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ALMIDONES RESISTENTES.

David Villaseor Ortiz


100mg. De muestra
Aadir 4ml. De -amilasa
Agitar 5seg-.
Incubar a 37C. X 16hrs. 200stoks
4ml de Etanol (99-96% v/v) IMS
Agitar 5 seg.
Centrifugar (3000rpm) x 10min, sin tapa
Decantar el sobreNadante (almacenar1)
Aadir 2ml etanol (50% v/v)
Agitar 5seg.
Aadir 6ml etanol (50% v/v)
Aguitar 5seg.
Centrifugar (3000rpm) x 10min
Decantar el sobreNadante (almacenar2)
Aadir 6ml etanol (50% v/v)
Aguitar 5seg.
Centrifugar (3000rpm) x 10min
Decantar el sobreNadante (almacenar3)
Retirar exeso de etanol volteando los tubos

Medicin de RS:

Colocar aguitador (5x15mm)


Aadir 2ml de KOH 2M
Aguitacin magnetica con hielo
Aadir 8 ml buffer Acetato de Na. 1,2m (Ph 3,8)
Aguitacin magnetica con hielo
Aadir 0,1ml de AMG de botella 1
Mezclar completamente
Incubar a 50C bao de agua x 30min
Aguitar 5seg.

iv. Para muestras 10% en concentracin de RS.


Transferir a matraz aforado de 100ml
Retirar el aguitador
Usar agua para remover todo
Llevar a 100ml con agua destilada
Mezclar por 20seg.
Centrifugar (3000rpm) x 10min
Almacenar lo drenado

v. Para muestras 10% en concentracin de RS.


Centrifugar (3000rpm) x 10min (sin dilucin)
Almacenar el sobrenadante.

Para iv y v.
Transferir 0,1ml de SobreNadante del paso iv (duplicado)
sobrenadantes del paso v (sin diluir) (16x100mm tubos)
Aadir 3ml de GOPOD (Solucin 4)
Incubar a 50C X 20min.
Medir absorvancia a 510nm (para ambos casos)

Preparar blanco:
0,1ml buffer Acetato de Na de 100Mm (Ph 5,4)
Aadir 3ml de GOPOD

Preparar D-glucosa (cuadriplicado):


Mezclar 0,1ml de D-glucosa (1 mg/ml)
Aadir 3ml de GOPOD

Medicin de almidn resistente-no (Solubilizado).


Combinar sobreNadante 1 ,2 Y 3.
Llevar a 100ml en un matraz aforado con Buffer Acetato de Na 100Mm
(pH4.5)
Mezclar bien 20seg.
Extraer alcuotas de 0,1ml (duplicado)
Aadir 10 L de sol. AMG (300U/ml)
Aadir 100Mm buffer de maletato de Na ( 6 pH )
Incubar por 20 min a 50 C.
Medir absorbancia 510 contra blanco
Calcular el cont. De alm no resistente (disolucin)

Preparacin de reactivos dispuestos en el KIT.


(botella1) Amiloglucosidasa (AMG):
Diluir 2ml de AMG a 22ml con buffer Maletato de Na 0.1m, pH6
Dividir en alcutas 5ml
Congelar
5 aos vida til.

(Botella2) -amilasa Pancretica:

1g -amilasa pancretica
Diluir en 100ml buffer de Maletato de Na (100Mm, ph6)
Mezclar por 5min
Aadir 1ml de AMG
Mezclar por 5 min
Centrifugar a 3000rpm x 10min
Almacenar el sobredrenante
GOPOD BUFFER (BOTELLA 3):
Diluir botella 3 en 1L de agua destilada
(Solucin 3) usar inmediatamente

GOPOD ENZIMAS (BOTELLA 4); GOPOD REACTIVO:


Disolver (botella 4) en 20ml de (solucin 3)
Mezclar por 10seg.
Transferir al sobrante de solucin 3
Cubrir botella con aluminio
Estable 3meses a 5C

Preparacin reactivos no suministrados:


Buffer maletato de Na:
23,2g. Ac. Maleico glacial (1,5 g/ml)
Disolver en 1600ml de agua destilada
Ajustar pH6 con hidrxido de Na, 4M (160g/l)
Aadir 0,74g de cloriro de Ca dihidratado
Aadir 0,4 g de azida de Na
Disolver
Ajustar a volumen 2L
Estable 12 meses a 4C

Buffer acetato de Na (1.2M, pH3.8):


69,6ml de Ac. Actico glacial (1,205gr/ml)

Disolver en 800ml de agua destilada


Ajustar pH3.8 Con hidrxido de NA 4M
Ajustar volumen 1L con agua destilada
Estable 12 meses T. ambiente

Buffer acetato de Na (100Mm, pH4.5):


5,8ml de Ac. Actico glacial
En 900Ml de agua destilada
Ajustar pH4.5 Con hidrxido de NA 4M
Ajustar el volumen a 1l con agua destilada
Dura 2 meses a 4C

Hidrxido de k (2M):
112,2gr de KOH
En 900ml de agua desionizada
Disolver por agitacin
Ajustar el volumen a 1l
Almacenar hermticamente
2 aos T. ambiente

Etanol en estado lquido ( IMS) (50% v/v Aprox.):


500ml de etanol (95% v/v 99% v/v) Industrial desnaturalizado IMS
EN 500ml de agua destilada
Estable por 2 aos tem ambiente.