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ACTIVIDAD SOLUBILIZADORA IN VITRO DE FOSFATOS Y PRODUCCIN DE BIOFILM

POR RIZOBACTERIAS NATIVAS AISLADAS DE MAZ (Zea mays L.).


N.I. Buono; P.I. Rodrguez; J.M. Peralta; E.L. Ulla.
Ctedra de Microbiologa Agrcola, Facultad de Agronoma y Zootecnia, UNT. Av. Pte. Nstor
Kirchner 1990, San Miguel de Tucumn, Tucumn (4000). *manuel.peralta90@gmail.com
Introduccin. Uno de los nutrientes ms necesarios y, paradjicamente, ms deficitarios para los
cultivos es el fsforo (P). A pesar de un relativo alto contenido de P total en la mayora de los suelos,
el 98% tienen un inadecuado suplemento de P disponible para la nutricin de los cultivos, condicin
que induce deficiencias en distinto grado de severidad, con graves repercusiones en los niveles de
productividad y rendimiento1. Esta condicin de deficiencia es superada normalmente con la
aplicacin de fertilizantes fosfricos de sntesis qumica, alternativa que pese a su eficiencia en general
implica enfrentarse a varios problemas: a) altos costos econmicos, b) muy baja eficiencia (5-30%), c)
acumulacin crnica de fosfatos en el ambiente, y d) escasez global de roca fosfrica, insumo esencial
para la produccin de fertilizantes fosfricos 2. En estas condiciones, la utilizacin biotecnolgica de
microorganismos solubilizadores de fosfatos (MSF) del suelo, merece especial atencin por sus
mltiples ventajas3. Los MSF constituyen un grupo importante de microorganismos promotores del
crecimiento vegetal (PGPMs, por sus siglas en ingls), pues estn involucrados en un amplio rango de
procesos que afectan la transformacin del fsforo, siendo componentes integrales del ciclo edfico de
este nutriente4. En ambientes naturales, la rizsfera de diferentes especies de plantas es afectada por
los PGPM, incluidos los MSF; estos ltimos movilizan fosfato inorgnico insoluble desde la matriz
mineral hasta el suelo donde puede ser absorbido por las races 5. En este sentido, tanto la adherencia
como la capacidad de formar biofilm, son factores fundamentales para la interaccin de los
microorganismos con los diferentes tejidos de la planta. Estos mecanismos permiten mantener a las
clulas en un lugar especfico durante perodos suficientemente largos, de manera de iniciar
interacciones beneficiosas con la planta 6. Segn diversas investigaciones, los MSF han sido aislados
de suelos rizosfricos de varios cultivos de inters agrcola como arroz, trigo, soja, mostaza, berenjena
y chili7. Asimismo se registran estudios sobre su accin promotora del crecimiento en cultivos de aj,
pepino, maz, brcoli, frijol, garbanzo, trigo entre otros 3. En este trabajo se evalu la actividad
solubilizadora in vitro de fosfatos por rizobacterias aisladas de maz y su potencial capacidad de
adherencia y formacin de biofilm.
Materiales y mtodos. Se trabaj con tres aislamientos del cepario de la ctedra de Microbiologa
Agrcola de la FAZ-UNT: J1 (Pseudomonas fluorescens), J2 (Pseudomonas Chlororaphis) y J3
(Bacillus amyloliquefaciens) aisladas de races de maz.
Solubilizacin de fosfatos en medio slido. Los aislamientos se sembraron en 50 ml de medio TSC y
se colocaron en un agitador a 28 C y 150 rpm hasta alcanzar DO (590 nm) de 0,8 (J1); 0,6 (J2) y 0,9 (J3). Se
sembraron por triplicado 10 l en cajas de petri con medio NBRIP. Las cajas inoculadas se dejaron
reposar en flujo laminar durante 30 minutos. Luego, se incubaron a 28 C durante 11 das. Pasado ese
tiempo, se midieron los dimetros de cada colonia y de cada halo, en tres direcciones y se
promediaron; se determin una eficiencia de solubilizacin promedio segn la frmula: ESP=
(Dimetro halo/ Dimetro colonia)x 100(8).
Cuantificacin de fsforo soluble en medio lquido. Los aislamientos se sembraron en 50 ml de medio
TSC durante 24 hs a 28C y 150 rpm. La DO (590 nm) de los cultivos fueron ajustados a 0,9-1 con
solucin salina y 5 ml fueron usados para inocular frascos Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 50 ml
de medio NBRIP. Se incubaron en un agitador a 150 rpm y 28C 9. Para la cuantificacin del P soluble
se aplic el mtodo del azul fosfomolibdato10. Se tomaron muestras a los 2, 4, 6 y 9 das despus de la
inoculacin.
Adherencia. Los aislamientos se sembraron en 50 ml de medio TSC hasta fase estacionaria de
crecimiento y luego se diluyeron hasta alcanzar una DO (590 nm) 0,2. Se coloc 1 ml de cada uno de los
cultivos en tubos eppendorf estriles y se incub sin agitacin durante 7 das a 28C. Despus de la
incubacin, se aspir con pipeta automtica el medio de cultivo conteniendo las bacterias planctnicas
y se midi absorbancia a 590 nm. Luego, se coloc 1 ml de medio TSC en cada tubo para resuspender
las bacterias adheridas, a las cuales se les midi absorbancia a 590 nm. El porcentaje de adherencia se

determin con la frmula: %Adhesin= (DO 590nm bacterias formadoras de biofilm/ DO 590nm bacterias
planctnicas)x 100.11
Produccin de Biofilm. Los aislamientos se sembraron en 50 ml de medio TSC hasta fase estacionaria
de crecimiento y luego se diluyeron hasta alcanzar una DO (590 nm) 0,2. Se coloc 1 ml de cada uno de los
cultivos en tubos eppendorf estriles, y se incub sin agitacin durante 7 das a 28C en cmara
hmeda. Luego de la incubacin, se aspir con pipeta automtica el medio de cultivo conteniendo las
bacterias planctnicas. Los pocillos se lavaron dos veces con 500 l de NaCl 0,9 % (p/v). Despus del
lavado, se agreg 1,2 ml de cristal violeta 0,1% (p/v) en cada tubo, y la placa se incub durante 15
minutos a temperatura ambiente en oscuridad. Se aspir el exceso de colorante de cada tubo, y se lav
con 1 ml de NaCl 0,1% (p/v) tres veces. Los tubos se dejaron secar durante 2 minutos, y se agregaron
250 l de EtOH absoluto por tubo para extraer el colorante adherido a las bacterias formadoras de
biofilm. Finalmente, la produccin de biofilm se cuantific por determinacin de absorbancia medida
a 590 nm.12
Todos los ensayos fueron realizados utilizando un diseo totalmente al azar con tres repeticiones. Los
resultados se analizaron con ANOVA y prueba LSD de Fisher con un nivel de significacin del 5%.
Resultados y discusin. En cuanto a la solubilizacin de fosfatos en medio slido, existieron
diferencias significativas entre los tres aislamientos, destacndose J 1 con una ESP de 341, valor que
concuerda con el obtenido para la misma cepa por el autor de referencia 8. En medio lquido la
concentracin inicial de P fue de 1250 mgL -1. La concentracin de P soluble en el medio se mantuvo
entre 85,2 mg.L-1 y 405,3 mgL-1, dependiendo del aislamiento. La mayor solubilizacin fue medida
para J1: 405,3 mgL-1, seguido de J3: 166,3 mgL -1 y J2: 85,2 mgL -1. Estos valores se encuentran en el
orden de los obtenidos por otros autores9 con excepcin de J1 cuyo valor duplica al obtenido para otras
cepas en dicha investigacin. En cuanto al porcentaje de adherencia no se observaron diferencias
significativas, con valores de 28,57% (J 1), 37,44% (J2) 35,47% (J3), bastante alejados de los valores
estndares ptimos6. Las tres cepas evaluadas fueron capaces de formar biofilm y los resultados avalan
los obtenidos por otros autores11; existieron diferencias significativas entre los tres aislamientos siendo
J2 el de mayor produccin.
Conclusiones. En base a los resultados obtenidos, se concluye que los tres aislamientos estudiados
presentaron capacidad para solubilizar fosfatos en condiciones in vitro, tanto en medio slido como en
medio lquido, destacndose Pseudomonas fluorescens (J1). Asimismo, los tres aislamientos
presentaron capacidad para formar biofilm con un mejor comportamiento por parte de Pseudomonas
chlororaphis (J2). Estos mecanismos ponen en evidencia la potencialidad de las cepas bacterianas
estudiadas como promotoras del crecimiento vegetal en cultivos de inters agrcola. Sin embargo se
requiere estudiar estrategias para incrementar la capacidad de adherencia de estas rizobacterias a los
fines de favorecer la interaccin planta-microorganismo.
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