12mm


Mezclar por lo menos 10 minutos en agitador mecnico.
Cargar cmara de Nueubahuer con 10uL de la dilucin
Observar al microscopio con aumento 40X, de preferencia en microscopio de contraste de
fases.
5. Contar plaquetas que se encuentran en el cuadrante central de 1mm2 (0,1uL)
6. Calcular el nmero de plaquetas por uL.
7. Calcular el nmero de plaquetas por uL
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

33

N plaquetas contadas : N
Superficie contada
: 1mm2
Dilucin
: 1 /100
Profundidad de la cmara: 1/10 mm
FORMULA
N plaquetas por uL = N x 100 x 10
N plaquetas por uL = N x 1000
N plaquetas por uL = N de plaquetas contadas x dilucin
Volumen contado (uL)
Informe
N plaquetas por uL
Unidades internacionales: N plaquetas por Litro.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

34

TIEMPO DE SANGRA
Este mtodo permite evaluar la hemostasia primaria. Mide el tiempo que dura la hemorragia
provocada por la incisin de pequeos capilares cutneos, lo que permite evaluar la accin de la pared
del vaso sanguneo, la interaccin de las plaquetas y su funcionalidad.
Valores de referencia
Entre 3-9 minutos
Materiales
Algodn , alcohol 70% y tela adhesiva
Aparato de Ivy o Simplate I-IIR
Cronmetro
Esfigmomanmetro
Papel filtro
Procedimiento Mtodo de Ivy
1) Entrevistar al paciente (Actividad, enfermedades hematolgicas, medicamentos, examen de piel
etc.)
2) Preparacin de materiales
3) Siente al paciente con el brazo descubierto y desinfectado en Posicin supina sobre una superficie
firme
4) Escoja un rea lateral en la parte muscular del antebrazo, evitando venas superficiales, cicatrices o
lesiones.
5) Limpie el rea con algodn y alcohol. Si es necesario afeitar la zona.
6) Ponga el manguillo del esfigmomanmetro de acuerdo al tamao del paciente e infle hasta 40 mm
de Hg.
7) Inmediatamente ponga el simplate firme en el rea desinfectada de forma que el corte se realice
en forma perpendicular al pliegue del codo.
8) Oprima el disparador del simplate y ponga en marcha el cronmetro.
9) Cada 30 segundos absorber las gotas de sangre con papel filtro, cuidando de no apoyarlo
directamente sobre la herida.
10) Esperar hasta que se detenga el sangramiento, una vez detenido el sangramiento quite el
manguillo. Realice una pequea curacin dndole indicaciones sobre el cuidado de la herida.
Informe e interpretacin
El resultado se informa en tiempo que se necesit para que se detuviera el sangramiento.
ej. Tiempo de Sangra Mtodo de Ivy 4 minutos 30 segundos.
Factores de error
Alteraciones de la presin del esfigmomanmetro.
Presin excesiva del aparato de Ivy o Simplate.

Tarea:
Investigue el fundamento del equipo Platelet Analizer Function PFA-100
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

35

TIEMPO DE RETRACCIN DEL COAGULO


Luego de aproximadamente 1 hora de extrada una muestra de sangre y al ser depositada en
un tubo de vidrio esta se coagula, debido a que la carga negativa del vidrio activa la coagulacin.
Tal como ocurre in vivo para restablecer la perfusin sangunea, una vez que se completa el
proceso de coagulacin se produce la retraccin del coagulo para luego mediante el sistema
fibrinoltico eliminar este trombo estable definitivamente.
Este mtodo nos da informacin sobre el nmero y la funcionalidad de las plaquetas
Valor de referencia
Normoretractil: Coagulo ocupa entre 40 50% del volumen de muestra total.
Equipo
Bao termorregulado
Procedimiento
1. Extraer una muestra venosa y depositarla en un tubo sin aditivo
2. Dejar de forma perpendicular y no mover durante 1 hora a 37C
medir la distancia desde la base del tubo hasta el menisco formado por el suero
3. Retirar cuidadosamente el coagulo con una varilla de madera, dejando solo el suero en el tubo
4. Medir la distancia del menisco formado por el suero desde la base del tubo
Calcular:
Distancia del suero desde la base del tubo sin coagulo
% de retraccin del coagulo = ------------------------------------------------------------X100
Distancia total desde la base del tubo con coagulo
Informe
Normo retrctil o hipo-retrctil
Factores de error
Utilizacin de una superficie de contacto diferente al vidrio
Superficie del vidrio sucio
Paciente con recuento plaquetas inferior a 100.000/ul
Paciente con hipofibrinogenemia o disfibrinogenemia
Se debe retirar el coagulo cuidadosamente para evitar que se comprima este con la
posterior liberacin de suero adicional.
Comentarios
La retraccin del coagulo es completa a las 24 horas y se requiere normalidad en:
Recuento plaquetas mnimo de 100.00/ul
Concentracin normal de fibringeno
Plaquetas con Glicoprotena IIb/IIIa Normal.
Retraccin menor al 40% se observa en trombastenia de Glanzmann.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

36

TIEMPO DE PROTROMBINA (TP)


Fundamento
Al aadir, a una muestra de plasma, tromboplastina y calcio ligeramente en exceso se activa la
va extrnseca del sistema de coagulacin permitiendo as la formacin del cogulo de fibrina.

Valor de referencia
Depende de: edad del paciente, mtodo de determinacin y tromboplastina utilizada, pero en
general respecto de la actividad de la tromboplastina puede considerarse como valor de referencia
entre 70-120% de actividad.
Muestra
Sangre venosa o arterial anticoagulada con citrato de sodio 3,2% tubo tapa celeste.
Informe de Resultados del Tiempo de Protrombina
Tiempo del Paciente
Tiempo del pool Normal
% Actividad
INR
Intervalos de referencia:
Tiempo del Paciente
% Actividad
INR

: 10 - 14 segundos
: 70 120%
: 0.9 1.1

Reactivos y equipos
Tromboplastina liofilizada
Suero Fisiolgico
Coagulmetro mecnico u ptico
Control normal y anormal
Pool de plasmas normales
Cronmetro
Procedimiento
Antes de procesar muestras se debe realizar una curva de calibracin de tiempo de protrombina, para
calcular el % actividad.
Esta curva debe cambiarse cada vez que se cambie el lote de tromboplastina

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

37

CURVA CALIBRACIN DE TIEMPO DE PROTROMBINA


1. Preparar un pool de plasmas normales frescos o estndar a partir de personas sanas, sin
tratamiento anticonceptivo ni anticoagulante.
2. Diluir de la siguiente forma:
Reactivo
Suero Fisiolgico
Mezclar y transferir
% de actividad

Tubo1
------2 ml
pool
100 %

Tubo2
1ml
1ml
(tubo1)
50 %

Tubo3
1ml
1ml
(tubo2
25 %

Tubo4
1ml
1ml
(tubo3)
12,5 %

3. Realizar una determinacin en duplicado de tiempo de protrombina (ver punto de


Determinacin de Tiempo de Protrombina) a cada dilucin, y calcular el promedio en
segundos de cada dilucin.
4. Grafique la curva de calibracin anotando para cada dilucin la actividad de protrombina y el
promedio en segundos para ese mismo tubo. (grafico en papel grfico recproco-lineal)
5. Unir los puntos con una lnea recta y calcular r, A, B, C discutir la correlacin obtenida y
comprela con los valores propuestos por el fabricante.
6. Si se tiene un terminal de datos en el equipo ingresarlos en l considerando: el valor 100% el
promedio en segundos del tubo 1 y el ISI de la tromboplastina.
DETERMINACIN DEL TIEMPO DE PROTROMBINA DE MUESTRAS Y CONTROLES
1. Llevar los reactivos a temperatura ambiente, reconstituirlos y homogenizarlos bien antes de
usar evitando la formacin de espuma.
2. Llevar los reactivos reconstituidos a 37C o a los incubadores del equipo.
3. Dependiendo del mtodo empleado y equipo tome una cubeta de coagulmetro e introduzca
si no la tiene una esfera o cilindro de acero agregue 100 ul. de plasma citratado y encube por
2 minutos exactos a 37C.
4. Agregar 200 ul. de tromboplastina y activar el cronmetro.
5. Al formarse el cogulo de fibrina, se detiene el cronmetro.
6. Los equipos actuales con que se trabaja en los laboratorios clnicos indican el tiempo de
incubacin, el punto final de la reaccin y emiten un informe.
7. Anotar y calcular tiempo en segundos del paciente, tiempo en segundos del pool de plasmas
normales, la actividad en porcentaje calculada por la calibracin realizada y el INR si es
necesario.
CALCULO
% de actividad: Es obtenida al ubicar en la curva de calibracin el tiempo en segundos
obtenido y extrapolarlo en el eje de actividad.
El INR: Es slo para pacientes en tratamiento anticoagulante y se calcula de la
siguiente forma:
ISI
Tiempo en segundos del paciente
INR =

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

38

Tiempo en segundos del pool normal

ISI

est indicado en cada lote de reactivo de tromboplastina.


En 1985 el Comit de Estandarizacin en Hematologa (ICSH) y el Comit Internacional de
Trombosis y Hemostasia (ICTH) introdujeron el INR como mtodo para reportar los resultados
del TP. A partir de esta fecha se recomend a todos los fabricantes de Tromboplastinas la
determinacin del ISI para cada lote de reactivo producido. Para ello se utiliza el modelo
matemtico de Kirkwood.

ISI 1
TP 1 del paciente
TP 1 standard

ISI 2

TP 2 del paciente
TP 2 standard

Tarea:
Investigue como se establece el ISI de cada lote de Tromboplastina
Control de Calidad
En cada corrida analtica procesar 2 niveles de control.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

39

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADO (TTPA)


Fundamento
En este examen se utiliza un activador el cido elgico, el cual gatilla la va intrnseca de la
coagulacin, al activar los factores de contacto. En presencia de calcio y fosfolpidos, estos factores
inician una cascada de reacciones enzimticas que culminan en la generacin de trombina y el
posterior cogulo de fibrina.
Intervalos de referencia
26 a 40 segundos
Muestra
Sangre venosa o arterial anticoagulada con citrato de sodio 3,2% tubo tapa celeste
Reactivos
Cefalina
Cloruro de calcio 0,025 M
Coagulmetro mecnico u ptico
Control normal y anormal
Cronmetro, Pipetas y puntas automaticas
Procedimiento
1. Esta tcnica no requiere de calibracin
2. Llevar los reactivos a temperatura ambiente y homogenizarlos bien antes de usar sobre todo
si el activador es Kaoln
3. Llevar los reactivos mezclados a 37C o a los incubadores del equipo.
4. Dependiendo del mtodo empleado y equipo tome una cubeta de coagulmetro e introduzca
si no la tiene una esfera o cilindro de acero agregue 100 ul. de plasma citratado y 100 ul. de
cefalina, encube por 3 minutos exactos a 37C.
5. Agregar 100 ul. de cloruro de calcio 0,025 M y activar el cronmetro.
6. El cronmetro se detiene al aparecer la malla de fibrina.
Interpretacin
Esta tcnica no tiene calibracin y el valor informado es solamente el valor en segundos reportado al
formarse la malla de fibrina. El TTPA prolongado puede evidenciar dficit de factores VIII, IX, XI, XII en
concentracin menores a un 40% o ser consecuencia del tratamiento del paciente con heparina.
Tarea:
Investigue la utilidad, procedimiento tcnico y fundamentos de la Curva de Heparina

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

40

DMERO D
Fundamento: Anticuerpos monoclonales anti Dmero D fijados en partculas de ltex, reaccionan con
fragmentos D-D presentes en la muestra, producindose la aglutinacin de las partculas de ltex.
Intervalos de referencia
Dependen del mtodo a emplear en tcnicas cualitativas es negativos mientras que en tcnicas
cuantitativas es < de 0,5 ug. /ml.
Muestra
Sangre venosa o arterial anticoagulada con citrato de sodio 3,2% tubo tapa celeste ver captulo
anticoagulantes en tcnicas hematolgicas.
Reactivos
Partculas de ltex recubiertas de anticuerpos monoclonales Anti Dmero D Comerciales.
Buffer PBS
Control Positivo y Control Negativo
Varilla plstica y Placa de reaccin o aglutinacin

PROCEDIMIENTO
Tcnica cualitativa
1. Llevar los reactivos a temperatura ambiente y homogeneizarlos bien.
2. Poner una gota de ltex en 3 crculos de la placa de reaccin
3. Al primer crculo agregar 20 ul. de plasma, al segundo una gota de control normal y al tercero
una gota de control anormal
4. Mezclar con una varilla plstica y activar el cronmetro
5. Mover la placa en forma rotatoria por 3 minutos
6. Observar aglutinacin dentro de ese tiempo.
Tcnica semicuantitativa
1. Si la determinacin cualitativa es positiva, diluir el plasma en forma seriada.
2. Con cada dilucin realizar la tcnica cualitativa antes descrita.
3. Se informa la concentracin de Dmero D aproximada, que corresponda a la ltima dilucin en
la que se observ aglutinacin.

LECTURA E INTERPRETACIN
Una aglutinacin negativa sugiere normalidad en el funcionamiento de la fibrinolisis, mientras que una
aglutinacin positiva podra corresponder a TVP, EP, CID o a fibrinolisis reactiva, secundaria a otras
patologas.
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

41

TIEMPO DE TROMBINA
El tiempo de trombina mide el tiempo que demora el fibringeno presente en la muestra de
plasma en transformarse en fibrina por la adicin de una cantidad estandarizada de trombina.
Intervalos de referencia
15 a 20 segundos
Muestra
Sangre anticoagulada con citrato de sodio 3,2%
Materiales y Reactivos
Coagulmetro
Bao termorregulado a 37C
Pool de plasma normal
Trombina
Procedimiento
1. Agregar a un tubo kahn mantenido a 37C, 200 ul de plasma en estudio
2. Incubar 2 minutos a 37C
3. Agregar 100ul de trombina
4. Cronometrar
5. Agitar suavemente para detectar hilos de fibrina
6. Anotar tiempo en segundos
7. Procesar un control normal con muestra del pool normal y seguir el mismo procedimiento.
Informe
Informar en segundos
Factores de error
Baja actividad de la trombina
Interpretacin
Resultados prolongados en:
Disminucin de fibringeno o afibrinogenemia
Presencia de inhibidor de la reaccin trombina fibringeno
Presencia de heparina, antitrombinas y PDF
Enfermedades hepticas avanzadas.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

42

DIAGRAMA DE FLUJO DE PRUEBAS BASICAS DE LA COAGULACION

TP Anormal Prolongado

TP con mezcla de pool de plasma normal 1:1

No corrige el tiempo

Corrige el tiempo

Inhibidor de factor VII

cuantificacin de FVII
Dficit de F VII

TTPA Anormal Prolongado

TTPA con mezcla de pool de plasma normal 1:1

No corrige el tiempo

Corrige el tiempo

Presencia de inhibidor
A. Lpico

Ac Anti Factor

Dficit de:
i. Precalicreina
ii. Kininogeno de alto peso molecular
iii. F VIII, FIX, FXII
Profesor Autor
el factor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad SantoCuantificar
Tomas Sede Santiago
43

TP y TTPA Anormal Prolongado

TP y TTPA con mezcla de pool de plasma normal 1:1

No corrige el tiempo

Corrige el tiempo

Presencia de inhibidor
B. Lupico

Ac Anti Factor

Dficit de:
i. F II, FV, FX o FI
ii. Vitamina K, hepatopata o CID

TT Anormal Prolongado

TT con mezcla de pool de plasma normal 1:1

No corrige el tiempo

TTO con Heparina

Corrige el tiempo

fibrinlisis aumentada
Hipofibringenemia
Afibrinogenemia
Disfibrinogenemia

DETERMINACION DE FIBRINGENO

Ensayos funcionales y/o antignicos

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

44

Uno de los mtodos para medir fibringeno es el mtodo de Claus. Que usa trombina como
activador, este mtodo permite cuantificar la concentracin de fibringeno solo en los casos en que la
actividad del fibringeno es normal por lo que es una prueba fundamentalmente para medir
fibringeno funcional.
Intervalos de referencia
Recin Nacidos: 125 300 mg/dL
Adultos: 200 400 mg/dL
Muestras
Muestra de sangre anticoagulada con citrato de sodio 3,2%.
Equipos y Reactivo
Bao termorregulado 37C
Buffer Owren
Estndar de calibracin
Trombina
Procedimiento
1. Realizar una curva de calibracin den estndar de fibringeno normalmente
concentracin 330 mg/dl o pool normal (diluir estndar 1/5 hasta 1/40)
2. Cada dilucin del estndar se diluyen nuevamente con buffer Owren 1:10
De cada dilucin se toman 50 ul y se incuban 3 minutos (algunos laboratorios sugieren
60 o 120 segundos ) a 37C
Luego de la incubacin a cada dilucin de agregan 100ul de Trombina bobina (100
NIH/ml) previamente incubada a 37C
3. Realizar las determinaciones y graficar cada dilucin en papel milimetrado.
4. La curva de calibracin debe hacerse nuevamente frente a cualquier cambio de lote de
trombina.
Muestra del paciente
a. Diluir 1:10
b. Tomar 50 ul de la dilucin
c. incubar 3 minutos a 37C
d. agregar 100ul de Trombina
e. medir el tiempo de la formacin del coagulo
f. extrapolar en la grfica de la calibracin y obtener la concentracin funcional
de fibringeno
Informe
Informar la concentracin de fibringeno en mg/dl y el mtodo usado.
Factores de error
Pacientes con heparinoterapia
Actividad y dilucin de la trombina en el caso de usar trombina de uso clnico

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

45

Comentarios
La concentracin mayor de trombina respecto del estndar diluido proporciona una relacin
inversa pero lineal entre el intervalo para la formacin del coagulo (tiempo) y la concentracin del
fibringeno funcional.
Esta prueba es lineal cuando la concentracin de fibringeno se encuentra entre 100-400 mg/dL,
concentraciones menores a 100 se realiza dilucin 1:5 de la muestra y para mayores a 400 se
recomienda 1:20
Interpretacin
Los valores de referencia del fibringeno varan de acuerdo al mtodo utilizado, reactivo y equipo
empleado.
La determinacin de fibringeno es til en otras patologas que cursan con hipofibrinogenemias como
CID, fibrinlisis sistmica y enfermedad heptica grave.
La hiperfibrinogenemia se puede
encontrar en enfermedad heptica grave, embarazo,
hiperfibrinogenemias transitorias, traumatismos, IAM, infecciones (protena de fase aguda).
La afibrinogenemia congnita presenta tiempos de coagulacin prolongados y se asocia a un trastorno
hemorrgico con presentacin clnica variable.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

46

DETERMINACION CUANTITATIVA DE FACTORES DE LA COAGULACION


Principalmente las deficiencias y tambin el incremento de la actividad de los factores de la
coagulacin pueden identificarse con plasmas deficientes, utilizando un tiempo de tromboplastina
parcial activado. Los factores ms comunes a determinar son los factores VIII, IX, XI y XII.
El fundamento de este mtodo se basa en el hecho en que todos lo dems factores necesarios
para la coagulacin estn presentes en la concentracin necesaria en el plasma deficiente. Por lo tanto
el tiempo depende exclusivamente en el factor a determinar.
La deficiencia del factor se puede determinar cuantitativamente en % de actividad trazando
una curva de calibracin.
Intervalos de referencia
Factor VII : 60 a 150 % de actividad
Factor VIII: 60 a 150 % de actividad
Muestras
Muestra de sangre anticoagulada con citrato de sodio 3,2% con TTPA alargado que corrige el
tiempo con mezcla de pool de plasma normal.

Equipos y Reactivo
Bao termorregulado 37C
Cronometro
Buffer Owren
Plasma normal fresco o control hemostasia normal valorado.
Plasma deficiente en el factor a estudiar.
Procedimiento
Curva de calibracin
o Preparar pool de plasma normal fresco (PPF) o utilizar un control normal valorado.
Diluir el plasma en tampn Owren de la siguiente forma
Reactiv
o

Buffer
Owren
(uL)

800

500

500

500

500

500

500

Plasma
Normal
(M y
T)*
Dilucin

200

500

500

500

500

500

500

1/5

1/10

1/20

1/40

1/80

25%

12.5
%

6.25
%

1/16
0
3.12
%

1/32
0
1.56
%

Activida
100
50%
d
del
%
factor
MT*: mezclar y transferir al tubo siguiente

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

47

o
o
o
o
o
o

Pipetear 100ul de cada dilucin de plasma


Agregar 100ul de plasma deficiente
100 ul de cefalina
Mezclar e incubar 3 minutos a 37C
Aadir 10ul de cloruro de calcio 0.025M (preincubado a 37C)
Cronometrar hasta la aparicin de formacin del coagulo (detener cuando aparezca la primera
red de fibrina
Graficar la curva de calibracin de los resultados obtenidos.

Informe.
Se informa el % de actividad del factor estudiado
Leer en la curva de calibracin la actividad del factor en % en la abcisa, interpolando el tiempo de
coagulacin en segundos en el eje de la ordenada.
Factores de error
Mezcla incorrecta de muestra sangre anticoagulante.
Preincubacin de plasma y reactivo insuficiente
Diluciones incorrectas
Materiales de laboratorio contaminados
pH del agua inadecuado.
Interpretacin
Aplicaciones diagnosticas
o Deficiencia congnita de factores
o Deficiencias adquiridas de factores
o CID
o Deficiencia de vitamina K: II, VII, XI, IX, X
o Hiperfibrinolisis: V, VII, XI, XII
o Transfusin masiva : VIII
o Hemofilias : VIII y IX

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

48

ANTITROMBINA III
La Antitrombina III (AT III) es una glicoprotena srica sintetizada por las clulas del endotelio
vascular e hgado. Es un inhibidor tipo proteasa y la protena ms importante de la regulacin de la
hemostasia. La AT III se une a trombina evitando la conversin de fibringeno a fibrina.
Se incuba el plasma con exceso conocido de trombina en presencia de heparina.
La cantidad remanente de trombina es determinada por su actividad amiloiditica sobre un sustrato
cromognico (reaccin leda a 4005 nm)
La cantidad de trombina neutralizada es proporcional al nivel de AT III presente en el plasma
estudiado.
Valores de referencia
Mtodo amiloiditico: 80 120% actividad
Muestras
Muestra de sangre anticoagulada con citrato de sodio 3,2%.
Equipos y Reactivo
Kit comercial determinacin Antitrombina III
Sustrato cromognico CBS 34-47
Trombina humana
Buffer
cido actico concentrado
Plasma de referencia para calibracin
Procedimiento
Preparacin plasma diluido
Muestra a estudiar (1:40) con buffer heparinizado.
Diluir el plasma de calibracin en buffer heparinizado:
Dil 1:40 actividad de 100%
Dil 1:80 actividad de 50%
Solo buffer corresponde a actividad de 0%
Anlisis de muestra
1. En tubo khan a 37C agregar:
a. 200 ul de dilucin de la muestra
b. 200 ul de trombina, mezclar e incubar
c. 200 ul de sustrato mezclar e incubar 30 seg
d. 200 ul de cido actico, agitar
e. 200 ul agua destilada
2. Blanco reactivo
a. 200 ul de cido actico
b. 200 ul de bufer
c. 200 ul de trombina
d. 200 ul de sustrato
e. 200 ul agua destilada
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

49

3. Leer a 405 nm en contra blanco reactivo (color estable por 2 horas)


Informe
Graficar curva de calibracin en papel milimetrado los % de actividad del calibrador en la
abscisa y la DO en la ordenada
Los resultados de expresan en % actividad interpolando en la curva de calibracin

Factores de error
En la determinacin no influye la concentracin de heparina, por lo tanto puede ser realizada
en pacientes con heparinoterapia.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

50

Parte III
Hematologa Clnica:
Tcnicas de Hematologa para Diagnstico

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

51

GLOSARIO DE TRMINOS USADOS EN HEMATOLOGA

TERMINO
Citos
Osis
Penia
Filia
Cromia
hipo
Hiper
Megalo
Macro
Micro
Aniso
Poiquilo
Sidero

SIGNIFICADO
Clula
Aumento
Reduccin
afinidad
Color
Reduccin
Aumento
Muy grande
Grande
Pequeo
Heterogneo
Variado
De hierro

CARACTER
Sufijo
Sufijo
Sufijo
Sufijo
Sufijo
Reduccin
Reduccin
Reduccin
Reduccin
Reduccin
Reduccin
Reduccin
Reduccin

Definicin de la estructura:
Eritrocitos = rojo
Blasto = primitivo
La combinacin de estos trminos determinan otros como: anisocitosis, megaloblastosis, hipocroma.
Anemia: disminucin por bajos los valores aceptados como normales de la concentracin de
Hemoglobina y el porcentaje de hematocrito.
Policromatofilia o policromasia: presencia en el frotis sanguneo de eritrocitos de mayor tamao de
color azul grisceo (basofilia) que indica eritrocitos inmaduros con restos de cido ribonucleico. Son
equivalentes a reticulocitos observados con tinciones especiales.
Anemia Hipocroma: es la anemia caracterizada por la presencia de eritrocitos hipocromos.
Anemia Normocroma: es aquella en donde los eritrocitos son de croma normal.
Anemia Macrocitica: anemia caracterizada por la presencia de eritrocitos macrociticos en cantidad
leve o marcada.
Anemia microcitica: es aquella donde predominan eritrocitos microciticos.
Anemia Arregenerativa: aquella caracterizada por reticulocitos normales o disminuidos y ausencia de
policromasia o policromatofilia.
Anemia Regenerativa: aquella caracterizada por aumento de reticulocitos y policromasia o
policromatofilia.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

52

Acantocito: eritrocitos con proyecciones irregulares en su superficie.


Aneosinofilia: ausencia de eosinofilos en el frotis de sangre.
Anillos de Cabot: filamento de membrana nuclear, circulares o en ocho de color purpura.
Anisocitosis: en el frotis sanguneo de eritrocitos de diferente tamao que puede ser leve,
moderada o intensa y de predominio microcitico o macrocitico.
Anisocromia: presencia en el frotis sanguneo de eritrocitos de diferente croma, es decir, de croma
normal y croma disminuida.
Basofilo: granulocitos cuyos grnulos se tien con colorantes bsicos de color oscuro.
Basofilia: aumento del basofilos sobre 5% en el recuento diferencia.
Basopenia: disminucin de basofilos bajo 0,02x109 /L
Clulas falciformes, drepanocitos, sickle cell: eritrocitos en forma de hoz o en semiluna.
Codocito, target cell, dianocito: eritrocitos con reborde perifrico ntido que rodea una zona angular
de hemoglobina ms clara y por su parte central ms clara.
Concentracin de hemoglobina corpuscular media: indica la concentracin media de hemoglobina por
litro de una masa de hemates, se expresa en gr/L
Crenocito, equinocito: eritrocito espiculado con proyecciones cortas que cubren su superficie.
Cuerpos de Dhle: areas basofilas circunscritas en el citoplasma de los neutrofilos. Aparecen
especialmente en infecciones graves.
Cuerpos de Howell Jolly: granulo grueso, esfrico, generalmente excntrico, se tie de color azulado
(basofilo) ubicado en el interior de un eritrocito, corresponde a restos de ncleo.
Dacriocito: eritrocito con extremo elongado en forma de gota o lagrima
Desviacin a la derecha: aparicin de neutrofilos con un nmero de segmentos ms de lo normal.
Desviacin a la izquierda: aumento en el recuento diferencial de baciliformes y a veces tambin
presencia de juveniles y mielocitos.
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

53

Distribucin por anchura de eritrocitos (red cell volumen distribution width) (RDW): medicin de
anisocitosis, se expresa en porcentaje.
Eliptocito u ovalocito: eritrocito en forma ovalada y elongada.
Eosinofilo: granulocito cuyos grnulos se tien de color caf oro con colorantes cidos.
Eosinofilia: aumento de los eosinofilos sobre 0,45x109/L
Eosinopenia: disminucin de los eosinofilos bajo 0,05x109/L
Eritroblasto: clula de la serie roja inmadura, presenta ncleo.
Esferocito: eritrocitos esfricos que han perdido su forma bicncava, sin centro claro
Esquistocito, esquizocito: eritrocito fragmentado con aspecto cuneiforme, irregular espiculado, con
proyecciones cortas que cubren la superficie.
Estomatocito: eritrocito con depresin central en forma de boca.
Granulacion Toxica Degenerativa de los leucocitos, RTD, GPN o Granulacin patolgica: presencia de
neutrofilos con granulas hiperteidos y vacuolas en el citoplasma.
Hemoglobina corpuscular media (HCM): indica la hemoglobina contenida en el glbulo rojo y se
expresa en picogramos (pg/Clula
Hematocrito: relacin entre el volumen de eritrocitos y volumen sanguneo de una columna de sangre
centrifugada (microhematocrito)
Hipocroma: disminucin de la coma del eritrocitos, por disminucin del contenido de hemoglobina.
Linfocito Reactivo: linfocito con alteraciones morfolgicas caracterizadas por la abundancia de
citoplasma, borde irregular, basofilia citoplasmtica, ncleo maduro o joven de forma irregular y
cromatina ms fina.
ndice ictrico: mide la intensidad de color amarillo del plasma.
Inmunoblasto: clula de gran tamao 20 30 ul con un amplio ncleo central, cromatina laxa con
numerosos nuclolos. Su citoplasma moderadamente extenso presenta intensa basofilia y pironinofilia
Linfocitosis absoluta: aumento absoluto de los linfocitos circulantes sobre 4x109/L en adultos. 9x109/
en nios menores y 7x109/L en nios mayores.
Linfocitosis relativa: aumento porcentual de los linfocitos en el recuento diferencial sin que este
aumentado en forma absoluta.
Linfopenia: disminucin de las cifras absolutas de linfocitos menor a 1,4x109/L en nios y 1x109/L en
adultos.
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

54

Leucocitos: incluye todos los glbulos blancos, tanto granulocitos como agranulocitos
Leucocitosis: aumento del nmero de leucocitos sobre valores normales mayor de 11x109/L
Leucopenia: disminucin del nmero de leucocitos bajo valores normales (menos de 4x109/L)
Macrocitosis: presencia en el frotis sanguneo de eritrocitos grandes en cantidad leve o marcada
Microcitosis: presencia en el frotis sanguneo de eritrocitos pequeos en cantidad leve o marcada
Megaloblastos: eritroblastos con alteraciones madurativas. Se encuentran en medula sea.
Megalocito: eritrocitos grandes ovalados y con escaso o nulo centro claro
Monocitosis: aumento del nmero de monocitos sobre 0,8x109/L
Monocitopenia: recuento absoluto de monocitos inferior a 0,2x109/L
Neutrofilos: granulocitos, cuyo citoplasma se tie de forma neutra.
Neutrofilo hipersegmentado: Neutrofilos cuyo ncleo se ha segmentado en ms de 5 lbulos.
Neutofilia: aumento de los granulocitos neutrofilos sobre 7,5x109/L
Neutropenia: disminucin de los granulocitos neutrofilos bajo 1,5x109/L
Normocitosis: eritrocitos de tamao normal
Normocromia: eritrocitos de color rosado con coloracin normal.
Pancitopenia: trastorno de la formacin de las tres series que se caracteriza por anemia, leucopenia y
trombocitopenia.
Pelger Het: anomala constitucional de los granulocitos en done los neutrofilos solo maduran hasta la
forma de baciliforme y presentan ncleo bilobulado lentes de sol
Macroplaqueta: plaqueta de gran tamao
Plasmocitosis: aumento de los plasmocitos sobre 0,01x109/L
Poiquilocitosis: presencia en el frotis sanguneo de eritrocitos de diferentes formas que puede ser leve
moderada o marcada.
Policitemia o poliglobulia: aumento del nmero de hemates por unidad de volumen sanguneo.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

55

Punteado basofilo: presencia de eritrocitos con punteado mltiple en su interior que se tie con
colorantes bsicos, son eritrocitos jvenes con restos de ribosomas.
Reaccin leucemoide: cambios hematolgicos que asemejan una leucemia. El patrn puede ser
mieloide o linfoide y raramente monocitoide.
Reticulocitos: eritrocitos jvenes en los cuales persiste restos de acido ribonucleico en forma de
retculo. Solo es posible observarlos con tinciones especiales.
Rouleaux: eritrocitos observados en el frotis sanguneo en donde se disponen en formacin de pilas de
monedas
Sndrome leucoeritroblastico: presencia en el frotis de eritroblastos y reaccin leucemoide de los
granulocitos.
Restos de Gmprecht: restos nucleares de linfocitos frgiles.
Trombocitosis: aumento del nmero de plaquetas sobre 440000/uL
Trombopenia, trombocitopenia, plaquetopenia: disminucin del nmero de plaquetas bajo el rango
normal.
VHS, velocidad de sedimentacin globular o eritrosedimentacion: mide la distancia en mm de la cada
de los eritrocitos en una hora.
Volumen corpuscular Medio (VCM): seala el volumen promedio de cada eritrocito y se expresa en
femtolitro (fL)
Ref. Hematologa y procedimientos de laboratorio Guido Osorio.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

56

FERREMIA
Ferremia es el trmino que describe la concentracin de hierro circulante en el suero.
En el organismo normalmente existen 4 grs de hierro, aproximadamente 65% reside en la hemoglobina,
3% en la mioglobina y una pequea cantidad se encuentra en las enzimas celulares que catalizan la oxidacin y
reduccin del hierro. El resto de fierro est almacenado en el hgado, medula sea y bazo como ferritina o
hemosiderina.
El hierro es el elemento esencial para la sntesis de hemoglobina. En la sangre el hierro srico es
transportado por la transferrina (protena sintetizada en hgado). La medicin de Ferremia es til para la
determinacin de varios trastornos relacionados con el hierro, como la sobrecarga sistmica y especialmente
para el diagnstico diferencial de las anemias.
Muestra:
Suero preferentemente o plasma heparinizado.
El paciente debe estar en ayuno de por lo menos 8 horas. La extraccin se hace de preferencia en la maana por
el ciclo circadiano del Fe.
El suero debe estar libre de hemlisis.
Mtodo para determinacin Fotomtrico colorimtrico
Fundamento del mtodo
En un medio cido, proporcionado por el buffer acetato de sodio pH4.7, el fierro se puede liberar de su
protena transportadora. Luego el Fe+3 reacciona con el reactivo de color cromazurol B (CAB) y
cetiltrimetilbromuro de amonio (CTMA) para formar un complejo ternario coloreado con una absorbancia
mxima a 623nm.
La intensidad del color es proporcional a la concentracin de fierro presente en la muestra.
Reactivos
Reactivo listo para usar y contiene:
-Cromazurol B
- Cetiltrimetilbromuro de amonio
- Cloruro de guanidina
- Buffer acetato de sdio pH 4.7
Estndar (hierro ionizado)

0.18 mmol/L
2.2 mmol/L
2.6 mol/L
4.5 mmol/L
100ug/dL

Procedimiento
En tres tubos libres de fierro marcados B (blanco); S (estndar); M (muestra), colocar:
Blanco Reactivo
Estndar
Muestra
H2O bidestilada
50 l
----------------------Estndar
Suero
Reactivo
Mezclar bien.

-------------------------1.0 ml

50 l
----------1.0 ml

------------50 l
1.0 ml

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

57

Incubar por 15 minutos a temperatura ambiente


Leer la Absorbancia de los tubos a 623nm antes de 60 minutos.
El mtodo es lineal hasta 500l/dl.
Calculo de resultados
Calcular el Factor Recproco de Calibracin (FRC), sabiendo que:
Concentracin estndar
FRC = ---------------------------------------Absorbancia estndar
Calculado el FRC, multiplique este valor por la Absorbancia de cada muestra, para obtener la concentracin de
las muestras
Concentracin Muestra = FRC x Absorbancia Muestra
Valores de referencia
Hombre: 59 148 ug/dl
Mujer: 37 - 145 ug/dl
Control de calidad: Procesar control comercial con valores conocidos.
NOTA IMPORTANTE: Todo el material de laboratorio empleado (puntas desechables, cubetas de lectura, tubos
etc.) debe estar libre de fierro, para lo cual una vez realizada la limpieza habitual se debe sumergir en cido
clorhdrico (HCl) al 10 % o 15 % p/v por 12 a 24 horas. Luego enjuagar con agua destilada libre de fierro o agua
bidestilada al menos por tres veces. Secar y guardar en papel kraft, para evitar el contacto con el polvo
ambiental.
Aumento de Ferremia
Disminucin de Ferremia
Envenenamiento agudo por hierro (nios)
Infeccin crnica o aguda
Leucemia aguda
Carcinoma
Enfermedad heptica aguda
Perdida crnica de sangre
Anemia aplasica
Hipotiroidismo
Terapia excesiva con hierro
Anemia por deficiencia de hierro
Hemocromatosis
Malnutricin de protenas
Anemias Hemolticas
Anemia perniciosa
Anemias Sideroblasticas
Talasemias
Transfusiones
Deficiencia de vitamina B6

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

58

CAPACIDAD TOTAL DE FIJACIN DE HIERRO


Capacidad Total de Fijacin de Hierro o TIBC (Total Ion Binding Capacty)
Mide la capacidad que posee la transferrina de unir hierro a su molcula saturndola en su totalidad
Principio:
La protena transportadora de hierro, Transferrina, es saturada con exceso de iones de hierro (Fe+3). El hierro no
unido es adsorbido con oxido de aluminio y precipitado y luego se mide el hierro unido a la transferrina que
permanece en el sobrenadante.
Reactivos:
Solucin de hierro (Cloruro de hierro) 0.09mmol/L
Oxido de Aluminio
Reactivos para determinacin de Ferremia
Procedimiento
Reactivo
Tubo de Reaccin
Cloruro de hierro
1.0 ml
Muestra
0.5 ml
Mezclar bien e incubar por 5 minutos a temperatura ambiente
xido de aluminio
aprox. 0.25 0.35gr
Tapar el tubo y mezclar en rotador por 10 minutos, luego dejar reposar por 3 minutos.
Centrifugar 1 minuto a 5000 rpm
Realizar tcnica de Ferremia al sobrenadante.
Calculo de resultados TIBC
Para calcular la capacidad total de fijacin de hierro de la transferrina, la ferremia determinada se debe
multiplicar por 3 (factor de dilucin de la muestra).
TIBC = Fierro determinado x 3

TIBC Aumentado
Enfermedad heptica aguda
Anemias por deficiencia de hierro

TIBC Disminuido
Infecciones crnicas
Cirrosis
Hemocromatosis
Anemias hemolticas
neoplasia
Depresin de Protenas
Anemias Sideroblasticas
Talasemias

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

59

RESISTENCIA OSMTICA DE LOS ERITROCITOS


El test de Resistencia Globular Osmtica es realizado por el mtodo de lisis de los eritrocitos en
soluciones hipotnicas y cuantificacin colorimtrica.
Es un examen utilizado como ayuda diagnstica en la esferocitosis hereditaria, debido a que en este
cuadro clnico los eritrocitos son ms sensibles a los cambios de tonicidad del medio externo.
Principio
Medicin espectrofotomtrica de la hemoglobina liberada tras la lisis de los eritrocitos incubados en
soluciones de NaCl decrecientes
La membrana del eritrocito es semipermeable, es decir, permite el libre paso de agua a su interior, pero
restringe el de ciertos solutos inicos (Cl-, K+, Na+ principalmente). Por esto cuando el eritrocito se incuba en un
medio hipertnico, se produce por efecto osmtico un paso de agua desde el interior al exterior de la clula que
condiciona su deshidratacin.
Por el contrario, si el medio es hipotnico, el agua atraviesa la membrana en sentido contrario y el
eritrocito se hidrata.
En eritrocito la resistencia osmtica depende de la relacin superficie/volumen. Debido a su forma de
disco bicncavo, el eritrocito puede aceptar sin hemolizarse una entrada de agua capaz de aumentar su volumen
hasta un 70%, si sobrepasa este lmite se produce hemlisis.
Mtodo: espectrofotomtrico de Dacie
Muestra: Sangre heparinizada (2 tubos)
Materiales:
solucin de NaCl 1%
Agua destilada
Pipetas 10 ml

Tubos de vidrio 12 ml
Gradilla
Centrifuga

Procedimiento
1. Preparar todos los reactivos utilizados en esta tcnica (ver anexo: Preparacin de Reactivos)
2. Incubar uno de los tubos con la muestra de sangre del paciente en la estufa a 37C por 24 horas.
3. Colocar 12 tubos con capacidad para 10 mL en una gradilla e identificarlos con la concentracin de NaCl
que corresponda
4. Realizar diluciones de la solucin de trabajo al 1% segn tabla:
N Tubo Concentracin NaCl (%)
Buffer NaCl 1% (mL)
1
0,85
8,5
2
0,75
7,5
3
0,65
6,5
4
0,60
6,0
5
0,55
5,5
6
0,50
5,0
7
0,45
4,5
8
0,40
4,0
9
0,35
3,5
10
0,30
3,0
11
0,20
2,0
12
0,10
1,0
Tapar con papel parafilm y mezclar por inversin

Agua Purificada (mL)


1,5
2,5
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
8,0
9,0

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

60

5.
6.
7.
8.
9.

Homogenizar la muestra del paciente suavemente


Agregar 100 ulL de sangre a cada tubo y tapar con parafilm. Mezclar suavemente por inversin.
Incubar a temperatura ambiente (15 30C) por 30 minutos.
Mezclar por inversin y centrifugar los tubos durante 5 minutos a 3000 rpm.
Leer la hemlisis (absorbancia) del sobrenadante de cada tubo en el Fotmetro a 540nm usando: Tubo
N1 como blanco. Tubo N 12 como 100% de hemlisis.
10. A las 24 hrs realizar la misma tcnica con la muestra incubada a 37C.
Si la resistencia osmtica a las 0 hrs esta disminuida agregar 2 tubos ms con concentraciones 0,9% de NaCl: 9
mL de solucin de trabajo (NaCl al 1%) + 1 mL de agua purificada. Y un tubo al 1,2% de NaCl: 1,2 mL de solucin
STOCK (NaCl 10%) + 8,8 mL de agua purificada (blanco)
Calculo de resultado
1. Calcular el % de lisis de cada tubo considerando:
- La absorbancia del tubo 0,85% de NaCl es usado como blanco (0% de hemlisis).
- La absorbancia del tubo 0,10% de NaCl es usado como el 100% de hemlisis.
2. Realizar un grfico a las 0 y 24 hrs con % Lisis versus Concentracin de NaCl.
3. Informar la conclusin del examen
Valores Normales
Concentracin NaCl
% lisis 0 hrs
% lisis 24 hrs
0,20
100
95 100
0,30
97 100
85 100
0,35
90 99
75 100
0,40
50 95
65 100
0,45
5 45
55 95
0,50
06
40 85
0,55
0
15 70
0,60
0
0 40
0,65
0
0 10
0,75
0
0
< 6% hemolisis a concentracin NaCl 05%

Aumento de Resistencia Osmtica


Talasemia
Anemia ferropriva
Reticulocitosis

Disminucin de Resistencia Osmtica


Esferocitosis hereditaria (en el 5% de los
casos la curva est dentro del rango normal).

Doble Poblacin
En anemia hemoltica autoinmune y en alteraciones enzimticas se observa una poblacin de clulas menos
resistentes (relacionados con el nmero de esferocitos) y otra poblacin ms resistente (relacionada a la
poblacin de reticulocitos).
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

61

Anexo: Preparacin Reactivos


Solucin Stock NaCl 10% con buffer fosfato
NaCl
90 gr
Na2HPO4
13,655 gr

NaH2PO4 H2O
Agua purificada

Solucin de trabajo NaCl 1%


Solucin stock NaCl al 10% 100 mL
Agua purificada
900 mL

2,149 gr
1000 mL

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

62

ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA
Aprovechando los diferentes puntos isoelctricos de las diferentes hemoglobinas se hacen
migrar en una cmara electrofortica, a distinto pH que puede ser 8,9 o 6,25. El soporte puede ser
acetato de celulosa o gel de agar. Permite separar mejor las diferentes hemoglobinas normales y
anormales.
Valor de referencia
RN de trmino

Hb Fetal = 65-80
HbA = 20-35
HbA2 = 0,2

%
%
%

> De 6 meses: HbA1 = 94,2-98,5 %


HbA2 = 1 4
%
HbF = 0,5- 2,0 %
Muestra
Muestra de sangre recolectada y anticoagulada con EDTA frasco tapa lila, siempre procesar en
paralelo con la muestra problema una muestra de adulto normal y otra de RN para control de
la tcnica.
Equipo
Cmara electrofortica
Densitometro
Reactivos
TRIS-EDTA-BUFFER pH 8,9-9,1
TRIS 7-9
= 16,1 gr
Disodium EDTA = 1,56 gr
cido brico = 0.92 gr
Agua destilada = 1.000 ml
Cloroformo o tolueno
Suero fisiolgico
Solucin de fijacin, Tincin y aclaracin
Placa de acetato de celulosa
Papeles secantes
Procedimiento
Preparacin del hemolizado:
Centrifugar 2-4 ml de sangre anticoagulada con EDTA
Eliminar el plasma, lavar los glbulos rojos 3 veces con suero fisiolgico, eliminando el
sobrenadante, posterior al ltimo lavado medir el volumen de glbulos rojos.
Por cada 1 ml de glbulos rojos lavados agregar 1,5 ml de agua destilada, mezclar bien
Agregar 4 ml de cloroformo o tolueno por cada ml de glbulos rojos lavados, agitar
vigorosamente por 7 minutos.
Centrifugar 15 minutos a 3000 r.p.m. y obtener el hemolizado aspirndolo.
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

63

Montaje de la electroforesis de hemoglobina:


Agregar Buffer Tris EDTA pH 8,9 en celda o cubeta de migracin hasta la marca
lateral, que indica la misma cubeta.
Humedecer la membrana de acetato de celulosa en Buffer tris EDTA pH 8,9 por 10
minutos.
Eliminar el exceso de buffer colocando la membrana entre los papeles secantes por
ms o menos 30 segundos.
Colocar la membrana humedecida en el porta membrana y ste en la cubeta de
migracin.
Inocular la muestra en la membrana de acetato de celulosa mediante el aplicador de
muestras.
Realizar la corrida electrofortica a 300 volts por 30 minutos.
Fijacin y tincin:
Para la fijacin y tincin se utiliza una solucin Fixotive/Dye por 10min.
Realizar lavados sucesivos en soluciones de cido actico glacial al 5%, deshidratar con
metanol por un minuto y por ltimo aclarar por 1 minuto 30 segundos con una solucin de
cido actico glacial al 13% en etanol 90%.
Secado:
Retirar la membrana de acetato de celulosa del aclarador y colocar sobre un vidrio y
con otro en ngulo de 45 se elimina el exceso de aclarador.
La placa de vidrio con la membrana se colocan a secar aprox. entre 100-150C por 510 minutos.
Despegar cuidadosamente la membrana del vidrio y se coloca en una envoltura o
estuche plstico especial para ser leda en densitmetro.
Clculo del porcentaje de las diferentes fracciones de hemoglobina:
El densitmetro entrega graficadas las diferentes bandas, por ejemplo en un adulto,
cada pique de hemoglobina se grafica en una serie de rayados inferiores en los cuales
cada ngulo vale 10 y en caso de no alcanzar a 10 se suma el valor intermedio. As en
el ejemplo:
HbA = 133
Total = 140 as HbA = 95% y HbA2 = 5%
HbA2 = 7
Informe:
Grfico entregado por el densitmetro
Porcentaje de HbA y HbA2 u otra hemoglobina anormal que se observe.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

64

HEMOGLOBINA FETAL
METODO
Desnaturalizacin alcalina (singer)
FUNDAMENTO
La determinacin de HbF por esta tcnica se basa en la desnaturalizacin proteica por
accin de un lcali. La hemoglobina A se desnaturaliza, desdoblndose las cadenas de
aminocidos mientras que la HbF es resistente, apareciendo en el filtrado despus de
neutralizar el pH con una solucin semisaturada de Sulfato de amonio.
VALORES DE REFERENCIA
RN:
> De 2 aos:

55-85%
1%

MUESTRA
3-5 ml de sangre oxalatada o con EDTA

REACTIVOS
Suero fisiolgico
Tolueno o tetracloruro de carbono
-KOH (1,167gr aforar a 250 ml con agua destilada)
Sulfato de amonio semisaturado (disolver 195 gr. en 250 ml de agua destilada fra
agitar hasta saturarla. Tomar el sobrenadante y diluirlo al 50% con agua destilada,
agregar 1 ml de HCl 10 N y mantener a temperatura ambiente.
HCl 10 N medir 82,8 ml de HCl al 37% de pureza y de una densidad de 1,19 gr./ml y
llevar a 100 ml. Con agua destilada, no olvidar de agregar siempre el cido sobre el
agua. Mantener a temperatura ambiente.
PROCEDIMIENTO
1. Preparacin de la solucin stock de hemoglobina (bemolizado)
a) -Centrifugar 3-5 ml de sangre anticoagulada.
b) Eliminar el plasma, lavar los glbulos rojos 3 veces con suero fisiolgico, eliminando el
sobrenadante, posterior al ltimo lavado medir el volumen de glbulos rojos.
c) Por cada 1 ml de glbulos rojos lavados agregar 1,4 ml de agua destilada, y 0,4 ml de tolueno
agitar vigorosamente por 5 minutos.
d) Centrifugar 15 minutos a 3.000 r.p.m.
e) Eliminar la capa de tolueno por absorcin, sacar la tapa de solucin de hemoglobina por
insercin de la capa de eritrocitos con una pipeta Pasteur.
Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

65

f) Filtrar. Lo obtenido corresponde a la Solucin Stock de hemoglobina. De esta solucin se


necesita ms de 0,5 ml.
2. Preparaciones de las soluciones de trabajo.
Se preparan dos soluciones de trabajo Hemoglobina total y hemoglobina fetal. Ambas a partir de la
solucin stock de hemoglobina.
Solucin de hemoglobina total:
Solucin stock de hemoglobina: 0.02 ml
Agua destilada:
5,0 ml
Solucin de Hemoglobina fetal:
Agregar 3,2 ml de KOH N/12 en un tubo de ensayo a una temperatura de 1921C.
Agregar 0,2 ml de solucin stock de hemoglobina, hacer funcionar un
cronmetro. Enjuagar reiteradas veces la pipeta y agitar por inversin
completa unos 10 segundos.
Exactamente 60segundos despus de haber hecho funcionar el cronmetro,
aadir 7 ml de la solucin semisaturada de sulfato de amonio. Agitar por
inversin unas 6 veces.
Filtrar de tal forma de obtener una solucin cristalina.
Esta solucin filtrada corresponde a hemoglobina fetal.

7. LECTURA Y CALCULOS
-Leer las soluciones de hemoglobina total y fetal a 540 nm., utilizando como blanco
agua destilada.
-La concentracin de hemoglobina fetal se obtiene utilizando la siguiente frmula.
DO HbF x 0,207*
HbF (%) =
DO Hb total

x 100

*0,207 se obtiene de:


Dilucin de HbF
Dilucin de Hb Total
Proporcin 52 : 251

1 : 52
1 : 251
0,207

Tarea:
Investigue el mtodo citoqumico de elucin cida de Kleihauer Betke para la determinacin
de hemoglobina fetal, considere: Fundamento, Valores normales, tipo de muestra y controles,
reactivos, procedimiento e interpretacin de resultados.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

66

SCREENING TEST PARA LA DEFICIENCIA DE G6PD

El Ascorbato exgeno en presencia de oxihemoglobina, sufre una oxidacin completa


generndose perxido de hidrgeno. Si el agua oxigenada no es destoxificada por la glutatin
peroxidasa, esta reacciona con la hemoglobina convirtindola en un hemocromo de color caf
visible a simple vista. Para evitar que la catalasa acte en las destoxificacin del perxido de
hidrgeno se inhibe con cianuro neutro.

VALOR DE REFERENCIA
Negativo

MUESTRA
3 ml de sangre anticoagulada

REACTIVOS
Ascorbato de sodio
10 mg
Glucosa
5 mg
KCN 0,1 M neutralizado, disolver 0,6512 gr. de KCN en 60 ml de agua destilada;
agregar 20 ml de buffer fosfato pH 7,4 y aforar con agua destilada a 100 ml. Esta
solucin es estable indefinidamente a temperatura ambiente.
Buffer Fosfato Isotnico Na2HPO4 x 2H2O
NaH2PO4

23,4 gr.
21,3 gr.

PROCEDIMIENTO
En un tubo de hemlisis agregar:
10 ml de Ascorbato de sodio
5 mg de glucosa
2 ml de Sangre
0,1 ml de KCN neutralizado
Encubar a 37C y observar cambios de coloracin entre las 2-4 horas
LECTURA
En una deficiencia de G6PD se observa una coloracin caf dentro de 1-2 horas de
incubacin a 37C. En el control normal se mantiene el color rojo de la sangre. Es posible
obtener falsos positivos en caso de que existiera una deficiencia de glutatin peroxidasa o
glutatin reductasa que son otras enzimas involucradas en la destoxificacin del H2O2 Despus
de la G6PD.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

67

CUERPOS DE HEINZ
Los Cuerpos de Heinz corresponden a hemoglobina denaturada y oxidada. Se debe
buscar con coloracin supravital como azul cresil brillante. Hay tcnicas de buscan los Cuerpos de
Heinz en forma espontanea o de forma inducida.
La provocacin de Cuerpos de Heinz en eritrocitos susceptibles sirve como ayuda en el diagnostico de
deficiencias enzimticas del eritrocito (deficiencia de glucosa 6- fosfato deshidrogenasa),
hemoglobinas inestables (HbH, HbZurich, etc) o intoxicaciones por drogas
Tanto en las hemoglobinopatas como en las deficiencias enzimticas como glucosa 6- fosfato
deshidrogenasa, aparecen despus de la ingestin de drogas oxidantes.
Este cuerpo puede ser inducir con una sustancia redox como azul cresil brillante o acetifenilhidrazina.
La acetifenilhidrazina al igual que otros compuestos aminos, nitroaromaticos y agentes oxidantes
inorgnicos como cloruro de potasio pueden producir la oxidacin de grupos sulfidrilos expuestos en la
hemoglobina causando la formacin de puentes disulfuros y distorsin de la estructura terciaria de la
hemoglobina. El resultado es la precipitacin de ella formando inclusiones intracelulares llamadas
cuerpos de Heinz los cuales son visualizacin mediante la tincin con cristal violeta.
TECNICA DE CUERPO DE HEINZ ESPONTANEOS
Intervalo de referencia
Negativo
Muestra
Muestra de sangre anticoagulada con EDTA
Reactivos y equipos

Azul cresil brillante


1 grs

Suero fisiologico 100 ml

Citrato de sodio 400 mg (filtrar antes de usar)


Procedimiento
1.
2 volumen de sangre + 1 volmenes de solucin de azul cresil brillante
2.
Incubar a 37C y realizar frotis a los 20, 60 y 120 minutos.
3.
Observar con objetivo de inmersin.
Interpretacin
Los cuerpos de Heinz se tien de color purpura intenso pueden ser nicos o mltiples
grandes o pequeos de forma esfrica. Se informa en porcentaje. Ver figura 13

Figura 13. Cuerpos de Heinz espontneo


Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

68

TECNICA DE PROVOCACION DE CUERPOS DE HEINZ


Valor se de referencia
< 32% de eritrocitos con 5 o ms cuerpos de Heinz
Muestra
Muestra de sangre anticoagulada con EDTA
Reactivos y equipos
Solucin de acetilfenilhidrazina (preparar al momento de usar)
o 10 mg de acetilfenilhidrazina en 10 ml de Buffer pH 7,6.
Solucin buffer pH 7.6 (preparar al momento de usar)
Solucin A
KH2OPO4 0,066M = 0,091 grs. KH2OPO4 en 10ml agua destilada
Solucin B
Na2HPO4 0,066M = 0,095 grs. de Na2HPO4 en 10ml agua destilada
Mezclar 1,3 ml de solucin A con 8,7 ml de solucin B y Agregar 0,02ml de glucosa por cada 10 ml de
buffer.
Solucin cristal violeta
o 2 gr de cristal violeta y disolver en 100 ml de NaCl 0,73%
o Filtrar
o Agregar el filtrado a otros 100 ml de NaCl 0,73%
o Filtrar antes de usar.
Bao termorregulado
Tubos de vidrio, Gradilla
Portaobjetos, cubreobjetos, Microscopio
Pipetas automticas, puntas micropipetas
Procedimiento
1
Mezclar 100 ul de sangre con 2 ml de solucin acetilfenilhidrazina. Airear la mezcla
insuflando 2 a 3 veces aire con una pipeta plstica.
2
Procesar con la muestra 2 controles normales.
3
Incubar muestra y controles en tubos destapados en bao termorregulado a 37C
durante 2 horas. Airear la muestra 2 a 3 veces.
4
Incubar un segundo periodo por 2 horas a 37C.
5
Luego de la incubacin, mezclar y en un portaobjeto juntar una pequea gota (10ul)
de la muestra con 25ul de solucin de cristal violeta. Cubrir con cubreobjeto.
6
Esperar 5 minutos antes de realizar la observacin.
7
Observar la preparacin al microscopio (100X) y contar el % de los eritrocitos que
contengan 5 o ms cuerpos de Heinz. Ver figura 14

Figura 14. Tcnica de provocacin de Cuerpos de Heinz


Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

69

TINCIN DE HEMOSIDERINA MEDULAR


Por el mtodo de Perls los iones frricos liberados por un acido de su unin a las protenas, en
presencia de ferrocianuro de potasio dan origen a un precipitado azul de ferrocianuro frrico o azul de
Prusia, que se observa en frotis de medula sea o de sangre perifrica cuando se sospecha de cuerpos
de Pappenheimer.
Valores de referencia:
Hemosiderina medular libre en el retculo
% de sideroblastos por cada 100 eritroblastos: 30 60%
Sideroblastos en anillo: negativos
Hemosiderina en macrfagos siderofagos.
Muestra:
Frotis de sangre perifrica o mdula sea.
Reactivos y equipos:
HCl 0,2N (1,65 ml de HCl 37%+ 100 ml agua destilada)
Ferrocianuro de potasio al 2% (a T ambiente)
Eosina 0,1%
Metanol p.a
Solucin de trabajo preparar al momento de usar: HCl 0,2N y Ferrocianuro de potasio
al 2% en partes iguales.
Procedimiento:
1. Fijar los frotis de medula sea o sangre perifrica en metanol por 15 minutos.
2. Lavar y secar al aire
3. Preparar solucin de trabajo en frasco coplin
4. Sumergir los frotis 30 minutos a T ambiente
5. Lavar con agua destilada por 5 minutos
6. Teir con Eosina 0,1% por 5 minutos.
7. Lavar con agua destilada por 2 minutos
8. Secar a T ambiente
9. Montar y observar al microscopio.
10. La hemosiderina se observa como grnulos color celeste
Informe:
Buscar hemosiderina libre
Buscar hemosiderina asociada a las clulas.

Profesor Autor
T.M Lic. Anglica Opazo F. Escuela de Tecnologa Mdica Universidad Santo Tomas Sede Santiago

70

También podría gustarte