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NDICE

INTRODUCCIN3
OBJETIVOS4
MARCO TEORICO.........................................................................................5
MTODOS CLSICOS DE SECUENCIACIN..5
Mtodo qumico de Maxam y Gilbert .6
Mtodo de Sanger..8
SECUENCIACIN AUTOMTICA EMPLEANDO EL METODO ENZIMTICO.10
Secuenciacin empleando cebadores fluorescentes..10
Secuenciacin por terminadores fluorescentes
SECUENCIADORES AUTOMTICOS
Secuenciadores automticos capilares
Secuenciacin
automtica
en
geles
acrilamida/bisacrilamida

desnaturalizantes

REACCION DE CADENA POLIMERASA O PCR

OTROS METODOS DE SECUENCIACION:


Secuenciacin por hibridacin:
Secuenciacin a futuro sin fragmentacin de ADN:
Secuenciacin tipo shotgun o Shotgun Sequencing:

APLICACIONES DE LA SECUENCIACIN DE ADN.

CONCLUSIONES.

de

INTRODUCCIN
La estructura de la doble hlice del ADN fue descrita por James Watson y
Francis Crick en 1953. Dicho descubrimiento ha supuesto un hito en la historia
de la biologa y su modelo propuesto ha sido ampliamente confirmado.
Segn este modelo, la molcula de ADN est constituida por dos largas
cadenas de nucletidos con polaridad opuesta, unidas entre s formando una
doble hlice. Cada nucletido est formado por un azcar: la desoxirribosa, una
base nitrogenada que puede ser de cuatro tipos diferentes: adenina (A),
guanina (G), citosina (C) y timina (T) y un grupo fosfato.
Los nucletidos se enlazan entre s a travs del grupo fosfato formando
largusimas cadenas . La estructura fosfato-pentosa recorre el esqueleto de la
hlice, mientras que las bases se disponen formando un ngulo recto con el eje
de la misma.
Las dos cadenas de polinucletidos que constituyen una molcula de ADN se
mantienen unidas entre s gracias a la formacin de puentes de hidrgeno
entre las bases nitrogenadas complementarias de ambas cadenas que quedan
enfrentadas (dos puentes de hidrgeno entre A y T, y tres puentes de hidrgeno
entre G y C)
La estructura de un determinado ADN est definida por la ordenacin o
"secuencia" de las bases nitrogenadas en la cadena de polinucletidos,
residiendo precisamente en esta secuencia de bases la informacin gentica
del ADN.
La estructura en doble hlice del ADN, con el apareamiento de bases limitado
(A-T; G-C), implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas
determina automticamente el orden de la otra, por ello se dice que las
cadenas son complementarias.

OBJETIVOS:

MARCO TEORICO:
SECUENCIACION DEL ADN
La secuenciacin
del
ADN es
un
conjunto
de
mtodos
y tcnicas bioqumicas cuya finalidad es la determinacin del orden de
los nucletidos (A, C, G y T) en un oligonucletidode ADN. La secuencia de
ADN constituye la informacin gentica heredable que forman la base de los
programas de desarrollo de los seres vivos (de procariotas, de eucariotas en el
ncleo celular, y en los plsmidos, en la mitocondria y en cloroplastos de las
plantas). As pues, determinar la secuencia de ADN es til en el estudio de la
investigacin bsica de los procesos biolgicos fundamentales, as como en
campos aplicados, como la investigacin forense. Adems, se puede utilizar la
secuenciacin del ADN para conocer las mutaciones somticas, como las
sustituciones de bases, generadas entre distintos organismos.
El desarrollo de la secuenciacin del ADN ha acelerado significativamente la
investigacin y los descubrimientos en biologa. Las tcnicas actuales permiten
realizar esta secuenciacin a gran velocidad, lo cual ha sido de gran
importancia para proyectos de secuenciacin a gran escala como el Proyecto
Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la
colaboracin investigadora a escala mundial, han establecido la secuencia
completa
de
ADN
de
muchos genomas de animales, plantas y microorganismos. A pesar de las
distintas tcnicas que permiten secuenciar el ADN, no siempre se puede llegar
a conocer el genoma completo de los organismos. Esto, puede llevar a errores
en la reconstruccin de los linajes y en la estimacin del tipo de mutaciones y
del nmero de mitosis generadas.

MTODOS CLSICOS DE SECUENCIACIN


LOS INICIOS:
Durante treinta aos la mayor parte de la secuenciacin de ADN se llev a
cabo con el mtodo de terminacin de la cadena desarrollado por Frederick
Sanger y colaboradores, en 1975. 1 2 Antes del desarrollo de mtodos rpidos
de secuenciacin del ADN a principios de los 70 por Sanger
en Inglaterra y Walter Gilbert y Allan Maxam en Harvard,3 4 se utilizaban varios
mtodos de laboratorio. Por ejemplo, en 1973 5 Gilbert y Maxam publicaron una
secuencia de 24 pares de bases utilizando un mtodo conocido como "de
punto corrido" (wandering spot).
La secuenciacin del ARN, que por razones tcnicas es ms sencilla de llevar
a cabo que la del ADN, se desarroll con anterioridad a la del ADN. El mayor

hito en la secuenciacin del ARN, que data de la era previa al ADN


recombinante, es la secuencia del primer gen completo y del genoma completo
del Bacterifago MS2, identificado y publicado por Walter Fiers y colaboradores
de la Universidad de Gante.
Los dos protocolos clsicos de secuenciacin (mtodo qumico y enzimtico)
comparten etapas comunes.
o Marcado: Es necesario marcar las molculas a secuenciar radiactiva o
fluorescentemente
o Separacin: Cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de ADN
marcadas cuyos tamaos se diferencian en una nica base. Estas cadenas de
distintas
longitudes
pueden
separarse
por electroforesis en geles
desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida-urea, donde aparecen como una
escalera de bandas cuya longitud vara en un nico nucletido.
Para obtener estas cadenas se emplean dos procedimientos:

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert


Originalmente descrito por A. Maxam y W. Gilbert en 1977.
Esta tcnica consiste en romper cadenas de ADN de cadena sencilla marcadas
radiactivamente con reacciones qumicas especficas para cada una de las
cuatro bases. Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven, por
electroforsis, en funcin de su tamao en geles de poliacrilamida donde la
secuencia puede leerse en base al patrn de bandas radiactivas obtenidas.
En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un mtodo para
secuenciar ADN basado en la modificacin qumica del ADN y posterior
escisin en bases especficas8Aunque Maxam y Gilber publicaron su
secuenciacin qumica dos aos antes del trascendental artculo de Sanger y
Coulson sobre su mtodo de secuenciacin "ms-menos", 9 10 la secuenciacin
de Maxam y Gilbert rpidamente se hizo ms popular hasta que se pudo utilizar
ADN directamente, mientras que el mtodo inicial de Sanger requera que cada
comienzo de lectura fuera clonado para producir un ADN de cadena simple. No
obstante, con el desarrollo y mejora del mtodo de terminacin de la cadena
(ver ms adelante), la secuenciacin de Maxam y Gilbert ha quedado en
desuso debido a su complejidad tcnica, el uso extensivo de productos
qumicos peligrosos y dificultades para escalarla. Adems, a diferencia del
mtodo de terminacin de la cadena, los reactivos que se usan en el mtodo
de Maxam y Gilbert no se pueden adaptar para utilizarse en un kit biolgico
estndar.

En resumen, el mtodo requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la


purificacin del fragmento de ADN que se desea secuenciar. El tratamiento
qumico genera rupturas en una pequea proporcin de uno o dos de los cuatro
nucletidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Los
agentes qumicos utilizados en cada caso son: DMS (G), cido frmico (A+G),
hidrazina (C+T) e hidrazina ms sales (C).De ese modo se genera una serie de
fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta el primer
lugar de "corte" en cada molcula.
Los fragmentos posteriormente se separan por tamao mediante electroforesis
en gel, separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras
distintas, pero una al lado de la otra. El gel utilizado presenta condiciones
desnaturalizantes, y un contenido en poliacrilamida que vara entre un 6 y un
20 %. Para visualizar los fragmentos generados en cada reaccin, se hace
una autoradiografa del mismo, lo que proporciona una imagen de una serie de
bandas oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con e
lradioistopo, a partir de las cuales se puede inferir la secuencia.
Conocido en ocasiones como "secuenciacin qumica", este mtodo se origin
en el estudio de las interacciones entre ADN y protenas (huella gentica),
estructura de los cidos nucleicos y modificaciones epigenticas del ADN, y es
en estos campos donde an tiene aplicaciones importantes.

Un fragmento de ADN se marca


radiactivamente en sus extremos
con gamma 32P gamma 32S
dATP
por
accin
de
la
polinucletido quinasa. La tcnica
consiste
en
romper
estas
molculas
marcadas
con
reacciones qumicas especficas
para cada una de las cuatro bases.
Cuatro alcuotas de la misma
muestra se tratan bajo condiciones
distintas,
posteriormente
el
tratamiento con piperidina rompe
la molcula de ADN a nivel de la
base modificada. Los productos de
estas
cuatro
reacciones
se
resuelven en funcin de su tamao
en geles de poliacrilamida donde la
secuencia puefe leerse en base al
patrn de bandas radiactivas
obtenidas. Esta tcnica permite la
lectura de unas 100 bases de
secuencia.

Mtodo
Sanger

de

Este
mtodo
de
secuenciacin de ADN fue diseado por Sanger, Nicklen y Coulson tambin en
1977 y se conoce como mtodo de los terminadores de cadena o dideoxi.
Para este mtodo resulta esencial disponer de un ADN de cadena
simple (molde) y un iniciador, cebador o "primer" complementario de una regin
del ADN molde anterior a donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se
utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa I que va a extender la
cadena copiando de forma complementaria el molde de ADN.
El mtodo dideoxi de secuenciacin ideado por Sanger est basado en el
empleo de didesoxinucletidos que carecen de uno de los grupos hidroxilo, de
manera que cuando uno de estos nucletidos se incorpora a una cadena de
ADN en crecimiento, est cadena no puede continuar elongndose ya que la
ADN polimerasa necesita un extremo 3 OH para aadir el siguiente nucletido
y el desosinucletido incorporado carece de este grupo hidroxilo.

Se asla y se clona el ADN que se desea secuenciar, este ADN se


desnaturaliza y se emplea una sola hlice en la secuenciacin. En la
secuenciacin se utiliza un cebador o primer marcado radiactivamente que
suministra el extremo 3OH que necesita la ADN polimerasa. Se preparan
cuatro tubos de reaccin, cada uno con el ADN molde de hlice sencilla que se
desea secuenciar, con ADN polimerasa, con el cebador marcado y con los
cuatro nucletidos trifosfato. A cada tubo se le aade una pequea proporcin
de un didesoxinucletido trifosfato , un tubo con ddATP, otro con ddTTP, el
tercero con ddGTP y el cuarto con ddCTP. En cada uno de estos tubos se
producirn cadenas de ADN de distintas longitudes, terminando todas en el
lugar en el que se incorpor el dideoxi correspondiente aadido al tubo.

Posteriormente, estas piezas de ADN se separan mediante electroforesis


vertical en geles de acrilamida. Las piezas ms pequeas migran ms
rpidamente que las grandes y la secuencia se puede leer directamente sobre
el gel de acrilamida.
En el siguiente esquema se indican los resultados que obtendramos al realizar
la autorradiografa del gel de secuenciacin :

SECUENCIACIN AUTOMTICA EMPLEANDO EL METODO ENZIMTICO


Es una alternativa al mtodo de Sanger. Consiste en marcar el oligo cebador o
los terminadores con un compuesto fluorescente y activar la reaccin de
secuencia. Los productos de la reaccin se detectan directamente durante la
electroforsis al pasar por delante de un lser que al excitar los fluorforos
permite detectar la fluorescencia emitida
Secuenciacin empleando cebadores fluorescentes

PARTE DE GUIMEL

SECUENCIADORES AUTOMTICOS
SECUENCIADORES AUTOMTICOS CAPILARES
Basados en electroforesis capilar (CE) Los sistemas de secuenciacin
basados en electroforesis capilar son muy recientes y est claro que
representan la prxima generacin de secuenciacin automtica. Su ventaja
principal es justamente sa: el proceso se automatiza todava ms, siendo por
ello muy cmodos. Basta colocar las reacciones de secuenciacin en las
placas microtiter y la mquina se encarga del resto. Adems son mucho ms

rpidos y el operario no tiene que manipular directamente la acrilamida (no hay


que 4 preparar gel). Su inconveniente es que las lecturas obtenidas (unas 500
bases con 99% de precisin) son menores que las que se consiguen mediante
PAGE. Adems, el costo por reaccin es aproximadamente el doble que el de
los sistemas basados en gel.
Basados en electroforesis capilar (CE) Los sistemas de secuenciacin basados
en electroforesis capilar son muy recientes y est claro que representan la
prxima generacin de secuenciacin automtica. Su ventaja principal es
justamente sa: el proceso se automatiza todava ms, siendo por ello muy
cmodos. Basta colocar las reacciones de secuenciacin en las placas
microtiter y la mquina se encarga del resto. Adems son mucho ms rpidos y
el operario no tiene que manipular directamente la acrilamida (no hay que 4
preparar gel)
El principio de la mquina es simple y se resume en la grfica siguiente:

El
capilar

contiene una resina comercial, cuya composicin es secreta. Una extremidad


del capilar es insertada en el tubo de la muestra, que a su vez contiene un
electrodo (-). Una fuerte diferencia de potencial se crea y permite de "aspirar "
rpidamente una alcuota en el capilar. La extremidad del capilar es enseguida
transferida en la cubeta que contiene el tampn de electroforsis., que a su vez
contiene electrodos (-). La otra extremidad del capilar se deposita desde el
comienzo dentro de otra cubeta que contiene tampn y el electrodo (+).

A lo largo del capilar se


encuentra una ventanita de
cuarzo. Al frente de la misma
el emisor laser y detrs el
detector.
Su funcin: detectar el paso
de las ADN fluorescentes y de
comunicar
eso
a
la
computadora.
Todas estas manipulaciones
son
realizadas
automticamente,
an
el
llenado de los capilares y el
pasado por la resina.
El investigador simplemente
introduce
la
muestra
preparada y lee los resultados
en la pantalla.

Secuenciacin automtica
en geles desnaturalizantes
de acrilamida/bisacrilamida
La secuenciacin automtica
mediante
geles
desnaturalizantes, se realiza
polimerizando un gel de
acrilamida/bisacrilamida entre
dos
cristales
montados
adecuadamente
sobre
el
cassette que sirve de soporte
para los mismos y que posteriormente se acoplar en el secuenciador
automtico para proceder a la carga de la muestras.
La secuenciacin automtica mediante geles desnaturalizantes, se realiza
polimerizando un gel de acrilamida/bis entre dos cristales montados
adecuadamente sobre el cassette que sirve de soporte para los mismos y que
posteriormente se acopla en el secuenciador automtico para proceder a la
carga de la muestras.

El nmero de muestras que podemos cargar en cada gel, viene determinado


por el nmero de pocillos que posee el peine ( de dientes de tiburn) que
utilicemos. Hay peines de cuatro tamaos distintos: de 36, 48, 64 y 96 pocillos.
La electroforesis se desarrolla durante 7 horas, y se puede realizar una lectura
de unos 700pb aproximadamente, dependiendo siempre de la calidad del ADN,
de la correcta cuantificacin del mismo, de la utilizacin del primer adecuado, y
de la polimerizacin correcta del gel de acrilamida/bis principalmente.
Cuando las muestras a secuenciar tienen una longitud no superior a 400pb,
podemos disminuir el tiempo de la electroforesis a 3.5 horas, aumentando la
velocidad de barrido del laser, y el resultado es igualmente optimo.

REACCION DE CADENA POLIMERASA O PCR


La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en
ingls
(polymerase chain reaction),
es
una
tcnica
de
biologa
molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis. Su objetivo es obtener un gran
nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo;
en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde.
Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras
la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta
probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar
personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado.
Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una

tcnica muy extendida, sobre todo en el mbito de la investigacin forense, con


el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevar a cabo dicha
tcnica.
Fundamento e importancia
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN
polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de
altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin
formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que las
hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente.
Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un aparato
llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin para
controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin. Los tubos
usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una
buena conductividad trmica, permitiendo que se alcance rpidamente
el equilibrio trmico.
Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en
laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una gran variedad de
aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonacin de ADN para
la secuenciacin, la filogenia basada en ADN, el anlisis funcional de genes, el
diagnstico de trastornos hereditarios, la identificacin de huellas
genticas (usada en tcnicas forenses y test de paternidad) y la deteccin y
diagnstico de enfermedades infecciosas.
Reactivos
Para realizar la tcnica se necesitan:

Los
4 desoxirribonucletidos-trifosfato (dNTP),
para polimerizar nuevo ADN.

Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers), oligonucletidos que son,


cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son
secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucletidos, normalmente de
dieciocho a veintids, que permiten que la polimerasa inicie la reaccin.

Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comnmente


como cloruro de magnesio (MgCl2), o algn otro catin divalente. Tambin
se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagnesis de ADN mediante
PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error
durante la sntesis de ADN..

sustratos

Iones monovalentes, como el potasio.

Una solucin tampn o buffer que mantiene


funcionamiento de la ADN polimerasa.

ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima


alrededor de 70 C (la ms comn es la polimerasa Taq).

ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.

el pH adecuado

para

el

Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada


una de las etapas que conforman un ciclo.
Ciclo de amplificacin
Inicio
Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-96 C (
98 C si se est usando una polimerasa termoestable extrema), que se
mantiene durante 1-9 minutos. Esto slo es necesario para ADN
polimerasas que requieran activacin por calor.
Desnaturalizacin
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las
cuales est constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos,
siendo el calentamiento (94-95 C) de la muestra la forma ms habitual. Otros
mtodos, raramente empleados en la tcnica de la PCR, seran la adicin de
sales o agentes qumicos capaces de realizar la desnaturalizacin.
Alineamiento o unin del cebador
A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se
unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario
bajar la temperatura a 40-68 C durante 20-40 segundos (segn el caso),
permitiendo as el alineamiento. Los puentes de hidrgeno estables entre las
cadenas de ADN (unin ADN-ADN) s lo se forman cuando la secuencia del
cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el
hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los
cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser
amplificada.
Extensin o elongacin de la cadena
Acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena
complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para

la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN


complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTP complementarios en
direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La
temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que usemos. Para la
polimerasa Taq, la temperatura de mxima actividad est en 75-80 C
(comnmente 72 C). El tiempo de extensin depende tanto del ADN
polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a
amplificar. Hay una regla comnmente usada: en su temperatura ptima, la
polimerasa de ADN polimerizar mil bases en un minuto.
Elongacin final
Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 C durante 5-15
minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de
cadena simple restante sea totalmente ampliado.
Conservacin
Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo indefinido
para conservar la reaccin a corto plazo.
La PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 15-100 L, en
pequeos tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.
Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se
emplean tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN
generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y
dependiendo de la matriz empleada, a su tamao: tpicamente se emplean
la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida,
para los ms pequeos; y, de forma ms rpida y aplicable a la PCR asociada
a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.


OTROS METODOS DE SECUENCIACION:
Secuenciacin por hibridacin:
Forma en la cual se puede utilizar la hibridizacin para secuenciar. La
molcula de ADN se hibridiza contra pequeos oligonucleotidos que son
como palabras. Despus, se determina la secuencia.
Una forma en la cual puede funcionar este mtodo es utilizando
microarrays. Estos son soportes pequeos en los cuales se imobilian
pequeos fragmentos de ADN en un orden conocido. Despus se pasa la
muestra de ADN (con secuencia desconocida) y se cuantifica el grado de
hibridizacin, y por consecuencia el grado de identidad con las secuencias
fijas en el soporte.Esto parece funcionar especialmente bien en la
identificacin de SNPs. Wang et al. reportaron que es posible identificar el
genotipo de un individuo analizando 500 SNPs a la vez en un experimento
de hibridizacin con un microarray de oligonucleotidos. Una posibilidad
para la secuenciacin de acidos nucleicos a futuro, que discuten los autores
Cantor y Smith es el hacer hibridizacin contra oligonucleotidos que formen
palabras de tal forma que se pueda ir determinando la secuencia
sobrelapando los fragmentos (de 6-8 nucletidos) con los cuales hbrida el
fragmento secuenciado .

Secuenciacin a futuro sin fragmentacion de ADN:


Los autores Cantor y Smith discuten posibilidades en funcin de que poder
secuenciar molculas individuales de ADN sin fragmentarlos en segmentos.
Por ejemplo, usar molculas de ADN fijas a un soporte que se van
degradando con una exonucleasa y algn detector que determine cuales son

1
2
3

los nucletidos que se van liberando). Una segunda posibilidad es utilizar


microscopia electronica para determinar la secuencia de acidos nucleicos en
42 una molcula de ADN. Esto se podra hacer tal vez marcando las bases
individuales con algn metal pesado. Ninguno de estos dos mtodos se ha
implementado por dificultades en los detalles .
Dificultades:
primer caso:
como marcar cada base con alguna etiqueta como un fluoroforo
tener un detector suficientemente sensible que sea capaz de detectar un
solo nucletido marcado.
segundo caso (microscopia electronica):
no se pudo marcar cada base con algn metal sin tener reacciones laterales
no deseadas (con otras bases la molcula de ADN).
Caminata cromosomal o Chromosome Walking:
Permite determinar la secuencia de un fragmento enorme de ADN
ensamblando muchas secuencias pequeas de distintas clonas
Es una estrategia general para secuenciar fragmentos grandes de ADN.
y consiste en lo siguiente:
La fragmentacin parcial del ADN para su insercin en un vector de
clonacin.
La obtencin de un banco de clonas de fragmentos que contienen
segmentos que se traslapan.
La secuenciacin de una clona y la identificacin de una segunda que posea
la continuacin del segmento que se est secuenciando.

Este proceso se repite hasta que se completa la secuencia de la molcula


original de ADN (e.g., un cromosoma). Esta estrategia se utiliz
originalmente en el proyecto de secuenciacin del genoma humano.
Ventaja :
Se asegura la obtencin de la secuencia completa de la molcula original de
ADN. En teora, no se requiere hacer secuenciacin redundante.
Desventajas :
Primero, cada clona se tiene que analizar individualmente y en serie. No se
puede secuenciar la siguiente clona hasta no conocer la primer secuencia.
Segundo, se requiere la sntesis de un enorme nmero de iniciadores para
continuar la secuenciacin. Suponiendo que cada iniciador empleado es
nico y sirve para secuenciar slo una parte de una clona particular, se
requiere sintetizar de 5 a 10% de la secuencia total . Tomando esto en
cuenta, no es sorprendente que hasta 1998 slo se haba secuenciado el
5% del genoma humano .Era necesario un cambio de estrategia para
completar la secuencia del genoma humano en el tiempo previsto.

Secuenciacin tipo shotgun o Shotgun Sequencing:

Se secuencian fragmentos al azar y luego usando un programa


computacional se encuentran las regiones que se traslapan para determinar
la secuencia del fragmento original.
Es la segunda estrategia general para la secuenciacin de fragmentos
grandes de ADN. La gran diferencia entre esta estrategia y la anterior es que
en el shotgun la secuenciacin se hace a partir de fragmentos al azar.
Despus, se utiliza un programa de cmputo para encontrar las regiones que
se traslapan entre las secuencias individuales. As se va ensamblando la
secuencia del fragmento original .
Ventaja:
Es rpida
Requiere la sntesis de pocos iniciadores
Tiene una eficiencia comprobada .
Desventajas :
Requiere la redundancia de las secuencias para asegurar la obtencin de
una muestra completa del ADN original
Requiere mucha tecnologa computacional para ensamblar la secuencia
original
A veces quedan gaps (regiones del fragmento original que no se
secuenciaron).

Utilizando esta estrategia de secuenciacin, es necesario secuenciar al


menos 5 veces el ADN original para poder lograr un muestreo completo .Tal
vez, esta razn es suficiente para explicar la resistencia durante tanto tiempo
para la realizacin del proyecto del genoma humano, considerando que es
un genoma al menos 25 veces ms grande que cualquier otro genoma ya
secuenciado . Aun cuando Weber y Myers (1997) presentaron un plan para
terminar la secuenciacin del genoma humano con esta estrategia,
demostrando que sera ms rpido y menos costoso, su propuesta no fue
bien recibida.

APLICACIONES DE LA SECUENCIACIN DE ADN


o Deteccin de mutaciones
o Secuenciacin de ADNs fsiles
o Diagnstico de enfermedades genticas
o Identificacin de especies y control de cruces entre animales
o Proyecto genoma humano
Deteccin de mutaciones
Esta tcnica nos permite localizar mutaciones previamente descritas. Se
emplea as la secuenciacin de ADN como un mtodo de diagnstico: una vez
que se ha caracterizado la relacin con una enfermedad de una determinada

mutacin puntual (mutaciones en el gen de la galactosa 1P uridiltransferasa en


la galactosemia, mutaciones en c-Ras y cncer, etc..) o de una pequea
delecin (delecin de 3 bases en el gen CFTR en la fibrosis qustica), puede
desarrollarse un mtodo de deteccin rutinario. La secuenciacin automtica
puede emplearse como mtodo de screenig en la localizacin de nujevas
mutacioines.
Secuenciacin de ADNs fsiles
El uso del PCR ha abierto la posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de
unas pocas copias intactas presentes en especmenes de museo y
descubrimientos arqueolgicos en los cuales la mayora de las molculas estn
daadas o degradadas, para proceder posteriormente a su estudio mediante
secuenciacin.
Diagnstico prenatal / Diagnstico preimplantacin
Diagnstico de enfermedades hereditarias o determinacin del sexo del feto
previamente a su implantacin en procesos de fecundacin in vitro.
Una o dos clulas del pre-embrin se retiran en el estado de 8 a 16 clulas,
previo a la implantacin. Estas pueden utilizarse para amplificar un gen o genes
especficos y as estudiar la enfermedad gentica o el sexo (utilizando genes
especficos del cromosoma Y).
Identificacin de especies y control de cruces entre animales
Las tcnicas para identificar especies pueden ser muy importantes para
descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie ms
barata a los precios de otra ms cara, o el comercio ilegal de especies en
peligro. Estos estudios pueden realizarse utilizando el ADN mitocondrial, el cual
presenta secuencias altamente variables entre especies distintas, aunque sean
cercanas entre s, y bastante conservadas dentro de la misma especie.
Los controles de relaciones parentales en animales tiene importancia forense
para el control de comercio ilegal de especies protegidas. Individuos jvenes de
especies en peligro son sacados de sus lugares de nacimiento y "disfrazados"
por certificados veterinarios falsos. En estos caso, el estudio familiar es el nico
medio de descubrir el origen ilegal de los individuos.
Proyecto Genoma Humano
El Proyecto Genoma Humano es un proyecto internacional cuyo objetivo final
es obtener una descripcin completa del genoma humano a travs de la
secuenciacin del ADN. El genoma que se investiga es el genoma nuclear.

Desde su inicio, el proyecto ha sido justificado especialmente por los beneficios


mdicos que se espera obtener del conocimiento de la estructura de cada gen
humano. Esta informacin proporcionar una capacidad de diagnstico en
individuos con riesgo de ser portadores del gen de alguna enfermedad.
Tambin se espera que aporte un marco de trabajo para el desarrollo de
nuevas terapias, adems de nuevas estrategias para la terapia gnica.

CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFIA:
http://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htm#aplicaciones
http://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/maxam.htm
https://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa
https://www.google.com.pe/search?q=Reacci
%C3%B3n+en+cadena+de+la+polimerasa&biw=1242&bih=585&source=l
nms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwjGuKqzg57NAhVLWx4KHZ8bDgUQ_AU
IBigB#imgrc=otriRI4Vwq4NJM%3A
https://es.wikipedia.org/wiki/Secuenciaci%C3%B3n_del_ADN
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/secuenciacion_acidos_nucleicos.
pdf