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Introduccin Mtodos Instrumentales de Anlisis: Mtodos pticos.

Clasificacin Radiacin electromagntica Espectro


electromagntico Absorcin de radiacin electromagntica Fundamentos de la espectrofotometra de absorcin UV-Vis
Teora de la absorcin de radiacin UV-Vis Espectro de absorcin Especies absorbentes. Tipos de transiciones
electrnicas Bases del color 4. Leyes de la absorcin de la radiacin: Ley de Lambert Beer Limitaciones y Desviaciones
de la Ley de Beer Instrumentacin 6. Aplicaciones analticas Caractersticas analticas del mtodo Anlisis cuantitativo.
Detalles del procedimiento experimental Aplicaciones al anlisis de alimentos 1 CONTENIDOS

1. Introduccin Estn basados en la medida de propiedades qumicas y fsicas de los analitos con fines cualitativos
y cuantitativos. La medida se realiza en un instrumento apropiado. Mtodos Instrumentales de Anlisis 2

Mtodos que miden alguna propiedad de la radiacin electromagntica emitida por la materia o que interacciona con
ella Clasificacin Mtodos espectroscpicos: Existe intercambio de energa entre la radiacin electromagntica y la
materia Mtodos de absorcin: Miden la disminucin de la potencia de la radiacin electromagntica debida a la
absorcin que se produce en su interaccin con el analito Mtodos de emisin: Miden la radiacin electromagntica
emitida cuando el analito es excitado por energa trmica, elctrica o radiante Mtodos no espectroscpicos: Se
producen cambios en la direccin o en las propiedades fsicas de la radiacin electromagntica: Dispersin
Refraccin Difraccin Rotacin ptica Mtodos pticos de anlisis 3 1. Introduccin

La radiacin electromagntica es una forma de energa que se transmite por el espacio a gran velocidad sin soporte
de materia. La radiacin electromagntica puede describirse segn: la teora ondulatoria: formada
por ondas sinusoidales la teora corpuscular: flujo de partculas o corpsculos de energa llamados fotones La
radiacin electromagntica 4 1. Introduccin

1. Introduccin La radiacin electromagntica (REM) se representa como ondas consistentes en campos elctricos y
magnticos que estn en fase y que oscilan sinusoidalmente de manera perpendicular entre s y respecto a la
direccin de propagacin Direccin x Campo elctrico y Campo magntico z Teora ondulatoria. Parmetros
ondulatorios (Gp:) Longitud de onda? (Gp:) Amplitud A La potencia P: es la energa del haz que llega a un rea dada
por
segundo
Parmetros
ondulatorios
5

La radiacin electromagntica es considerada como paquetes discretos de energa llamados fotones o cuantos.
Dualidad onda-partcula: Un fotn es una partcula de radiacin electromagntica con masa cero y energa E
proporcional a la frecuencia de la radiacin? La energa de un fotn: E = h? E = energa del cuanto de radiacin: Cal
mol-1? = frecuencia de la radiacin: hertzio (Hz) = ciclos s-1 h = constante de Planck = 6,624 10-27 erg s
Velocidad de la luz : v =?? Velocidad de la luz en el vaco: c = 3,00 1010 cm s-1 Energa de un fotn: E = h? = h
c /? Cuando? aumenta, disminuye la energa y frecuencia del fotn Teora corpuscular. Propiedades corpusculares de
la radiacin electromagntica? m = 10-6 m nm = 10-9 m = 10-10 m 6 1. Introduccin

Abarca un intervalo muy amplio de longitudes de onda o energas. Segn recibe diferentes nombres. La luz visible,
que es la nica perceptible por el ojo humano, representa solamente una pequea parte del espectro, desde 350-380
a 750-780 nm. Espectro electromagntico 7 1. Introduccin

2. Absorcin de radiacin electromagntica Absorcin: proceso por el cual una especie, en un medio transparente,
capta selectivamente ciertas frecuencias de la radiacin electromagntica. El fotn absorbido hace pasar a la especie
de su estado fundamental a un estado excitado de energa M*: M + h ? ? M* Tras un corto perodo de tiempo,
aproximadamente 10-8 a 10-9 s, se pierde la energa de excitacin, generalmente en forma de calor, y la especie M
vuelve a su estado fundamental: M* ? M + calor Los mtodos de absorcin tienen la ventaja de producir poca o
ninguna alteracin en el sistema estudiado. 8

Para que la radiacin electromagntica sea absorbida por la materia deben cumplirse dos condiciones generales: 1)
debe haber una interaccin entre el campo elctrico de la radiacin y alguna carga elctrica de la sustancia 2) La
energa de la radiacin incidente debe ser exactamente igual a la energa cuantizada que requiere la sustancia.
Ecuacin de Bohr ?E = Ef Ei = h ? h ?: energa del fotn absorbido Ei: energa total de la materia en el
estado fundamental Ef: energa total de un estado permitido de energa superior o estado excitado. Requisitos 9 2.
Absorcin de radiacin electromagntica.

3. Fundamento de la Espectrofotometra de Absorcin UV-visible Mtodo instrumental ptico basado en la medida


directa de la absorcin de radiacin electromagntica UV-Visible, por las molculas del analito contenido en
la muestra. La regin ultravioleta comprende entre 10 y 400 nm y la regin visible comprende entre 350 y 750 nm.
Las radiaciones UV y visible tienen en comn el hecho de que la absorcin de ambas regiones por molculas,
provoca la excitacin de e- de enlace a niveles de E superiores. Los picos de absorcin pueden correlacionarse con
los tipos de enlaces de la especie absorbente, base de su aplicacin cualitativa 10

Un analito molecular tiene la capacidad de absorber ciertas longitudes de onda caractersticas de la radiacin
electromagntica UV-Visible. En este proceso, la radiacin es transferida temporalmente a la molcula y, como
consecuencia, disminuye la intensidad de la radiacin. Dicha disminucin, debida a la absorcin experimentada por
el analito, puede ser cuantificada utilizando diversas magnitudes, siendo la Absorbancia, A, la ms comnmente
utilizada en la espectrofotometra de UV-Vis. La aplicacin cuantitativa de la espectroscopia de absorcin UV-Vis se
basa en la medida, a una ? fija, de la A de una disolucin del analito contenida en una cubeta transparente de camino
ptico b cm. 11 3. Fundamento de la Espectrofotometra de Absorcin UV-visible

(Gp:) E0 (Gp:) E1 (Gp:) E2 (Gp:) ?E1 = E1-E0=hd1 = hc/?1 (Gp:) ?E2 = E2-E1=hd2= hc/?2 Espectro de absorcin
(Gp:) Cubeta (Gp:) Radiacin incidente P0 (Gp:) b (Gp:) Radiacin transmitida P (Gp:) Disolucin de analito de
concentracin c Transmitancia = T = P/P0 Absorbancia = A = - log T = log P0 /P Atenuacin de un haz de radiacin
por una especie absorbente contenida en la cubeta Transiciones energticas en la molcula del analito (Gp:)
Absorbancia A (Gp:) ?, nm 12 3. Fundamento de la Espectrofotometra de Absorcin UV-visible

Un espectro de absorcin es una representacin grfica de la absorbancia de un analito (o de otra magnitud


equivalente) en funcin de la longitud de onda de la radiacin ? (o de otro parmetro relacionado con la energa de la
radiacin utilizada). El mximo de absorbancia obtenido en el espectro de absorcin de un analito, nos dar la
longitud de onda que proporciona la mayor sensibilidad posible, y por tanto ser la que se utilizar en el anlisis
espectrofotomtrico de dicho analito. Espectros de absorcin (Gp:) Absorbancia A (Gp:) ? nm ?max 14 3.
Fundamento de la Espectrofotometra de Absorcin UV-visible

La sensacin de color se produce cuando disminuye apreciablemente una o ms zonas de la regin visible. Si el ojo
recibe luz de todas las ? de la regin visible el efecto es luz blanca. El color aparente siempre es el color
complementario del que ha sido eliminado. Los colores complementarios son tiles para predecir la ? de absorcin
de los compuestos coloreados: una disolucin amarilla, absorber luz azul 450-480 nm, para analizarla debemos
usar luz con esta ? seleccionada con el monocromador o bien usar un filtro azul, que transmite esta luz azul Teora
del color 15 3. Fundamento de la Espectrofotometra de Absorcin UV-visible

Para cada estado electrnico en una molcula existen varios estados vibracionales y para cada uno de stos,
numerosos niveles rotacionales. Etotal= Eelectrnica + Evibracional + Erotacional La radiacin absorbida por la
molcula puede ser utilizada para originar las diversas transiciones electrnicas posibles. ?E = Ef Ei = h ? =
Energa del fotn absorbido Diagrama de niveles de energa Teora de la absorcin molecular.

Especies absorbentes Las especies absorbentes: molculas orgnicas y aniones inorgnicos que tienen electrones:
en orbitales moleculares s en orbitales moleculares p en orbitales no enlazantes n. Tipos de transiciones
electrnicas : Cuando absorben fotones de E adecuada se pueden dar 4 tipos de transiciones electrnicas: s ? s * n?
s * p ? p* n? p* Transiciones electrnicas entre niveles de energa moleculares ? ? n ?* ?* 18 3. Fundamento de la
Espectrofotometra de Absorcin UV-visible

Especie absorbente Sus electrones ms exteriores o electrones de enlace pueden ser elevados a niveles de E ms
altos al incidir sobre ellas una radiacin electromagntica apropiada Grupo cromforo Grupo atmico presente en
una molcula que lleva asociada una banda de absorcin electromagntica: C=C; C=O; C=N. Especies
con grupos funcionales con enlaces p. Grupos cromforos ?dobles y triples enlaces. Bandas en el UV cercano y
visible. Etileno, carbonilo, ster, amida, nitro Grupo auxocromo Grupos que no producen por s mismos bandas de
absorcin, pero intensifican la de los grupos cromforos: C-Br; C-OH Responsables del color de muchos iones y
compuestos de metales de transicin que poseen orbitales d y f Bandas de campo ligando 3. Fundamento de la
Espectrofotometra de Absorcin UV-visible 19

4. Leyes de la absorcin de la radiacin Al interaccionar la radiacin electromagntica con la materia, tiene lugar la
absorcin si la ? de la radiacin coincide con la energa necesaria para que el sistema pase a un nivel de energa
superior y permitido h ? = E2 - E1 Las dos leyes fundamentales que rigen el comportamiento de la fraccin de la
radiacin incidente absorbida al pasar a travs de una muestra dada son: Ley de Lambert: predice el efecto que
produce el espesor del medio-muestra sobre la fraccin de radiacin que se absorbe. Ley de Beer: establece el
efecto de la concentracin del medio-muestra sobre la fraccin de radiacin que se absorbe. Ley de Lambert-Beer

20

Ley de Lambert-Beer: muestra cmo la absorbancia es directamente proporcional a la longitud b de la trayectoria a


travs de la solucin y a la concentracin c del analito o especie absorbente. a: cte de proporcionalidad llamada
absortividad. (unidades L/cmg, si c=g/L) b: longitud del camino que recorre la radiacin a travs del medio
absorbente. c: concentracin expresada en g/L (mg/L, ...). Si la concentracin c viene expresada en mol/L, la cte de
proporcionalidad se denomina absortividad molar y se representa por ? (unidades L/cmmol). La absortividad
molar, ?, es caracterstica de cada especie a una ? determinada Disoluciones que contienen varias especies
absorbentes: Para cada ?: Atotal =?Ai = A1 + A2 + .... + An Como A = ? b c A = ?1 b c1 + ?2 b c2 + . +?n b
cn Siendo 1, 2, , n los componentes absorbentes. 4. Leyes de la absorcin de la radiacin 21

Ley de Lambert- Beer (Gp:) AT,l = (Gp:) log (Gp:) P0 (Gp:) P (Gp:) = (Gp:) e b c (Gp:) Absorbancia total medida a la
longitud de onda l (Gp:) Concentracin molar de las especies absorbentes (Gp:) camino ptico (Gp:) Potencia del haz
despus de atravesar la muestra (Gp:) Potencia del haz antes de atravesar la muestra (Gp:) P (Gp:) P0 (Gp:) =
Transmitancia (T) (Gp:) A = -logT Absortividad molar A = e b c Ley de Lambert- Beer 22 4. Leyes de la absorcin de la

radiacin

La Ley de Beer debe comprobarse siempre antes de utilizarla para un anlisis cuantitativo exacto. Para ello se
preparan una serie de disoluciones estndar del analito en el intervalo en el que se supone que se encuentra la
muestra. Se registra el espectro de absorcin utilizando una de ellas. Se mide la absorbancia de dada una de las
disoluciones a la ? del mximo de absorcin del analito con una longitud de cubeta dada, generalmente 1 cm. Se
representan las absorbancias en funcin de las concentraciones. Si la ley de Beer se cumple en todo el intervalo de c
estudiado: A = ebc se obtiene una lnea recta en todo el intervalo, que pasa por el origen. La recta obtenida se llama
Curva de calibrado. Pueden aparecer desviaciones positivas o negativas a partir de una determinada concentracin
debido a Limitaciones de la ley de Beer y/ a posibles errores experimentales cometidos Comprobacin de la Ley de
Beer. Curva de calibrado 23 4. Leyes de la absorcin de la radiacin

Desviaciones de la Ley de Beer La proporcionalidad directa entre absorbancia y concentracin cuando b es


constante, slo se cumple en un intervalo de concentraciones del analito. Fuera de dicho intervalo se observan en las
curvas de calibrado desviaciones positivas o negativas de la linealidad debido a las limitaciones de la Ley de Beer:

(Gp:) A (Gp:) concentracin (Gp:) Para la aplicacin cuantitativa, las medidas de A de la muestra deben estar
incluidas en el intervalo lineal (Gp:) respuesta debida a la autoabsorcin o a la luz escasa que atraviesa la cubeta
(Gp:) respuesta del blanco, interferencias o escasa sensibilidad (Gp:) A= ebc (Gp:) Intervalo lineal 24 4. Leyes de la
absorcin
de
la
radiacin

Limitaciones propias o reales Variacin de la absortividad con el ndice de refraccin n, que vara con la c. Para c <
0,01 M n= cte: Ley de Beer se cumple. Incumplimiento de las premisas de la ley de Beer. Interacciones entre el
soluto y la radiacin producidas por mecanismos distintos al de absorcin. Interacciones entre las especies
absorbentes del soluto . Radiacin no monocromtica. Limitaciones de la Ley de Beer 25 4. Leyes de la absorcin de
la
radiacin

Errores qumicos. Efectos debidos a sistemas en equilibrio: equilibrios de dimerizacin equilibrios cido-base
equilibrios de complejacin Efectos debidos al disolvente. Efectos debidos a impurezas absorbentes de los reactivos.
Efectos debidos a la presencia de interferencias absorbentes en la muestra. Errores instrumentales. Errores
de lectura: El mnimo error relativo se obtiene para una absorbancia de 0,434 Las absorbancias deben estar
comprendidas entre 0,2 y 0,8 para obtener el mnimo error Radiacin parsita. Errores personales: Utilizacin y

cuidado de las cubetas de absorcin. Control de Temperatura. Errores al aplicar la Ley de Beer 26 4. Leyes de la
absorcin
de
la
radiacin

5. Instrumentacin Componentes bsicos de los espectrofotmetros Fuente de energa radiante Selector de ?


Detector Dispositivo de lectura Cubeta muestra 27 (Gp:) Luz compuesta (Gp:) Monocromador (Gp:) I0 (Gp:) I (Gp:) b
(Gp:)
Luz
monocromtica
(Gp:)
Fuente
de
radiacin
(Gp:)
Detector
(Gp:)
Muestra

(Gp:) 300 (Gp:) 500 (Gp:) 700 (Gp:) 900 (Gp:) Lmpara de Deuterio (Gp:) Lmpara de Tungsteno o Wolframio (Gp:)
longitud de onda (nm) (Gp:) intensidad lumnica (Gp:) 1100 Fuente de energa radiante Continua. Estable. Intensa
Para ? en el Visible Para ? en el Ultravioleta Caractersticas 28 5. Instrumentacin

Selector de ? Filtros de corte Filtros de absorcin Filtros de interferencia longitud de onda de mxima transmisin
ancho de banda efectivo Caractersticas Monocromadores de prisma Monocromadores de red Fotmetros
Espectrofotmetros 29 5. Instrumentacin

Cubetas Absorcin mnima a la longitud de onda de trabajo Colocar con caras transparentes perpendiculares a la
direccin del haz incidente Caractersticas Vidrio o plstico Visible Slice Ultravioleta 30 5. Instrumentacin

Detectores deben responder a un amplio rango de longitudes de onda deben dar respuesta rpida deben ser
sensibles a bajos niveles de radiacin deben producir seal elctrica fcilmente amplificable la seal debe ser
proporcional a la potencia radiante Su funcin es convertir la respuesta del instrumento en una seal medible.
Caractersticas
Fototubos
Fotomultiplicadores
Fotodiodoarray
31
5.
Instrumentacin

Espectrofotmetros Haz sencillo Doble haz 32 Fuente de radiacin Sistema selector de ? Cubeta de muestra
Fotodetector Registrador o PC Fotocelda 1 Fotocelda 2 Cubeta de referencia Amplificador Fuente de radiacin
Sistema selector de ? Amplificador diferencial Registrador o PC Cubeta de muestra Cubeta de referencia 5.
Instrumentacin

La espectrofotometra de absorcin molecular se puede aplicar tanto al anlisis cualititativo como cuantitativo.
Anlisis cualitativo: los espectros de la muestra se comparan con los de los correspondientes estndares, con el fin
de identificar las bandas de absorcin coincidentes. Este tipo de anlisis es ms frecuente en UV e IR para identificar
compuestos orgnicos y ms rara vez se utiliza en Vis. Anlisis cuantitativo: est basado en la ley de Lambert-Beer
en el intervalo de concentraciones de cumplimiento de la ley. Se establece la curva de calibrado usando estndares y
la absorbancia de la muestra de concentracin desconocida se remite a la curva (a veces basta con un solo
estndar). En espectrofotometra Vis, el analito se suele incorporar a una especie compleja que presente bandas de
absorcin intensas. Siempre que sea posible se debe medir la absorbancia a ?max 6. Aplicaciones analticas 33

Amplia aplicabilidad: Anlisis orgnico e inorgnico Elevada sensibilidad: los lmites deteccin de 10-4 a 10-5 M.
Selectividad de moderada a alta. Buena exactitud: errores de concentracin 1-5% o incluso menores. Facilidad y
comodidad en las medidas espectrofotomtricas. Se prestan a una fcil automatizacin. Campo de aplicacin
Especies absorbentes: compuestos orgnicos que contengan grupos cromforos y especies inorgnicas como son
los metales de transicin. Especies no absorbentes: los analitos reaccionan con un reactivo para producir un
compuesto absorbente. Caractersticas de los mtodos espectrofotomtricos 34 6. Aplicaciones analticas

Toma y tratamiento de la muestra Seleccin de la longitud de onda Control de las variables que influyen en la
absorbancia Determinacin de la relacin entre la absorbancia A y la concentracin c Metodologa cuantitativa.
Detalles del procedimiento experimental Realizar un espectro de absorcin de la muestra Para obtener mxima
sensibilidad, realizar las medidas de A a una ? que corresponda a un mximo de absorcin ?max, ya que
el cambio en la absorbancia por unidad de concentracin es mayor en este punto. lanaturaleza del disolvente
el pH de la disolucin la temperatura las concentraciones altas del electrolito la presencia de sustancias interferentes
Elegir las condiciones para el anlisis Calibracin con patrones de concentracin conocida Mtodo de las adiciones
estndar a) El mtodo de un solo punto b) El mtodo de las adiciones mltiples 35 6. Aplicaciones analticas

Pocas veces es posible suponer el cumplimiento de la ley de Beer y utilizar un nico patrn para determinar la
absortividad molar. Comprobar la ley de Beer realizando un calibrado a la ? del mximo de absorcin. Se miden las
absorbancias de patrones y muestras y se obtiene la ecuacin de la recta de calibrado generalmente aplicando el
mtodo de mnimos cuadrados: A = mc + b Los estndares o patrones de calibracin se deben aproximar tanto como
sea posible a la composicin final de las muestras reales y deben abarcar un intervalo razonable de concentraciones
del analito. La concentracin de la muestra se calcula a partir de la ecuacin de la recta de calibrado sustituyendo
su valor de A y despejando la c correspondiente Calibracin con patrones de concentracin conocida Metodologa

cuantitativa.

Detalles

del

procedimiento

experimental

36

6.

Aplicaciones

analticas

Calibracin con patrones de concentracin conocida Analito en la muestra A muestra A (? = 508 nm) 37 6.
Aplicaciones
analticas

Cuando se analizan muestras complejas, como alimentos cenizas vegetales, suele ser imposible o muy difcil
preparar estndares que se asemejen a las muestras. En este caso, el mtodo de las adiciones estndar es til para
contrarrestar los efectos de matriz. Mtodo de las adiciones estndar Mtodo de las adiciones estndar. El mtodo
de un solo punto Se toman dos porciones de la muestra Una porcin se mide como de costumbre A la segunda
porcin se le agrega una cantidad conocida de la disolucin estndar de analito Ambas respuestas se utilizan
entonces para calcular la concentracin desconocida, suponiendo una relacin lineal entre la respuesta y la
concentracin del analito Metodologa cuantitativa. Detalles del procedimiento experimental 38 6. Aplicaciones
analticas

Absorbancia de la primera disolucin A1 = K cx cx concentracin desconocida de analito en la 1 disolucin K


constante de proporcionalidad. Absorbancia de la segunda disolucin A2 = (K vx cx / v t) +( K v s c s / v t)
vx volumen de la disolucin de concentracin desconocida de analito, vs volumen agregado de la disolucin estndar
de analito, v t es el volumen total despus de la adicin y cs es la concentracin de la disolucin estndar de analito
cx = A1 v s c s / A 2 v t - A1 vx Mtodo de las adiciones estndar. El mtodo de un solo punto 39 6. Aplicaciones
analticas

Mtodo de las adiciones estndar. El mtodo de las adiciones mltiples Varias alcuotas idnticas Vx de la solucin
desconocida con concentracin Cx se transfieren a matraces volumtricos de volumen Vt. A cada uno de esos
matraces se le aade un volumen variable Vs de una disolucin patrn del analito, con concentracin conocida Cs.
Despus, se aaden los reactivos que originan el color y se diluye cada solucin hasta un volumen Vt. Si el sistema
qumico sigue la ley de Beer, A i= (e b Vs Cs / Vt ) + (e b Vx Cx / Vt ) = K Vs Cs + K Vx Cx K es una constante = e b /
Vt Una grfica de AI en funcin de Vs debe originar una recta de la forma A i = m Vs + b Donde la pendiente m y la
ordenada en el origen b vienen dadas por m = K Cs y n = K Vx Cx El anlisis de mnimos cuadrados de los datos se

puede utilizar para determinar m y b; despus, es posible calcular Cx a partir del cociente de esas dos cantidades
y los valores conocidos de Vx y Cs Cx = (Cs / Vx ) ( n/m) 40 6. Aplicaciones analticas

A = mc+b 0 = mc muestra + b Cmuestra = b/m Mtodo de las adiciones estndar. El mtodo de las adiciones
mltiples Concentracin aadida del estndar Concentracin de la muestra A0 A1 A2 A3 c1 c2 c3 41 6. Aplicaciones
analticas

La espectroscopia en la regin ultravioleta-visible (UV-Vis) es una de las tcnicas de laboratorio ms comnmente


encontradas en el anlisis de los alimentos. Ejemplos: Cuantificacin de macrocomponentes (el contenido total de
hidratos de carbono, por medio del mtodo del fenol-cido sulfrico) Las estimaciones de enranciamiento (el

estado de la oxidacin de los lpidos, por medio del ensayo del cido tiobarbitrico) Determinacin de pigmentos
basada en su absorcin de radiacin en la zona del visible Anlisis del contenido de protenas solubles.
Determinacin de nitritos en jamn de York Determinacin de hierro en vinos Determinacin de fosfato en bebidas
Aplicaciones al anlisis de alimentos 42 Especies que no absorben en el Visible: mediante su reaccin previa con
reactivos adecuados para dar un compuesto coloreado 6. Aplicaciones analticas

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