42.

Aislamiento y visualizacin de cidos

nucleicos
Gabriel Dorado Prez
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba

RESUMEN

La informacin necesaria para la construccin de los seres vivos se

encuentra almacenada en los cidos nucleicos. Existen dos variedades
qumicas de cidos nucleicos: el DNA (cido desoxirribonucleico) y el
RNA (cido ribonucleico). El cromosoma de las bacterias es de doble
cadena (dsDNA), circular y superenrollado. Su tamao es de ~4.500 kilo
pares de bases (kpb). Estas clulas pueden contener tambin molculas
de dsDNA relativamente pequeas (~3 kpb), circulares y superenrolladas:
plsmidos. El RNA generalmente se encuentra en forma de cadena
sencilla, aunque suele formar estructuras secundarias de doble hlice,
por autoapareamiento de regiones complementarias. Existen diversos
tipos de RNA ribosmico (rRNA), nombrados de acuerdo con su
coeficiente de sedimentacin Svedberg, que es una medida de su
tamao (peso), conformacin y agregacin. As, los rRNA de procariontes
tienen tamaos de 23S (~25 kilobases; kb) y 16S (~15 kb). Una cantidad
menor de RNA aunque muy importante para la clula, es el RNA
mensajero (mRNA), que existe en una amplia variedad de tamaos: de
cientos a miles de bases (b). El mRNA representa la expresin de algunos
de los genes contenidos en el DNA cromosmico. El mRNA es ledo en
los ribosomas con la ayuda del RNA transferente (tRNA; ~80 b),
traducindose a protenas, que son las biomolculas que sirven para
construir los seres vivos. El objetivo de esta prctica es obtener una
preparacin de todo el material gentico de bacterias, que pueda ser
sometida a electroforesis.
Palabras clave: agarosa, bromuro de etidio, congelacin, electroforesis, gel, luz
ultravioleta.
Abreviaturas empleadas (por orden alfabtico de abreviatura). ADN: acido
desoxirribonucleico; BrEt: bromuro de etidio; LB: medio rico Luria-Bertani; Na2
EDTA: sal disdica del cido etiln diamino tetra-actico; PM: peso molecular;
RNA: cido ribonucleico; SDS: dodecil sulfato de sodio; TAE: solucin
amortiguadora Tris-Actico-EDTA; TBE: solucin amortiguadora Tris-BricoEDTA; Tris base o Trizma base: Tris (hidroximetil) aminometano.

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
La prctica se realizar en grupos de 24 alumnos, repartidos en ocho
subgrupos de tres. Tendr una duracin aproximada de cuatro horas.

La informacin necesaria para la construccin de los seres vivos se

encuentra almacenada en los cidos nucleicos. Su nombre deriva de su
carcter cido y del hecho de que fueron descubiertos en el ncleo de las
clulas eucariontes.
Existen dos variedades qumicas de cidos nucleicos: el DNA (cido
desoxirribonucleico) y el RNA (cido ribonucleico). Generalmente, la
informacin gentica se almacena en forma de cromosomas de DNA y se
expresa en forma de mRNA (RNA mensajero). Las bacterias son procariontes
(sin ncleo celular); por tanto, todos sus cidos nucleicos se encuentran en el
citoplasma.
El cromosoma de las bacterias es de doble cadena (dsDNA), circular y
superenrollado. Su tamao es de ~4.500 kilo pares de bases (kpb). Estas
clulas pueden contener tambin molculas de dsDNA relativamente pequeas
(~3 kpb), circulares y superenrolladas: plsmidos. stos confieren diferentes
caractersticas a las clulas hospedadoras, como resistencia a antibiticos o
prototrofa para determinados nutrientes. Los plsmidos son adems unas
herramientas muy valiosas en ingeniera gentica y biologa molecular.
El RNA generalmente se encuentra en forma de cadena sencilla, aunque
suele formar estructuras secundarias de doble hlice, por autoapareamiento de
regiones complementarias. La mayor parte del RNA forma parte (estructural y
funcional) de los ribosomas. Existen diversos tipos de RNA ribosmico (rRNA),
nombrados de acuerdo con su coeficiente de sedimentacin Svedberg, que
es una medida de su tamao (peso), conformacin y agregacin. As, los rRNA
de procariontes tienen tamaos de 23S (~25 kilobases; kb) y 16S (~15 kb).
Una cantidad menor de RNA aunque muy importante para la clula, es el
RNA mensajero (mRNA), que existe en una amplia variedad de tamaos: de
cientos a miles de bases (b). El mRNA representa la expresin de algunos de
los genes contenidos en el DNA cromosmico. El mRNA es ledo en los
ribosomas con la ayuda del RNA transferente (tRNA; ~80 b), traducindose a
protenas, que son las biomolculas que sirven para construir los diferentes
seres vivos.
El objetivo de esta prctica es obtener una preparacin de todo el
material gentico de bacterias, que pueda ser sometida a electroforesis.

2. UTILIDAD DE LA PURIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS

El aislamiento y purificacin de cidos nucleicos puede ser analtico o
preparativo y tiene diferentes objetivos. En el primer caso, slo nos interesa
visualizar dicho material gentico; generalmente, para determinar su tamao y
seleccionar el apropiado. As puede comprobarse, por ejemplo, si hemos
clonado un inserto o DNA pasajero en un vector o plsmido. La purificacin
preparativa se realiza generalmente como paso siguiente, cuando necesitamos
dicho material gentico para realizar futuras manipulaciones con el mismo; por
ejemplo, secuenciarlo o usarlo para transformar bacterias.
El resultado de la purificacin analtica o preparativa se suele someter a
electroforesis en gel de agarosa y se tie con bromuro de etidio. Estos anlisis
2

son complementarios: puede realizarse uno, varios o todos; segn las

necesidades y tiempo disponible.

3. PURIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS: PRINCIPIOS

Existen diversos mtodos de purificacin de cidos nucleicos. stos varan
segn se desee aislar DNA o RNA, as como del grado de pureza requerido.
Otro aspecto importante a considerar es el uso de sustancias txicas o inocuas.
Aunque hace unos aos era normal usar fenol y cloroformo para la purificacin
de cidos nucleicos, actualmente existen metodologas tan eficientes o ms,
que no emplean compuestos qumicos txicos.
En esta prctica se realiza primero un aislamiento rpido por lisis celular.
Despus se procede a la separacin electrofortica en gel de agarosa y
visualizacin de dichos cidos nucleicos. Tambin se llevar a cabo un clculo
aproximado de pesos moleculares (tamaos) del material gentico
obtenido.
Como se observa, se trata de un mtodo analtico; es decir, cuyo objetivo no
es utilizar dichos cidos nucleicos en futuras manipulaciones, sino,
simplemente, visualizar las diferentes formas moleculares de los mismos, as
como determinar su tamao aproximado y posteriormente desecharlos. Existen
varios protocolos de purificacin rpida de DNA (genmico, plsmidos, etc) y
RNA (total, mRNA, etc). Por ejemplo, algunos protocolos de purificacin de
plsmidos utilizan detergentes (como el SDS) para romper las clulas, lcali
(como NaOH) para desnaturalizar el cromosoma bacteriano y las protenas y
sal (como KCl) para favorecer la precipitacin de las protenas y cromosomas
desnaturalizados. Ello arrastra tambin los restos de membrana y pared celular
a los cuales se encuentra unido fsicamente el cromosoma, otros restos
celulares y el propio SDS. De esta forma, los plsmidos quedan en solucin
(detallado en Sambrook y Russell, 2001: Protocol 6. Preparation of plasmid
DNA: toothpick minipreparations, pp. 1-511.54).
En esta prctica se describe un protocolo algo menos eficiente para
visualizar plsmidos. No obstante, es mucho ms eficiente para visualizar
todo el material gentico de las bacterias (diferentes tipos de DNA y RNA),
y claramente mucho ms rpido y cmodo.

4. VISUALIZACIN RPIDA DE CIDOS NUCLEICOS DE BACTERIAS

Nota: como es habitual, la manipulacin del material biolgico se debe
realizar bajo las oportunas condiciones de esterilidad, a fin de evitar
contaminaciones y degradacin de las muestras.
ATENCIN: el material biolgico de desecho deber ser destruido. Por
ejemplo, mediante inmersin en un agente oxidante fuerte como leja
(hipoclorito sdico) al 10%, agua oxigenada (perxido de hidrgeno) al 3%,
esterilizacin hmeda en autoclave a 120 C y 1 bar (1 kg/cm2) durante 20
min, o esterilizacin seca en horno a 180C durante 4 h. Los dos primeros

mtodos suelen emplearse para destruir cidos nucleicos; los dos ltimos para
matar clulas.
Cada subgrupo procesar una muestra, que ser finalmente cargada en el
gel de electroforesis, junto con dos patrones de peso molecular. La fotografa
del gel servir para realizar los correspondientes clculos de peso molecular
(tamao).
a).-Crecer la bacteria Escherichia coli DH5F hospedadora del plsmido
recombinante pGEM5Zf(+) o pBluescript(SK+) en 1 a 5 ml de medio rico LuriaBertani (LB), en presencia del antibitico selectivo apropiado (ampicilina), hasta
cultivo estacionario (p.ej., unas 12 a 16 h durante la noche) a 37C y en
condiciones de agitacin vigorosa (p.ej., 200 rpm) para asegurar una buena
aireacin y crecimiento. El cultivo puede repartirse en tubos de microfuga y
guardarse a 4C durante varios das (una a dos semanas). Tambin puede
guardarse durante meses a 20C o menos (aunque ello provocar la rotura de
algunas clulas).
b).-Centrifugar 0,5 ml del cultivo estacionario en un tubo de microfuga de 1,5
ml) a 12.000 g durante 30 segundos o a 16.000 g durante 15 segundos para
precipitar las clulas. Eliminar el sobrenadante por decantacin. Dejar escurrir
boca abajo sobre papel absorbente (higinico o de filtro) uno o varios minutos.
Nota: en una microfuga estndar tipo Eppendorf 5415C o similar, 12.000 g
son aproximadamente 12.000 rpm; 16.000 g son aproximadamente 14.000 rpm
(mxima velocidad de dicha microfuga).
c).-Aadir 50 l de agua destilada estril en la tapa del tubo (para no
ensuciar la punta y as poder usar la misma punta con todos los tubos). Agitar
vigorosamente con un agitador tipo vrtex para resuspender bien las clulas. Si
se dispone de muchos tubos, puede emplearse un soporte multitubo para
acelerar el proceso. Estas muestras pueden guardarse durante meses a 20C
o menos hasta su posterior uso. En caso de no realizarse el paso siguiente (c
opcional), pasar al e indicado ms adelante.
d).-Opcional (para incrementar rendimiento unas 100 veces): congelar a
80C y descongelar a 100C una o dos veces las clulas para provocar la lisis
celular. Tambin puede congelarse a 20C y descongelar a 100C, en cuyo
caso se recomienda hacerlo dos veces. El proceso consiste en congelar,
descongelar hirviendo un minuto, agitar vigorosamente en vrtex y en su
caso repetir el proceso.
ATENCIN: para que los tubos no se abran durante el hervido, deben
usarse tubos especiales, como se indica a continuacin.
e).-Opcional: fijar la apertura del tubo Eppendorf con un pico de pato para
que el tubo no se abra (otra alternativa es usar tubos Eppendorf con cierre de
seguridad), e incubar en un bao de agua a 95100C durante 1 min. Agitar
vigorosamente mediante vrtex.

f).-Centrifugar a 12.000 g durante 5 min o a velocidad mxima (16.000 g)

durante 2 minutos. Recoger el sobrenadante, que contendr parte de los
cidos nucleicos.
g).-Someter a electroforesis 9 l del sobrenadante + 1 l de solucin Ficoll
de carga 10X, en gel de agarosa teido con bromuro de etidio. Se recomienda
echar primero 1 l del solucin de carga en el fondo de cada tubo nuevo,
usando la misma punta. El resultado esperado y obtenido puede apreciarse en
la Fig. 1.
Nota: como la solucin Ficoll de carga 10X es muy densa, se recomienda
ajustar una pipeta tipo Gilson P20 a unos 3 l para coger 1 l. Si se ajusta a 1
l no se coge nada. En cualquier caso, estos volmenes son aproximados; y da
igual coger 1 l que el doble o triple. Eso no va a alterar para nada el resultado
de la electroforesis que se realice a continuacin.

Figura 1. Patrn electrofortico de cidos nucleicos de Escherichia coli DH5F. Se

aprecia el DNA genmico (banda superior), el DNA plasmdico (banda tenue intermedia) y
diversas formas de RNA como el ribosmico (mancha inferior). El tRNA se encontrara en la
parte inferior (aunque no es apreciable), mientras que el mRNA se econtrara a lo largo del
carril (fondo). Los carriles de los extremos contienen el marcador de peso molecular x Pst
I (izquierda) y x Hind III (derecha).

h) Como marcadores de peso molecular pueden emplearse 0,5 g/10 l del

vector pGEM5Zf(+) o pBluescript(SK+) superenrollado. Tambin pueden
usarse otros patrones de peso molecular, como 0,5 g/10 l de xHind III
5

(fragmento menor visible de ~2 kpb) y xPst I (fragmento menor visible de ~300

pb).
Nota: los plsmidos son generalmente dsDNA superenrollado (I). No
obstante, parte de los mismos puede encontrase en forma relajada (II; cuando
una de las hebras est cortada) o incluso lineal (III; ambas hebras rotas en el
mismo sitio). Las proporciones relativas suelen ser: I >>> II > III. Por otra parte,
el bromuro de etidio se intercala entre las bases del DNA, reduciendo la
densidad de ste. La movilidad de las molculas en una electroforesis en gel
de agarosa depende no slo de su carga, tamao y densidad, sino tambin de
su forma. As, en ausencia de bromuro de etidio, los plsmidos generan tres
bandas que se distribuyen ctodo > nodo de la siguiente forma: tipo II -> III ----> I. En presencia de bromuro de etidio, la movilidad pasa a ser: tipo III -----> I
-> II.
i).-Visualizar el resultado de la electroforesis, capturar la imagen en disco e
imprimirla.
j).-Realizar el clculo aproximado del tamao del material gentico
visualizado: DNA genmico, DNA plasmdico superenrollado y RNA. Este
clculo puede realizarse de forma aproximada por comparacin de visu con el
estndar conocido. Un clculo ms preciso implica construir una recta patrn,
representando la distancia en mm desde el pocillo a la banda (ordenadas)
frente al lg del tamao (kpb) de las bandas del patrn de pesos moleculares
(abscisas).
ATENCIN: a la hora de comparar tamaos, es importante no olvidar que
slo el dsDNA lineal tiene movilidades equiparables a un estndar de pesos de
dsDNA (que es lineal). Los plsmidos superenrollados slo podrn compararse
con otros superenrollados. La razn estriba en que el dsDNA superenrollado de
los plsmidos avanza ms rpidamente que ese mismo DNA lineal. Por tanto,
no puede calcularse de forma precisa el tamao de un plsmido
superenrollado, usando estndares de peso molecular de dsDNA lineal.
Aunque siempre podr inferirse un tamao mayor que el correspondiente a
dicha banda (si fuera dsDNA lineal). As, por ejemplo, un plsmido de 3 kb
migrar como un DNA lineal de 1 kb. Por tanto, podremos decir que dicho
plsmido es mayor que 1 kb. Otra opcin sera emplear estndares de peso
molecular compuestos por dsDNA superenrollados, pero ello no suele
realizarse por la dificultad tcnica que supone la obtencin de dicho material.
Lo que s suele hacerse es incluir un plsmido de tamao conocido como
referencia
Corolario: el protocolo descrito previamente est diseado para visualizar
todos los cidos nucleicos de las bacterias. As, aparecern dos manchas
muy llamativas de RNA (tRNA y sobre todo rRNA 23S y 16S,
respectivamente) de bajo peso molecular (de 100 a 500 kpb), que pueden
aparecer fusionadas cuando existe gran cantidad de rRNA. La mayor
intensidad de estas bandas es normal, ya que el RNA se encuentra
fundamentalmente en forma de cadena sencilla (ssRNA), por lo que tiene
expuestas sus bases nitrogenadas al exterior, provocando una mayor
fluorescencia. Por otra parte, la agarosa no tiene suficiente poder resolutivo
para diferenciar bien tamaos tan pequeos. Asimismo, debe apreciarse un
6

fondo dbil de mRNA a todo lo largo de cada carril. El DNA plasmdico (en
caso de que la bacteria porte dicho material gentico), suele aparecer de forma
tenue en la zona de 1 a 2 kpb (para plsmidos superenrollados de 3 a 4
kpb). Finalmente, el DNA genmico (cromosoma bacteriano), aunque tiene
4.500 kpb, aparece como una banda intensa y definida en la regin de 10
kpb. Ello es as porque la agarosa no tiene suficiente poder resolutivo como
para diferenciar tamaos tan grandes.

5. BIBLIOGRAFA COMENTADA
+ Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl
K (eds) (2005): Current Protocols in Molecular Biology. Vols 1 a 4. New
York: Greene & John Wiley (New York). Manual de protocolos. La nueva
Biblia del Bilogo Molecular actualizada trimestralmente. Clasificacin:
PROTOCOLOS.
Brown TA (ed) (1998): Molecular Biology LabFax. Vol I (Recombinant DNA) &
II (Gene Analysis). 2nd ed. San Diego: Academic Press. Clasificacin:
DATOS.
+ Sambrook J, Russell D (2001): Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd
edition, Vols 13. New York: CSH Laboratory Press. Manual de protocolos.
La Biblia clsica del Bilogo Molecular. Clasificacin: PROTOCOLOS.
Watson JD, Gilman M, Witkowski J, Zoller M (1992): Recombinant DNA New
York: Freeman and Company. Divulgativo y a la vez con nivel y rigor
cientfico. Clsico sobre Ingeniera Gentica y sus aplicaciones. Claro,
didctico y con numerosos esquemas e ilustraciones explicativas. Muy
recomendable. Clasificacin: TEORA DIVULGATIVO.
Nota: las referencias fundamentales para la preparacin de la prctica se
indican con el smbolo +.

AGRADECIMIENTOS
Proyecto PAFPU FORMAPROFE ('UCO-N-031') de Formacin del
Profesorado Universitario, Junta de Andaluca.

ANEXO 1: MEDIOS, SOLUCIONES Y MATERIAL BIOLGICO EMPLEADO

Pesar o aadir las cantidades o volmenes que se indican en las tablas
correspondientes, disolver en agua (en el caso de que se desee repartir en
botes) y esterilizar en autoclave (autoclavar) a 120C y 1 bar (= 1 kg/cm2) de
presin durante 20 minutos. Una vez esterilizados, los medios con agar pueden
conservarse lquidos en una estufa a 63 C hasta su uso.
Normas para el manejo del autoclave: Comprobar que el autoclave tiene
suficiente agua. En caso contrario, aadir agua destilada hasta la rejilla del
fondo de la mquina. Asimismo, comprobar que las salidas de agua y de aire
se encuentran cerradas. Si no se toman estas precauciones podra quemarse
el autoclave. Una vez haya terminado el autoclave hay que esperar que baje la
presin y la temperatura para abrirlo sin peligro.
7

ATENCIN: Como norma general, no se deben autoclavar soluciones

concentradas de cidos (clorhdrico, sulfrico) o lcalis (NaOH). Como es
obvio, estas soluciones son estriles per se. Adems, pueden daar la
estructura de acero del autoclave. Tampoco se autoclavan soluciones
concentradas de disolventes orgnicos (acetona, tolueno, ter, metanol, etanol,
etc).
Generalmente las soluciones se preparan en botes de vidrio tipo Pyrex.
ATENCIN: Los lcalis como la sosa (NaOH) o la potasa (KOH) atacan al
vidrio. En estos casos debern usarse botes de plstico para su
almacenamiento.
Medio rico LuriaBertani
A continuacin se indica la composicin del medio rico de cultivo de
Escherichia coli.
Tabla 1. Preparacin de medio rico LuriaBertani

Bacto triptona
Extracto de levadura
ClNa
Agar
Agua destilada

Medio lquido
(g)
10
5
10

Hasta 1 litro

Medio slido
(g)
10
5
10
15
Hasta 1 litro

El medio rico lquido puede prepararse en botes Pyrex o en matraces

erlenmeyer para cultivos (10 ml de medio rico en matraz de 100 ml). El medio
slido tambin se prepara en matraz de 100 ml, se deja enfriar un poco
despus de la esterilizacin (~63 C) y se reparte a razn de 25 ml por caja de
petri de 9 cm . Por lo tanto, cada alumno preparar 10 ml de medio lquido y
25 ml de medio slido.
Las cajas de medio rico, una vez haya solidificado el medio, se dejan boca
abajo en la estufa a 37C hasta el da siguiente (para secar el vapor
condensado). El secado puede realizarse rpidamente colocando las cajas
abiertas en una cabina estril de flujo laminar durante una hora.
El medio rico lquido se almacena a temperatura ambiente. Las cajas de
medio rico se guardan en bolsas cerradas a 4C hasta su uso. El medio rico
permanece estable durante meses.
Nota: No conviene aadir los agentes selectivos (en su caso) a las cajas con
medio slido que vayan a ser conservadas en frigorfico. Es mejor prepararlas
sin dichos agentes (p.ej., antibiticos), y aadirlos en la superficie con un asa
de siembra triangular justo antes de usarse. As se asegura que el antibitico
no ha sido degradado.
Solucin amortiguadora TBE

A continuacin se indica la composicin de la solucin amortiguadora TBE

para electroforesis.
Tabla 2. Solucin amortiguadora 5X TBE

Tris base
cido brico
Na EDTA
Agua destilada
2

3,8 litros
(g)
212
160
18,6
Hasta 3,8 litros

1 litro
(g)
55,8
42,1
4,9
Hasta 1 litro

ATENCIN: La solucin amortiguadora 10X TBE puede prepararse tambin,

pero con el tiempo y las bajas temperaturas acaba por precipitar, siendo luego
imposible volver a disolverlo. Por ello se recomienda preparar la mxima
concentracin como 5X TBE.
Solucin amortiguadora TAE
A continuacin se indica la composicin de la solucin amortiguadora TAE
para electroforesis.
Tabla 3. Solucin amortiguadora TAE

50X
242 g
57,1 ml
100 ml
Hasta 1 litro

Tris base
cido actico glacial
Na EDTA (05 M, pH 80)
Agua destilada
2

1X
484 g
1,14 ml
2 ml
Hasta 1 litro

Solucin 20X Bromuro de etidio

A continuacin se indica la composicin de la solucin de bromuro de etidio.
Tabla 4. Solucin 20X Bromuro de etidio (10 mg/ml)

10 ml
100 mg
Hasta 10 ml

Bromuro de etidio
Agua destilada

1 ml
10 mg
Hasta 1 ml

ATENCIN: El BrEt es un mutgeno potente. NO es necesario esterilizarlo.

NO se debe autoclavar por precaucin. Deben seguirse escrupulosamente
medidas estrictas de seguridad (guantes, mascarilla, campana extractora) en
su preparacin a fin de evitar la inhalacin del polvo o su contacto con la piel.
Una vez en solucin es ms fcil de manipular.
ATENCIN: El BrEt es sensible a la luz. Proteger la solucin en bote
envuelto por papel aluminio o mejor en bote con cristal mbar.
Soluciones Ficoll de carga
A continuacin se indica la composicin de la solucin Ficoll de carga.
Tabla 5. Soluciones 10X Ficoll (I y II)

Tipo I
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Tipo II

(g)
(g)
17,5
17,5
([Final]: 17,5%) ([Final]: 17,5%)
Azul de bromofenol
0,06

([Final]: 0,06 %)
Xileno Cianol FF
0,12

(final: 0,12 %)
Na EDTA (0,5 M, pH 8,0)
10 ml
10 ml
([Final]: 50 mM) ([Final]: 50 mM)
Agua destilada milli-Q
Hasta 100 ml
Hasta 100 ml
Esterilizar en autoclave
Guardar a temperatura ambiente
Ficoll (PM ~400)

Estndar de peso molecular ( x Pst I)

Realizar las mezclas e incubaciones que se indican a continuacin.
ATENCIN: El DNA del fago lambda generalmente se recibe liofilizado.
Debe tenerse un cuidado especial en su manipulacin, ya que este fago es
capaz de infectar a E. coli y otras bacterias generalmente usadas en biologa
molecular. Lo ideal es comprar el preparado de Sigma e inyectar en el bote
original los reactivos necesarios para digerir dicho DNA.
Tabla 6. Estndar de peso molecular ( x Pst I) a [500 ng DNA/10 l]

Con solucin Ficoll de carga Con solucin Ficoll de carga

(I)
(II)
Para 10 ml
Para 1 ml
Para 10 ml
Para 1 ml
DNA del fago lambda sin metilar
500 g
50 g
500 g
50 g
Restrictasa Pst I
500 U
50 U
500 U
50 U
10X amortiguador de Pst I
2 l
2 l
2 l
2 l
Agua destilada milli-Q
Hasta 20 l
Hasta 20 l
Hasta 20 l
Hasta 20 l
Mezclar bien
Incubar a 37C 1 hora (o ms)
10X Solucin Ficoll (I)
1 ml
100 l

10X Solucin Ficoll (II)

1 ml
100 l
Agua destilada milli-Q
Hasta 10 ml
Hasta 1 ml
Hasta 10 ml
Hasta 1 ml
Guardar stock a 4C y tubo en uso a temperatura ambiente
Nota: Pueden emplearse cantidades menores de Pst I en la digestin arriba
indicada. En tal caso, debe incrementarse el tiempo de incubacin varias horas
(incluso un fin de semana completo no produce efectos negativo, ya que Pst I
no tiene actividad star; es decir, no corta en sitios inespecficos).
Estndar de peso molecular ( x Hind III)
Realizar las mezclas e incubaciones que se indican para x Pst I (Tabla 6),
pero empleando la restrictasa Hind III en vez de Pst I.
Material biolgico (Escherichia coli)

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Bacteria Escherichia coli DH5F hospedadora del plsmido recombinante

pGEM5Zf(+) o pBluescript(SK+).

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