rea Agropecuaria y de Recursos Naturales Renovables

CARRERA DE INGENIERA AGRONMICA

1. Tema: Esterilizacin de materiales de laboratorio y medios de cultivo

2. Objetivos:
2.1. Aplicar las diferentes tcnicas, mtodos de esterilizacin y
desinfeccin de materiales de laboratorio.
2.2. Elaborar medios de cultivo general y diferencial.
3. Revisin bibliogrfica
3.1.

Esterilizacin de materiales de laboratorio

Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de esterilizacin y

desinfeccin para limitar la presencia o eliminar los microorganismos. La
esterilizacin es un mtodo de eliminacin total de todo tipo de organismo
y que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras
que la desinfeccin es un proceso que solamente elimina formas
vegetativas de los microorganismos. (Manual de Practicas del Laboratorio
de Microbiologia General, 2004)
La esterilizacin con calor seco y hmedo son los procesos de mayor
utilizacin en microbiologa, el calor seco desnaturaliza las enzimas y
destruye a los microorganismos por oxidacin por ejemplo al ponerlos
directamente a la flama de un mechero o en un horno a 150C o1 80C,
durante dos horas, estos mtodos se aplican principalmente en la
esterilizacin de asas de inoculacin y todo tipo de material de vidrio y
quirrgico (Manual de Practicas del Laboratorio de Microbiologia General,
2004)
Los procesos de calor hmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo,
soluciones y cultivos bacterianos que se desechan el ms recomendable
es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presin para alcanzar
temperaturas de 121C, el materia se deja a esta temperatura durante 15
minutos para asegurarse de la destruccin de endoesporas, que sin las
estructuras bacteriana ms resistentes al calor (Manual de Practicas del
Laboratorio de Microbiologia General, 2004)

3.2.

Medios de cultivo

Un medio de cultivo es un sustrato o una solucin de nutrientes que permite

el desarrollo de microorganismos. (Lpez Tvez & Torres, 01)
El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de
Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las
bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo debe reunir
una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y
presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o
alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante. (Gertrudis Torrico Cabezas, 2012)
Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para
evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o
incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especmenes
inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios
de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como
agente esterilizante) (Gertrudis Torrico Cabezas, 2012)
Factores selectivos que alteran las condiciones del medio tenemos:
Cambio de pH: por ejemplo agregando cido actico para
favorecer el crecimiento de Lactobacillus (pH final: 5,4 que es hostil
para la mayora de las especies que crecen entre 6,5 y 7,2). Los
hongos crecen entre pH 4 y 6 y S. faecalis a pH 9,6. (Lpez Tvez &
Torres, 01)
Cambio de temperatura: la mayora de las bacterias crece
ptimamente entre 20 C y 40 C. Los cultivos tpicos de S. Faecalis
requieren 60 C de temperatura y los de Listeria son capaces de
desarrollarse y crecer a 4 C. (Lpez Tvez & Torres, 01)
Alteraciones osmticas: se acrecientan las propiedades osmticas
un medio con el agregado de cloruro de sodio. Estos medios
intensifican la seleccin de bacterias halfilas como Staphylococcus
spp. (7,5%). (Lpez Tvez & Torres, 01)
Ajuste en la tensin de oxgeno: es importante en la seleccin de
aerobios y anaerobios. (Lpez Tvez & Torres, 01)

 Ajuste en la tensin de anhdrido carbnico: muchos patgenos

importantes pueden ser cultivados a menos que se eleve la tensin
ms all de la atmosfrica. (Lpez Tvez & Torres, 01)
3.1.1. Clases de medios de cultivo segn su origen:
a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen
animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya
composicin qumica no se conoce exactamente. (Gertrudis Torrico
Cabezas, 2012)
b) SINTTICOS: son los medios que contienen una composicin qumica
definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados
reproducibles. (Gertrudis Torrico Cabezas, 2012)
c) SEMISINTTICOS son los sintticos a los que se les aaden factores de
crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por
ejemplo extracto de levadura. (Gertrudis Torrico Cabezas, 2012)
3.1.2. Medios de Cultivo para Hongos

MEDIO DE CULTIVO PDA (papa, dextrosa, agua): es un medio solido

complejo comercial de uso general para el cultivo de hongos.
Ingredientes:
Cantidad g/l
Glucosa
20.0
Extracto de papa
4.0
Agar
15.0
PH
5.6

Fig.1. Aislamiento de hongos en placa y tubos inclinados conteniendo medio de cultivo

Fuente: (Gertrudis Torrico Cabezas, 2012)

Es un mediode cultvo sencilloque incluye dextrosa e infusion de patata es

impotante resaltar que se han obtenido meores resultados con la patata
blanca que con alguna otra variedad.
En este medio los hongos crecen y se reproducen muy facilmente puede
aadirse acido tartarico al 10% para bajar el Ph hasta un 3.5 para inhibir el
crecimiento bacteriano.
En general para que un hongo crezca en medio unicamente se requiere
una fuente de carbono organico y de nitrogeno los mediosde cultivo para
hongo tienen la caracteristica de un pH bajo, lo que inhibe el crecimiento
de otras bacterias. El agar permite la identifiacion de ciertos hongos pro la
reduccion de sulfito de bismuto. (Maria de los Angeles Aquiahatl, 2004)
3.1.3. Medio de Cultivo para Bacterias.

Mac Conkey Agar : es un medio de cultivo especfico para

bacterias Gram negativas y cepas, ya que contiene cristal violeta y
sales biliares que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas
Ingredientes:

En g/l

Peptona

17

Pluripeptona

Lactosa

10

Mezcla de sales biliares

1.5

Cloruro de sodio

5.0

Agar

13.5

Rojo neutro

0.03

Cristal violeta

0.001

Esta frmula fue diseada sabiendo que las sales biliares precipitan por
accin de cidos y determinados microorganismos entricos fermentan la
lactosa,

mientras

que

otros

no

presentan

dicha

capacidad.

Posteriormente, este medio fue modificado varias veces. El agar

MacConkey es slo ligeramente selectivo, dado que la concentracin de

sales biliares, que inhiben los microorganismos Gram positivos, es baja en
comparacin con otros medios en placa entricos.
En el medio de cultivo las peptonas aportan los nutrientes necesarios para
el desarrollo bacteriano la lactosa en el hidrato de carbono fermentable y
la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que
inhiben el desarrollo de gran parte de la flora de Gram positiva.
Por la fermentacin dela lactosa disminuye el pH alrededor de la colonia
esto produce un viaje del color del indicador del pH (rojo neutro), los
microorganismos

no

fermentadores

de

lactosa

producen

colonias

incoloras. (Maria de los Angeles Aquiahatl, 2004)

FIG .2. Medio de cultivo macconkey

FUENTE; (Lpez Tvez & Torres, 01)

Kligler:

Permite

un

diagnstico

rpido

orientativo

del

tipo

enterobacteria aislado las enterobacterias ms patgenas no suelen

fermentar (producir cidos), la lactosa. Se detecta la produccin de
cidos acompaada o no del desprendimiento de gases de glucosa
o lactosa y produccin de SH2

El agar medio de Kligler (TSI, Triple Sugar Iron) es un medio diferencial

que puede ayudarnos a distinguir entre especies de enterobacterias
de acuerdo a su capacidad (o falta de ella) para:
Metabolizar lactosa, sacarosa o ambas
Producir acido mediante fermentacin
Producir gas durante la fermentacin
Generar cido sulfhdrico
-

Produccin del cido de la glucosa. En la superficie

del

,medio las enterobacterias respiran consumiendo la glucosa

cuando la agotan (solo tiene el 0.1%), consumen los pptidos y
se alcaliniza el medio(superficie rosa), en el fondo las
enterobacterias

fermentan

la

glucosa

produciendo

cidos(fondo amarillo)
-

Produccin de los cidos de lactosa y glucosa. En la superficie

del medio las enterobacterias respiran utilizando la glucosa y
luego la lactosa en el fondo producen una elevada cantidad
de cidos

y difunden hasta la superficie(todo el medio de

color amarillo)
-

Produccin de SH2 ; La bacteria ha realizado una respiracin

anaerobia utilizando en tiosulfato como aceptor de electrones
el tiosulfato se convierte en SH2 que con el FE3* origina S3FE2
(color negro)

FIG .3. Medio de cultivo Kligler

FUENTE; (Lpez Tvez & Torres, 01)

Agar Nutriente: O Agar nutritivo es un medio de cultivo usado

normalmente como rutina para todo tipo de bacteria. Es muy til
porque permanece solido incluso a relativas altas temperaturas.
Adems, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la
superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeas.
En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el lquido, y aparece
como una sustancia espesa, con colonias difcilmente observables. El
agar nutritivo contiene normalmente (w/v).
0.5 % Peptona
0.3 % extracto de carne/extracto de levadura
1.5 % agar
0.5% NaCl
Agua destilada
pH casi neutro (6.8) a 25 C.

FIG .4 AGAR NUTRITIVO

FUENTE; (Lpez Tvez & Torres, 01)

4. Materiales y reactivos
Materiales
Cantidad
4
5
10
2
26
1
1

Unidad
unidad
unidad
gramos
unidad
unidad
unidad
unidad

Descripcin
Erelenmeyer
Tubo de ensayo
Algodn hidrfilo
Ligas
Caja de Petri
Pinza(esterilizar)
bureta(esterilizar)

Reactivos
Cantidad
200

Unidad
Gramos

Descripcin
Papa

5. Equipos y herramientas
Equipos
Cantidad
1

Unidad
unidad

unidad

unidad

1
2
1
1

unidad
unidad
unidad
unidad

Descripcin
Sistema de purificacin
de agua
Balanza electrnica de
precisin
Plato caliente con
agitador magntico
Refrigerador
Autoclave
pH metro digital
Balanza

Herramientas
Cantidad
Unidad
5
Unidad
5

Unidad

Unidad

1
1

Unidad
Unidad

Descripcin
Erlenmeyer
Vaso de precipitacin
del 1000 ml
Vaso de precipitacin
de 500 ml
Probeta de 500 ml
Varilla de agitacin

6. Procedimiento
6.1. Procedimiento de esterilizacin y desinfeccin
Colocar agua destilada en un Erlenmeyer o en un baln de fondo
plano, tapar con algodn y cubrir con papel aluminio.
Envolver las cajas Petri, pinzas, bisturs agujas en papel.
Realizar la esterilizacin en el autoclave a una temperatura de 121 o
C 1 C y a 1, 5 Kg /cm2 por un lapso de 20 minutos.
6.2. Procedimiento de medios de cultivo

PDA
Calentar 500 cm3 de agua destilada en un vaso de precipitacin.
Pelar los 200,0 g de papa, picar y cocinar en el vaso se precipitacin
con constante agitacin hasta que est lista, filtrar en un lienzo.
Calentamos 500 ml de agua destilada hasta que alcance el punto
de ebullicin, apagamos el plato caliente, trasvasamos en agua al
Erlenmeyer de 500 ml y, poner los 20 g de dextrosa y 18 gramos de
agar y el filtrado de papa, luego trasvasamos a tubos de ensayo o
Erlenmeyer
Realizar la esterilizacin en el autoclave a una temperatura de 121 o
C 1 C y a 1, 5 Kg /cm2 por un lapso de 15 minutos.

Mac Conkey Agar

Se pesa 40 gramos de medio de cultivo y se diluye 1000 cm3 de
agua destilada caliente, colocar en un Erlenmeyer, tapar con
algodn, cubrir con papel o papel peridico.
Realizar la esterilizacin en el autoclave a una temperatura de 121 o
C 1 C y a 1, 5 Kg /cm2 por un lapso de 15 minutos.

Kligler
Pesar 54.8 gramos de medio de cultivo, diluir en agua tibia y colocar
en tubos de ensayo, tapar con algodn y papel aluminio.
Realizar la esterilizacin en el autoclave a una temperatura de 121 o
C 1 C y a 1, 5 Kg /cm2 por un lapso de 15 minutos.

Agar Nutriente
Se pesa 40 gramos de medio de cultivo y se diluye 1000 cm3 de
agua destilada caliente, colocar en un Erlenmeyer, tapar con
algodn, cubrir con papel o papel peridico.
Realizar la esterilizacin en el autoclave a una temperatura de 121 o
C 1 C y a 1, 5 Kg /cm2 por un lapso de 15 minutos.

7. Conclusiones

Se logr estar al tanto

los diferentes
tipos de esterilizacin y
desinfeccin de materiales y medios de cultivo, adems conocer la
importancia que tienen dichos procesos en las normas de asepsia del
laboratorio de microbiologa
El medio de cultivo para hongo PDA, es un medio que se utiliza
universalmente, es muy recomendado dado a su combinacin del pH y
la actividad enzimtica, permiten que el medio de cultivo sea ptimo
para hongos, levaduras, etc.
El medio PDA de cultivo proporciona al hongo los nutrientes necesarios
para un desarrollo ptimo ya que los hongos son especialistas en
degradar carbohidratos.
Por lo tanto los medios de cultivo de bacterias son medios artificiales
que renen para condiciones suficientes como: temperatura, grado de
humedad, presin de oxgeno, grado de acidez o alcalinidad. Debe

tener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios para el cultivo

y aislamiento de estos microorganismos.
8. Recomendaciones
Es importante no manipular los materiales estriles con las manos
hmedas, ni colocarlos sobre superficies mojadas
Mantener el rea de almacenamiento limpia, libre de polvo, sucio e
insectos.
Para homogeneizar el medio agitar tomando el envase desde el cuello
del Erlenmeyer, evitar las varillas de vidrio
Al momento de cubrir con peridico los materiales de vidrio tendr que
estar cubierto por completo asegurndose que no haya algn espacio
sin cubrir
Dejar que los materiales que salen del horno o autoclave alcancen la
temperatura ambiente antes de ser almacenados; de esta forma se
evita la condensacin dentro del empaque.

Utilizar, preferiblemente, estantes cerrados para colocar el material

esterilizado.

9. Bibliografa
Gertrudis Torrico Cabezas, M. M. (2012). MEDIOS DE CULTIVO EN UN LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA. Recuperado el 15 de 05 de 2016, de medios de cultivo:
libroslaboratorio.files.wordpress.com
Lpez Tvez, L., & Torres, C. (2006 de 09 de 01). TRABAJO PRACTICO N 4 Medios de Cutivo.
Recuperado el 15 de 05 de 2016, de medios de cultivo: www.biologia.edu.ar/../tp4.pdf
Maria de los Angeles Aquiahatl, M. d. (2004). Manual de Practicas del Laboratorio de
Microbiologia General (1 ed., Vol. 1). MEXICO, MEXICO, MEXICO.

Madigan M.; Martinko J.; Parker J. 2004. Brock, Biologa de los

Microorganismos. Madrid, Espaa Ed. Dcima, Editorial. PEARSON.
ISBN. 8420536792.
Carrillo Leonor. 2003. Microbiologa Agrcola. Salta, Argentina Ed.
Primera, Editorial Universidad Nacional de Salta. ISBN. 987-9381-16-5

 Trivedi P.; Pandey S.; Bhadauria S. 2010. Text Book of Microbiology.

Jaipur, India. Ed. Primera. Editorial Aavishkar. ISBN. 978-81-7910-306-7.
Noel R. Krieg, James T. Staley, Daniel R. Brown, Brian P. Hedlund, Bruce
J. Paster, Naomi L. Ward, Wolfgang Ludwig and William B. Whitman.
2010. Bergeys Manual, Georgia, EE-UU Ed. Segunda. Editorial.
Springer. ISBN. 978-0-387-95042-6.
Leboffe M y Pierce B. 2011. Microbiology, California-EE-UU. Ed. Cuarta
2011. Editorial Morton. ISBN. 978-089582-872-9
Prescott, Harley y Klein. 2002. Microbiologa. Madrid, Espaa. Ed.
Quinta. Editorial The McGrawHill Companies.
Elmer H.; James L. 2001. Applied Dairi Microbiology. New York, EE-UU.
http://www.dekker.com. ISBN. 0-8247-0536-X.
Michael Gillings y Andrew Holmes. 2004. Plant Microbiologa. Sydney,
Australia. http://www.bios.co.uk/. ISBN. 0-203-62500-5.

Otras
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/maconkeyagar.h
tm
http://www.britanialab.com/productos/565_hoja_tecnica_es.pdf

http://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-v/pb-v-3-kligler.htm
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/nutritivoagar.htm
http://www.britanialab.com/productos/234_inserto_es.pdf
http://www.biobacter.com/INSERTOS/AGAR%20NUTRITIVO%20%20pg%201.pdf
http://education.sterra .com/c3/c3_monitoring.htm